Name: Vivo에서 검색 및 Rb 단백질 SUMOylation 인간 세포에서의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 학습하세요 인간 세포에서 Rb 단백질 SUMOylation을 검출하는 방법을. HEK293 세포를 사용하여 내인성 및 외인성 조건에서 단백질 수정을 분석하고 세포 주기 조절 메커니즘을 이해하세요.

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이 연구는 과학 및 기술 위원회 상하이 (보조금 번호 14411961800)와 국가 자연 과학 재단의 중국 (보조금 번호 81300805)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

1. 탐지의 내 생 Rb SUMOylation 초기 g 1 단계에서 <ol><li>문화 및 세포 주기 동기화 셀.
	<ol><li>유지 HEK293 세포 성장 매체를 포함 하는 Dulbecco에서 &#39; s 수정이 글 매체 (DMEM) 1% 펜 Strep 및 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO 2 보충.</li>
		<li>G0 단계에서 HEK293 세포를 동기화합니다.
		<li>HEK293 세포 15 cm에서 hemocytometer와 씨 ~1.5 x 10 7 셀을 사용 하 여 치료 전에 24 h에 대 한 25 ml 성장 매체와 접시 수 <ol>. 70%-80%, aspirate의 합류에 도달 세척 매체 후 셀 두 번 5 mL와 함께 prewarmed 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS).</li>
			<li>추가 25 mL 1% 포함 된 DMEM 페니실린-스와 72 h. 씻어 3 mL 얼음 처럼 차가운 PBS를 사용 하 여 접시에서 셀에 대 한 37 ° C에서 세포를 품 어. 새로운 5 mL 튜브로 셀 전송.</li>
			<li>Cytometry (1.2 단계)에 의해 세포 주기 분석에 셀의 작은 부분을 주제; 실 온에서 5 분 동안 200 x g에서 원심 분리 하 여 셀의 나머지 대부분을 수집 하 고 분석까지 울트라-낮은 온도 냉동 고에 저장 하 Rb SUMOylation.</li>
		</ol></li> <li>G1 단계를 셀, G0 동기화 프로세스의 끝에는 DMEM를 제거 하 고 다시 신선한 성장 매체, 세포 주기를 재입력 하 HEK293 세포 되므로 추가. 그런 다음, 다른 g 1 단계에서 세포를 수집 (초기 g 1: 30 분; G1: 2 h) 세포 주기 분석 및 추가 스모 시험.</li>
		<li>더블 티 미 딘 블록 메서드를 사용 하 여 S 단계에서 HEK293 세포를 동기화 합니다.
		<li>성장 HEK293 세포 50% 및 세척의 confluency <ol>prewarmed PBS 가진 셀입니다. 2.5 m m 티 미 딘 18 h (첫 번째 블록)에 대 한 보충 성장 매체를 추가 합니다.</li>
			<li>티 미 딘을 포함 하는 매체를 제거 하 고 셀 prewarmed PBS로 두번 세척. 14 h 셀 출시를 위한 신선한 성장 매체 추가.</li>
			<li>는 피 펫과 매체를 삭제 하 고 2.5 m m 티 미 딘 다른 18 h (2 블록)에 대 한 보충 성장 매체는 세포 주기 및 Rb SUMOylation의 분석을 수행 하기 전에 추가.</li>
		</ol></li> <li>G 2은 / M에 대 한 동기화, 25 mL 24 h에 대 한 성장 매체와 15cm 접시 접시 ~1.5 × 10 7 HEK293 세포. 다음 400 ng/mL의 최종 농도 얻을 때까지 매체에 nocodazole을 추가 합니다. 마지막으로, 세포 주기 및 Rb SUMOylation의 분석을 수행 하기 전에 16 h에 대 한 셀을 품 어.</li>
	</ol></li> <li>Cytometry에 의해 세포 주기 분석.
	<ol><li>다시 PBS에 동기화 HEK293를 일시 중단 하 고 다음 2 h 4에서 차가운 70% 에탄올을 사용 하 여 셀 서 스 펜 션 수정 ° C. 셀 클러스터링 최소화, 세포 현 탁 액의 최종 농도를 얼음 처럼 차가운 100% 에탄올 dropwise 추가할 유의 부드럽게 vortexing 동안 70% 에탄올.</li>
		<li>X 500g에 5 분에 대 한 셀을 원심 다음 신중 하 게 하 게 삭제는 상쾌한 하 고 PBS로 두 번 셀을 씻어. 원심 분리기 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>추가 500 µ L PBS 포함 50 µ g/mL 핵 산 얼룩 propidium 요오드 화물, 셀에 0.1% 트라이 톤 X-100 그리고 1 µ g/mL RNase A와 섞어 잘. 15 분 37에 대 한 셀을 품 어 ° c.</li>
		<li>Cytometry 분석까지 4 ° C에서 샘플 저장.</li>
	</ol></li> <li>생 Rb 단백질의 Immunoprecipitation.
	<ol><li>준비는 HEK293 세포 lysates입니다.
		<ol><li>Lyse 부드럽게 다시 차가운 라디오-immunoprecipitation (RIPA)의 분석 결과 세포의 용 해 버퍼 (표 1)의 1 mL에 갓 포함 하는 그들을 중단 하 여 동기화 HEK293 세포 추가 20 mM N-Ethylmaleimide, 수 있는 isopeptidase 억제제 스모 프로 테아 제를 차단 하 고 안정화 스모 어원이 같은 말.</li>
