Name: 세포내 루멘 Morphogenesis 그리고 Vivo에서 편광 막 속 단일 셀에 대 한 모델로 선 충 C. Excretory 운하: GFP 융해, RNAi 상호 작용 화면 및 이미징 라벨 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 배우세요 C. elegans 배설관을 이용한 단일 세포 내 루멘 형태발생 및 편광 막 생합성 분석 방법입니다. GFP 융합 단백질 라벨링과 RNAi 스크리닝을 통해 생체내 막 확장 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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우리 엠 부 (캔자스의 대학, 캔사스, 미국), K. Nehrke (로체스터 대학 의료 센터, 로체스터, 뉴욕, 미국), 꼬마 유전학 센터, 건강의 국가 학회, 연구 인프라의 투자 감사 프로그램 (P40 OD010440)입니다. 이 작품은 NIH GM078653, MGH는 224570 V.G.에 SAA 223809 교부 금에 의해 지원 되었다

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저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

C. 선 충 유전 다양성, 투명성, 간단한 몸 계획, 고정 세포 계보는 우수한 morphogenesis의 분석 모델 만들. 이 프로토콜 표준 유전 조작 및 이미징 결합 하는 방법을 설명 합니다 2 미크론의 활용 연구 얇은 편광된 막과 세포내 루멘 속 단일 셀 튜브에서 연구 선 충 C. 배설 운하.
라벨 C. 선 충 배설 운하 허용 하는 라이브 분석 (여기에 설명 된), 형광 성 융해 단백질의 표정 또는 항 체 또는 화학 얼룩 (참조 창 자 tubulogenesis 항 체 얼룩이 지기에 대 한 종이 동반 표시 될 수 있습니다. 3). 두 개 이상의 다른 fluorophores, 또는 이들의 조합 식 다른 기술, 라벨 수 있습니다 (그림 2) 이러한 얇은 tubules의 고해상도 영상 해 부에 대 한. 운...

모든 내부 장기의 튜브, 전송 및 가스, 액체 및 영양분의 교환 및 변화 낭비의 배설물 같은 그들의 여러 가지 기능에 대 한 중요 한 구성 됩니다. 그들의 편광된 캐릭터, 독특한 꼭대기와 lumenal 멤브레인과 이러한 특정 기능, 적응 하 고 결함 그들의 엔도-및 플라즈마 멤브레인 시스템의 속에는 인간의 질병1,2의 빈번한 원인이. 튜브는 맥 관 구조와 내부 장기의 대부분은 다세포 이며 intercellularly;는 루멘을 형성 그러나, 침 루멘을 형성, 단 세포 관, 수 예, 나타낼 만큼 인간의 모 세관 침대2의 30-50%. 비록 그들의 microdomains 튜브의 특정 기능 (예를 들어, 꼬마 장 microvilli 대 배설 운하 canaliculi에 따라 다를 수 있습니다 멀티-및 단 세포 튜브의 편광된 막 구성 면에서 유사 하다 선 충; C. 선 충 장 tubulogenesis 종이 동반 참조)3. 편광된 막 속 및 tubulogenesis의 원리는, metazoans 중 보존 하 고 유사한 분자 기계는 그들에 지시1,,24.
