Name: 생산, 결정 화, 및 인간 IKK1/α의 구조 결정에 대 한 안내 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: 학습하세요 인간 IKK1/α의 생산, 결정화 및 구조 결정 방법을 통해 면역 신호 전달 메커니즘을 이해하고 합리적 약물 설계 기반을 마련하는 방법을. 이 기술은 구조 생물학 연구에 필수적인 결정화 난제를 극복하는 데 도움이 됩니다.

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우리 직원을 beamlines 19ID, 24ID, 및 다양 한 결정에는 데이터 수집 중 지원에 대 한 고급 광자 소스, Lemont, 일리노이에서 13ID에 감사합니다. 우리는 우리 안에 지도/모델의 구축, 초기 IKK1 분자 대체 검색 모델을 구축 하는 데 사용 된 초기 단계에서 낮은 해상도 cryo-EM 지도 인출 하기 위한 드미트리 Lyumkis, 솔 크 연구소에 감사. 이러한 결과 연구 GG에 NIH 교부 금 AI064326, CA141722, 및 GM071862에서에서 자금 지원을 받고 있다. SP는 현재 Wellcome 신뢰 DBT 인도 중간 동료.

<ol><li>Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB%2C+an+active+player+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+immunology+research%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB, an active player in human cancers.</a> Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).</li>
<li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity%2C+inflammation%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Immunity, inflammation, and cancer.</a> Cell. 140 (6), 883-899 (2010).</li>
<li>Ben-Neriah, Y., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+meets+cancer%2C+with+NF-kappaB+as+the+matchmaker%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker.</a> Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).</li>
<li>Hinz, M., Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IkappaB+kinase+complex+in+NF-kappaB+regulation+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond.</a> EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).</li>
<li>Karin, M., Ben-Neriah, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+meets+ubiquitination%3A+the+control+of+NF-%5Bkappa%5DB+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity.</a> Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).</li>
<li>Ghosh, S., Karin, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11983155">Missing pieces in the NF-kappaB puzzle.</a> Cell. 109, Suppl . S81-S96 (2002).</li>
<li>Sun, S. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22435551">The noncanonical NF-kappaB pathway.</a> Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).</li>
<li>Bonizzi, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+NF-kappaB+activation+pathways+and+their+role+in+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity.</a> Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).</li>
<li>DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytokine-responsive+IkappaB+kinase+that+activates+the+transcription+factor+NF-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB.</a> Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).</li>
<li>Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus+specificity+of+gene+expression+programs+determined+by+temporal+control+of+IKK+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity.</a> Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).</li>
<li>Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IkappaB+kinase+complex+%28IKK%29+contains+two+kinase+subunits%2C+IKKalpha+and+IKKbeta%2C+necessary+for+IkappaB+phosphorylation+and+NF-kappaB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation.</a> Cell. 91 (2), 243-252 (1997).</li>
<li>Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IKK-gamma+is+an+essential+regulatory+subunit+of+the+IkappaB+kinase+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex.</a> Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).</li>
<li>Yamaoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementation+cloning+of+NEMO%2C+a+component+of+the+IkappaB+kinase+complex+essential+for+NF-kappaB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation.</a> Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).</li>
<li>Li, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IKKbeta+subunit+of+IkappaB+kinase+%28IKK%29+is+essential+for+nuclear+factor+kappaB+activation+and+prevention+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis.</a> J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).</li>
<li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+principles+in+NF-kappaB+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Shared principles in NF-kappaB signaling.</a> Cell. 132 (3), 344-362 (2008).</li>
<li>Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+nuclear+factor-kappaB+in+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity.</a> Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).</li>
<li>Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAFF-induced+NEMO-independent+processing+of+NF-kappa+B2+in+maturing+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells.</a> Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).</li>
<li>Senftleben, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+by+IKKalpha+of+a+second%2C+evolutionary+conserved%2C+NF-kappa+B+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway.</a> Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).</li>
<li>Coope, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100+to+p52%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52.</a> EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).</li>
<li>Dejardin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lymphotoxin-beta+receptor+induces+different+patterns+of+gene+expression+via+two+NF-kappaB+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways.</a> Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).</li>
<li>Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+p100+processing+by+NF-kappaB-inducing+kinase+involves+docking+IkappaB+kinase+alpha+%28IKKalpha%29+to+p100+and+IKKalpha-mediated+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation.</a> The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).</li>
