Name: 반복된 오존 노출에 의해 쥐에 만성 폐쇄성 폐 질환 모델의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 배우세요 반복된 오존 노출을 통해 쥐에서 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD) 동물 모델을 생성하는 방법을. 이 모델은 COPD의 병리학적 과정을 재현하며 약물 선별 연구에 활용됩니다.

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저자가이 프로토콜에서 µCT 평가와 기술 지원 씨 Boyin 진 (상하이 보건 임상 센터)에 게 감사를 표현 하 고 싶습니다.

참고: 모델에 OE를 생성 하 고 이전에 보고 된 연구 30 , , 31 32에서 사용. 모든 동물 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 상하이 교통 대학에 의해 승인 했다.
 1. 쥐 아래 <ol><li>집 병원 체-무료, 7-를 9 주-오래 된 여성 BALB/c 마우스 동물에 개별 통풍이 장에 시설 제어 온도 (20 ℃)와 습도 (40-60%). 12 h 빛 및 시설에 12 h 어두운 주기를 제공 합니다. 음식을 제공 하 고 광고 libitum 물.</li>
</ol> 2. 오존 또는 공기 노출 <ol><li>씰링 (예: Perspex) 아크릴 상자에 전기 발전기로 생성 오존. 상자 안쪽에 연결 되는 공기 환기 파이프를 통해 작은 공기 송풍기를 사용 하 여 상자에서 공기를 불어. 오존 프로브를 사용 하 여 상자에서 오존의 농도 모니터링 합니다. 상자에서 오존의 농도 당 2.5 부분에 도달할 때까지 기다려 백만 (ppm). 
	참고: 오존 프로브 켜거나 오존 생성기를 자동으로 전환할 수 있습니다 및 2.5 ppm에 상자에서 오존 수준을 유지할 수 있습니다.</li>
	<li>오존의 수준에 도달 하면 2.5 ppm 상자에 마우스를 놓습니다. 계속 쥐 3 h 상자에서 각 시간 오존 노출. 
	참고: 상자 3 h 동안 켜거나 오존 생성기를 자동으로 전환 하 여 2.5 p p m의 오존 레벨을 유지할 수 있고 상자 마우스에 의해 생산 되는 CO 2 부.</li>
	<li>7 주 동안 주당 (한 번 매 3 일) 두 오존 노출 (3 h 지속 각 노출)를 주고, 동시에 및 동일한 기간 동안에 컨트롤 마우스를 노출.</li>
</ol> 3. 마이크로-단층 <ol><li>주 7의 끝에, anesthetize pelltobarbitalum natricum의 복 주사와 쥐 (1%, 0.6-0.8 ml/100 g) 마우스 하지 않습니다 보고 개별 상황에 따라 복용량을 조정 발가락을 꼬집어. 모니터 응답 및 꾸준한 호흡 주파수;에서 마우스를 계속 아무 자발적인 동의 절차 동안 존재 다는 것을 확인.</li>
	<li>마이크로 계산 된 단층 촬영 (µCT)의 약 실에 있는 마 취 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>보정 표준 프로토콜 및 제조 업체를 사용 하 여 µCT &#39; s 지시. 50 x 선 튜브 설정 k v 및 450 µ A 전류. 
	참고: 모두는 마우스 주위를 회전 하는 x-선 및 검출기.</li>
	<li>µCT 분석 한 조각, 300 ms의 노출 시간과 0.093 m m의 슬라이스 두께 0.092 mm의 효과적인 픽셀 크기 515 계획을 획득 하 여 수행.</li>
	<li>인수 이미지 소프트웨어를 사용 하 여 폐를 재구성 합니다. -750 및-550 Hounsfield 단위, 최소 및 최대는 회색조의를 각각 설정 하 여 회색 음영 이미지의 밝기를 조정. 