C. 선 충 배설 시스템 이루어져 5: 배설 셀 (EC), 덕트 세포 (DC), 셀 (PC)와 두 개의 선 셀 기 공. EC, DC 또는 PC의 절제는 바디 구멍에 한 초기 애벌레 단계5에서 동물 다 액체 축적을 발생합니다. 이 3 단 세포 관 글, 세 가지 방법으로 그들의 루멘을 만들: (EC)를 공동 화; 세포에 의해 셀 포장 결합 autocellular 접합 형성 (PC); 그리고 셀 배치 하 여 결합 autofusion (DC); 다른 메커니즘의 루멘 morphogenesis 모든 phylogenetically 보존된6,7입니다. EC, 후부 인 두 전구의 측면 왼쪽에 있는 밖으로 보내는 두 측면 확장 4 운하 anteriorly 확장 하는 확장에서 그리고 뒤로 (둘 다 오른쪽과 왼쪽 측면) 벌레의 코 및 꼬리의 끝에 각각 (그림 1)5,,68. EC에서에서 확장 약 1 µ m 2 x 1000 µ m, 동물에서 가장 큰 셀을 만들기. Subcellular 수준에 배설 채널 pseudocoelom, 향해 이동 하 고 lumenal 막 (endotube)에 의해 터널링 기저 막에서 생성 된 간단한 튜브입니다. 그것의 유일한 세포 접합;에서 덕트 lumenal 막에 연결 하는 운하 lumenal 막 운하는 그렇지 않으면 그들의 길이 (그림 1)에 따라 junctionless. 배설 운하 lumenal 막 및 그것의 submembraneous 골격 꼭대기 막의 조성과 소장, 같은 다세포 튜브의 submembraneous 골격 유사한 그들의 분자 구성에 의해 정의 된 꼭대기는 그리고 다른 (예를 들어, 평면) epithelia의. 세포질 세포, endosomal 나노미터 및 기타 (예, 골) endomembranes는 운하의 길이 따라 배포를 포함 하 여 또한, 여러 canalicular 소포-중 lumenal 막에 연결 된 상호 또는 절연-운하 세포질7,,89,10 통해 스레드는 . 이 동적 플라즈마 멤브레인/canalicular 연결 추가 채널의 막 시스템을 확장 하 고 모두 루멘 morphogenesis 및 osmoregulation10에 기여. 배설도 따라서 엔도-와 편광된 막 속의 분석 및 엔도-플라즈마 멤브레인 인터페이스의 규제에 대 한 훌륭한 모델을 제공 하는 플라즈마 세포 막의 거의 전적으로 구성 되어 있습니다. 이 단일 셀 시스템-루멘 확장명이 일치에서 운하 morphogenesis-동안 꼭대기 막의 극적인 확장 하실 수 있습니다을 안정 시키고 세포내 lumenal 막 센터는 필요에 의해 발생 하는 건축 문제를 분석 하 . 이 프로토콜에 초점을 맞추고 보다 직접 셀 움직임에서 EC의 위치를 생성 하는 신호 채널 튜브와 루멘의 구조 morphogenesis 및이 프로세스에 필요한 세포내 막 역동성의 분석에는 배설 체계 다른 세포 요소 (6에서검토) 그것의 복잡 한 연결을 구성 하 고.
편광된 막과 세포내 루멘 속의 분석에 대 한 선 충 C. 단일 셀 운하 시스템의 추가 이용은 개발 시간을 통해 그것의 막의 다른 구성 요소의 세대를 분리 하는 기능 그리고 접속점입니다. EC와 복 부 폐쇄의 시간에 태어난 ventro 옆 인 두의 중간 embryogenesis5,6,8, 동안 시간 측면 운하 확장 하 고 분기 발생 동안 침전. 이것은 늦은 embryogenesis, (그림 1) L1 애벌레 단계에 계속 하는 과정 동안 앞쪽 후부 운하 확장에 의해 선행 된다. 새로 부 화 애벌레, 후부 운하 끝에 도달 하면 벌레의 중간 약, 벌레8함께 elongates 완전히 확장 꼬리에 L1 무대의 끝에 어느 시간 후 운하. 그러나 따라서 동물의 성장을의 그것을 초과 하는 속도에서 활성 채널 성장 종료 첫 번째 애벌레 단계에서, 추가 성장 추가 애벌레 단계 (L2-4) 전체 동물의 성장과 동시에 발생 합니다. 이 설정은 드 노 보 편광 막 속의 편광된 세포 분열 또는 마이그레이션 독립의 다른 단계를 분석할 기회를 제공 한다. 또한, 접속점 (에서 발생 하는 루멘 개시 전에 배아);의 어셈블리에서이 프로세스의 분리 허용 막 분극에 그들의 정확한 요구 사항을 여전히 극성 필드에 오픈 질문 이다. 마지막으로, 그것은 고유 하 게 꼭대기 기저 막 확장, 배설 운하10전 앞 후자의 프로세스에서에서 분리 합니다. C. 선 충 배설 채널 모델은 따라서 편광된 막 속의 분석에 대 한 이러한 장점의 번호를 공유 하지만 다세포 설정 (참조 실행 장 모델에 특히 유익한 보완 함께 종이 장 tubulogenesis3에).