			<li>더 균질 Dounce 균질, 쥡니다 또는 단순히 통과 10 배 2 mL 주사기에 21 G 바늘을 통해 얼음에 셀. 그런 다음, 5 분 ice에 셀을 품 어 
			참고: 음이온 세제 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) RIPA 버퍼에는 Rb 스모의 최신 결정에 대 한 중요 한으로 Rb 단백질 및 기타 비 공유 상호작용에서 파생 된 불특정 스모 신호를 제거할 수 있습니다. 비-Rb 스모 종.</li>
		</ol></li> <li>4 시 30 분에 대 한 18000 x g에서 세포 lysates 원심 ° C. 새로운 1.5 mL 마이크로 원심 튜브는 supernatants 전송. 
		참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 단백질-80 ° C에 6 개월 이상 저장할 수 있습니다.</li>
		<li>나중 서쪽 오 점을 위해 각 샘플의 입력된 컨트롤을 준비 하 저장 위의 설명 상쾌한의 작은 부분 새로운 튜브와 스토어-80 ° c.</li>
		<li>위의 supernatants Rb 항 체 단일 클로 널 및 50% 단백질 A/G-sepharose 슬러리의 20 µ L 1 µ g의 일반적인 마우스 면역 글로불린 G (IgG) 같은 종과 isotype의 추가. 그런 다음, 부드러운 회전 4 ° C에서 1 시간에 품 어.</li>
		<li>원심 3 분 3000 x g에서 샘플 4 ° C. 신중 하 게 구슬, 방해 하지 않고는 supernatants를 수집 하 고 새로운 1.5 mL 마이크로 원심 관에 그들을 전송. 각 샘플에 5 µ L Rb 1 차적인 항 체와 50% 단백질 A/G-sepharose 슬러리의 40 µ L를 추가 합니다. 그런 다음, 부드러운 회전 4 ° C에서 밤새 품 어.</li>
		<li>4 ° C에서 3 분 동안 3000 x g에서 원심 분리 하 여 비즈를 수집 하 고 조심 스럽게 pipetting으로 상쾌한을 제거 합니다. 비드 손실을 방지 하기 위해 유의 구슬 드라이 발음 하지 않습니다.</li>
		<li>씻어 4 번 RIPA 버퍼의 1 mL와 구슬. 각각, 혼합 튜브 15 분에 4 ° C에서 수집 하는 회전에 의해 잘 구슬 4 ° C에서 3 분 동안 3000 x g에서 낮은 속도 원심 분리에 의해 시간과 다음 삭제는 supernatants.</li>
		<li>Supernatants 최종 세척에서 제거 후 다시 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지) 로드 버퍼 (표 1) x 30 µ L 1에에서 비즈를 일시 중단 하 고 잘 혼합.
		<ol><li>품 튜브는 열에 100 ° C에서 10 분 원심 작은 구슬에 1 분 동안 12000 x g에서 샘플에 대 한 차단. 신중 하 게 구슬, 방해 하지 않고는 supernatants를 수집 하 고 1.5 mL 마이크로 원심 관에 그들을 전송.</li>
		</ol></li> <li>샘플 4%-20% 그라데이션 SDS 페이지 젤 분석 및 서양 오 점 또는 나중에 사용-20 ° C에서 저장.</li>
	</ol></li></ol> 2. 인간 세포에 외 인 Rb SUMOylation 6XHis 태그의 분석 <ol><li>세포 문화 및 transfection.
	<ol><li>씨 ~ 6 × 10 6 HEK293 세포 10 cm에 요리 하 고 75%-85 %confluent 셀을 얻으려고 정상 세포 문화 조건 하에서 성장 매체에 24 h에 대 한 품 어. Transfection, 전에 성장 매체를 제거 하 고 prewarmed 감소 된 혈 청 매체의 6 mL을 추가 (재료의 표 참조) 하 고 다음 요리 다시 인큐베이터.</li>
		<li>Rb에 대 한 제정 SUMOylation 분석 결과, 각각 1.5 mL 마이크로 원심 튜브에 500 µ L 감소 된 혈 청 매체에 15 µ g 각 6XHis 태그 Rb-Ubc9-WT, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT 및 Ubc9 C93S 플라스 미드의 추가.
		<ol><li>야생 타입 Rb의 스모 활용 및 그것의 SUMOylation 결함 돌연변이 분석, 10 µ g 어느 6XHis 태그 Rb-WT 또는 Rb K720R 플라스 미드 GFP SUMO1와의 혼합 (10 µ g) 500 µ L 감소 1.5 mL 마이크로 원심 분리기에서 혈 청 매체 13 관.</li>
		</ol></li> <li>한편, 별도 튜브에서 50 µ L transfection 시 약을 혼합 500 µ L 감소, 혈 청 매체 (재료의 표 참조) 및 5 분에 대 한 실 온에서 품 어</li>
		<li>완벽 하 게, 위에서 설명한 두 개의 별도 튜브를 결합 하 여 세포 시 약/플라스 미드 단지 15 분 추가 transfection에 대 한 실 온에서 품 어 고 8에 대 한 문화를 계속 5% CO 2와 37 ° C에서 h</li>
		<li>Transfection 후 48 h에 대 한 정상적인 문화 조건 하에서 세포를 품 어 고 성장 매체, 감소 된 혈 청 매체.</li>
