Name: Vivo에서경작-Murine 이다 빠르고, 간단 하 고 저렴 한 AWESAM 프로토콜을 사용 하 여 같은 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 배우세요 AWESAM 프로토콜을 사용하여 쥐 뇌에서 별아교세포를 빠르고 간단하게 배양하는 방법입니다. 이 기법은 생체와 유사한 형태학적 특성 및 칼슘 신호를 유지하여 신경과학 연구에 활용됩니다.

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우리는 유럽 연구 위원회 (FP7/260916), 알렉산더 폰 훔볼트-재단 (Sofja Kovalevskaja), 그리고 도이치 가운데 (DE1951 및 SFB889)에서 자금을 인정 합니다.

여기에 설명 된 모든 동물 실험은 독일 동물 복지에 대 한 지침에 따라 수행 했다.
참고: 타임 라인 및 프로토콜의 주요 단계는 그림 1에서 그림.
1입니다. 준비
<ol><li>
다음과 같은 솔루션을 준비 합니다.
	<ol>
<li>DMEM + 다각형 MD 이다 경작에 대 한 준비: DMEM 10 %FCS 100 U 페니실린, 100 µ g/mL 스.</li>
		<li>NB + H 방사상 이다 경작에 대 한 준비: 5 ng/mL HBEGF, B-27 보충, 1 x 글루타민 보충, 100 U 페니실린과 100 µ g/mL 스 x 1와 neurobasal 매체. 참고: HBEGF의 높은 농도의 Aliquots 준비 고 필요할 때마다 중간에 추가 될-20 ° C에서 저장 될 수 있습니다.</li>
		<li>절 개 매체 (10 mM HEPES HBSS에)를 준비 합니다.</li>
		<li>0.05% 트립 신-EDTA와 6-7 mL 15 mL 튜브에 0.25% trypsin EDTA의 6-7 mL의 aliquots을 준비 합니다. 이 37 ° C 물 목욕에 해 동 고-20 ° C에서 저장 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>프로토콜을 시작 하기 전에 날 코트 0.04 %polyethylenimine (페이) 각의 5 mL와 10 cm 조직 문화 취급 요리.</li>
	<li>다음 날는 페이 제거 하 고 두 번 이온, 증 류 물으로 설거지. DMEM + 12 mL 각 접시에 추가 하 고 미리 셀을 도금 하기 전에 적어도 30 분 동안 37 ° C, 5% CO2 배양 기에서 equilibrate.</li>
	<li>해 부 지역 준비: 층 류 절 개 후드, 장소 2 10 cm 배양 접시 가득 얼음에 해 부 매체. 되도록 각 뇌 영역에 대 한 (예, 피 질, 해 마), 절연 15 튜브 14 mL 절 개 매체와 가득 준비 하 고 얼음에 계속. 70% 에탄올와 후드에 해 부 현미경 옆 해 부 도구 (좋은 위, Dumont #3, #5 집게)를 스프레이.</li>
</ol>2. 쥐 또는 마우스 뇌 해 부
참고: 두 쥐 쥐를 사용할 수 있습니다. P8도 사용할 수 있습니다 보다 더 오래 된 동물 (우리는 P12까지 테스트), 하지만 meninges 제거 점점 더 어렵게 될 것입니다. 또한, 셀 생산량 및 건강 것입니다 축소, 이후 복잡 한 프로세스와 연결 조직 분리, 증가 된 세포 죽음으로 이어지는 동안 휴식 수 있습니다 오래 된 동물에서 뇌 세포 형성 됩니다. 대뇌 피 질의 준비 설명, 하지만 다른 뇌 영역을 사용할 수 있습니다.
<ol><li>37 ° C 물 욕조에 0.05% 트립 신-EDTA를 놓습니다.</li>
	<li>CO2 농도 천천히 올려서 (임신 쥐 E19 새끼 또는 P0-P8 동물) 동물을 euthanize 하 고 두뇌를 분리. 다음 단계는 메 마른 기술 필요.</li>
	<li>
배아 조직으로 작업 하는 경우 먼저 자 궁에서 태아를 제거 하 고 배아 낭 열고 즉시가 위로 머리를 잘라. 모든 머리는 잘라, 미리 냉각된 해 부 중간에 그들을 전송 합니다.
	<ol>
<li>일단 머리는 중간에 잠긴, 집게와 소 뇌에서 핀치 피부와 두개골 (둘 다는 매우 부드러운 젊은 동물에서)을 엽니다. 신중 하 게 레버 두개골에서 뇌의 나머지. 참고: 2 ~ 4 E19 배아 항복 해 부의 날에 접시 당 500000 셀에 도금 하는 대뇌 피 질의 이다의 적어도 8 10 cm 요리에 대 한 충분 한 조직.</li>
	</ol>
</li>