야생-타입 운하는이 작은 벌레의 ultrathin tubules, 비록 그들의 루멘 6 수 있습니다.이 투명 한 동물에 Nomarski 광학에 의해 직접 sualized. 사실, 돌연변이 낭 성 운하 형태학 레이블이 없는 동물 해 부 현미경, tubulogenesis11에 관련 된 유전자를 식별 하기 위해 앞으로 유전 스크린에 큰 효과를 사용 하는 낮은 확대를 사용 하 여 특징 수 있습니다. 그러나 향상 된 시각화 운하의 형태와 그들의 편광된 막, cytoskeletal 구성 요소, 다른 세포내 세포 및 다른 subcellular 구조의 구별의, 라벨링 요구 하 고 높은 형광등을 전원 해 고 confocal 현미경 검사 법입니다. 비록 운하 미세 구조 포즈 다양 한 라벨 및 현미경 검사 법에 대 한 어려움, 막 및 subcellular 구성 요소는 각 구획에 고유한 특정 분자를 통해 구별 될 수 있다 및 동물 안전 하 게 장착할 수 현미경에 대 한 경우 특정 아티팩트 ( 프로토콜 및 토론참조) 소개를 피하기 위해 주의. 라벨 immunohistochemistry 고정된 표본에 의해 또는 그들의 자신의 통제 형광 성 융해 단백질을 표현 하는 유전자 변형 벌레를 생성 하 여 수행할 수 있습니다 또는 vivo에서 화상 진 찰에 대 한 배설 운하 관련 발기인. 이 프로토콜 설명는 후자의 라벨 (동반 종이3를 얼룩이 지는 항 체에 대 한 장 tubulogenesis 참조).
결합 손실 또는 이득-의-기능 학문 vivo에서 vivo에서 이미징 단일 셀에서 분석 하는 능력 개발은 전체 선 충 C. 배설 운하는 분자에 대 한 특히 강한 모델 레벨 및 단 세포 tubulogenesis의 세포 분석입니다. 정방향 또는 역방향 유전 스크린 운하 morphogenesis 고기 (예를 들어, cysts)을 식별 하는 야생-타입 또는 레이블이 유전자 변형 동물 시작 수행할 수 있습니다 그리고 그들의 기본 유전자 결함. 또는, 이러한 화면 돌연변이 표현 형 (예, 낭 성 운하)로 시작 하 고 진압 또는 증강이이 형의 유전자 돌연변이 표현 형을 일으키는 기능적으로 상호 작용 하는 유전자를 식별 식별 수 있습니다. 돌연변이 체 표현 형을 일으키는 유전적 결함 (예를들면, 유전자 삭제 통해 ) 손실 또는 이득 일으킬 수 있다 (예를 들어,를 통해 활성화 돌연변이 또는 초과 유전자의 도입을 통해) 조사 기능. 앞으로 mutagenesis 또는 체계적인 RNAi 스크린 유전자 기능에 편견 없이 고 관심의 기능에 관련 된 유전자의 편견된 식별을 허용. 라이브러리를 수 유 하는 게놈 넓은 RNAi의 가용성을 감안할 때 거의 모든 유전자 수 수 쉽게 뜨 RNAi C. 선 충에 의해 그런 관심사의 어떤 단일 유전자 또는 유전자 (예를 들어, 대상된 화면에서)의 어떤 그룹 수 있습니다 또한 신속 하 게 찾는 것 대 한 반전 유전학 접근에 그들의 효과. 접근의 가능한 조합을 보여, 우리 여기 설명 대상된 RNAi 상호 작용 화면 기능 이득 낭 성 배설 운하 돌연변이로 시작 세포질 운하 녹색 형광 단백질 (GFP)으로 표시. 돌연변이 형 음-1, 높은 보존된 C. 선 충 의 overexpression에 의해 생성 된 막 걸 링커 가족 Ezrin-Radixin-Moesin (ERM), 루멘 morphogenesis 및 막에 연루 되어 있는의 ortholog 많은 종12조직입니다. C. 선 충 음 1 배설 운하 등 소장, 내부 장기의 lumenal 막 localizes 및 두13루멘 형성에 대 한 필요 합니다. 음-1 overexpression 초과 말라와 루멘에 플럭스를 증가 하 고 짧은 낭 운하와 두꺼워 말라 undercoat9방해 lumenal 막 생성의 운하 lumenal 막에 소포를 보충 한다. 프로토콜 융합 단백질 (또는 다른 단백질); 운하 표현 배설와 유전자 변형 종자를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 타겟된 RNAi 스크린 운하 형;의 한정자를 식별 하기 위해 이러한 긴장 시작을 수행 하는 방법 그리고 시각적으로 형광 해 고 confocal 현미경 검사 법, 유익한 tubulogenesis 고기를 계량 하는 간단한 방법을 포함 하 여 이러한 스크린의 결과 분석 하는 방법. 대체 기술 및 RNAi, 종종 치명적인 tubulogenesis 유전자 조정의 세부 사항 라벨 장 tubulogenesis3에 동반 종이에서 찾을 수 있습니다. 