	참고: 소프트웨어 자동으로 폐 실질과 낮은 감쇠 지역 (LAA) 34 , 35의 볼륨 계산 합니다.</li>
	<li>총 폐 볼륨에 의해 라 볼륨을 나누어 라 (라 %)의 비율을 계산.</li></ol>
 4. 디딜 방 아 테스트 <ol><li>주고는 실행 디딜 방 아 기계입니다. 참고에 10 분 동안 10 m/분의 속도에 적응 한 쥐 테스트: 전기는 항상 떨어져 절차 실시 되는 때.</li> <li>관리는 피로 마우스를 테스트 합니다.
	<li>워밍업 5 분에 대 한 10 m/min의 속도로 마우스</li> <ol>
		<li>10 분에 대 한 15 m/분 속도 증가</li>
		<li>운동 강도 증가: 5 m/min, 20 m/분에서 시작 하 여 속도 증가 마우스까지 30 분 마다 36 실행을 계속할 수 없습니다.</li>
	</ol></li> <li>거리가 고 실행 시간 피로 거리 및 피로 시간으로 각각 총 기록.</li></ol>
 5. 폐 기능 측정 <ol><li>Anesthetize pelltobarbitalum natricum의 복 주사와 쥐 (1%, 0.6-0.8 ml/100 g) 마우스는 볼을 개별 상황에 따라 복용량을 조정 발가락 핀치에 응답 하지 및 쥐 유지 자발적인 호흡. 모니터와 꾸준한 호흡 주파수;에서 마우스를 계속 될 때까지 기다립니다 아무 자발적인 동의 절차 동안 존재 다는 것을 확인.</li>
	<li>신중 하 게 쥐를 tracheostomize 하 고 컴퓨터 제어 통풍 기에 연결 된 몸 plethysmograph에 그들을 배치. 
	참고: 환기 proximally endotracheal 튜브에 있는 밸브를 통해 제어 됩니다. 설치 다른 자동 기동, 준 정적 압력 볼륨의 책략 및 빠른 흐름 볼륨의 책략을 포함 하 여 제공 합니다.</li>
	<li>호흡 주파수 150 호흡/분 일반 호흡 패턴까지 압력 제어 환기를 통해 마 취 마우스의 평균 고 각 호흡 사이클에서 완전 한 만료 획득.</li>
	<li>는 plethysmograph에서 생성 하는 부정적인 압력을 사용 하 여 장치와 유사 정적 압력-볼륨 책략을 수행.</li>
	<li>는 FVC는 FEV를 기록 준 정적 압력-볼륨 루프 내 빠른 흐름 볼륨 책략을 수행 합니다. + 30 cm H 2로 폐를 팽창 O 및 즉시 이후에 만료 될 때까지 잔여 볼륨-30 cm H 2 o. 기록에 첫 번째 25, 50, 및 증발 기 (FEV 25의 75 ms에 FEV를 적용 하는 매우 부정적인 압력에 연결 FEV 50 및 FEV 75, 각각). 최적이 아닌 훈련을 거부 한다. 모든 단일 마우스를 각 테스트에 대 한 모든 숫자 매개 변수에 대 한 신뢰할 수 있는 의미를 세 허용 훈련의 최소 수행.</li>
</ol> 6. BALF 컬렉션 <ol><li>pelltobarbitalum natricum와 터미널 마 취에 따라 ((1%, 1.8-2.4 ml/100 g) 마우스 발가락 핀치에 응답 하지 않는 및 숨을 잃게 참조 하는 개별 상황에 따라 복용량을 조정), 게는 1 m m 직경 endotracheal 튜브 및 다음 검색 BALF 10 통해 PBS의 2 mL와 쥐.</li>
	<li>풀 검색 된 게 aliquots 및 4 ° C와 10 분 대 한 250 x g에서 원심</li>
	<li>즉각적인 사용을 위해 상쾌한을 수집 하 고 저장-80 ° C 또는 액체 질소에서 나머지.</li>
	<li>는 hemocytometer를 사용 하 여 셀의 총 수를 계산 하.</li>
	<li>PBS에 다음 스핀 (1400 x g, 6 분) 250 µ L 슬라이드 회전자 원심 분리기를 사용 하 여 슬라이드에 resuspended 셀의 셀 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>제조 업체에 따라 슬라이드에 세포 적용 라이트를 얼룩 &#39; s 프로토콜.</li>