	<li>신생아 이상 강아지에 대 한가 위, 머리를 잘라 하 고 두뇌 medially 코 끝에 머리 뒤쪽에서 직선에 피부를 절단 하 여 분리 합니다. 옆으로 그리고 신중 하 게 잘라 두개골 왼쪽 및 오른쪽, 다음 리프트를 두개골 뼈 피부를 당겨. 소 뇌, 떨어져 고 레버는 두개골에서 뇌의 나머지. 참고: 2 ~ 3 P0-P8 새끼 양보 해 부의 날에 접시 당 500000 셀에 도금 하는 대뇌 피 질의 이다의 적어도 8 10 cm 요리에 대 한 충분 한 조직.</li>
	<li>기본 midbrain 구조에서 피 질을 구분 합니다. 다음 장소는 반구 사이 fissure 내 집게 꼬집어 각 반구 무료 (경도 균열에 수직) 한 반구의 피 질 및 midbrain 구조 사이 집게를 이동 합니다.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 모든 meninges 각 반구 (와 그것의 해 마), 다음은 된 분리. Hippocampal 이다 필요한 경우 14 mL 해 부 중간에 얼음으로 가득 15 mL 튜브에 각 마를 이동 합니다.</li>
	<li>제거 더 지역 각 반구의 피 질에서 특정 영역은 필요 (예를 들어, 담당). 잘라 1 m m3보다 더 큰 조각으로 이다 생성 하는 데 사용할 모든 대뇌 피 질의 조직. 해 부 중간에 얼음 가득 별도 15 mL 튜브에 대뇌 피 질의 조직의 모든 조각을 수집 합니다.</li>
</ol>3. 조직 소화 및 분리
<ol><li>모든 조직 조각 수집 되 면 튜브의 하단에 정착 하도록 기다리는 다음 가능한 많은 매체를 발음.</li>
	<li>0.05% 트립 신-EDTA 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 2-3 mL를 추가 하 고 20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 튜브를 품 어. 참고: 조직 조각을 혼합 하 고 다시 정착 수 있도록 신속 하 게 피 펫에서 모든 트립 신-EDTA를 해제 합니다.</li>
	<li>조심 스럽게 발음 트립 신-EDTA, 가능한 튜브의 하단에 작은 액체도에서 조직 조각을 떠나.</li>
	<li>나머지 트립 신-EDTA 씻어 미리 냉각된 해 부 중간의 5 mL를 추가 합니다. 조직 조각의 혼합 달성 하기 위해 튜브의 상부 쪽으로 플라스틱.</li>
	<li>해 부 중간 발음 하 고 가능한 작은 액체로 조직 조각에 둡니다. 두 번 더 미리 냉각된 해 부 매체와이 세척 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>마지막 세척 단계 후 DMEM + (실내 온도를 따뜻하게) 사용 하 여 1000 µ L 피 펫 팁, 및 triturate pipetting으로 조직 고 거품 소개 없이 아래쪽의 1 mL를 추가 합니다. 참고: 그것은 중요 하다을 생산 하는 거품을 피하기 위해이 솔루션을 이다 아주 민감한 하의 pH를 변경 될 수 있습니다.</li>
	<li>50 mL 튜브의 개통에서 100 µ m 셀 스 트레이너를 놓고 미리 미리 냉각 DMEM + 4.5 mL와 함께 필터를 젖은.</li>
	<li>셀 스 트레이너에 천연된 직물 서 스 펜 션의 1 mL를 플라스틱 및 다른 4.5 mL을 추가 사전 냉각 DMEM + 셀 스 트레이너를 통해 세포를 씻어.</li>
</ol>4. 셀 도금 뿌리고 여 사이토 농축에 대 한
<ol><li>10 µ L 10 µ L trypan 블루와 세포 현 탁 액의 희석 한 hemocytometer에 믹스를 pipetting을 예를 들어, 셀을 계산.</li>
	<li>10 cm 접시 당 12 ml DMEM + 500000 셀 플레이트. 주: DMEM +는 astrocytic 성장을 위한 도움이 그래서 신경 또는 microglia 보다 더. 떨고, 하는 동안 유리 coverslips 우물 내에 물리적 힘 (coverslips) 없이 10 cm 요리에 그 보다 훨씬 강해 있습니다. 만약 셀 24-잘 접시에 동요는, 그들은 건강에 해로운 될 또는 죽어. 만 떨고 후 24-잘 접시에 이다 격판덮개.</li>
	<li>7 일 동안 37 ° C, 5% CO2 인큐베이터에서 셀 문화 유지.</li>
	<li>6 일에 동요 하 고 셀을 뿌리고 전날 페이 코팅 배양 배지 단계 5에서에서 설명한 대로 준비 합니다.</li>
</ol>5. 뿌리고 셀
<ol><li>
뿌리고, 전날 코트 0.04% 페이와 세포 배양 배지.
	<ol>
