Name: C. 선 충 장 한 모델으로 루멘 Morphogenesis 세포를 단일 세포 수준에서 Vivo에서 편광 막 속: 항 체 얼룩이 지기, RNAi 손실의 기능 분석 및 이미징 라벨 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: 배우세요 C. elegans 장을 이용한 단일 세포 수준 편광 막 생물학 및 루멘 형태 발생 분석 방법입니다. 항체 염색, RNAi 기능 상실 분석 및 정밀 이미징 기법을 활용하여 생체 내 막 생물학 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

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우리 감사 마리오 데 보노 (MRC 분자 생물학의 실험실, 케임브리지, 영국), 케네스 J. Kemphues (코넬 대학, Ithaca, 미국), 미셸 Labouesse (Institut de Biologie 파리 세 느 강, 대학교 피에르 외 마리 퀴리, 파리, 프랑스), 그레고리우스 미 쇼 (대학교 드렌 1, 렌, 프랑스)와 CGC, 긴장 및 항 체에 대 한 NIH 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 사무실에 의해 자금. 이 작품은 NIH GM078653, MGH는 224570 V.G.에 SAA 223809 교부 금에 의해 지원 되었다

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저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

이 프로토콜 표준 기능 손실 유전/RNAi 및 이미징 (라벨 부착 및 현미경) 접근 시각과 분자 해 부 의 생체 조건에 대 한 모델로 C. 선 충 장 상피의 활용을 결합 하는 방법을 설명 합니다. 편광된 막과 루멘 속.
라벨
이 프로토콜은 항 체 얼룩이 지기에 초점을 맞추고. 제자리에서 항 체에 의해 라벨 라벨 형광 성 융해 단백질 (배설도 막 속에 동반 종이에 설명)2에 의해 매우 구체적인 대체 접근 방식입니다. 비록 항 체 얼룩이 라이브 이미징 허용 하지 않습니다, 그것은 (어느 라벨 방법은 실패 하지 않고) 관심사의 단백질의 지역화에 대 한 확인을 제공할 수 있습니다. 또한, morphogenesis 또는 단백질의 subcellular 지 방화에 관한 질문 종종 고정 동물에서 평가 수 있습니다. Immun...