	</ol></li> <li>선호도 풀 다운 6XHis 태그 Rb 단백질의 니켈.
	<ol><li>Transfected HEK293 세포를 lyse 고 설명된 섹션 1.3.1로 총 단백질 추출.</li>
		<li>원심 분리기는 세포 lysates 18000 x g에서 4 시 30 분에 대 한 ° C. 신중 하 게는 supernatants 수집 하 고 깨끗 한 튜브에 그들을 전송. 
		참고: 단백질 얼 수 있다이 시점에서 6 개월 이상-80 ° c.</li>
		<li>나중 서쪽 오 점을 위해 각 샘플의 입력된 컨트롤을 준비, 새로운 관을-80에 게 위에서 설명한 supernatants의 작은 부분 저장 ° c.</li>
		<li>워시 25 µ L 50%의 니켈 각 샘플에 대 한 1.5 mL 마이크로 원심 튜브에 두 번 RIPA 버퍼 nitrilotriacetic 산 (Ni-NTA) agarose 구슬. 4 시 3 분에 대 한 3000 x g에서 원심 분리 하 여 비즈를 수집 ° c.</li>
		<li>10 m m의 최종 농도 얻기 위해 각 샘플에 추가 1 M 이미. 그런 다음 준비 된 Ni NTA agarose 구슬 포함 된 튜브에 각 샘플 추가.</li>
		<li>구슬과 부드러운 회전 4 ° C에서 2 h lysates 품 어. 4 ° C에서 3 분 동안 3000 x g에서 구슬 회전 하 고 조심 스럽게 pipetting으로 supernatants를 제거 합니다. 손실을 방지 하기 위해 구슬, 구슬 드라이 발음 하지 마십시오.</li>
		<li>이미 20 m m (표 1)를 포함 하는 워시 버퍼의 1 mL와 구슬 세척. 각 시간, 혼합 튜브 15 분 수집 4 ° C에서 회전에 의해 잘 구슬 4 ° C에서 3 분 동안 3000 x g에서 회전 및 삭제는 supernatants.</li>
		<li>최종 세척 후 각 샘플을 차입의 30 µ L 버퍼 포함 250 m m 이미 (표 1)를 추가 하 고 혼합 영화. 그런 다음, 단백질을 elute 하 4 ° C에서 20 분 동안 품 어.</li>
		<li>혼합 각 샘플 6 × SDS 페이지 로딩 버퍼 (표 1). 그런 다음, 10 분에 대 한 열 블록에 100 ° C에서 튜브를 품 어</li>
		<li>원심 분리기에서 12000 x g 작은 구슬 1 분. 신중 하 게 구슬, 방해 하지 않고는 supernatants를 수집 하 고 1.5 ml 마이크로 원심 관에 샘플을 전송. 샘플을 서쪽 오 점 분석 또는 나중에 사용-20 ° C에서 저장 수 있습니다.</li>
	</ol></li></ol> 3. 서쪽 오 점 <ol><li>로드는 immunoprecipitation 또는 풀 다운 4-20% 그라데이션 SDS 페이지 젤에 이전 단계에서 얻은 샘플. 단백질 분리를 90 분 동안 120 V에서 전기 이동 법 실시.</li>
	<li>전송 단백질 젤에서 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막에 300에서 electroblotting에 의해 탱크 전송 방법을 사용 하 여 4 ° C에서 90 분 동안 mA. 5%의 저지방 우유 (표 1) 실 온에서 1 h를 포함 하는 블록 버퍼에 PVDF 막 차단.</li>
	<li>품 3% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) (표 1)를 포함 하는 항 체 희석 버퍼에 1 차 항 체로 막 4 ° c.에서 하룻밤 1 차 항 체에 대 한 작동 농도 0.5 µ g/mL (안티-SUMO1 항 체), 또는 1: 2000 (안티-Rb 및 안티 Tubulin 항 체), 또는 1:5,000 (안티-GFP와 반대로 그의 항 체)의 희석 사용.</li>
	<li>씻고 막 3 x 10 분 트윈 (TBST) 버퍼 (표 1) tris 버퍼 염 분 x 1을 사용 하 여 각 시간에 대 한. 5% 탈지 우유 (표 1)를 포함 하는 블록 버퍼에 종 특정 양 고추냉이 과산화 효소 HRP 활용 된 이차 항 체 희석된 1:5,000와 막 품 어. 3 막 씻고 10 분 1 x TBST 버퍼를 사용 하 여 각 시간에 대 한 x.</li>
	<li>는 솔루션 작업 향상 된 화학 (ECL)와 막 품 어. 커버 플라스틱 포장을 가진 막 및 신호 강도 따라 x 선 필름에 노출.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 종이 감지 하 여 인간의 세포에 Rb 생 SUMOylation 분석 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 특히 글로벌 스모 관련 신호의 어떤 교체 없이 생 Rb 단백질에 초점이, Rb 스모 수정 완전히 자연 생리 상황 조사를 위한 중요 한 도구입니다.
이 목표를 달성 하기 위해, 그것은 마음에 유지 하는 것이 중요 하는: 1) 스모는 ubiquitination에 비해 4 개의 isoforms (SUMO1-4, 각각 서로 다른 유전자에 의해 부호화)으로 구성, 모든 스모 종은 훨씬 풍부한; 2) 대부분의 스모 대상 단백질에 대 한 스모 활용에 관련 된 효소 사이 지속적인 경쟁의 결과 이며14,21; deconjugation는 안정 된 상태에서 SUMOylated는 주어진된 단백질의 단지 작은 부분 그리고 3) 스모 목표 SUMOylation 및 deSUMOylation의 급속...