<li>Immunocytochemistry, 바이러스 성 변환, 또는 플라스 미드 transfection, 24-잘 또는 6 잘 플레이트 (각 포함 하는 멸 균된 12 m m 또는 25 m m 유리 coverslip, 각각)를 사용 합니다.</li>
		<li>적어도 1 시간에 70% 에탄올에 외피에 의해 유리 coverslips 소독 다음 우물에 있는 coverslips를 배치 하기 전에 세 번 이온 증류수에 세척.</li>
		<li>적어도 70 µ L 24-잘 접시에 12 m m coverslip 당 0.04% 페이 6 잘 플레이트에 25mm coverslip 당 600 µ L 0.04% 페이 추가 합니다.</li>
		<li>서쪽 오 점 또는 RNA-Seq 분석, 10 cm 요리 이미 해 부 후 셀을 포함 하는 사용할 수 계속할 수 있습니다. 요리만 흔들릴 수 필요가 다음 셀 1 x PBS로 세척 및 NB + H로 치료 (새로운 요리를 전송 하지 않습니다).</li>
	</ol>
</li>
	<li>하루에 생체 외에서 (DIV) 7 해 부 후에 셀 10 cm 요리 DMEM + 인큐베이터에서 실험실 셰이 커에 놓고 흔들어 6 h 110 rpm에서 요리 합니다.</li>
	<li>이온, 증 류 물으로 코팅된 coverslips에서 페이 두 번 씻어. 번호판 (잘 24-잘 접시와 6 잘 플레이트 잘 당 2 mL 당 500 µ L) NB + H 매체를 추가 합니다. 전 37 ° C, 5% CO2 10 cm 요리 떨고 있다, 동안에 또는 적어도 30 분 동안 인큐베이터에 접시 equilibrate.</li>
	<li>6 h 떨고의 끝 전에 20-30 분 전 1 x PBS, DMEM +, NB + H, 및 0.25 %trypsin-EDTA 물 목욕에서 37 ° C에 따뜻한.</li>
	<li>떨고, 6 h 문화 요리 흔드는 고 즉시 10 mL (흥분 상태에서 뉴런, oligodendrocytes, 및 microglia를 포함) 하는 매체 대체 후 미리 접시 당 1 x PBS를 따뜻하게 합니다. 참고: 그것은 즉시 다시 연결 비 astrocytic 셀을 피하기 위해 분리 된 셀을 포함 오래 된 매체를 발음 하는 것이 중요입니다.</li>
	<li>PBS를 제거 하 고 접시 당 3 mL 미리 따뜻하게 트립 신-EDTA를 추가. 37 ° C, 5% CO2배양 기에서 4 분에 대 한 각 접시를 품 어. 참고: 서쪽 오 점 또는 RNA-Seq에 대 한 샘플을 준비 하는 경우에 트립 신-EDTA 추가 하지 마십시오. 대신, 12 mL PBS 바꿀 미리 NB + H, 이후 문화 인큐베이터에 다시 배치할 수 따뜻하게 합니다.</li>
	<li>미리 따뜻하게 DMEM + 각 3 mL 트립 신-EDTA를 접시, 플라스틱 접시 5 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여에서 셀 고 수집 50 mL 튜브에 세포 현 탁 액 5 mL를 추가 합니다. 참고: 피 펫-접시의 아래쪽에서 직접 접시의 바닥 해야 될 셀 분리로 명확 하 게. (대신 DMEM +), 매체를 포함 하는 혈 청 혈 청은 트립 신으로 사용 합니다.</li>
	<li>4 분 동안 20 ° C에서 3,220 x g에 세포 현 탁 액 원심</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 resuspend 셀 펠 릿 1 mL에는 NB + H에 미리 예 열.</li>
</ol>6. 셀 도금 최종 사이토 문화에 대 한
<ol><li>셀을 계산 합니다.</li>
	<li>(잘 당 2 mL NB + H 매체)에 6-잘 접시에 잘 당 20000 셀 이나 잘 (잘 당 500 µ L NB + H 매체)에 24-잘 접시 당 5000 셀 접시.</li>
	<li>추가 처리 또는 분석까지 37 ° C, 5% CO2 인큐베이터에서 셀 문화 유지.</li>
	<li>일주일에 한 번 반 매체를 교환 합니다. 참고: 낮은 영양소 환경에서 이다 확산 중지 하지만 (비록 우리의 경험에 아무 microglia AWESAM 문화에 나타난) 모든 나머지 microglia 확산 것입니다. 일단 주 어떤 잠재적으로 나머지 microglia8의 농축을 방지 하 고는 monocultures 적어도 3 주 동안 건강 유지 절반 매체를 교환.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