세포 및 subcellular asymmetries, 편광된 막 도메인의 형성 등의 세대 morphogenesis 및 셀, 조직 및 장기1의 기능에 결정적 이다. 여러 연속과 일치 extracellular 및 세포내 신호는 의존 subcellular 구성 요소 할당에 방향 변경 이후 epithelia에 편광된 막 속에 대 한 연구 기술 도전 남아 어려운 대부분의 모델에서 분리 하 고 강하게 모델 시스템에 따라 달라 집니다. 모델은 여기에 제시-단일 층 꼬마 선 충 장-절묘 한 단순의 조직 이다. 단일 셀과 함께 배설 C. 선 충 ( C. 선 충 배설 운하에 편광된 막 속에 종이 동반 참조)2운하, 식별에 대 한 여러 독특한 이점을 제공 하 고 편광된 막 속에 필요한 분자 특성 이 간단한 무척 추 동물 기관 효 모에서 남자에 분자 극성 단서의 보존에 게 훌륭한"vivo에서 조직 챔버" 상피의 극성에도 아직까지 인간의 시스템에 직접적인 관련성 주소 질문에 복잡 한 단일 이러한 이벤트의 시각적 해 부를 허용을 세포 수준 비보.
비록 extracelluar 매트릭스 (1), (2) 플라즈마 멤브레인 교차점, 및 (3) 세포내 기공을 매매에서 여러 보존된 극성 신호 왔다 발견된3, 그들의 통합의 과정의 기본 원리 편광 된 상피 막과 조직 속에는 불완전 하 게 이해4입니다. 클래식 단일 셀에 vivo에서 모델 (e.g.S. cerevisiae 와 선 충 C. zygote) 편광된 세포 분열 및 이전 후부 극성의 원칙을 정의 수단이 고 중요 한 식별 멤브레인 관련 극성 (작은 GTPases/CDC-42, 분할 결함 동위) 결정 요인5,6, 하지만 그들은 신호 (버드 흉터, 정자 항목)을 깨는 독특한 대칭에 의존 하 고 접점 확보 부족 apicobasal 막 도메인 그리고, 아마도, 해당 세포내 apicobasal 기계를 정렬. 그러나 편광 epithelia, 매매의 조직에 대 한 우리의 현재 지식, 주로 의존 포유류 2D monocultures7는 막의 위치를 변경할 수 있는 세포 외 및 발달 생리 신호 부족 도메인 및 밀매 궤도의 방향 (혼자 문화 시스템 3 차원 생체 외에서 2D에서 스위치 MDCK (Madin-다 비 개 신장) 세포에서 막 극성 반전 충분)8. 무척 추 동물 모형 유기 체에서 상피 극성에 발달 학문 vivo에서 초파리 melanogaster 표 피, 그들은 중요 한 기여를 식별 하는 어디에 예를 들어 평면 epithelia에 처음 실시 했다 접합 역학 편광된 셀 마이그레이션 및 셀 시트 운동9, 그리고 극성 유지 보수10endocytic 인신 매매의. 3 차원 생체 외에서 및 MDCK 세포와 선 충 C. 소장 관 epithelia에 루멘 morphogenesis의 분석 vivo에서 각각 최근 확인 드에 대 한 세포내 매매의 요구 노 보 (꼭대기) 도메인 및 루멘 속11,,1213위치. 두께의 (평면) 대 관 상피 세포는 subcellular asymmetries의 3D 분석에 대 한 장점 꼭대기 lumenal 막, apico-측면 접합, 측면 막의 뛰어난 시각적 구별 허용 이후와 세포내 세포의 위치입니다. 이러한 시각적 장점에 선 충 C. 모델에 비보 설정, 개발 축, 투명도, 몸 계획, 고정 및 정의 된 세포 계보, 분석의 단순 추가 (유전) 및 아래에 설명 된 추가 장점.
C. 선 충 자체는 관 구조 그의 투명성 및 간단한 건축 마찬가지로 관 내부 장기는 직접에 액세스할 수 있도록 튜브와 루멘 morphogenesis의 시각적 분석의 거 위. 그것의 창 (21 또는 22 셀에 경우에)14 의 20 셀 단일 조상 셀 (E)에서 파생 된과 9 INT 반지의 양측 대칭 관으로 한 윤 단계 두 계층 상피에서 개발 (4 개의 세포는 첫 번째 링; 그림 1 도식)14,,1516. 내장의 계보 및 조직 분석, 처음 결정 핵 정체성17통해 Nomarski 광학에 의해 이후에 의해 레이블이 막 통해 형광 현미경 검사 법에 자사의 morphogenesis에 중요 한 통찰력을 제공 하고있다 특정 방향 세포 분열 및 움직임 (예, 윤, 오른쪽 왼쪽 asymmetries, 앞쪽에 및 사후 관 회전)14,18 셀 자치 및 셀-비-자치 요구 사항 . 초기 endodermal 셀 사양 및 기관이 클론 모델의 개발을 제어 유전자 규제 네트워크 잘 특징이19,20있습니다. 그러나 여기에,, 초점은 편광된 막과 단 관 세포의 루멘 속의 endomembranes, cytoskeletal 구조와이 과정을 동반 하는 세포의 세포내 asymmetries의 분석에 있습니다. 분석은 어디 (ultrastructural 수준에 microvilli로 구분) 모든 꼭대기 막 루멘 얼굴과 모든 기저 막 서로 연락 측면 멤브레인과 외부 튜브 표면, 얼굴,이 튜브의 단순에 의해 촉진 된다 접합 하 여 꼭대기 막에서 분리 (그림 1 회로도; C. 선 충에 대 한 참조 참조 (16,21)-꽉의 특정 조직 및 외화 접합 구성 요소). 꼭대기 막 속은 이렇게 루멘 morphogenesis 일치 이다. 또한, 성인 장 세포-배설 셀의 예외) (와이 작은 동물의 가장 큰 셀-의 크기 대략 vivo에서 시각적 추적의 subcellular 요소, 예를 들면 허용, 포유류 세포의 크기 일반적으로 소포 궤적에 시도 생체 외에서 문화 접시에.