	<li>마우스 당 200 셀, 400 배 확대;에서 표준 형태에 따라 세포 또는 호 중구, 셀을 식별 하 고 그들의 숫자의 개수 계산.</li>
</ol> 7. 심장 혈액 샘플링 <ol><li>심장 찔린 통해 혈액 수집 1.5 mL 튜브에 그것을 로드 하 고 30 분에 대 한 얼음에 그것을 유지</li>
	<li>2000 g x 4에서 5 분에 대 한 혈액 샘플을 원심 ° c.</li>
	<li>새 튜브를 상쾌한 (혈 청)을 전송 하 고-80 ° C 또는 액체 질소에 저장.</li>
	<li>IL 1β에 대 한 혈 청을 준비 IL-10, 및 각각 ELISA 키트를 사용 하 여 TNF-α 탐지 테스트.</li>
</ol> 8. 폐 형태학 분석 <ol><li>부 폐와 쥐에서 tracheas.
	<ol><li>희생 후 즉시 외과 보드에 각 안락사 마우스 위치.</li>
		<li>멀리는 platysma 해 부 및 시각화 하 고 액세스 tracheal 반지 앞쪽 tracheal 근육.</li>
		<li>열기는 흉부를 캐비티입니다. 폐와 기관지, 해 부 하지만 폐에서 마음을 분리 하지 마십시오.</li>
	</ol>
	</li> <li>PE90 폴 리 에틸렌 튜브를 통해 4 %paraformaldehyde 포함 된 주사기에 연결할 endotracheal 테. 
	주의: Paraformaldehyde 독성이 있다. 장갑, 안전 안경 착용 하 고 연기 후드 내부 솔루션을 사용 하 여.</li>
	<li>Endotracheal 카 테 터를 통해 4 %paraformaldehyde (10 방울, ~ 200 µ L)를 사용 하 여 완전히 폐를 부 풀 려. 인플레이션의 완료 후에 심장 제거.</li>
	<li>유지 적어도 4 헤에 대 한 4 %paraformaldehyde 10 mL를 포함 하는 15 mL 튜브에 폐</li>
	<li>는 파라핀에 폐를 포함합니다. 파라핀 블록 회전 톰으로 단면 5 µ m 섹션을 얻을. 단면, 하는 동안 폐 조직 기관지 트리 영역 내에서 최대 표면적 노출.</li>
	<li>형태학 분석 수행 되며 고 오신 (H &#38; E) 섹션에 얼룩.</li>
	<li>밝은 분야 직 립 현미경 (대물 렌즈, 20 X, 노출 시간, 1.667 ms) 섹션 이미지.</li>
	<li>두 수 사관 치료 프로토콜을 눈 멀게 하는 조직학 단면도 독립적으로 계산 했습니다. 간 치경 septal 벽의 거리를 측정 하기 위한 매개 변수로 평균 선형 절편 (L m)를 사용 합니다. 다음 단계를 사용 하 여 L m 결정: <ol><li>포토샵에서 섹션의 이미지를 열고 5 550 µ m 긴 라인 이미지에 reticule 그리드를 그립니다.</li>
		<li>폐 포의 수를 계산 하는 격자 라인에 걸쳐.</li>
		<li>는 그리드 라인의 길이 폐 포의 수로 나누어 L m을 계산 합니다. 정량화, 마우스 당 5 섹션 이미지. 각 섹션 (하나의 이미지 필드 당)의 10 개의 이미지를 수집 하 고 무작위로 평가. 필드 선택, 동안 앞 또는 다른 방향에서 한 필드를 이동 하 여 항공 및 선박 분야 방지. 
		참고: 데이터 평균 ± S.E.M.로 표시 됩니다. 유엔 쌍체 t 검정은 공기에 노출 된 쥐와 쥐 오존 노출 사이 비교를 위해 실시 됐다. 각 그룹의 3 개의 동물 상당한 차이 계산 하기 위해 사용 되었다. P-값이 &#60; 0.05 중요 하 게 고려 되었다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Z.W.S.와 트 면은 현재 직원 및 셀룰러 의학 그룹의 스톡 옵션 보유자 (나스닥: CBMG). 다른 작가 들은 아무 경쟁 관심사를 선언 합니다.