프로토콜 내에서 4 단계는 중요: 1)를 준비 하 고 정확 하 게 5 ng/ml, HBEGF 농도 때문에 농도 있는 작은 증가 미 숙 문화, 예를 들어, 발생할 수 있습니다 10 ng/mL HBEGF 드 차별화 이다4; 조직 또는 pH를 변경 하 고 사이토 건강;을 방해 수 있는 셀을 포함 하는 솔루션 2) 피 거품 3) 전 평형 미디어 최적 pH 및 온도 성장 하는 건강 한 이다; (비록 아무 microglia AWESAM 문화에서 지금까지 발견 된) 4) 교환만 절반 매체 일주일에 한 번 모든 나머지 microglia 충분 한 양분이 존재 하 고 매체에 가능성이 있기 때문에8 정기적으로 교환. 이 마지막 포인트, astrocytic, 차별화, 생존과 확산을 지원할 수 있습니다 그들은 그 문화 내에서 사이토 파생 요소 하지 완전히 제거 해야 참고 중요 하다.
성숙한 사이토 소스...

영양 지원, 혈액 흐름, 시 냅 스 신호 및 소성, 및 세포 통신-는 모두 얇은 astrocytic 프로세스 중심 메커니즘을 통해 뇌 기능에 영향을 이다. 여기에 설명 된 AWESAM 프로토콜을 사용 하는 유용한 예를 들어, 많은 단백질 및 심지어 캘리포니아2 + 신호 표현의 다른 뇌 세포에 걸쳐 다른 명과 뉴런에서 간섭 없이 이러한 프로세스의 연구 유형입니다. 또한,이 방법은 이전에 사용할 수 있는 기술의 한계 극복. 특히, 우리의 프로토콜 vivo에서제공-형태학 (방사상 이다 얇은 프로세스) 및 유전자 발현에 빨리, 쉽게, 그리고 저렴 한 방식으로 같은.
셀 형태, 유전자 발현, 그리고 다른 많은 규제 프로세스는 직접 환경에 의해 영향을 받습니다. 문화 접시에이 주변의 세포 뿐만 아니라 세포 재배 되 고 있는 매체에 의해 발표 하는 요소를 말합니다. 이다, HBEGF 방사상 형태로1 을 유도 하기 위해 이전에 보고 하지만 드 이다2를 차별화 하는 또한 발견 했다. 그러나, HBEGF의 낮은 농도 나중 더 vivo에서생성 하는 데 사용 했다-두 개의 서로 다른 프로토콜3,4RNA 시퀀싱을 통해 발견 이다 처럼. 또한, 사이토 형태학 프로토콜4에 중간 구성 변경: HBEGF의 낮은 농도와 Neurobasal 매체는 방사상 이다 (예를 들어, 다른 중간 작곡 하면서 성장을 위한 최적의 혈 청-포함 된 DMEM) (immunopanning에 의해 고립 된 갓 이다)에 다각형 세포를 생산.
AWESAM 프로토콜 사이토 monocultures4성장에 대 한 이전 방법의 단점을 극복 했다. 성장 하는 사이토 monocultures 이전 기술은 다음과 같은 단점이 있습니다: 방사상 이다에 vivo에서 (MD 방법)5;의 특성은 다각형 형태 길이 비용 (유도 만능 줄기 세포는 이다 3 개월을 준비 하며 고가의 성장 인자를 포함 하 여 많은 시 약) 프로토콜의6; 낮은 양의 재료 (immunopanning 방법)3; 이다의 탈 분화와 3D 매트릭스 (Puschmann 외.)의 요구 사항 1 , 2. AWESAM 프로토콜을 제공 하는 반면,: vivo에서-같은 형태 (얇은 프로세스와 방사상 이다); 빠른, 쉽게, 그리고 저렴 한 방법; 대량의 물자; 그리고 vivo에서가장-같은 비해 immunopanned 및 MD 이다 유전자 발현. 또한, 2D 문화 캘리포니아2 + 신호 및 얇은 프로세스, 고 막 가까이 이벤트 재활용 기의 연구에 대 한 수 있습니다 (예를 들어, TIRF 현미경 불가능 3D 문화에서).
MD 메서드는 19805, 다각형 사이토 monocultures는 간단 하 고 빠른 기술 제공에 그것의 간행물부터 광대 하 게 사용 되었습니다. 간단히, MD 메서드 수반 송아지 태아 혈 청 (FCS)에서 성장 혼합된 뇌 세포-(다른 모든 뇌 세포 유형을 분리 접시에서)로 이다에 대 한 풍부 하 고 더 동일한 매체에 문화 단계를 흔들어 뒤 DMEM, 포함 된. DMEM fcs 보충 fibroblasts 및 adipocytes에서 다른 암 세포 선, 모두의 공유 문화에서 MD 이다에 의해 전시 다각형 형태에 이르기까지 많은 다른 세포 유형, 사용 됩니다. 초기 2000 년대7까지 작은 생각 했던 특히 그들의 전형적인 방사상 형태를 선호 하 미디어 이다에 맞게 주어진 에 비보를 발견. 2011 년에 출판 한 프로토콜 같은 방사상 형태를 달성지 않습니다: 혈 청 자유로운 매체 이다3경작을 위해 최적화 된 사용 immunopanning 메서드를 호출. 이 메서드를 사용 하 여 갓 고립 된 뇌 세포는 대상 셀 형식 관련 세포 표면 단백질, 이다에 대 한 풍부 하 게 하는 항 체로 입힌 요리 시리즈에 노출 됩니다. 더는 비보에도 불구 하 고-immunopanned 이다의 형태와 식 프로필, 같은 생체 외에서 연구의 대다수는 여전히 MD 사이토 방법에 의존. MD 메서드는 간단 하 고 빠른, 문화의 첫 번째 날에 더 복잡 하 고 시간이 많이 걸리는 단계를 구성 하는 immunopanning 메서드 (더 이상 효소 소화 기간 등 다른 밀도, 자체, immunopanning 솔루션의 주의 레이어 링 및 여러 원심 분리 단계-모든 도금 하기 전에). 그러나, 보다 전문적인된 매체를 사용 하 여 AWESAM 메서드를 사용 하면 두 속도의 MD 메서드는 vivo에서제공-immunopanning 프로토콜의 형태 처럼.
전반적으로, AWESAM 프로토콜은 더 vivo에서공부 하는 데 유용-2D monocultures (immunostainings, immunoblots, 및 RNA 시퀀싱에 의해 이전 특징된4 )로 신경 및 다른 명과 격리에서 이다 처럼. 그것은 얇은 astrocytic 프로세스의 연구에 대 한 허용 하 고 자연 스러운 캘리포니아2 + 신호 (예를 들어, TIRF 현미경 검사 법에 의해 몇 군데) 막 가까이 이벤트 시각화를 위한 훌륭한 접근을 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>0.05 % 트립신 -EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td>37 &ordm에서 따뜻하게; C 사용 전 수조</td></tr><tr><td>0.25 % 트립신 -EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>37 &ordm에서 따뜻하게; C 사용 전 수조</td></tr><tr><td>B-27 보충제</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>50X 주식</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100X 재고</td></tr><tr><td>페니실린 / 스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>50 주식; 페니실린: 5000 U/ml; 스트렙토마이신: 5000 &마이크로; g/ml</td></tr><tr><td></td><td>L-글루타민이 없는</td><td></td><td>Gibco</td> 21103049</tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td></td> 41966029 <td></td></tr><tr><td>HBEGF</td><td>시그마</td><td>4643</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>1X 100 &뮤; m 나일론 셀 여과기</td><td>BD</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Trypan 블루</td><td>시그마</td><td>T8154&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 인큐베이터</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hera Cell 240i 세포 배양 인큐베이터</td><td></td></tr><tr><td>실험실 쉐이커</td><td>Heidolph</td><td>Rotamax 120&nbsp;</td><td>세포 배양 인큐베이터 내부 사용</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