이 세포 및 subcellular 분석을 위해 적절 한 라벨링은 중요 합니다. 장 엔 또는 플라즈마 멤브레인 도메인, 접합, cytoskeletal구조, 핵 및 다른 subcellular 세포는 그들의 특정 분자 구성 요소에 라벨 하 여 구상 될 수 있다. 이러한 많은 구성 요소 특징 되었습니다와 발견 계속 (표 1 몇 가지 예제를 제공 하 고 리소스 참조). 예를 들어, 플라즈마 막에 포스트-골 지 소포를 통해 골을 응급실에서 장 endomembrane 시스템의 관 또는 기공을 구획을 구별 하는 다양 한 분자 식별된22되었습니다. 특정 단백질 (로 지질과 당 분) 수 중 표시를 직접 또는 간접적으로 단백질 바인딩 통해. 이 프로토콜은 제자리에 고정된 표본, 두 표준 라벨 기법 중의 항 체 얼룩이에 초점을 맞추고 (동반 종이 대 한 설명은 다른 기술2 -배설 운하 tubulogenesis에 참조 vivo에서 라벨 형광 성 단백질 융해-소장;에 직접 적용 되는 통해 테이블 2 소장 같은 융해 단백질의 표정 드라이브를 사용할 수 있는 내장 전용 발기인의 예를 제공 합니다). 더블-또는 어느 방식으로 또는 두 플러스 추가 화학, 얼룩이 지기의 조합으로 여러 라벨 수 큰 깊이 있는 영상 해상도 공동 지역화에 공간 및 시간적 변화의 시험 및 특정의 모집 분자 또는 subcellular 부품 (그림 2). 고정 하 고 녹색 형광 단백질 (GFP) immunostaining 절차 동안 라벨의이 프로토콜 지원 보존에 설명 된 절차를 얼룩. 이미징에 대 한 핵심 포인트는 검출 및 표준 현미경 절차 (형광 해 고 confocal 현미경 검사 법)를 통해 고기는 tubulogenesis의 (, 그림 3 4설명). 이러한 고해상도 이미징 인스턴스 해상도 현미경 검사 법 그리고 전송 전자 현미경 검사 법 (여기 설명)에 대 한 접근을 확장할 수 있습니다.
이 시스템의 주요 힘은 성인 기 통해 embryogenesis에서 다른 발달 단계에서 개별 셀에 극성을 분석 하는 능력 이다. 예를 들어, 꼭대기 막 도메인 및 루멘 속 추적할 수 있습니다 단일 세포 수준에서 개발에 걸쳐 음-1, Ezrin-Radixin-Moesin 가족23,24의 높은 보존된 막 걸 링커로 통해 . 음-1 때 수반 편광된 세포 분열 및 마이그레이션 (apically 윤 중 루멘 주위 세포 이동)15; 배아 튜브 morphogenesis, 동안 꼭대기 막 속 (1) 시각화 (2) 세포 분열 또는 마이그레이션;의 부재에서 진행 하는 늦은 배아와 애벌레 튜브 확장 중 (3) 편광된 막 도메인 (그림 1)을 유지은 성인 소장에서. 확장 포스트 mitotic 애벌레 상피에 드 노 보 편광 막 속 따라서 편광된 조직 morphogenesis 불가능 대부분 vivo에서 그리고 생체 외에서 상피 극성 모델에,에서 분리 될 수 있다 단일 셀 해상도 (예: 3D MDCK 낭종 모델8)에 그들을 포함 하 여. 다른 구성 요소에 대 한 라벨,이 설정은 제공 기회 (특히 L1 애벌레 단계에서 때 세포가 높은 세포질/핵 비율) 막 속 (편광에 관련 된 그 세포내 변화를 구별 하 예를 들어 밀매 궤적의 재교육) 수반 편광된 세포 분열 및 마이그레이션에 필요한에서.
C. 선 충 의 유전자 다양성은 잘 알려진25그리고 생물학 질문의 분자 분석에 대 한 강력한 모델 시스템. Morphogenesis에 대 한 연구 예를 들어, 야생-타입 스트레인, 관심 (예: 막)의 구조 라는 형광 표시와 함께 또는이 결함 손실 또는 이득-의-기능 돌연변이와 유전자 변형 긴장을 시작할 수 있습니다. 구조입니다. 전형적인 역 유전자 연구 mutagenesis (일반적으로 생산 필연적인 손실, 감소, 또는 기능에 이득 포인트 돌연변이 의해 수정 (예: 대상된 삭제에 의해), 생식에 관심사의 유전자 삭제 돌연변이 생성할 수 있습니다. 유전자), 또는 그것의 사본을 RNAi에 의해 감소 된다. 먹이 선 충 C.26 에 의해 RNAi의 용이성 또한 관심사의 유전자의 큰 그룹을 검사 하는 대상 화면 디자인에 적용 됩니다. 유전자 모델 생물의 틀림 없이 가장 큰 힘이 이다 vivo에서 앞으로 화면 (예: mutagenesis, 체계적인 또는 게놈 넓은 RNAi 스크린)의 표현 형에 대 한 분자 원인으로 중 정한 조회를 수행 하는 기능 관심입니다. 예를 들어, 편견된 visual 유전자 변형 동물 꼭대기 막 음 1 표시와 함께 시작 하는 선 충 C. RNAi tubulogenesis 스크린, 발견 한 흥미로운 가역 장의 극성 변환 및 소성 루멘 형, 사용 분석의이 유형에 대 한 예로 여기. 이 화면이이 극성을 일으키는 특정 분자 결함으로 glycosphingolipids (GSLs; 의무 막 지질, 그들의 GLS 생 합성 효소를 통해 식별)의 고갈 및 소포 코트 clathrin와 그것의 AP-1 어댑터의 구성 요소 식별 변환 형, 따라서 vivo에서 으로 분자를 밀매 이러한 특성화 꼭대기 막 극성과 루멘12,13위치에 대 한 단서. 같은 화면 (또는 단일 유전자/RNAi 상호 작용 실험) 수 관심 (참조 종이 배설에 동반의 두 개 또는 여러 개의 유전자 간의 상호 작용을 기능 검사 또한 특정 유전자 돌연변이/morphogenesis 표현 형으로 시작, 이 같은 분석의 예 운하)2. 이 프로토콜은 RNAi는 직접 그 손실 앞으로 스크린에 표현 형을 하면 유전자를 식별 하는 능력 뿐만 아니라 morphogenesis의 분석에 대 한 구체적인 장점을 제공에 집중 한다. 종종 morphogenesis 감독 유전자 제품 복용량 의존 방식에서 작동, RNAi 이므로 일반적으로 고기의 스펙트럼을 생성에 성공. 유익한 부분 손실의 기능 고기를 생성 하는 기능 또한 중요 한 tubulogenesis 유전자의 대다수는 필수 고 그들의 손실을 불 임의 원인과 초기 배아 치 사 율 그 문제를 해결 하기 위해 도움이 됩니다. 이 프로토콜이이 어려움을 극복 하기 위해 조건부 RNAi 전략을 포함 하 고 고기, mutagenesis에 의해 생산 하는 유전자 시리즈의 광범위 한 스펙트럼의 생성을 최적화 하는 방법을 제안.