진 핵 세포에서 세포 주기 진행의 정확한 컨트롤을 특정 이벤트 정렬된 방식으로1,2자리 보장 꽉 규제 네트워크를 기반으로 합니다. 이 네트워크에서 핵심 선수 중 하나입니다 (Rb) retinoblastoma 단백질, 첫 번째 복제 종양 억제기1,3. Rb 단백질은 세포 주기 진행, 특히 S 단계 변화 및 종양 성장4,5G0/G1의 부정적인 레 귤 레이 터 라고 생각. Rb 함수 실패 하거나 직접 리드 어린이, 가장 일반적인 안구 내부 악성 retinoblastoma, 또는 많은 다른 유형의 암5의 개발에 기여 한다. 또한, Rb 세포 분화, chromatin 개장, 및 중재 하는 미토 콘 드리 아는 apoptosis3,,67를 포함 하 여 많은 세포질 통로에서 포함 된다.
포스트 번역 상 수정 RB 함수8,9의 규칙에 있는 중추적인 역할을 한다. 인 산화는 같은 한 수정, 그리고 그것은 일반적으로 Rb 비활성화 리드. 무부하 G0 셀에 Rb 인 산화 낮은 수준으로 활성화 됩니다. G0/G1 단계 진행 세포, Rb는 순차적으로 하이퍼-phosphorylated  종속 단백질 kinases (CDKs) 및 Rb를 비활성화 하 고 세포 주기를 억 누르기 위해 능력 제거   및 E/CDK2 D/CDK4/6, 같은 cyclins, 일련의에 의해 관련 유전자 식4,10. Rb 또한 작은 유비퀴틴 관련 한정자 (스모)11,,1213수정 될 수 있습니다.
스모 다양 한 대상 단백질에 연결 covalently 유비퀴틴-같은 단백질 이다. 그것은 세포 주기 규칙을 포함 하 여 다양 한 세포질 프로세스에 대 한 중요, 전사, 단백질 세포질 지 방화 및 저하, 전송, 및 DNA 복구14,,1516, 17 , 18.에 스모 활용 통로로 구성 되어 dimeric 스모 E1 활성화 효소 SAE1/UBA2 단일 E2 conjugating 효소 Ubc9, 여러 E3 ligases, 스모 관련 프로 테아 제. 일반적으로, 초기 스모 단백질 proteolytically 성숙한 형태를 생성 하기 위해 처리 되어야 합니다. 성숙한 스모 E1 heterodimer에 의해 활성화 하 고 Ubc9 E2 효소로. 마지막으로, 스모의 C-터미널 글리신 covalently, 기판의 대상 리에 활용 된 그리고이 과정은 일반적으로 E3 ligases에 의해 촉진 된다. 스모 단백질 특정 프로 테아 제에 의해 수정 된 기판에서 제거할 수 있습니다. 이 문서의 저자에 의해 이전 연구 Rb SUMOylation CDK2에 그것의 바인딩을 초기 g 1 단계, 세포 주기 진행13에 필요한 과정에서 인 산화 하이퍼로 이어지는 증가 밝혀. 우리는 또한 Rb SUMOylation의 손실 감소 셀 확산 원인 설명 했다. 또한, 그것은 최근에 Rb의 SUMOylation proteasomal 회전율에서 따라서 셀19Rb 단백질의 수준을 증가 Rb 단백질을 보호 시연 했다. 따라서, SUMOylation 다양 한 세포질 프로세스에서 Rb 기능에 중요 한 역할을 재생합니다. 추가 연구를 기능 결과 Rb SUMOylation의 생리 적인 관련성 그건 인간의 세포 또는 환자 조직에서 Rb의 스모 상태를 분석 하는 효과적인 방법을 개발 하는 것이 중요.
SUMOylation 가역, 매우 역동적인 과정 이다입니다. 따라서, 완전히 생 조건에서 스모 수정 단백질을 검출 하기 위하여 일반적으로 어렵습니다. 이 종이 생 Rb SUMOylation 검색 하는 메서드를 제공 합니다. 또한, 그것은 야생-타입 Rb와 그 스모 결핍 돌연변이11외 인 Rb SUMOylation 감지 하는 방법을 보여 줍니다. 특히, 제이콥스 외. 주어진된 기판의 스모 수정 Ubc9 퓨전 감독 SUMOylation (UFD)20특히 증가 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법에 따라,이 프로토콜은 Rb의 강제 SUMOylation 그리고 그것의 기능적인 결과 분석 하는 방법을 설명 합니다. 스모 기판의 수백 설명한가지고 있고 더 많은 putative 스모 기판 많은 proteomic 기반 분석 실험에서 확인 되었습니다,이 프로토콜 분석 인간 세포에이 단백질의 SUMO 수정에 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco의 수정된 독수리 매체 (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>소태아 혈청(FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>Sigma</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>프로피듐 요오드화물</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>AMRESCO</td><td>694</td><td></td></tr><tr><td>RNase A&nbsp;</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>N-에틸말레이미드</td><td>시그마</td><td>E3876&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)</td><td>AMRESCO</td><td>M107</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 대체물 (NP-40)</td><td>AMRESCO</td><td>M158</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제</td><td>Roche</td><td>5892970001</td><td></td></tr><tr><td>마우스 면역 글로불린 G (IgG)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2025</td><td></td></tr><tr><td>Rb 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>#9309</td><td></td></tr><tr><td>단백질 A/G-세파로스 비즈</td><td>산타크루즈 생명공학</td><td>sc-2003</td><td></td></tr><tr><td>리포펙타민-2000&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>니켈 니트릴로트리아세트산(Ni-NTA) 아가로스 비드</td><td>Qiagen</td><td>30230</td><td></td></tr><tr><td>이미다졸</td><td>시그마</td><td>I0250</td><td></td></tr><tr><td>4%-20% 그래디언트 SDS-PAGE 겔</td><td>BIO-RAD</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>AMRESCO</td><td>M147</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin 항체</td><td>Abmart</td><td>M30109</td><td></td></tr><tr><td>SUMO1 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33-2044</td><td></td></tr><tr><td>GFP 항체</td><td>Abmart</td><td>M20004</td><td></td></tr><tr><td>양고추냉이 과산화효소(HRP) 2차 항체</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>715-035-150</td><td></td></tr><tr><td>향상된 화학발광(ECL) 키트</td><td>Thermo Fisher 과학</td><td>32106</td><td></td></tr></tbody></table>