이 연구에서 우리는 새로운 COPD 모델을 생성 하기 위한 신뢰할 수 있는 방법 제시. (즉, LPS 또는 PPE 모델) 다른 모델에 비해,이 OE 모델이 COPD 환자 들의 병 적인 과정. 담배 연기 때문에 인간의 환자40에서 COPD를 일으키는 주요 유해 물질, CS 모델 가장 인기 있는 COPD 모델41,42남아 있습니다. 그러나 CS 모델 3-12 개월 연구를 필요로 하는, &#38; D 기간 새로운 약물에 대 한. CS 모델에 비해, 현재 OE 모델 6-8 주를 생성 기간을 감소 시킨다. 우리는 우리의 이전 연구30,,3132에 오존 노출의 6 주 후 남성 생쥐에서 기종 관찰. 이 연구에서 우...

폐기 종 등 만성 기관지염 COPD 20201,2세계에서 죽음의 세 번째 주요 원인 것으로 추정 되었다. 40 세 이상 인구에서 COPD의 잠재적인 발생률 남성에서 12.7%와 8.3%3다음 40 년 이내 여성에서 추정 된다. 아니 약물 COPD 환자4진보적인 악화를 현재 사용할 수 있습니다. COPD의 신뢰할 수 있는 동물 모델 뿐만 아니라 질병 병리학 과정의 모방을 요구 하지만 짧은 세대 기간 필요. LPS 또는 PPE 유도 모델을 포함 하 여 현재 COPD 모델 기종 같은 증상5,6을 유도할 수 있다. 폐를 생산 하는 단일 관리 또는 쥐 또는 쥐에 bronchoalveolar 게 액체 (BALF), 증가 프로-염증 성 중재자 (예를 들어, TNF-α 및 IL 1β) BALF 또는 혈 청에서 표시 된 neutrophilia LPS 또는 PPE의 1 주일 동안 도전 parenchymal 파괴 확대 공기 공간, 고도 공기5,6,7,,89,10. 그러나, LPS 또는 PPE 인간의 COPD의 원인이 되지 않습니다 및 따라서 병 적인 과정11를 모방 하지 않습니다. CS 유발 모델 지속적인 공기 흐름 제한, 폐 parenchymal 파괴, 생산과 기능적 운동 능력을 감소. 그러나, 전통적인 CS 프로토콜 COPD 모델12,13,,1415를 생성 하기 위해 3 개월 이상 필요 합니다. 따라서, 두 가지 요구 사항을 충족 하는 새로운, 더 효율적인 동물 모델을 생성 하는 것이 중요 하다.
최근, 담배 흡연, 뿐만 아니라 대기오염과 직업적 노출 되고있다 COPD16,,1718의 일반적인 원인. 오존, 주요 오염 물질의 한으로 (비록 아니라 대기오염의 주요 구성 요소), 수 직접 호흡기로 반작용 하 고 어린이 젊은 성인19,20,21의 폐 조직 손상 ,,2223,,2425. LPS, PPE, CS, 등 다른 자극으로 오존, 심각한 폐 산화 스트레스와 DNA 손상의 생 화 확 적인 통로의 참여 하 고 개시와 COPD26,27의 승진에 연결. 또 다른 요인은 일부 COPD 환자의 증상 오존, 오존이 폐 기능18,,2829을 방해할 수 있습니다 나타내는 노출 후 악화 이다. 따라서, 우리는 반복 해 서 7 주;에 대 한 오존의 높은 농도에 쥐를 노출 하 여 새로운 COPD 모델 생성 이 공기 결함 및 이전 조사30,,3132의 그들과 유사 하 폐 parenchymal 손상 귀착되는. 우리이 연구에서 여성 쥐 OE 프로토콜을 확장 하 고 우리의 이전 연구30,,3132남자 쥐에서 관찰 하는 기종 성공적으로 재현. 때문에 남성에서 COPD 사망률은 감소 하지만 많은 국가33여성 증가, 여성에서 COPD 모델 메커니즘을 연구 하 고 필요한 여성 COPD 환자에 대 한 치료 방법을 개발 하. 모든 성별에 OE 모델의 적용 COPD 모델로 사용 하는 추가 지원을 빌려준다.