<table><tbody><tr><td>항체 염색</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>Fisher Scientific</td><td>A949SK-4</td><td></td></tr><tr><td>트윈</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-213-612</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>분유</td><td>시그마</td><td>MT409-1BTL</td><td></td></tr><tr><td><강력한>일차 항체</강력한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MH27 (마우스)</td><td></td><td></td><td>농도: 1:20 자원: 발달 연구 Hybridoma Bank.</td></tr><tr><td>MH33 (마우스)</td><td></td><td></td><td>농도: 1:10 자원: Developmental Studies Hybridoma Bank.</td></tr><tr><td>anti-ICB4 (토끼)</td><td></td><td></td><td>집중: 1:5 자원: A gift from Mario de Bono (Medical Research Council, England)</td></tr><tr><td>anti-PAR-3 (rabbit)</td><td></td><td></td><td>집중: 1:50 자원: A gift from Kenneth J. Kemphues (Cornell University)</td></tr><tr><td>Secondary antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Floor 568 (anti-rabbit)</td><td>ABCam</td><td>AB175471</td><td>농도 : 1:200</td></tr><tr><td>Cy5 (안티 마우스)</td><td>Life technologies</td><td>A10524</td><td>농도 : 1:200</td></tr><tr><td>TRITC (안티 토끼)</td><td>Invitrogen</td><td>T2769</td><td>농도 : 1:200</td></tr><tr><td>FITC (안티 마우스)</td><td>Sigma</td><td>F9006</td><td>농도 : 1:100</td></tr><tr><td>라벨링 된 화학 물질</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-Phalloidin</td><td></td><td></td><td>농도: 1:100 자원: Molecular Probes-T7471</td></tr><tr><td>재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>진공 그리스 실리콘</td><td>Beckman</td><td>335148</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>4448</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버슬립 (22x22-1)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans related</td><td></td><td></td><td>표준 C. elegans Culture and Maintenance Procedures는 Reference29 를 참조하십시오.</td></tr><tr><td>프로토콜은 LB Medium 및 plates</td><td></td><td></td> <td>참조29 참조.</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Acros Organics</td><td>611845000</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214040</td><td></td></tr><tr><td>암피실린</td><td>시그마</td><td>A0116</td><td></td></tr><tr><td>테트라사이클린</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912</td><td></td></tr><tr><td>M9 프로토콜은 Medium</td><td></td><td></td>reference<td>29 참조</td></tr>.<tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>NGM plates</td><td></td><td></td><td>see reference29 프로토콜에 대해 설명합니다.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>펩톤</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td><td>Acros 유기물</td><td>611845000</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214040</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>시그마</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>RNAi plates</td><td></td><td></td><td>see reference30 프로토콜.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>펩톤</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td><td>Acros 유기물</td><td>611845000</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214040</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>시그마</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>US Biological</td><td>I8500</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2648</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>차아염소산나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>50371500</td><td></td></tr><tr><td>Bacteria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 박테리아</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT115 박테리아</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>게놈 와이드 RNAi 라이브러리 Ahringer 게놈 와이드 RNAi 공급 라이브러리(ref 30,49,50)</td><td>출처: BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref51)</td><td>출처: BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging related</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td>, <td>Fisher Scientific</td><td>BP9221-500</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td> 고출력 스테레오 형광 부착물이 장착된 <td>Nikon</td><td>SMZ-U</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경(Kramer Scientific), Q 캡처 소프트웨어가 있는 CCD 카메라 및 X-Cite 형광등(Photonic Solutions)</td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>레이저 스캐닝 컨포칼 현미경</td><td>Leica Microsystem</td><td>TCS SL</td><td></td></tr><tr><td>레이저 스캐닝 컨포칼 ECLIPSE Ti-E 도립형에 장착 현미경</td><td>니콘</td><td>C2</td><td></td></tr></tbody></table>