<li>Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB-inducing+kinase+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100.</a> Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).</li>
<li>Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+basally+translated+NF-kappaB-inducing+kinase+%28NIK%29+protein+functions+as+a+molecular+switch+of+processing+of+NF-kappaB2+p100%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100.</a> J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).</li>
<li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+NF-kappaB+activation+requires+coordinated+assembly+of+a+regulatory+complex+of+the+adaptors+cIAP1%2C+cIAP2%2C+TRAF2+and+TRAF3+and+the+kinase+NIK%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).</li>
<li>Vallabhapurapu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonredundant+and+complementary+functions+of+TRAF2+and+TRAF3+in+a+ubiquitination+cascade+that+activates+NIK-dependent+alternative+NF-kappaB+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).</li>
<li>Annunziata, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+engagement+of+the+classical+and+alternative+NF-kappaB+pathways+by+diverse+genetic+abnormalities+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).</li>
<li>Keats, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuous+mutations+activate+the+noncanonical+NF-kappaB+pathway+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).</li>
<li>Staudt, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+activation+of+NF-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+biology%22%5BJournal%5D)">Oncogenic activation of NF-kappaB.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109(2010).</li>
<li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+basis+for+IkappaB+kinase+2+activation+via+oligomerization-dependent+trans+auto-phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation.</a> PLoS Biol. 11 (6), e1001581(2013).</li>
<li>Hinz, M., Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IkappaB+kinase+complex+in+NF-kappaB+regulation+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond.</a> EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).</li>
<li>Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IkappaB+kinase+complexes%3A+gateways+to+NF-kappaB+activation+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription.</a> Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).</li>
<li>Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+infectious+recombinant+baculoviruses+by+site-specific+transposon-mediated+insertion+of+foreign+genes+into+a+baculovirus+genome+propagated+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli.</a> J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).</li>
<li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+for+the+Activation+of+IKK1%2Falpha%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha.</a> Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).</li>
<li>Otwinowski, Z. aM., W, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+X-ray+Diffraction+Data+Collected+in+Oscillation+Mode%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode.</a> Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+human+IkappaB+kinase+beta+asymmetric+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological+crystallography%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li>
<li>McCoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?he5368">Phaser crystallographic software.</a> Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li>
<li>Vagin, A. T., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?li5010">MOLREP: an automated program for molecular replacement.</a> J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).</li>
<li>Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Version+1.2+of+the+Crystallography+and+NMR+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Version 1.2 of the Crystallography and NMR system.</a> Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).</li>
<li>Brunger, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallography+%26+NMR+system%3A+A+new+software+suite+for+macromolecular+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological%22%5BJournal%5D)">Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).</li>
<li>McRee, D. E. <a target="_blank" href="http://www.iucr.org/__data/assets/pdf_file/0010/8983/dem.pdf">XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview.</a> J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).</li>
<li>Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+biomolecular+crystallography+with+low-resolution+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data.</a> Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).</li>
<li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+basis+for+IkappaB+kinase+2+activation+via+oligomerization-dependent+trans+auto-phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation.</a> PLoS biology. 11 (6), e1001581(2013).</li>
<li>Christopher, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+discovery+of+2-amino-3%2C5-diarylbenzamide+inhibitors+of+IKK-alpha+and+IKK-beta+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+medicinal+chemistry+letters%22%5BJournal%5D)">The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases.</a> Bioorganic & medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).</li>
<li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+crystallographic+model+and+data+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Linking crystallographic model and data quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li>
<li>Chen, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MolProbity%3A+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological+crystallography%22%5BJournal%5D)">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).</li>
</ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사 또는 다른 충돌을 선언합니다.