vivo에서 검색 및 rb 단백질 sumoylation 인간 세포에서의 분석

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

포스트 번역 상 수정 단백질의 세포내 신호 변환의 적절 한 규제에 대 한 중요 하다. 이러한 수정 중 작은 유비퀴틴 관련 한정자 (스모) 대상 단백질 유전자의 전사, DNA 수리, 단백질 세포질 과정 통제의 다양 한의 리 진 잔류물에 연결 covalently 유비퀴틴-같은 단백질은 상호 작용 저하, subcellular 전송 및 신호 변환. 표현과 재조합 태그 단백질 박테리아에는 체 외에서 생 화 확 적인 반응을 간단 하 고 기계적 주소 지정을 위해 적당 한 수의 정화를 기반으로 하는 단백질 SUMOylation 감지 하는 가장 일반적인 방법은 질문입니다. 그러나, vivo에서SUMOylation 과정의 복잡성 때문에 그것은 감지 하 고 분석 단백질 세포, 특히 생 조건에서 SUMOylation 더 도전. 이 문서의 저자에 의해 최근 연구 생 retinoblastoma (Rb) 단백질, 세포 주기 진행의 부정적인 규정 하는 중요 한 종양 억제기 초기 g 1 단계에서 특히 SUMOylated는 밝혔다. 이 종이 검출 및 인간 세포에서 내 인 성 및 외 인 조건 하에서 Rb SUMOylation의 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 Rb, 뿐만 아니라 많은 다른 스모 타겟 단백질, 인간 세포에서의 스모 수정 phenotypical 및 기능 조사에 적합 합니다.

