C. 선 충 장 한 모델으로 루멘 Morphogenesis 세포를 단일 세포 수준에서 Vivo에서 편광 막 속: 항 체 얼룩이 지기, RNAi 손실의 기능 분석 및 이미징 라벨

이 표준 방법 조합의 전반적인 목표는 단세포 및 하위 세포 수준에서 편광막 생물 발생 및 내강 형태 형성의 생체 내 분석에 예쁜꼬마선충 장을 사용하는 방법을 입증하는 것입니다. 이 방법은 극성 및 생물 발생 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 형태 형성 중 및 후에 정점 대 기저측 막 도메인 및 기타 세포 내 비대칭이 어떻게 설정되고 유지되는지와 같은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 모델 시스템의 주요 장점은 20개의 세포로 구성된 이 투명한 단일층이 생체 내 조직 챔버에서 생존하여 단세포 편광 막과 내강 생물 발생을 해부할 수 있다는 것입니다.

이 기술은 다른 C.Elegans 형태 형성 표현형 분석으로 확장될 수 있으며, 여기서는 막 생물 발생, 특히 정점 막 및 내강 생물 발생에 대한 분석에 중점을 둡니다. 이 절차에는 고정된 동물과 살아 있는 동물을 대상으로 한 정교한 이미징 기술이 포함되어 있어 막 도메인과 세포 내 구성 요소를 구별하고 예쁜꼬마선충 장에서 루멘 형태 형성 표현형을 식별합니다. 장 세뇨관 형성에 관한 이 비디오는 배외관 세뇨관 형성에 대한 비디오와 함께 편광 막 생물 발생의 생체 내 분석에서 상호 정보 모델을 제공합니다.

라이브 이미징을 위해 형광 표지된 융합 단백질로 형질전환 동물의 생성을 라벨링하는 것과 관련하여, 배구관 세뇨관 형성 분석에 대한 첨부 비디오에 설명되어 있습니다. 이러한 동물은 RNAi 실험에 직접 사용할 수 있습니다. 3세대는 일반적으로 이러한 절차 조합의 첫 번째 단계입니다.

이 비디오는 동물을 고정해야 하는 항체 염색 대체 라벨링 방법으로 시작합니다. 다양한 라벨링 절차는 일반적으로 최종 이미징 분석에 사용되는 면역조직화학과 결합할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 또한 장 특이적 막 마커, 프로모터 및 두 라벨링 절차에 유용한 기타 리소스의 예가 있습니다.

면역조직화학을 입증한 후, 이 비디오는 ERM-1 GFP로 장 정점 막을 표지하는 형질전환 균주를 사용하여 RNAi를 사용하여 극성 및 루멘 형태 형성 표현형을 검색합니다. 먼저 벌레를 고칠 슬라이드를 준비합니다. 30마이크로리터의 폴리-L-라이신을 슬라이드에 피펫팅한 다음 두 번째 슬라이드를 다른 슬라이드에 놓고 함께 떨어뜨려 용액을 양쪽에 고르게 펴 바릅니다.

이제 두 개의 슬라이드를 떼어내고 30분 동안 자연 건조시킵니다. 그런 다음 액체 질소로 채워진 용기에 평평한 금속 블록을 넣습니다. M9 용액으로 플레이트를 세척하고 웜이 들어있는 M9 약 10 마이크로 리터를 옮깁니다.

또는 웜을 선택하고 슬라이드에 M9를 추가합니다. 웜이 옮겨지면 커버 슬립을 부드럽게 떨어뜨려 커버 슬립이 한쪽 가장자리를 걸도록 웜 위에 교차시킵니다. 그런 다음 측면 움직임 없이 커버 슬립을 부드럽게 누릅니다.

이제 즉시 슬라이드를 액체 질소의 금속 블록으로 옮기고 얼립니다. 5분 후 돌출된 가장자리를 사용하여 커버 슬립을 튕깁니다. 큐티클의 적절한 균열을 얻으려면 신속하게 이 작업을 수행하십시오.

다음으로 섭씨 영하 20도의 메탄올로 채워진 유리 코플린 항아리에 슬라이드를 담그십시오. 5분 후 슬라이드를 아세톤으로 채워진 유리 Coplin 용기로 옮기고 동일한 온도에서 5분 동안 더 이동합니다. 슬라이드는 직접 염색하거나 섭씨 영하 20도에서 보관할 수 있습니다.

아세톤에서 슬라이드를 제거하고 실온에서 자연 건조시킵니다. 다음으로, 슬라이드 아래쪽에 바셀린의 원형 벽 위치를 표시한 다음 젤리 벽을 쌓습니다. 이 절차를 수행하는 동안 젤리를 문지르지 마십시오.

다음으로 젖은 종이 타월이 있는 쓰레기통에 젖은 챔버를 준비하고 슬라이드를 그 안에 있는 선반에 놓습니다. 수건과 슬라이드 사이 또는 인접한 슬라이드 사이에 접촉이 없어야 합니다. 이제 해당 영역을 덮을 수 있도록 젤리 서클에 충분한 PBS를 피펫으로 넣습니다.

피펫 끝을 원의 가장자리에 부드럽게 놓고 액체가 벌레 위로 부드럽게 분산되도록 합니다. 그런 다음 뚜껑을 닫고 5분 동안 기다립니다. 5분 후 슬라이드를 기울이고 슬라이드에서 벌레를 잃지 않도록 주의하면서 PBS를 천천히 흡인합니다.

다음으로 젤리 서클에 갓 준비한 차단 용액을 조심스럽게 채웁니다. 그리고 슬라이드를 실온에서 15분 동안 배양합니다. 15분 후 차단 용액을 1차 항체가 포함된 차단 용액으로 교체합니다.