두 개의 관련된 IKK 단백질의 구조, 결정 화 및 생산 솔루션 우리 개념 그것은 비교적 간단한 운동 IKK2/β 단백질 생산, 결정 화, 및 구조 결정 우리의 경험을 주어진 것으로 IKK1/α의 x 선 결정 구조를 결정 하기 위해 밖으로 설정 합니다. 그러나, 우리가이 두 가지 관련된 단백질 결정의 용이성에 관한 매우 다르게 행동 매우 놀 랐 다. 여러 높은 프로 파일 실험실에서 노력에도 불구 하 고 IKK1 구조 결정 거의 2 년간 했다. 이 크게 몇 가지 주요 병목 현상에서 비롯 된.
첫 번째 어려움은 매우 순수 하 고 수용 성 단백질 양식을 했다. 곤충 세포 표현 시스템 밀리 그램 양의 합리적으로 수용 했다 순수 단백질을 얻기 위해 우리가 사용할 수 있습니다. 식의 수준에 관한 모든 IKK1/α 구문 IKK2/β 곤충 세포 식 시스템에서 구성 보다 훨씬 낮은 수준에서 표현. 어느 단백질은 가용성과 대장균에 표현 기능을 주...

Dimeric 녹음 방송 요인 NF-κB 가족의 transcriptional 활동은 염증과 면역에서 생존과 죽음에 이르기까지 다양 한 세포 기능에 필요 합니다. 이러한 활동은 세포와 자가 면역 질환, 그리고 암1,2,3를 포함 하 여 다양 한 병 적인 조건에 규제 리드의 손실에 엄격 하 게 제어 됩니다. 자극의 부재에서 NF-κB의 활동 저해 IκB (-κB의 억제제) 단백질4에 의해 유지 됩니다. IκB 단백질에 특정 Ser 잔류물 인 산화 ubiquitination 및 후속 proteasomal 저하 또는 선택적 처리5에 대 한 그들을 표시합니다. 두 개의 높은 동종 Ser/Thr kinases, IKK2/β와 IKK1/α, NF-κB 활동의 중앙 레 귤 레이 터가 인 산화 이벤트6,7을 수행 하 여 역할.
ligand와 수용 체 간의 상호 작용 transduces NF κB 요인의 활성화를 선도 하는 중재자의 시리즈를 통해 신호. NF-κB 신호 과정은 광범위 하 게 두 가지 경로-정규 및 비정규 (대체)8로 나눌 수 있다. IKK2/β의 활동은 주로 염증 성 및 타고 난 면역 반응9필수적인 정식 통로의 NF-κB 신호 통제 한다. 이 통로의 뚜렷한 특징은 지금까지 화학적 새롭거나 IKK 복잡 한 내 IKK2/β10 의 신속 하 고 단기 활성화-IKK1 및 IKK2, 뿐만 아니라 규제 구성 요소, 니 모를 찾아서 (NF κB 필수 변조기의 구성 될 것으로 추정 )11,,1213. 2 개의 촉매 IKK subunits IKK 복합물의, 사이 IKK2는 주로 책임14 원형 IκBs (α-β,-γ)의 특정 잔류물의 인 산화에 대 한 NF-κB, 그리고 또한 비정형 IκB 단백질에 바인딩된은 NF-κB1/p105는 NF-κB p50 소 단위5의 전조 인 산화 유도 ubiquitination 그리고 proteasomal IκB (또는 p105의 처리)의 저하 리드 릴리스 및 NF κB 이합체15의 특정 집합의 활성화. IKK2의 미 규제 기능 때문에 탈 선 NF κB 활동 면역 질환2,,316에서 뿐만 아니라 많은 암에 관찰 되었습니다.
IKK2/β, 달리 IKK1/α의 활동 NF κB 개발 및 내성에 대 한 필수적입니다 정식이 아닌 통로의 신호 조절. IKK1 phosphorylates의 처리, p52의 세대의 C-터미널 IκBδ 세그먼트에 NF-κB2/p100의 특정 잔류물. Transcriptionally 활성 p52:RelB heterodimer 형성 발달 신호7,17,18,,1920느리고 지속적인 응답을 시작합니다. 흥미롭게도,이 통로의 중앙 NF κB 요소 p52의 세대는 또 다른 요인은, NF-κB 유도 니 (닉)21,22에 IKK2 또는 니 비판적으로 의존 합니다. 휴식 셀에 닉의 수준 때문에 상수 프로테아좀 종속 저하23,,2425낮은 남아 있습니다. ' 비정규 ' ligands에 의해 그리고 특정 악성 세포에서 세포의 자극, 시 닉 모집을 활성화 하 고 IKK1 안정 된다/α. 닉의 IKK1 키 니 아 제 활동 p527에 p100의 효율적인 처리를 위해 필수적인. IKK1와 닉 phosphorylate 처리 및 p52의 세대의 C-터미널 IκBδ 세그먼트에 NF-κB2/p100의 3 serines (Ser866, 870, 872). 비정규 통로의 탈 선 활성화 여러 myeloma26,,2728를 포함 하 여 많은 악성 종양에 연루 되었습니다.
비록 아무도 지금까지 것으로 밝혀졌다는 효과적인 약 IKK2/β에 대 한 몇 가지 매우 효율적이 고 구체적인 억제제 알려져 있습니다. 반면, IKK1/α-특정 억제제 스파스 있습니다. 이 일부 IKK1/α, 셀, 및 합리적인 약 디자인에 IKK1에 의해 NF-κB의 활성화의 기계 기초의 우리의 이해를 제한에 대 한 구조 및 생 화 확 적인 정보의 부족에서에서 줄기 수 있습니다. IKK2/β의 엑스레이 구조 IKK2/β29;의 인증 메커니즘에 대 한 통찰력 제공 그러나, 이러한 구조는 어떻게 다른 업스트림 자극 공개 하지 수 IKK1/α 또는 IKK2/β NF κB 활동 30,31의 명료한 세트를 규제의 활성화를 방 아 쇠. 기계적으로 IKK1/α의 뚜렷한 신호 기능을 기본을 이해 하 고 합리적인 약 디자인을 위한 플랫폼을 구축, 우리 IKK1/α의 구조 결정에 집중 했다.

