반복된 오존 노출에 의해 쥐에 만성 폐쇄성 폐 질환 모델의 생성

이 실험의 전반적인 목표는 생쥐에서 오존 노출, O-E를 통해 만성 폐쇄성 폐 질환 또는 C-O-P-D를 유도하는 것입니다. 이 새로운 OE 모델은 COPD의 기본 메커니즘을 특성화하는 과정에서 발생할 수 있으며 신약 스크리닝에 사용할 수 있습니다. 이 OE 모델의 주요 장점은 COPD 환자의 병리학적 과정을 요약한다는 것입니다.

단 6주에서 8주 만에 생성될 수 있습니다. 저와 함께 절차를 시연할 사람은 우리 그룹의 연구원인 Weijaian Sang입니다. 오존을 생성하려면 발전기와 소형 송풍기를 사용하여 오존 프로브를 사용하여 상자 내부와 외부에 연결된 통풍구를 통해 밀봉 방풍 상자를 불어내어 상자 내 오존 농도를 모니터링합니다.

오존 농도가 2.5ppm에 도달하면 마우스를 상자에 3시간 동안 넣습니다. 7주차가 끝날 때 표준 프로토콜에 따라 마이크로 컴퓨터 단층 촬영으로 오존 처리된 동물을 이미지화합니다. 오존으로 인한 변화와 폐 피로와 같은 기능적 능력을 테스트하려면 먼저 트레드밀에서 분당 10미터의 속도로 마우스를 예열합니다.

5분 후 10분 동안 분당 15미터로 속도를 높입니다. 쥐가 더 이상 달릴 수 없을 때까지 30분마다 분당 5미터씩 속도를 계속 높입니다. 각 동물의 총 주행 거리와 주행 시간을 각각 피로 거리와 피로 시간으로 기록합니다.

오존에 노출된 동물의 폐 기능을 측정하려면 마취된 마우스를 컴퓨터로 제어되는 인공호흡기에 연결된 신체 혈량계에 넣습니다. 압력 조절 인공호흡기를 사용하여 규칙적인 호흡 패턴이 나타나고 각 호흡 주기에서 완전한 소멸이 이루어질 때까지 마취된 동물에게 분당 평균 150회의 호흡 빈도를 부과합니다. 그런 다음 날숨의 처음 25, 50 및 75밀리초에 강제 호기량을 기록하여 차선의 기동을 거부합니다.

말기 마취 후 직경 1mm의 기관내관을 사용하여 세척당 1ml의 PBS로 동물을 두 번 세척합니다. 원심분리를 위해 각 동물에서 회수한 세척액을 풀링하고 액체 질소에 상등액을 수집합니다. 계수를 위해 펠릿을 새 PPS에 다시 매달고 마우스당 두 개의 홀더에 현미경 슬라이드, 필터 카드 및 깔때기를 장착합니다.

약 100-125마이크로리터의 재현탁 세포를 각 깔때기에 추가합니다. 홀더를 사이토 원심분리기에 장착하고 셀을 슬라이드로 회전시킵니다. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 올바른 염색 용액을 세포에 바르고 400배 배율로 마우스당 200개의 세포를 계수합니다.

심장 혈액 샘플링을 위해 심장 천자를 통해 오존에 노출된 동물로부터 약 500마이크로리터의 혈액을 수집합니다. 그리고 얼음 위에 1.5ml 튜브에 혈액을 넣으십시오. 얼음 위에서 30분 후 혈액 샘플을 원심분리하고 혈청 상층액을 액체 질소에 저장하기 위해 새 튜브로 옮깁니다.

샘플은 나중에 표준 프로토콜에 따라 ELISA에 의한 혈청 사이토카인 발현 수준 평가를 위해 해동할 수 있습니다. 폐 형태 분석을 위해 심장 샘플링 후 첫 번째 마우스를 앙와위 위치에 놓습니다. 그런 다음 흉강을 열고 판형질과 전기관 근육을 절개하여 기관 고리에 접근합니다.

심장과 폐를 분리하지 않고 폐와 기관을 적출합니다. 다음으로, PE90 폴리에틸렌 튜브를 사용하여 4% 파워 포름알데히드가 함유된 주사기에 기관내 카테터를 연결하고 약 200마이크로리터의 파라포름알데히드로 폐를 완전히 팽창시킵니다. 그런 다음 10밀리리터의 신선한 4% 파워 포름알데히드가 들어 있는 15밀리리터 튜브에 폐를 최소 4시간 동안 넣습니다.

마이크로컴퓨터 단층촬영으로 평가한 바와 같이, 오존에 노출된 마우스는 주변 공기에 노출된 대조군 동물보다 훨씬 더 큰 총 폐 부피와 낮은 감쇠 면적의 백분율을 나타냅니다. 폐기종 표현형은 또한 폐 폐포 확대와 평균 선형 절편 증가에 의한 증거입니다. 혈량계에 의한 폐 기능 평가는 오존에 노출된 마우스에서 감소하는 모든 매개변수가 만성 폐쇄성 폐질환 환자에서 관찰된 일반적인 폐 기능 결함과 일치함을 보여줍니다.

또한, 오존 노출은 운동 내성 테스트에서 피로 시간과 피로 거리를 크게 감소시킵니다. 또한 오존 처리된 동물은 대식세포와 호중구를 포함한 염증세포의 현저한 증가와 IL-10의 현저한 감소, IL-1 베타 및 TNF 알파의 증가를 보여 오존 노출 모델이 인간의 만성 폐쇄성 폐질환과 유사한 증상을 재현하고 있음을 보여줍니다. C57 BR6 마우스와 같은 다른 마우스 균주에 대해 이 절차를 따라 이 OE 모델을 생성하는 데 사용할 수 있습니다.개발 후 이 기술은 폐 질환 분야의 연구자들이 COPD의 기본 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.

파라포름알데히드로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 이 시약으로 작업하는 동안 항상 장갑, 보안경을 착용하고 흄 후드 내부의 용액을 사용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.