vivo에서경작-murine 이다 빠르고, 간단 하 고 저렴 한 awesam 프로토콜을 사용 하 여 같은

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

AWESAM (는 low- e유도 stellate는 strocyte method 비용) 프로토콜 수반 vivo에서의 대량을 생성 하는 빠르고, 간단 하 고 저렴 한 방법-마우스와 쥐 사이토 monocultures 같은 : 뇌 세포는 서로 다른 뇌 영역에서 고립 될 수 있다 고 주 후에 세포 배양의, 비 astrocytic 셀 인큐베이터에 6 h에 대 한 통에 문화 요리를 배치 하 여 떨어져 동요는. 나머지 이다 (불리 NB + H) 사이토 관련 매체와 새로운 접시에 다음 passaged 있습니다. NB + H 혈 청 매체에 대신 사용 되는 헤 파 린 바인딩 EGF 같은 성장 인자 (HBEGF)의 낮은 농도 포함 합니다. NB + H, 성장 후 AWESAM 이다 방사상 형태와 기능은 괜 찮 프로세스 있다. 또한,이 이다 더 많은 비보에있다-같은 보다 이전에 게시 방법으로 생성 하는 이다 유전자 발현. 캘리포니아2 + 영상, 기 역학, 고 막 가까이 다른 이벤트 따라서 벌금 astrocytic 프로세스에서 생체 외에서 예를 들어, 라이브 셀 confocal 또는 TIRF 현미경을 사용 하 여 공부 될 수 있다. 특히, AWESAM 이다 또한 전시 자발적인 캘리포니아2 + 신호 이다에서 vivo에서유사한.