세포 주기 진행 하는 동안 내 생 Rb SUMOylation 감지,이 연구 처음 동기화 HEK293 세포 세포 주기 (G0, 초기 G1, G1, S, 및 G2/M)의 5 개의 다른 단계에서이 문서의 프로토콜 섹션에 설명 된 대로. 동기화의 품질 propidium 요오드 화물 흐름 cytometry 분석 (그림 1) 다음으로 핵 산 얼룩을 사용 하 여 확인 되었다. 다음으로, 셀 수집 되었고 RIPA 버퍼를 변성 시키기 의해 lysed. 스모 프로 테아 제 억제제, N-Ethylmaleimide, 실험 기간 동안 네이티브 스모 신호를 보존 하기 위해 20 mM의 최종 농도에 추가 되었습니다. 비 공유 난다 상호 작용, 그리고 안티-SUMO1 항 체를 사용 하 여 다음 서쪽 오 점 차단 조건을 변성 시키기 아래 생 Rb 종의 immunoprecipitation, 후 스모 신호의 존재 특히 감지에 초기 g 1 단계 (<st...

작은 유비퀴틴 관련 한정자 (스모) 가족 단백질은 다양 한 세포질 과정을 규제 대상 단백질의 리 진 잔류물을 활용. 이 종이 (Rb) retinoblastoma 단백질 SUMOylation 인간 세포에서 내 인 성 및 외 인 조건 하에서 검출을 위한 프로토콜을 설명합니다.

Vivo에서 검색 및 Rb 단백질 SUMOylation 인간 세포에서의 분석

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, ...