<table><tbody><tr><td>BALB/c 마우스</td><td>Slac Laboratory Animal, Shanghai, China</td><td>N/A</td><td>7-9주 된 암컷 BALB/c 마우스가 이 연구에 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>개별 환기 케이지</td><td>Suhang, Shanghai, China</td><td>모델 번호: MU64S7</td><td>케이지는 동물 시설에서 쥐를 수용하는 데 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>씰링 방풍 상자</td><td>Suhang, Shanghai, China</td><td>N/A</td><td>상자는 오존 발생기를 담는 데 사용되었습니다. 생쥐는 상자 안의 오존에 노출되었습니다.</td></tr><tr><td>전기 발전기</td><td>Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Germany</td><td>모델 500&nbsp;</td><td>이 장치는 오존을 생성하는 데 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>오존 프로브</td><td>ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, UK</td><td>오존 300</td><td>이 장치는 오존 생성을 모니터링하고 제어하는 데 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>Pelltobarbitalum natricum</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>P3761</td><td>마우스는 pelltobarbitalum natricum의 복강 내 주사로 마취되었습니다.</td></tr><tr><td>Micro-Computed Tomography</td><td>GE Healthcare, London, ON, Canada</td><td>RS0800639-0075</td><td>이 장치는 폐의 이미지를 획득하는 데 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>Micro-view 2.01 ABA 소프트웨어</td><td>GE Healthcare, London, ON, Canada</td><td>Micro-view 2.01&nbsp;</td><td>이 장치는 폐를 재건하고 폐의 부피, LAA를 분석하는 데 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>러닝머신 기계&nbsp;</td><td>Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, China</td><td>DSPT-208</td><td>이 기계는 피로 시험을 위해 usd였습니다.</td></tr><tr><td>신체 혈량계</td><td>eSpira&trade; Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK Forced</td><td>Manoeuvres System</td><td>이 장치는 폐활량 측정 폐 기능을 테스트하는 데 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>인공호흡기</td><td>eSpira&trade; Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK Forced</td><td>Manoeuvres System</td><td>이 장치는 폐활량 측정 폐 기능을 테스트하는 데 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>슬라이드 스피너 원심분리기</td><td>Denville Scientific, Holliston, MA, USA</td><td>C1183&nbsp;</td><td>BALF 세포를 슬라이드에 회전시키는 데 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>Wright Staining</td><td>Hanhong, 상하이, 중국</td><td>RE04000054</td><td>&nbsp; 그것은 현탁 된 BALF에서 대식 세포, 호중구를 염색하는 데 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific, Horsham, PA, USA</td><td>4000</td><td>세포를 계수하는 데 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>IL-1&베타;</td><td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td><td>ab100704</td><td>그들은 혈청의 각 인자를 테스트하는 데 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>IL-10</td><td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td><td>ab46103</td><td>그들은 혈청의 각 인자를 테스트하는 데 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>TNF-&알파;</td><td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td><td>ab100747</td><td>그들은 혈청의 각 인자를 테스트하는 데 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>파라포름알데히드&nbsp;</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>P6148</td><td>폐는 4% 파라포름알데히드로 팽창되었습니다.</td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Hualing, Shanghai, China</td><td>56#</td><td>폐를 삽입하는 데 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>로터리 마이크로톰</td><td>Leica, Wetzlar,&nbsp; 독일 헤센</td><td>RM2255</td><td>폐를 절단하는 데 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>Hgaematoxylin 및 Eosin(H& E) 염색 용액</td><td>Solarbio, 베이징, 중국</td><td>G1120</td><td>H & 형태 분석을 위해 E 염색을 수행했습니다.</td></tr><tr><td>정립 명시야 현미경</td><td>Olympus, Center Valley, PA, USA</td><td>, CX41</td><td>H&를 이미지화하는 데 사용되었습니다. E 염색 슬라이드.</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop 12</td><td>Adobe, San Jose, CA, USA</td><td>Adobe Photoshop 12</td><td>H&의 폐포 수를 계산하는 데 사용되었습니다. E 스테인드 이미지.</td></tr><tr><td>GraphPad prism 5</td><td>Graphpad Software Inc., San Diego, CA</td><td>GraphPad prism 5</td><td>데이터 분석 및 그림 제작에 사용되었습니다.</td></tr></tbody></table>

반복된 오존 노출에 의해 쥐에 만성 폐쇄성 폐 질환 모델의 생성

Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure

만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 지속적인 공기 흐름 제한 및 폐 parenchymal 파괴에 의해 특징입니다. 그것은 인구 고령 화에 매우 높은 발생률 있습니다. 의약품에 대 한 COPD 초점 주로 증상 수정; 현재 기존의 치료 따라서, 새로운 치료법의 개발이 절실히 필요 합니다. COPD의 자격 갖춘된 동물 모델 기본 메커니즘을 특성화 하는 데 도움이 수와 새로운 약물 검사에 사용할 수 있습니다. 현재 COPD 모델, lipopolysaccharide (LPS) 또는 돼지 췌 장 elastase (PPE)-유도 기종 모델, COPD 모양의 병 변 폐와 기도에서 생성 하지만 그렇지 않으면 인간의 COPD의 병 인을 유사 하지 않습니다. 담배 연기 (CS)-유도 모델 뿐만 아니라 호흡기 시스템에 COPD와 같은 장애를 시뮬레이션 하지만 그것은 또한 인 간에 있는 COPD를 일으키는 주요 유해 물질 중 하나에 기반 하기 때문에 가장 인기 있는 중 하나에 남아 있다. 그러나, CS 유발 모델의 시간과 노동 집약적인 측면 극적으로 새로운 약물 검사에 응용 프로그램을 제한합니다. 이 연구에서 우리는 성공적으로 오존의 높은 수준에 쥐를 노출 하 여 새로운 COPD 모델 생성. 이 모델은 다음 설명: 1) 강제로 내쉬는 숨의 볼륨 25, 50, 및 75/강제 중요 한 용량 감소 (FEV25/FVC, FEV50/FVC, 고 FEV75/FVC), 폐 기능;의 악화를 나타내는 2) 확대 폐 폐 포, 폐 parenchymal 파괴; 3) 감소 피로 시간과 거리; 그리고 4) 염증 증가. 함께 찍은, 이러한 데이터는 오존 노출 (OE) 모델은 오존 노출 과도 COPD의 etiological 요인 중 하나는 인 간에 게 유사한 이므로 신뢰할 수 있는 동물 모델을 보여 줍니다. 또한, 그것은 단지 6-8 주, 3-12 개월 OE 모델 COPD 연구를 위한 좋은 선택 일지도 모 르다 나타내는 담배 연기 모델을 유도 해야 하는 반면 OE 모델을 만드는 데 우리의 이전 작업에 기반 했다.