그리고 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 슬라이드를 배양합니다. 다음날 1차 항체를 제거하고 차단 용액을 3회 도포와 제거하여 슬라이드를 세척합니다. 각 블록 애플리케이션이 10분 동안 인큐베이팅할 수 있도록 허용합니다.

다음으로 차단 용액에 희석된 2차 항체를 첨가하고 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후 블로킹 용액으로 슬라이드를 두 번 세척한 다음 PBS로 한 번 세척합니다. 그런 다음 표본이 마르지 않도록 가능한 한 많은 PBS를 제거하고 표본 주변의 젤리를 조심스럽게 제거합니다.

표본에 장착 매체 한 방울을 바르고 커버 슬립과 매니큐어 씰을 바르십시오. 그런 다음 슬라이드를 섭씨 4도의 어두운 곳에 보관하십시오. RNAi 라이브러리 플레이트를 섭씨 영하 80도에서 드라이아이스로 옮깁니다.

밀봉 테이프를 제거합니다. 그리고 관심 클론을 선택적 오거로 옮깁니다. 그런 다음 클론을 줄무늬를 제거하고 밤새 박테리아를 성장시킵니다.

라이브러리 플레이트를 섭씨 영하 80도의 냉동고에 다시 넣기 전에 새 밀봉 테이프를 바르십시오. 다음 날, 플레이트의 콜로니를 암피실린을 함유한 1밀리리터의 액체 배지 분취액에 접종합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 약 14시간 동안 흔듭니다.

다음 날 클론당 200마이크로리터를 별도의 RNAi 플레이트에 파종합니다. 플레이트를 건조시키고 실온에서 하룻밤 배양으로 RNAi 생산을 유도합니다. 하루 후, 5개의 L4 단계 웜을 표적이 된 특정 유전자로 표지된 각 RNAi 플레이트로 옮깁니다.

그런 다음 플레이트를 일반적으로 섭씨 20도의 인큐베이터로 옮깁니다. 먼저 저배율 및 고배율의 밝은 빛 아래에서 대조군과 RNAi 동물을 비교하십시오. 다음으로, 적절한 필터 아래에서 형광등 아래에서 대조군 대 RNAi 동물을 조사합니다.

RNAi 동물이 있는 플레이트를 전체 플레이트의 왼쪽 상단에서 오른쪽 하단까지 체계적으로 스캔하여 표현형을 검색합니다. 관심 있는 동물을 찾으십시오. 선택한 RNAi 표현형을 자세히 검사하려면 장에 초점을 맞추고 확대/축소를 사용하여 세뇨관 형성 및 루멘 형태 형성 표현형을 평가합니다.

컨포칼 현미경 검사에서 관심 있는 벌레를 검사하려면 먼저 장착하고 손으로 고정시킵니다: 유리 슬라이드에 진공 그리스 또는 바셀린을 얇게 원을 그리십시오. 그리스 층은 0.1mm보다 두껍지 않은 얇아야 합니다. 다음으로 약 3.5마이크로리터의 10밀리몰 아지드나트륨을 원 중앙에 추가합니다.

그런 다음 용액이 마르기 전에 해부 현미경으로 용액에 관심 있는 벌레를 신속하게 선택합니다. 그런 다음 커버 슬립을 부드럽게 바르고 30분 이내에 동물을 이미지화합니다. 약한 압력을 사용하고 현미경으로 벌레가 용액에 떠 있지 않은지 확인합니다.

컨포칼 현미경에서 저전력과 초점으로 웜을 찾습니다. 그런 다음 60 또는 100X 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 장을 보고 이미지화합니다. 다음으로, 적절한 채널로 형광등 아래에서 동물을 검사하여 관심 있는 세포 결함을 표시하는 영역을 선택합니다.

사진 표백을 방지하기 위해 신속하게 움직입니다. 그런 다음 레이저 스캔으로 전환하고 등쪽과 복부 쪽에서 스캔 경계를 설정하여 이미지를 장으로 제한합니다. 이미지 시리즈를 캡처하고 나중에 이미지를 단일 프로젝션 이미지로 병합합니다.

이 프로토콜은 정점막과 내강 형태 형성이 일치하는 발달 중인 예쁜꼬마선충 장에서 편광된 막 생물 발생을 분자적으로 분석하고 시각적으로 해부하는 방법을 설명합니다. 정점 및 기저외측 막 도메인, 막 관련 연접부 및 장 내강을 해결할 수 있으며 발달 전반에 걸쳐 서로에 대한 관계를 검사할 수 있습니다. 이러한 세포 내 구성 요소는 동반 논문에 설명된 대로 이중 또는 삼중 표지를 위해 형광 표지된 항체 또는 형광 융합 단백질에 의해 표지될 수 있습니다.

총 루멘 결함은 해부 형광 현미경을 사용하여 빠르게 스캔할 수 있습니다. GFP에 결합된 정점 세포막 링커 ERM-1은 RNAi 스크리닝에 유용한 견고하게 발현된 마커입니다. 이 마커를 사용할 때 기저 유전자 결함과 함께 일련의 새로운 장 내강, 형태 형성 및 극성 표현형이 밝혀졌습니다.

그런 다음 컨포칼 레이저 스캔으로 획득한 고배율 이미지를 사용하여 표현형을 보다 주의 깊게 검사하여 근본적인 결함을 더 잘 이해했습니다. 일부 표현형은 정량화될 수 있습니다. 이러한 결함을 비교하고 개발을 통한 진행 상황을 추적하기 위해 정량화가 사용되었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 면역 염색을 통해 장막과 내막(endo membrane compartment)을 라벨링하는 방법과 편광막(polarized membrane) 및 내강(lumen) 생물발생의 기능 RNAi 표현형을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.