이 실험의 전반적인 목표는 인간 세포의 내생적 및 외생적 조건에서 retinoblastoma 단백질의 SUMOylation을 검출하는 것입니다. Small ubiquitin-related modifier, 즉 SUMO 패밀리 단백질은 표적 단백질의 리신 잔기에 결합하여 다양한 세포 내 과정을 조절합니다. 일반적으로 생체 내 SUMOylation의 복잡성으로 인해 세포 내에서 단백질 SUMOylation을 유도하는 것은 더 까다롭습니다.본 실험은 내인성 및 외인성 Rb 단백질 모두의 SUMOylation을 검출합니다. 이 방법은 Rb 단백질의 SUMOylation에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 세포 내 다른 많은 SUMO 표적 단백질을 검출하는 데에도 적합합니다. 우선, 1% penicillin streptomycin이 포함된 DMEM 25 milliliters를 첨가하고, HEK293 세포를 37 °C에서 72시간 동안 배양하십시오.3 mL의 차가운 PBS를 사용하여 플레이트에서 세포를 세척합니다. 그런 다음 세포를 새로운 5 mL 튜브로 옮깁니다. G0 동기화 과정 끝에 G1기 세포를 얻으려면, DMEM을 제거하고 신선한 성장 배지를 다시 추가하여 HEK293 세포가 세포 주기에 다시 진입하도록 합니다.그 후, 세포 주기 분석 및 추가 SUMO 분석을 위해 서로 다른 G1 단계에서 세포를 수집합니다. HEK293 세포를 S기에 동기화하려면 이중 티미딘 차단법(double thymidine block method)을 사용하십시오. 먼저, HEK293 세포를 50% 합류도(confluency)까지 배양합니다. 그런 다음 예열된 PBS로 세포를 세척합니다.첫 번째 블록으로 2.5 millimolar thymidine이 첨가된 성장 배지를 넣고 18시간 동안 배양합니다. thymidine이 함유된 배지를 제거하고 미리 데워둔 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 신선한 성장 배지를 넣고 14시간 동안 배양하여 세포를 블록에서 해제합니다.첫 번째 블록에서 세포를 해제한 후, 피펫으로 배지를 제거합니다. 그다음, 세포 주기 및 Rb SUMOylation 분석을 수행하기 전 두 번째 블록으로서 2.5 mM thymidine이 보충된 성장 배지를 추가하여 18시간 동안 더 배양합니다. G2 또는 M기 동기화를 위해서는, 약 1,500만 개의 HEK293 세포를 25 mL의 성장 배지가 담긴 15 cm 디시에 접종하고 24시간 동안 배양합니다.그 후, 최종 농도가 400 ng/mL가 되도록 배지에 nicotisol을 첨가합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 유세포 분석을 통해 세포 주기를 분석하기 전, 세포를 16시간 동안 배양합니다. SUMO 프로테아제를 억제하고 SUMO 접합체를 안정화하기 위해 갓 첨가한 isopeptidase 억제제가 포함된 1 mL의 얼음처럼 차가운 radioimmunoprecipitation assay(RIPA) 용해 버퍼에 동기화된 HEK293 세포를 부드럽게 재현탁하여 용해합니다.2 mL 시린지에 장착된 21 gauge 바늘을 통해 세포를 10회 통과시켜 얼음 위에서 추가로 균질화합니다. 그 다음 세포를 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다. 이어서, 세포 용해물을 4°C에서 18000 ×g로 30분 동안 원심분리합니다.원심분리 후, 상층액을 새로운 1.5 milliliter 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다. 상층액에 단일클론 Rb 항체와 동일한 종 및 동형인 1 microgram의 비특이적 마우스 immunoglobulin G를 첨가합니다. 또한, 20 microliters의 50 % protein AG sephyroslurry를 넣고, 혼합물을 4 °C에서 완만하게 회전시키며 1시간 동안 배양합니다.샘플을 4°C에서 3,000 ×g로 3분 동안 원심분리합니다. 비드가 흐트러지지 않게 주의하며 상층액을 조심스럽게 수집하여 새로운 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 각 샘플에 rb 1차 항체 5 µL와 50% protein ag sepharose slurry 40 µL를 첨가한 후, 4°C에서 완만한 회전과 함께 하룻밤 동안 배양합니다.원심분리 후, 1 mL의 rifa buffer로 비드를 세척합니다. 4 °C에서 15분 동안 회전시켜 튜브를 충분히 혼합합니다. 그 다음, 이전과 동일하게 저속 원심분리로 비드를 회수하고 상층액은 제거합니다.세척 과정을 4회 수행한 후, 1x sodium dodecalsulfate polyachrylymide gel electrophoresis 로딩 버퍼 30 µL에 비드를 재현탁하고 잘 섞습니다. 튜브를 히팅 블록에서 100 °C로 10분 동안 배양합니다. 샘플을 12,000 ×g에서 1분간 원심분리하여 비드를 침전시킵니다.마지막으로, 비드를 건드리지 않고 상층액을 조심스럽게 수집하여 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 HEK293 세포의 세포 배양 형질전환 및 세포 용해를 수행합니다. 그런 다음, 각 시료당 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 들어 있는 25 µL의 50% 니켈 니클로트리엣산 아가로스 비드를 RIPA 버퍼로 세척합니다.4°C에서 3,000 ×g로 3분간 원심분리하여 비드를 수집합니다. 각 시료에 1 M emytozol을 첨가하여 최종 농도가 10 mM이 되도록 합니다. 그런 다음 각 시료를 준비된 agoros 비드가 들어 있는 튜브에 넣습니다.비즈와 용해물을 4°C에서 2시간 동안 부드럽게 회전시키며 배양합니다. 그다음 4°C에서 3,000 ×g로 3분 동안 비즈를 원심 분리합니다. 원심 분리 후, 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다.비드의 손실을 방지하기 위해, 비드를 완전히 흡입하여 건조시키지 마십시오. 그다음, 20 millimolar emytozol이 포함된 세척 버퍼 1 mL로 비드를 세척합니다. 원심 분리로 비드를 회수하기 전, 4 °C에서 15분 동안 회전시켜 튜브를 충분히 혼합하십시오.마지막 세척 후, 250 millimolar emitozol이 포함된 Eleusian 완충액 30 µL를 각 샘플에 첨가하고 튕겨서 섞습니다. 그런 다음 단백질을 용출시키기 위해 샘플을 4 °C에서 20분 동안 배양합니다. 각 샘플을 6x SDS page 로딩 완충액과 혼합합니다.그 다음, 튜브를 히트 블록을 사용하여 100 °C에서 10분 동안 배양합니다. 원심분리 후, 면역침전 또는 풀다운 시료를 4%~20% 그래디언트 SDS-PAGE 겔에 로딩합니다. 단백질을 분리하기 위해 120 V에서 90분 동안 전기영동을 수행합니다.세포 주기 동기화 및 내인성 rb 종의 면역침전 후, 초기 G1기에서 anti SUMO one 항체를 통해 SUMO 신호의 존재를 특이적으로 검출하였습니다. 대표적인 결과는 SUMO E2 효소인 UBC9를 rb 단백질의 C 말단에 직접 융합시켜 rb 단백질의 강제 SUMO화를 보여줍니다. 가장 느리게 이동하는 SUMO화된 rb 단백질에 주목하십시오.rb의 SUMO 결핍 돌연변이체인 K720R을 사용하여 세포 내 rb SUMOylation의 존재를 추가로 확인하였습니다. 따라서 이 절차를 통해 배양 세포 내의 다른 여러 SUMO 표적 단백질을 분석할 수 있습니다. 대부분의 경우 기질의 매우 적은 부분만이 SUMOylation되므로, 이 절차를 수행할 때는 면역침전 효율을 최적화하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 순차 효소 캐스케이드를 사용하여 기질 단백질의 SUMOylation을 위한 in vitro 방법을 보여줍니다. 또한, 단백질의 SUMOylated 상태는 전기영동 및 면역블로팅 기술을 사용하여 식별됩니다.