c. 선 충 장 한 모델으로 루멘 morphogenesis 세포를 단일 세포 수준에서 vivo에서 편광 막 속: 항 체 얼룩이 지기, rnai 손실의 기능 분석 및 이미징 라벨

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

다세포 튜브, 모든 내부 장기의 기본 단위는 루멘과 basolateral 막 서로 또는 세포 외 매트릭스 연락 안 감 꼭대기 멤브레인과 편광 된 상피 또는 내 피 세포의 구성 됩니다. 이 독특한 막 비대칭 설립 되 고 기관 morphogenesis 동안 유지 하는 방법 아직도 세포 생물학의 미해결된 질문 이다. 이 프로토콜 꼭대기 막 및 루멘 속에 강조와 함께 튜브 morphogenesis 동안 편광된 막 속의 분석을 위한 모델 선 충 C. 소장을 설명합니다. C. 선 충 20 셀 단일 레이어 창 자 상피 간단한 양측 대칭 관, 허용 하는 단일 세포 수준에서 분석으로 배열 된다. 막 분극 발생 합니다 수반 편광된 세포 분열 및 마이그레이션 동안 초기 embryogenesis, 하지만 드 노 보 편광 막 속 세포 이상 증식 및 이동 하는 때 애벌레의 성장을 통해 계속. 후자의 설정을 동시에 이러한 서로 다른 편광 프로세스, 대부분 극성 모델에서 구분 하기 어려운 중재 subcellular 변경 분리 있습니다. 꼭대기-basolateral 막-, 접합-, cytoskeletal-endomembrane 구성 요소 또는 수 있습니다 분류 및 GFP 융해 단백질에 의해 개발을 통해 추적 제자리에서 얼룩이 지는 항 체에 의해 평가. 생물의 유전적 다양성, 함께 C. 선 충 장 따라서 독특한 vivo에서 발달, 시각 모델과 편광된 막과 튜브 속의 분자 유전 분석을 제공합니다. 여기에 설명 된 특정 방법 (모든 표준) 포함 하는 방법: 항 체 얼룩이 지기; 여 장 subcellular 구성 요소 레이블 일반적으로 필수 tubulogenesis 유전자;에 적응 하는 손실의 기능 연구에 의해 편광된 막 속에 관련 된 유전자 분석 다른 발달 단계; 극성 결함 평가 epifluorescence, 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 및 confocal 현미경 검사 법; 고기 해석 시각적 결함을 계량. 이 프로토콜 분석 관련 된 매우 자주 보존된 분자의 상피 극성, 막 속, 튜브 및 루멘 morphogenesis 적용할 수 있습니다.

이 프로토콜 분자로 분석 하 고 단일 세포 및 subcellular 수준에서 선 충 C. 내장에서 편광된 막 속 및 루멘 morphogenesis 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 20-셀 단일 레이어 C. 선 충 장 감독된 세포 분열 및 중앙 embryogenesis 동안 마이그레이션에 의해 형성 된다. 도메인 설치 되 고,이 시간, 편광 막 아직 드 노 보 에서 편광된 막 속에는 성숙한 계속 하지만 편광 분석에 초점을 수 있도록 성인 기까지 4 개의 애벌레 단계에 걸쳐 상피를 확대, 막 속 (그림 1A)
C. 선 충 세포 및 subcellular 구성 요소를 시각화 하려면 두 가지 일반적으로 사용 됩니다: 면역 형광 (에 대 한 자세한이 프로토...

투명 한 선 충 C. 소장"vivo에서 조직 챔버를" 다세포 tubulogenesis 동안 단일 세포 및 subcellular 수준 apicobasal 막과 루멘 속 공부에 대 한 될 수 있습니다. 이 프로토콜 표준 라벨을 결합 하는 방법을, RNAi/손실의 기능 유전자 및 분자 수준에서이 프로세스를 해 부 현미경 접근에 설명 합니다.