신경을 가진 공동 경작 하 고 NB + 매체에 성장 이다 문화 (그림 2)의 2 주 후 방사상 나타납니다. NB + 매체, 이외에 공동 경작된 이다 또한 아마 그들의 생존 및 형태학에 기여 하는 알 수 없는 신경 파생 된 요소에 노출 됩니다. 반면, 메릴랜드 이다 (후에 통과 하기 전에 다른 세포 유형 푸는) monocultures로 DMEM + 성장 다각형 2 주 후에 나타납니다. NB + H에서 떨고, 후 성장 하는 AWESAM 이다 문화의 2 주 후 많은 정밀한 프로세스와 방사상 나타납니다.
우리는 이전 AWESAM 이다 RNA 식 프로 파일은 이다에서 vivo에서 MD와 immunopanned 이다4에 비해의 가까이 보였다. 사이토 특정 단백질 ...

여기에 설명 된 AWESAM 프로토콜은 빠르고, 단순 하 고 저렴 한 방식으로 다른 뇌 세포 분리에서 murine 이다 경작에 최적입니다. AWESAM 이다 자발적인 캘리포니아2 + 신호, 형태학, 및 유전자 식 프로필 이다에서 vivo에서유사한 전시.

Vivo에서경작-Murine 이다 빠르고, 간단 하 고 저렴 한 AWESAM 프로토콜을 사용 하 여 같은

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

본 절차의 전반적인 목표는 간단하고 빠르며 경제적인 방법을 사용하여 생체 내(in vivo)와 유사한 성상교세포 단일 배양물을 생성하는 것입니다. 이 방법은 성상교세포의 물리적 방출 또는 흡수의 경제성 등 성상교세포 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 결과물로 얻은 세포들이 형태, mRNA 및 단백질 발현, 그리고 세포 간 칼슘 변동 측면에서 생체 내 성상교세포와 매우 유사하다는 점입니다.이 절차를 시작하려면, 해부 배지가 채워진 10 cm 페트리 접시 2개를 라미나 플로우 해부 후드 내의 얼음 위에 배치하여 해부 영역을 준비합니다. 분리할 각 뇌 영역마다 해부 배지 14 mL가 채워진 15 mL 튜브를 준비하여 얼음 위에 보관합니다. 그다음, 해부 도구에 70% ethanol을 분무하고 후드 내의 해부 현미경 옆에 배치합니다.배아 조직을 사용하는 경우, 먼저 자궁에서 배아를 꺼내어 배아낭을 엽니다. 즉시 가위로 머리 부분을 절단합니다. 모든 머리를 절단한 후, 미리 냉각시킨 해부 배지로 옮깁니다.머리가 배지에 잠기면, 핀셋으로 피부와 두개골을 열고 소뇌를 집어 제거합니다. 그런 다음 조심스럽게 뇌의 나머지 부분을 들어 올려 두개골 밖으로 꺼냅니다. 그 후, 피질을 아래에 있는 중뇌 구조로부터 분리합니다.포셉을 양쪽 뇌반 사이의 정중구(longitudinal fissure)에 넣고, 한쪽 뇌반의 피질과 중뇌 구조물 사이로 포셉을 이동시켜 각 뇌반을 집어 분리합니다. 이어서, 각 뇌반에서 모든 뇌수막을 제거하고 해마를 분리합니다. 해마 성상교세포가 필요한 경우, 각 해마를 ice 상에서 14 mL의 해부 배지가 채워진 15 mL 튜브로 옮깁니다.그 후, 성상교세포 생성에 사용할 피질 조직을 1 cubic milliliter 이하의 크기로 자릅니다. 그런 다음, 얼음 위에 놓인 해부 배지가 채워진 별도의 15 mL 튜브에 모든 피질 조직 조각을 수집합니다. 모든 조직 조각이 수집되면, 조각들이 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 기다립니다.그 다음, 배지를 가능한 한 많이 흡입하여 제거합니다. 이어서 0.05% trypsin EDTA 2-3 mL를 첨가하고, 샘플을 37 °C 항온수조에서 20분 동안 배양합니다. 이후, 튜브 바닥에 최소량의 액체와 함께 조직 조각들이 남도록 trypsin EDTA를 조심스럽게 흡입하여 제거합니다.다음으로, 미리 냉각시킨 해부 배지 5 mL를 첨가하여 남아 있는 trypsin EDTA를 씻어내고, 조직 조각들이 섞이도록 상단 튜브의 측면으로 피펫팅합니다. 그 후, 해부 배지를 흡입하여 제거하고 조직 조각들이 가능한 한 적은 양의 액체 속에 남도록 합니다. 미리 냉각시킨 해부 배지를 사용하여 이 세척 단계를 두 번 더 반복합니다.