각 그룹의 3 차원 µCT 이미지의 예는 그림 1는에 표시 됩니다. 오존 노출 쥐 상당히 큰 총 폐 볼륨 했다 (그림 1는 b)와 라 %그림 1(c) 보다 공기 노출 제어 마우스. 오존 노출31,32의 6 주 후 폐 볼륨 및 LAA % 상승 된 남아. 증가 폐 볼륨 및 LAA % 기종 표현 형을 나타냅니다. 그림 2는 에 폐 치경 확대의 예 기종 형성을 보여 줍니다. 평균 선형 절편 (Lm) 증가 오존에 노출 된 생쥐 (<strong c...

이 연구는 반복적으로 오존의 높은 농도에 쥐를 노출 하 여 새로운 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 동물 모델의 성공적인 세대를 설명 합니다.

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high ...

본 실험의 전반적인 목표는 마우스에 오존 노출(OE)을 통해 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)을 유도하는 것입니다. 이 새로운 OE 모델은 COPD의 기저 기전을 규명하는 특성 분석에 활용될 수 있으며, 신약 스크리닝에 사용될 수 있습니다. 이 OE 모델의 주요 장점은 COPD 환자의 병리학적 과정을 재현한다는 점입니다.이는 단 6주에서 8주 만에 생성될 수 있습니다. 본 실험 절차의 시연은 저희 그룹의 연구원인 Weijaian Sang이 진행하겠습니다. 오존을 생성하려면 전기 발생기와 소형 송풍기를 사용하여 공기를 밀폐된 Perspex 박스 밖으로 불어내야 하며, 이때 박스 내외부에 연결된 공기 배출 파이프를 통해 공기를 배출하고 오존 프로브를 사용하여 박스 내 오존 농도를 모니터링하십시오.오존 농도가 2.5 ppm에 도달하면 마우스를 박스 안에 넣고 3시간 동안 노출시킵니다. 7주 차 마지막에 표준 프로토콜에 따라 마이크로 컴퓨터 단층촬영(micro-computed tomography)으로 오존 처리된 동물을 영상화합니다. 폐 피로도와 같은 오존 유도 변화 및 기능적 능력을 테스트하기 위해, 먼저 트레드밀에서 분당 10 m의 속도로 마우스의 워밍업을 실시합니다.5분 후, 속도를 분당 15m로 높여 10분 동안 유지합니다. 마우스가 더 이상 달릴 수 없을 때까지 30분마다 속도를 분당 5m씩 계속해서 높입니다. 각 동물의 총 주행 거리와 주행 시간을 각각 피로 거리와 피로 시간으로 기록합니다.오존에 노출된 동물의 폐 기능을 측정하기 위해, 마취된 마우스를 컴퓨터 제어 인공호흡기가 연결된 전신 플레티스모그래프(body plethysmograph)에 넣습니다. 규칙적인 호흡 패턴과 각 호흡 주기마다 완전한 호기가 이루어질 때까지 압력 제어 환기를 사용하여 마취된 동물에게 분당 150회의 평균 호흡 빈도를 유지하도록 합니다. 그런 다음, 최적이지 않은 기동은 제외하고 호기 시작 후 처음 25, 50, 75ms 동안의 강제 호기량을 기록합니다.종말 마취 후, 직경 1 mm의 기관내 튜브를 사용하여 회당 1 mL의 PBS로 동물을 2회 세척합니다. 각 동물로부터 회수된 세척액 분획을 모아 원심 분리하고, 상층액을 액체 질소에 수집합니다. 펠릿을 신선한 PBS에 재현탁하여 세포 수를 측정하며, 마우스당 두 개의 홀더에 현미경 슬라이드, 필터 카드 및 깔때기를 설치합니다.재현탁한 세포 약 100 내지 125 µL를 각 깔때기에 추가합니다. 