C. 선 충 장 한 모델으로 루멘 Morphogenesis 세포를 단일 세포 수준에서 Vivo에서 편광 막 속: 항 체 얼룩이 지기, RNAi 손실의 기능 분석 및 이미징 라벨

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

이러한 표준 방법들의 조합을 통한 전반적인 목표는 C.elegans 장을 이용하여 단일 세포 및 세포 하위 수준에서 분극화된 막의 생합성과 루멘 형태 형성의 in vivo 분석을 수행하는 방법을 입증하는 것입니다. 이 방법은 형태 형성 도중 및 그 이후에 정단부 대 기저-측면 막 도메인 및 기타 세포 하위 비대칭성이 어떻게 형성되고 유지되는지와 같은 극성 및 생합성 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 모델 시스템의 주요 장점은 단 20개의 세포로 구성된 이 투명한 단일 층이 in vivo 조직 챔버에서 생존할 수 있어, 단일 세포의 분극화된 막과 루멘 생합성을 분리하여 분석할 수 있다는 점입니다.이 기술들은 다른 C. elegans 형태 형성 표현형 분석으로 확장될 수 있으며, 본 문서에서는 막 생합성, 구체적으로 정단막 및 루멘 생합성 분석에 초점을 맞춥니다. 절차에는 고정 및 살아있는 개체에서 막 도메인과 세포 하부 구성 요소를 구분하고 C. elegans 장 내의 루멘 형태 형성 표현형을 식별하기 위한 정밀 영상 기술이 포함됩니다. 장 관 형성(intestinal tubulogenesis)에 관한 이 영상은 배설관 관 형성(excretory canal tubulogenesis)에 관한 영상과 함께 제공되며, 이는 극성 막 생합성의 in vivo 분석에 있어 상호 보완적인 모델이 됩니다.형광 표지 융합 단백질을 발현하는 형성동물의 제작 및 표지에 관해서는 배설관 관형 형성 분석에 관한 동반 영상에 설명되어 있습니다. 이러한 동물들은 RNAi 실험에 직접적으로 활용될 수 있습니다. 일반적으로 3세대 동물이 이러한 일련의 절차를 결합하는 첫 번째 단계가 됩니다.이 영상은 동물을 고정해야 하는 대체 표지 방법인 항체 염색부터 시작합니다. 서로 다른 표지 절차들을 조합할 수 있으며, 일반적으로 최종 이미지 분석에는 면역 조직 화학 염색이 사용됩니다. 또한 본 프로토콜에는 두 가지 표지 절차 모두에 유용한 장 특이적 막 마커 프로모터 및 기타 리소스의 예시가 포함되어 있습니다.면역조직화학법을 시연한 후, 이 비디오에서는 RNAi를 사용하여 극성 및 루멘 형태 형성 표현형을 탐색하기 위해 장 상단막을 ERM-1 GFP로 표지하는 형질전환 균주를 사용합니다. 먼저 벌레를 고정하기 위한 슬라이드를 준비합니다. 폴리-L-라이신 30 µL를 슬라이드 위에 피펫으로 분주한 다음, 두 번째 슬라이드를 그 위에 덮고 함께 떨어뜨려 용액이 양쪽 슬라이드에 고르게 퍼지도록 합니다.이제 두 슬라이드를 떼어내고 30분 동안 자연 건조시킵니다. 다음으로 액체 질소가 채워진 용기에 평평한 금속 블록을 넣습니다. 플레이트를 M9 용액으로 세척하고 벌레가 포함된 M9 용액 약 10 microliters를 옮깁니다.또는 웜을 골라낸 후 슬라이드에 M9을 추가합니다. 웜을 옮긴 후, 커버 슬립의 한쪽 끝이 바깥으로 나오도록 웜 위에 가로 방향으로 조심스럽게 떨어뜨립니다. 그런 다음, 측면으로 움직이지 않도록 주의하며 커버 슬립을 부드럽게 누릅니다.이제 즉시 슬라이드를 액체 질소가 담긴 금속 블록으로 옮겨 동결시킵니다. 5분 후, 돌출된 가장자리를 이용하여 커버 슬립을 튕겨내어 제거합니다. 큐티클이 적절하게 갈라질 수 있도록 이 과정을 빠르게 수행하십시오.다음으로 슬라이드를 -20 °C의 메탄올이 채워진 유리 Coplin jar에 담급니다. 5분 후, 동일한 온도에서 아세톤이 채워진 유리 Coplin jar로 슬라이드를 옮겨 다시 5분 동안 둡니다. 슬라이드는 즉시 염색하거나 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.슬라이드를 아세톤에서 꺼내 실온에서 자연 건조시킵니다. 다음으로 슬라이드 뒷면에 바셀린을 원형으로 바를 위치를 표시한 후, 바셀린 벽을 세웁니다. 이 과정에서 바셀린이 문질러져 지워지지 않도록 주의하십시오.다음으로, 젖은 종이 타월을 넣은 보관함에 습윤 챔버를 준비하고 그 안의 랙 위에 슬라이드를 놓습니다. 이때 타월과 슬라이드 사이, 또는 인접한 슬라이드 사이에 접촉이 없어야 합니다. 이제 젤리 원 영역을 덮을 수 있을 만큼의 PBS를 피펫으로 분주합니다.피펫 팁을 원의 가장자리에 조심스럽게 위치시키고 액체가 벌레 위로 부드럽게 퍼지도록 합니다. 그런 다음 뚜껑을 닫고 5분 동안 기다립니다. 5분 후 슬라이드를 기울이고, 슬라이드에서 벌레가 유실되지 않도록 주의하며 PBS를 천천히 흡입하여 제거합니다.다음으로 젤리 원 안에 갓 준비한 블로킹 용액을 조심스럽게 채웁니다. 그리고 슬라이드를 상온에서 15분 동안 배양합니다. 15분 후 블로킹 용액을 1차 항체가 포함된 블로킹 용액으로 교체합니다.