마지막 세척 단계 후, 상온의 D-Mem Plus 1 mL를 첨가하고 기포가 생기지 않도록 피펫팅하여 조직을 분쇄합니다. 성상교세포(Astrocytes)는 pH에 매우 민감하므로, 용액의 pH를 변화시킬 수 있는 기포 발생을 방지하는 것이 중요합니다. 다음으로, 50 mL 튜브 입구에 100 micron 세포 스트레이너를 배치하고, 미리 냉각된 D-Mem Plus 4.5 mL로 필터를 미리 적셔줍니다.분리된 조직 현탁액 1 mL를 세포 스트레이너 위에 피펫으로 분주하고, 세포를 세척하여 통과시키기 위해 미리 냉각시킨 D-Mem Plus 4.5 mL를 추가로 넣습니다. 박리 후 체외 배양 7일째에, D-Mem Plus가 담긴 세포가 들어 있는 10 cm 디쉬를 인큐베이터 내의 쉐이커에 놓고 110 RPM으로 6시간 동안 흔들어 줍니다. 6시간의 쉐이킹이 끝나기 20~30분 전에 1 XPBS, D-Mem Plus, NB+H, 그리고 0.25% tripsen EDTA를 항온수조에서 37 °C로 예열합니다.6시간 동안 진탕한 후, 쉐이커에서 배양 접시를 꺼내어 즉시 배지를 접시당 10 mL의 예열된 1 XPBS로 교체하십시오. 이어서 PBS를 제거하고 접시당 3 mL의 예열된 tripsen EDTA를 첨가하십시오. 그런 다음 샘플을 37 °C에서 4분 동안 배양하십시오.Western Blot 또는 RNA 시퀀싱을 위한 샘플을 준비하는 경우, Tripsen EDTA를 첨가하지 마십시오. 대신 PBS를 12 mL의 예열된 NB+H로 교체한 후, 배양물을 다시 인큐베이터에 넣으십시오. 그다음, 각 디쉬에 5 mL의 예열된 D-Mem Plus와 3 mL의 tripsen EDTA를 첨가하십시오.디쉬에서 세포를 피펫으로 옮겨 50 mL 튜브에 세포 현탁액을 수집합니다. 그 후, 세포 현탁액을 20 °C에서 3220 ×g로 4분 동안 원심분리합니다. 그런 다음, 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 미리 데워둔 1 mL의 NB+H에 다시 현탁합니다.이 이미지들은 G-camp가 도입된 ausam 성상교세포가 얇은 돌기를 포함한 성상교세포 네트워크 전체에서 자발적인 칼슘 이온 이벤트를 나타냄을 보여줍니다. 여기에서 칼슘 이온 파동이 서로 다른 시점의 이미지 속에서 왼쪽에서 오른쪽으로 여러 성상교세포를 통해 이동하며, 밝은 색상은 칼슘 이온 농도가 높은 영역을, 검은색 영역은 세포 외 영역을 나타냅니다. 이 그래프에서는 색상으로 표시된 영역의 칼슘 이온 농도 변화가 시간에 따라 G-camp 형광 강도 추적선으로 표시되어, 칼슘 이온 신호 파동이 여러 성상교세포에 걸쳐 어떻게 확산되는지를 보여줍니다.이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 1시간 15분 만에 완료할 수 있습니다. 본 절차 이후에는 transfection 또는 바이러스 도입(viral transduction) 실험과 결합한 살아있는 세포 이미징(life cell imaging)과 같은 다른 방법들을 수행하여, 성상교세포 막에서 어떤 사건이 발생하는지와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 간단하고 빠르며 경제적인 방식으로 in vivo와 유사한 성상교세포 운동 배양물을 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 쥐의 피질에서 1차 성상세포를 배양하는 기술을 보여줍니다. 피질은 기계적으로 해리되어 균질한 신경교세포 현탁액을 얻은 다음 폴리펩타이드로 코팅된 플레이트에 도금되어 성상세포의 선택적 증식을 촉진합니다. 그 후, 성상세포는 효소를 통해 플레이트에서 해리되고 새로운 배지로 전달되어 순수한 성상세포의 배양을 가능하게 합니다.

쥐 새끼 뇌에서 성상세포의 1차 배양 생성

이 비디오는 다른 뇌 세포와 분리하여 쥐 성상세포를 배양하는 간단한 방법을 보여줍니다. 배양 중에 성상세포 특이적 배지를 사용하고 비성상세포 세포의 부착을 억제함으로써 이 방법은 성상세포를 선택적으로 배양합니다. 이러한 배양된 성상세포는 미세한 과정을 통해 성상 형태를 나타냅니다.