SUMOylation Assay: 면역블로팅을 통해 기질 단백질의 SUMOylation 상태를 검출하는 In vitro 기술

비례 생체 분자 비콘 (RBMBs)는 살아있는 세포에서 이미지를 하나의 설계 RNA 전 사체로 사용할 수 있습니다. 여기서 우리는 RBMBs, microporation 실시간으로 단일 RNA 전 사체의 형광 이미징에 의해 세포로 RBMBs 전달의 준비 및 정제에 대해 설명합니다.

비례 생체 분자 비콘을 사용하여 살아있는 세포의 단일 엔지니어링 RNA 성적 증명서의 실시간 영상

이 원고는 신진 효모 사카로 마이 세스 세레 비지에, sumoylation 및 동원체 단백질, Ndc10 및 Ndc80의 유비퀴틴의 검출에 대해 설명합니다.

Sumoylation과 신진 효모 동원체 단백질 Ndc10과 Ndc80의 유비퀴틴 화를 감지 할 수 있습니다 단백질 정제 기술

단백질-단백질 상호 작용은 세포의 핵과 세포질 모두에서 발생할 수 있습니다. 이러한 상호 작용을 조사하기 위해 기존의 동시 면역침전과 현대의 근접 결찰 분석법이 적용됩니다. 이 연구에서는 이 두 가지 방법을 비교하여 핵과 세포질에서 NF90-RBM3 상호 작용의 분포를 시각화합니다.

공동 면역 침전에 의한 핵 및 세포질 분수에서 단백질 - 단백질 상호 작용의 시각화 및<em&gt; 현장에서</em&gt; 근접 내고 분석

우리는 RNA 의무적인 단백질을 확인 하 고 중재 하는 UV photocrosslinking 및 질량 분석을 사용 하 여 라이브 셀에서 그들의 RNA 바인딩 영역 지도를 프로토콜을 설명 합니다.

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

유비퀴틴 ligases와 달리 몇 E3 스모 ligases가 확인 되었습니다. 이 수정 된 생체 외에서 SUMOylation 프로토콜 생체 외에서 재구성 분석 결과 의해 소설 스모 E3 ligases를 확인 할 수 있다.

생체 외에서 스모 E3 리가 활동 공부 SUMOylation 분석 결과

여기 선물이 있는 어떤 단백질 수 수 조건부로 비활성화 역 그것의 지배적인 부정적인 돌연변이 버전 overexpressing에 의해 지배 부정적인 유도할 수 있는 시스템을 개발 하는 프로토콜.

유도할 수 있는 고 가역 지배-네거티브 (DN) 단백질 억제

스모는 필수적이 고 고도로 보존 된, 작은 유비퀴틴 같은 수정자 단백질입니다. 이 프로토콜에서 우리는 스트레스를 견딜 수 있는 재조합 스모-포착 단백질 (kmUTAG)의 사용을 설명 하 여 다양 한 세포 유형에 서 고유 하 고 태그가 지정 되지 않은 스모 결합체와 그 현지화를 시각화 합니다.

스모를 이용한 스모 변성 단백질의 국 소화-단백질 포착

여기서, 우리는 스모 결합 엔티티(SUBEs)를 사용하여 인간 간종 세포및 간 종양으로부터 수득된 인간 간종 세포 및 간 종양모두에서 SUMO에 의해 변형된 단백질을 풍부하게 하고, 분리하고, 식별하고, 특성화하는 프로토콜을 제시한다.

간암에서 스모 프로테오메의 농축, 격리, 식별 및 특성화를 위한 도구로 스모 결합 엔티티(SUBEs)

이 프로토콜은 치료 또는 표현형과 같은 특정 조건과 관련된 이러한 종류의 번역 후 수정 (PTM)의 변경을 식별하기 위해 유비퀴틴 (Ub) 및 유비퀴틴 -좋아요 (Ubls) 특정 프로테오옴을 확립하는 것을 목표로합니다.

유비퀴틴 및 유비퀴틴과 같은 종속 적 번역 후 수정 및 중대한 변경 식별 프로파일링

이러한 프로토콜은 세포에서 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼라아제(PRMT) 제품군의 개별 구성원의 효소 활성을 평가하는 데 사용되는 방법론을 제공한다. 내인성 및 외인성 바이오마커, 메틸-아르기닌 인식 항체 및 억제제 툴 화합물을 이용한 PRMT 활성 평가에 대한 상세한 지침이 설명되어 있다.

세포에서 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼라제 1-9 활성을 연구하는 정량적 방법

학습하세요 인간 세포에서 Rb 단백질 SUMOylation을 검출하는 방법을. HEK293 세포를 사용하여 내인성 및 외인성 조건에서 단백질 수정을 분석하고 세포 주기 조절 메커니즘을 이해하세요.

Vivo에서 검색 및 Rb 단백질 SUMOylation 인간 세포에서의 분석

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