그 후 슬라이드를 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 1차 항체를 제거하고 블로킹 용액을 세 번 도포하고 제거하여 슬라이드를 세척합니다. 각 블로킹 단계마다 10분 동안 배양합니다.다음으로 블로킹 용액에 희석한 2차 항체를 추가하고 슬라이드를 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후 슬라이드를 블로킹 용액으로 2회 세척하고 PBS로 1회 세척합니다. 그런 다음 시료가 마르지 않도록 주의하면서 PBS를 가능한 한 많이 제거하고 시료 주변의 젤리를 조심스럽게 제거합니다.시료 위에 마운팅 용액 한 방울을 떨어뜨린 후 커버슬립을 덮고 매니큐어로 밀봉합니다. 그다음 슬라이드를 4 °C의 암소에 보관하십시오. RNAi 라이브러리 플레이트를 -80 °C에서 드라이아이스로 옮깁니다.실링 테이프를 제거합니다. 그런 다음 관심 클론을 선택 배지에 옮깁니다. 클론을 스트리킹하여 박테리아를 하룻밤 동안 배양합니다.라이브러리 플레이트를 -80 °C 냉동고에 다시 넣기 전에 새로운 밀봉 테이프를 부착하십시오. 다음 날, 플레이트의 콜로니를 ampicillin이 포함된 1 mL의 액체 배지 분주액에 접종합니다. 그 후 37 °C에서 약 14시간 동안 흔들어 배양하십시오.다음 날, 클론당 200 µL를 각각의 RNAi 플레이트에 접종합니다. 플레이트를 건조시킨 후, 상온에서 하룻밤 동안 배양하여 RNAi 생산을 유도합니다. 하루 뒤, 표적 유전자가 표시된 각 RNAi 플레이트에 L4 단계의 웜을 5마리씩 옮깁니다.그 후 플레이트를 보통 20 °C의 인큐베이터로 옮깁니다. 먼저 저배율 및 고배율의 명시야광 하에서 대조군 동물과 RNAi 동물을 관찰합니다. 다음으로 적절한 필터를 장착한 형광광 하에서 대조군 동물과 RNAi 동물을 관찰합니다.RNAi 동물이 있는 플레이트의 왼쪽 상단부터 오른쪽 하단까지 전체적으로 체계적으로 스캔하며 표현형을 탐색합니다. 관심 있는 동물을 찾으십시오. 선택한 RNAi 표현형을 더 자세히 조사하려면 장(intestine)에 집중하고, 줌 기능을 사용하여 세관 형성(tubulogenesis) 및 루멘 형태 형성(lumen morphogenesis) 표현형을 평가하십시오.공초점 현미경으로 관찰 대상 벌레를 검사하려면, 먼저 유리 슬라이드 위에 진공 그리스 또는 바셀린으로 얇은 원을 그려 수동으로 고정합니다. 그리스 층은 0.1 millimeter보다 두껍지 않게 얇게 도포해야 합니다. 그다음, 원의 중앙에 10 millimolar sodium azide 약 3.5 microliters를 추가합니다.그 다음, 용액이 마르기 전에 해부 현미경 하에서 관심 있는 벌레를 빠르게 집어 용액에 넣습니다. 그런 다음 커버 슬립을 조심스럽게 덮고 30분 이내에 동물을 촬영합니다. 가벼운 압력을 가하며, 현미경 하에서 벌레가 용액 속에 떠 있지 않은지 확인합니다.공초점 현미경의 저배율 렌즈로 벌레를 찾아 초점을 맞춥니다. 그런 다음 60배 또는 100배 유침 대물렌즈를 사용하여 장을 관찰하고 이미지를 획득합니다. 다음으로, 적절한 채널의 형광광 아래에서 개체를 검사하여 관심 있는 세포 결함이 나타나는 영역을 선택합니다.광퇴색을 방지하기 위해 신속하게 이동하십시오. 그 다음 레이저 스캐닝으로 전환하고, 스캐닝 경계를 장의 등쪽과 배쪽으로 설정하여 이미지를 장 영역으로 제한하십시오. 이미지 시리즈를 캡처한 후, 나중에 이 이미지들을 하나의 투영 이미지로 병합하십시오.본 프로토콜은 정단막과 루멘 형태 형성이 동시에 일어나는 발달 중인 C.elegans 장에서 극성 막 생성을 분자적으로 분석하고 시각적으로 해부하는 방법을 설명합니다. 정단 및 기저측 막 도메인, 막 결합 접합부 및 장 루멘을 분해하여 발달 과정 전반에 걸쳐 이들 간의 관계를 조사할 수 있습니다. 이러한 세포 하위 구성 요소들은 동반된 논문에 기술된 바와 같이, 이중 또는 삼중 표지를 위해 형광 표지 항체나 형광 융합 단백질로 표지할 수 있습니다.해부용 형광 현미경을 사용하여 관강의 거시적 결함을 빠르게 스캔할 수 있습니다. GFP와 결합된 정단막 세포골격 연결 단백질인 ERM-1은 RNAi 스크리닝에 유용한, 강력하게 발현되는 마커입니다. 이 마커를 사용하여 일련의 새로운 장 관강 형태 형성 및 극성 표현형과 그 기저가 되는 유전자 결함을 밝혀냈습니다.그 다음, 공초점 레이저 주사 현미경으로 획득한 고배율 이미지를 사용하여 표현형을 더 면밀히 관찰함으로써 기저 결함을 더 잘 이해하고자 하였습니다. 일부 표현형은 정량화가 가능했습니다. 이러한 결함을 비교하고 발달 과정에 따른 진행 상황을 추적하기 위해 정량 분석을 수행하였습니다.이 영상을 시청한 후에는 면역 염색을 통해 장막 및 내막 구획을 표지하는 방법과, 분극화된 막 및 루멘 생성의 RNAi 표현형 기능을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