<table><tbody><tr><td>Cellfectin/Cellfectin II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10362100</td><td>Cellfectin은 현재 단종되었으며 Cellfectin II</td></tr><tr><td>Sf900 III 곤충 세포 매체</td>로 대체됨 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12658-027</td><td></td></tr><tr><td>SF9 세포</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12659017</td><td></td></tr><tr><td>anti-IKK1 항체</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-56704</td><td>이전에 Imgenex에서 판매</td></tr><tr><td>anti-PentaHis 항체</td><td>Qiagen</td><td>34460</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 멤브레인</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>니트로 셀룰로오스도 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Ni-NTA agarose</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 분석 시약</td><td>BioRad</td><td>500001</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 열</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 농축기</td><td>Millipore</td><td>UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024</td><td></td></tr><tr><td>화합물 A</td><td>바이엘</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calbiochem IKK-억제제 XII</td><td>Calbiochem</td><td>401491</td><td></td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>SIGMA</td><td>S4400</td><td></td></tr><tr><td>MLN120B</td><td>Millenium</td><td>선물 품목</td><td></td></tr><tr><td>AMPPNP</td><td>SIGMA</td><td>A2647</td><td></td></tr><tr><td>덱스트런 설페이트</td><td>SIGMA</td><td>51227, 42867, 31404,</td><td></td></tr> <tr><td>덱스트란 설페이트</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62101</td><td></td></tr><tr><td>PEG</td><td>SIGMA</td><td>93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172</td><td>그들 중 일부는 SIGMA 카탈로그의 새로운 Cat #입니다. 우리가 가지고 있던 것은 원래 다른 Cat #을 가진 Fluka에서 온 것입니다.</td></tr><tr><td>결정화 스크린</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>크리스탈 스크린 I 및 II (크리스탈 스크린 HT)</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-130</td><td></td></tr><tr><td>Index HT</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-134</td><td></td></tr><tr><td>PEG/Ion 및 PEG/Ion2 (PEG/Ion HT)</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-139</td><td></td></tr><tr><td>PEGRX 1 및 PEGRx 2 (PEGRx HT)</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-086</td><td></td></tr><tr><td>SaltRx 1 및 SaltRx 2 (SaltRx HT)</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-136</td><td></td></tr><tr><td>Crystal mounts</td><td>Hampton Research</td><td>HR8-188, 190, 192, 194</td><td></td></tr><tr><td>Synchrotron</td><td>미국 에너지부의 APS(Advanced Photon Source) ' s Argonne National Laboratory</td><td>Beamline 19 ID</td><td>미국 에너지부의 APS(Advanced Photon Source) ' 아르곤 국립 연구소(Argonne National Laboratory)는 거의 모든 과학 분야의 연구를 위해 매우 밝은 고에너지 저장 링 생성 X선 빔을 제공합니다.</td></tr></tbody></table>