홀더를 사이토 센트리퓨지(cyto centrifuge)에 장착하고 세포를 슬라이드 위에 원심 분리합니다. 그 다음 제조사의 지침에 따라 세포에 적절한 염색액을 처리하고, 400배 배율 하에서 마우스당 200개의 세포를 계수합니다.심장 혈액 채취를 위해, 오존에 노출된 동물로부터 심장 천자를 통해 약 500 µL의 혈액을 수집합니다. 그리고 얼음 위에 놓인 1.5 mL 튜브에 혈액을 넣습니다. 얼음 위에서 30분 후, 혈액 샘플을 원심분리하고 혈청 상층액을 새 튜브로 옮겨 액체 질소에 보관합니다.샘플은 나중에 표준 프로토콜에 따른 ELISA를 통해 혈청 사이토카인 발현 수준을 평가하기 위해 해동할 수 있습니다. 폐 형태 측정 분석을 위해, 심장 샘플링 후 첫 번째 마우스를 앙와위로 눕힙니다. 그런 다음 흉강을 열고 활경근과 전기관 근육을 절개하여 기관륜에 접근합니다.심장을 폐에서 분리하지 않은 상태로 폐와 기관을 적출합니다. 다음으로 PE90 폴리에틸렌 튜브를 사용하여 기관 내 카테터를 4% 포름알데히드가 들어있는 주사기에 연결하고, 약 200 µL의 파라포름알데히드로 폐를 완전히 팽창시킵니다. 그런 다음 10 mL의 신선한 4% 포름알데히드가 들어있는 15 mL 튜브에 폐를 넣고 최소 4시간 동안 고정합니다.마이크로 컴퓨터 단층촬영(microcomputed tomography)으로 평가한 결과, 오존에 노출된 생쥐는 주변 공기에 노출된 대조군 동물보다 전체 폐 부피와 저감쇠 영역(low attenuation area)의 비율이 유의하게 더 컸습니다. 폐기종 표현형은 또한 확장된 폐포와 증가된 평균 선형 절편(mean linear intercepts)을 통해 확인되었습니다. 플레티스모그래프(plethysmograph)를 이용한 폐 기능 평가는 오존 노출 생쥐에서 감소한 모든 파라미터가 만성 폐쇄성 폐질환 환자에게서 관찰되는 전형적인 폐 기능 결함과 일치함을 보여줍니다.또한, 오존 노출은 운동 내성 검사에서 피로 시간과 피로 거리를 유의하게 감소시킵니다. 오존 처리된 동물은 대식세포와 호중구를 포함한 염증 세포의 유의한 증가와 더불어 IL-10의 유의한 감소 및 IL-1 beta와 TNF alpha의 증가를 보이며, 이는 오존 노출 모델이 인간의 만성 폐쇄성 폐질환과 유사한 증상을 재현함을 입증합니다. C57 BR6 마우스와 같은 다른 계통의 마우스에 이 절차를 적용하여 이러한 OE 모델을 생성할 수 있습니다. 이 기술의 개발은 폐 질환 분야의 연구자들이 COPD의 근본적인 기전을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 사용하는 것은 위험할 수 있으므로, 이 시약을 다룰 때는 항상 장갑과 보안경을 착용하고 흄 후드 내에서 용액을 사용하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

SCIREQ Inc의 몬트리올, 품질 관리, 현재의 프로토콜은 호흡 역학의 측정​​뿐만 아니라 강제 진동 기술을 사용하여 마우스의 흡입 메타 콜린에 대한기도 응답의 평가 (flexiVent을 실행하는 데 필요한 절차에 대한 자세한 단계별 설명을 제공합니다 , 캐나다).

강제 진동 기술을 사용하여 마우스의 호흡기 시스템 역학의 평가

우리는 마우스 모델에서 지속적인 장기 만성 녹농균기도 감염을 확립하는 한천 비즈 방법을 서술.