쥐 성상세포를 분리하고 배양하는 간단한 기술

이 비디오는 변형 인자를 뉴런으로 발현하는 성상세포의 직접 재프로그래밍을 보여줍니다. 형질전환 인자는 성상세포에서 뉴런으로의 전환을 촉진하는 일련의 분자 이벤트를 촉발합니다. 이 과정은 신경 분화 매체를 통해 특정 제제와 보충제를 공급함으로써 더욱 뒷받침됩니다.

마우스 성상세포를 뉴런으로 직접 뉴런 재프로그래밍(Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes into Neurons)

Astrocytes 정상 뇌 개발 및 기능, 및 중앙 신경계 수리를 위해 필수적인 기초 생물학적 과정에 참여하는 다양한 세포로 인정되었습니다. 여기 중추 신경계 세포의 주요 클래스의 생물학을 연구하는 순수 마우스 astrocyte 문화를 얻기 위해 빠른 절차를 제시한다.

마우스 두피 Astrocytes의 분리와 문화

플록스, 조건부 발암성 대립유전자로 조작되고 바이러스 Cre 매개 재조합을 통해 형질전환된 마우스에서 채취한 표현형 야생형 성상세포와 신경 줄기세포는 syngeneic, immune-competent littermate의 뇌에 형질전환된 세포의 orthotopic 주입에 의해 in vitro 및 in vivo에서 성상세포종 발병기전을 모델링하는 데 사용할 수 있습니다.

모델링 성상 세포종 병인 체외와 생체 대뇌 피질의 성상이나 조건, 유전자 조작 쥐에서 신경 줄기 세포를 사용하여

우리는 수정하고 흥분 대뇌 피질의 뉴런 (12)에 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)의 빠른 재현, 효율적인 분화를 설명하는 이전에 게시 된 프로토콜을 구현합니다. 특히, 우리의 수정은 네트워크 레벨에서의 전기 생리 학적 특성을 측정하기위한 마이크로 - 전극 어레이의 신경 세포 밀도 및 사용의 제어를 허용한다.

마이크로 전극 배열에 네트워크 활동을 측정하기위한 유도 다 능성 줄기 세포의 빠른 신경 세포의 분화

허 혈 성 뇌졸중 공부 하기 어려운 어떤 영향을 받는 뇌 영역에 이다의 구체적인 기여 산소 포도 당 부족 (지도부)에 노출 하는 복잡 한 이벤트입니다. 이 문서는 고립 된 이다 그들의 반응성 및 확산 지도부 조건 하에서 연구 하는 방법론을 소개 합니다.

사이토 반응성 및 확산에서 체 외에 허 혈 성 같은 조건 모니터링

우리는 hSOD1G93A 쥐 모델에서 근 위축성 측삭 경화증의 병태 생리학에 대한 연구를 위해 세포 내Ca 2+의 타임 랩스 비디오 이미징을 위해 쥐 피질에서 신경교 세포, 성상 세포 및 미세 아교 세포의 1 차 배양을 준비하는 방법에 대한 프로토콜을 제시합니다.

쥐 성상 세포와 미세 아교 세포의 1 차 배양과 근 위축성 측삭 경화증 연구에서의 사용

여기서 우리는 출생 후 마우스의 중추 신경계의 다른 영역에서 유래 된 성상 세포의 고도로 농축 된 배양물을 생성하고 전사 인자의 강제 발현에 의해 기능적 뉴런으로 직접 전환시키는 상세한 프로토콜을 설명합니다.

마우스 성상세포의 분리 및 직접 뉴런 리프로그래밍

이 프로토콜은 신경(면역)학 연구를 위해 배아 17일 마우스 뇌에서 중추 신경계 세포 배양을 생성하는 독특한 방법을 제시합니다. 이 모델은 RT-qPCR, 현미경, ELISA 및 유세포 분석을 포함한 다양한 실험 기술을 사용하여 분석할 수 있습니다.

감염 및 선천성 면역을 연구하기 위해 배아 쥐 뇌에서 혼합 신경 세포 및 신경교 세포 배양 확립

이 프로토콜은 성체 마우스 척수에서 정제된 성상교세포와 미세아교세포를 분리하여 RNA 분석 및 세포 배양과 같은 후속 응용 분야를 용이하게 합니다. 여기에는 분리된 세포의 품질과 수율을 모두 향상시키기 위해 고안된 상세한 세포 해리 방법 및 절차가 포함됩니다.

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies( 체외 분석 및 전사체 연구를 위한 성인 마우스 척수에서 순수 성상교세포 및 미세아교세포의 분리)

배우세요 AWESAM 프로토콜을 사용하여 쥐 뇌에서 별아교세포를 빠르고 간단하게 배양하는 방법입니다. 이 기법은 생체와 유사한 형태학적 특성 및 칼슘 신호를 유지하여 신경과학 연구에 활용됩니다.

Vivo에서경작-Murine 이다 빠르고, 간단 하 고 저렴 한 AWESAM 프로토콜을 사용 하 여 같은

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