생산, 결정 화, 및 인간 ikk1/α의 구조 결정에 대 한 안내

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

세포 외 자극의 클래스는 NF-κB 소 단위, p52의 선구자 p100의 처리를 통해의 생성을 유도 하 IKK1/α의 활성화를 필요 합니다. p52는 homodimer 또는 heterodimer 다른 NF-κB 소 단위, RelB와 함께 작동합니다. 이러한 이합체 차례로 염증, 세포 생존, 및 세포 주기 관련된 유전자의 수백의 표정을 통제 한다. IKK1/α 주로 삼항 복합물으로 니 모 IKK2/β와 관련 된 남아 있습니다. 그러나, 그것의 작은 수영장은 또한 낮은 분자량 complex(es)로 관찰 된다. 그것은 p100 처리 작업 내의 더 큰 IKK1/α의 활성화 또는 작은 복잡 한 수영장에 의해 트리거되는 경우 불명 하다. IKK1/α의 제정 활동 여러 암 및 염증 성 질환에서 발견 되었습니다. IKK1/α의 활성화의 메커니즘을 이해 하 고 약물 표적으로 그것의 사용을 가능 하 게, 우리는 대장균, 다른 호스트 시스템에 재조합 IKK1/α를 표현, 곤충 및 포유류 세포. 에 성공 하는 우리 곤충 세포, 밀리 그램 양의 매우 순수한 단백질을 얻기, 억제제, 존재 crystallizing 및 그것의 x 선 결정 구조를 결정 감염 성 IKK1/α 잠재에 표현. 여기, 우리는 재조합 단백질, 그것의 결정 화 및 그것의 x 선 결정 구조 결정 하는 자세한 단계를 설명 합니다.

복제 및 IKK1/α의 다른 구조 식 인간 IKK1/α는 N 맨끝 hexa-히스티딘을 자사의 EcoRI 및 노트 제한 사이트 내에서 잠재 식 벡터 pFastBacHTa로 복제 하는 전체 길이 IKK1 태그. 태그는 TEV 프로 테아 제 소화에 의해 제거 될 수 있습니다. 전체 길이 IKK1/α 양쪽 끝에 유연한 영역이 있기 때문에 유연한 영역 일반적으로 렌더링 단백질 구체화 하기 어려운, 우리 IKK1/α pFastBacHTa 벡터의 상술 사이트 내에서 다양 한 잘린된 조각 복제. IKK1/α의 다양 한 잘림 돌연변이 야생-타입 (wt)와 S176E, 180E 생성 된 (EE) 백본. IKK1/α EE phosphorylated 키의 constitutively 활성 폼의 모방을 말합니다. 단백질 표정과 재조합 잠재 생산 이전에 게시 프로토콜을 사용 하 여 약간 수정43 (<strong clas...

IκB 키 1/α (IKK1/α CHUK)는 Ser/Thr 단백질 키 니 아 NF κB 녹음 방송 요인의 활성화를 통해 주로 세포 활동의 무수 한에 관련 된 이다. 여기, 우리가 생산 및이 단백질의 크리스탈 구조 결정에 필요한 주요 단계를 설명합니다.