장기 만성<em&gt; 녹농균</em마우스의&gt;기도 감염

이 프로토콜의 목표는 COPD의 쥐 모델에서 만성 폐 병리학을 정량화하는 자동화된 방법을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜에는 생쥐를 담배 연기(CS)에 노출시키고, 폐 기능을 측정하고, 폐를 팽창시키고, 형태 측정 방법을 사용하여 생쥐의 폐기종 및 소기도 재형성을 측정하는 것이 포함됩니다.

담배 연기에 노출 된 마우스의 폐 폐기종 및 작은기도 리모델링 자동 측정

여기에 제시된 폐 고정을 위한 유용한 프로토콜은 기종의 마우스 모델에서 폐 견본의 조직학적 평가를 위한 안정한 조건을 만드는. 이 모델의 주요 장점은 폐 붕괴 또는 디플레이션없이 동일한 일정한 압력으로 많은 폐를 고정 할 수 있다는 것입니다.

마우스에 있는 기종의 평가를 위한 일정한 압력의 밑에 폐 고정

여기 우리가 폐 식 평가 하는 방법을 설명 예측 하는 miRNAs의 염증 유전자를 조절 하기 위해 마우스를 사용 하 여 오존에 노출 또는 estrous 주기의 여러 단계에서 공기를 필터링.

폐 예측에 관한 프로 파일링 걸쳐 the Estrous 사이클 오존에 노출 된 쥐에

이 원고는 오존에 노출 여부를 결정하기위한 프로토콜을 설명, 기준 대기 오염 물질, 생체 내에서 폐포 대식세포 efferocysis를 손상. 이 프로토콜은 일반적으로 사용되는 시약 및 기술을 활용하고 폐 포상 손상의 여러 모델에 적응하여 폐포 대식세포 효능에 미치는 영향을 결정할 수 있습니다.

오존 노출 에 따른 폐포 대식세포 비세포증의 생체내 평가

결합 된 오존과 세균성 내독신 노출 마우스는 호중구의 것을 포함하여 광범위한 세포 죽음을 보여줍니다. 우리는 세포 골격 라멜레포디아의 중단, 기관지 폐포 라베이지의 복잡한 V ATP synthase 서브유닛 β 및 혈관 스타틴의 세포 발현 증가, 폐 면역 반응 억제 및 지연 된 호중구 모집과 같은 세포 적응을 관찰했습니다.

결합 된 오존 과 LPS 유도 뮤린 급성 폐 부상 동안 폐 세포 적응 시각화

폐섬유증의 발병기전을 규명하고 새로운 약물 표적을 찾기 위해 블레오마이신을 이용한 다양한 폐섬유증 동물모델을 확립하였습니다. 그러나 폐 조직을 표적으로 하는 대부분의 폐섬유증 모델은 약물 투여가 고르지 않습니다. 여기에서는 비강 표백균 분무에 의해 유도되는 균일한 폐섬유증 모델을 제안합니다.

비강 Bleomycin 분무에 의해 유도된 폐 섬유증의 마우스 모델

이 프로토콜은 비강 점적을 통해 실리카 현탁액에 반복적으로 노출되어 규폐증의 마우스 모델을 확립하는 방법을 설명합니다. 이 모델은 높은 반복성과 경제성으로 인간 규폐증의 병리학적 과정을 효율적이고 편리하며 유연하게 모방할 수 있습니다.

결정질 실리카 분진을 반복적으로 흡입하여 확립된 규폐증 마우스 모델

이 프로토콜은 블레오마이신의 반복적인 구인두 투여를 통해 마우스에서 폐섬유증을 유발하는 방법을 설명하며, 이는 특발성 폐섬유증과 매우 유사한 병리학적 특징을 산출합니다.

특발성 폐섬유증의 정제된 쥐 모델

여기서는 기관을 통해 전달된 에어로졸화된 블레오마이신을 이용해 쥐의 폐섬유증을 모델링하는 프로토콜을 제시합니다. 이 최적화된 방법은 수술 절개 없이도 균일하고 정량적이며 정확한 전달을 가능하게 하여 블레오마이신 유발 섬유증의 재현성과 신뢰성을 높입니다.

폐섬유증의 재현 가능하고 최소 침습 마우스 모델을 위한 정교한 에어로졸 기반 기관내 블레오마이신 전달 방법

배우세요 반복된 오존 노출을 통해 쥐에서 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD) 동물 모델을 생성하는 방법을. 이 모델은 COPD의 병리학적 과정을 재현하며 약물 선별 연구에 활용됩니다.

반복된 오존 노출에 의해 쥐에 만성 폐쇄성 폐 질환 모델의 생성

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