the-c-elegans-intestine-as-model-for-intercellular-lumen

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이미징 C. 엘레간스</emEpifluorescent 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 사용> 태아

이 문서는 선충류에 embryogenesis의 초기 이벤트의 시각화를위한 기술을...

상순 Embryogenesis의 시간 경과 현미경 Caenorhabditis 엘레간스

이 동영상은 큐티클을 파괴하여 예쁜꼬마선충 조직이 항체 염색에 접근할 수 있도록 하는 방법인 동결 균열에 대해 설명합니다.

선충의 동결 균열: 염색을 위해 내부 벌레 조직을 노출시키는 방법

이 프로토콜은 이미지에 예쁜 꼬마 선충 배아의 조직 내에서 세포를 분할하는 방법에 대해 설명합니다. 여러 프로토콜은 초기 배아의 이미지 세포 분열에,이 프로토콜은 어떻게 중순 후반 배아 동안 개발 조직 내에서 세포 분열 이미지에 설명하는 방법을 설명하는 동안.

동안 Neuroblast 세포질 분열을 시각화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 배아

여기에서는 예쁜꼬마선충의 발달 과정을 추적하고 정량화하는 방법을 보여줍니다. 제시된 방법은 쉽게 구현할 수 있는 오픈 소스 도구를 기반으로 합니다. 3D 세포 모양 모델을 재구성하는 방법, 세포 내 구조를 수동으로 추적하는 방법, 피질 수축 흐름을 분석하는 방법을 보여줍니다.

의 발달 프로세스 추적 및 정량화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 오픈 소스 도구를 사용하여

C. 선 충 배설 운하 드 노 보 편광 막 속의 시각적 vivo에서 분석에 대 한 고유한 단일 셀 모델입니다. 이 프로토콜 표준 유전 RNAi 및 이미징 접근, 식별 및 분자 단 세포 tubulogenesis, 그리고 꼭대기 막 및 루멘 속 감독의 특성에 대 한 적응의 조합을 설명 합니다.

세포내 루멘 Morphogenesis 그리고 Vivo에서 편광 막 속 단일 셀에 대 한 모델로 선 충 C. Excretory 운하: GFP 융해, RNAi 상호 작용 화면 및 이미징 라벨

선물이 vivo에서 조직에서 장 3 차원 구조의 절연에 대 한 프로토콜 및 지하실 매트릭스 생체 외에서 organoids, 및 세부 다른 정착 immuno-microtubule의 라벨에 대 한 최적화 된 프로토콜을 얼룩이 지 포함 centrosomal, 그리고 접합 단백질도로 표식 줄기 세포 단백질 Lgr5를 포함 하 여 셀.

Microtubules 및 전 비보 장 조직 및 장 Organoids 3 차원 생체 외에서 Centrosomal 단백질의 면역 형광 라벨

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