생산, 결정 화, 및 인간 IKK1/α의 구조 결정에 대 한 안내

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

이 절차의 목적은 신호 기능의 기계론적 기초를 이해하고 합리적인 약물 설계를 위한 플랫폼을 구축하기 위해 인간 IKK1-알파의 생산, 결정화 및 구조적 결정에 대한 지침을 제공하는 것입니다. 이 방법은 연구원이 면역 신호 분야의 주요 쿼리에 대한 답변을 제공하는 IKK1의 구조를 결정하는 데 도움이 될 것입니다. 이 기술은 결정화에 다소 내화성인 IKK 단백질의 결정을 얻는 간소화된 경로를 설명하고 구조물을 결정하는 병목 현상을 극복하는 데 있어 다양한 중요한 정보를 제공합니다.일반적으로, 이 방법에 새로운 개별은 가용성, 잘 행동한 단백질의 밀리그램 양을 생성하기 때문에, 곤충 세포에 있는 그것의 발현을 필요로 하고, 결정화는 조건의 단지 높게 좁은 창에서 행해질 수 있기 때문에 투쟁할 것입니다. IKK1의 구조를 결정하는 데 사용되는 분자 교체 절차는 또한 매우 까다로울 수 있으며, 특히 적절한 검색 모델이 없는 경우 많은 IKK1 분자를 함유하는 비대칭 단위의 부위가 아닌 결정의 편향 특성이 좋지 않기 때문에 매우 까다로울 수 있다. 절차를 시연하는 것은 카일 슈메이트와 손지알라 호치키스, 내 실험실에서 학생들이 될 것입니다.첫날, Sf9 세포는 Sf903 곤충 세포 배지의 2밀리리터로, 6웰 플레이트의 각 우물에서 27°C의 배양합니다. 그들은 신선한 매체에 희석하여, 약 6 배 10에서 5의 밀도로, 신선한 매체에 희석하여 현탁액에 밀리리터 당 6 개의 세포에 2 ~ 3 배 10의 밀도에 도달 할 때 세포를 통과. 둘째 날, SF9 경질 시약의 8마이크로리터를 SF-903 또는 그레이스의 곤충 매체 100마이크로리터로 희석시.그런 다음 혼합물을 간략하게 소용돌이시다. 별도의 튜브에서 키트 정제 재조합 바미드 1마이크로그램을 동일한 배지의 100 마이크로리터에 희석시켰다. 희석 된 DNA와 경질 시약을 결합합니다.실온에서 15~30분 동안 배양한 후, 우물에서 배지를 제거합니다. 그런 다음 신선한 매체의 1 밀리리터를 추가합니다. 다음으로, 희석된 DNA 경전 시약 혼합물을 세포에 드롭와이즈로 추가하여, 부착 세포를 배출하지 않도록 낙하 크기를 조정한다.6 시간 후, 세포의 상단에 신선한 배지의 1.5 밀리리터를 추가합니다. 27섭씨에서 세포를 배양하고, 바이러스 감염의 징후는 12시간마다 주기적으로 우물을 검사합니다. 5일째에, 세포를 포함하는 배지를 제거, 60 72 시간 감염 후.배지를 튜브로 옮긴

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연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

구조 기반 약물 설계 약물 개발에 중요한 역할을한다. 병렬로 여러 대상을 추구하는 것은 크게 선 발견의 성공의 기회를 증가합니다. 다음 문서는 감염성 질환 시애틀 구조 유전체학 센터 PB2 인플루엔자 단위체의 유전자에 대한 구조 결정을위한 멀티 타겟 접근 방식을 활용하는 방법 강조한다.

인플루엔자 중합 효소의 유전자에 대한 구조 결정 PB2 소단위를위한 멀티 타겟 병렬 처리 방식

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β-barrel 외막 단백질(OMP)은 그람 음성 박테리아, 미토콘드리아 및 엽록체의 외막 내에서 많은 기능을 수행합니다. 여기에서 우리는 X선 결정학 또는 NMR 분광법에 의한 구조 결정을 위해 충분한 양의 β배럴 OMP를 생산하기 위한 프로토콜을 제시하여 구조 연구에서 알려진 병목 현상을 완화하기를 희망합니다.

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생산, 결정 화, 및 인간 IKK1/α의 구조 결정에 대 한 안내

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