모든 메서드는 채널 tubulogenesis에 다른 질문의 조사에 대 한 다양 한 조합에 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Cloning</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmid pPD95.75</td><td>Addgene</td><td>Cat. No. 37464</td><td></td></tr><tr><td>PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>Cat. No. 27106</td><td></td></tr><tr><td>결찰 키트</td>, <td>New England Biolabs,</td><td>Cat. 아니요. E2611L</td><td></td></tr><tr><td>DNA 마커</td><td>Thermo Scientific</td><td>Cat. 아니요. SM1331</td><td></td></tr><tr><td>아가로스 DNA 등급</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>고양이. 아니요. BP164-100</td><td></td></tr><tr><td>유능 세포</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat. 아니요. C2987H</td><td></td></tr><tr><td>트리스</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>고양이 아니요. BP154-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>시그마</td><td>Cat. 아니요. ED-1KG</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>고양이. 아니요. A38S-500</td><td></td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>고양이. 아니요. BP1302-10</td><td></td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR machine&nbsp;</td><td>MJ 연구</td><td>고양이. 아니요. PTG-200&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>고양이. No. 5415C</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>정밀 과학&nbsp;</td><td>고양이. 번호 666A3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>젤 러닝 기구</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat. 번호 09-528-165</td><td></td></tr><tr><td>젤 실행 전원</td><td>공급 장치 Fisher Scientific</td><td>Cat. No. 45-000-465</td><td></td></tr><tr><td>분자 이미저&nbsp; 젤 독 XR 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat. 번호 1708195EDU</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 분광 광도계</td><td>Thermo Scientific</td><td>Cat. 아니요. 표준</td> 예쁜꼬마선충 배양 및 유지 절차는 ND1000<td></td></tr><tr><td>C. elegans related1</td><td></td><td></td><td>1see reference19를 참조하십시오.</td></tr><tr><td>프로토콜은 LB Medium 및 plates2</td><td></td><td></td><td>2see reference19를 참조하십시오.</td></tr><tr><td>트립톤&nbsp;</td><td>Acros Organics</td><td>카탈로그 번호 611845000</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>BD Biosciences</td><td>카탈로그 번호 212750</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마</td><td>카탈로그 번호 S7653</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>카탈로그 번호 214040</td><td></td></tr><tr><td>암피실린</td><td>시그마</td><td>카탈로그 번호 A0116</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Fisher Scientific</td><td>카탈로그 번호 프로토콜은 BP912</td><td></td></tr><tr><td>M9 Medium2<</td><td></td><td></td><td>sup>2see reference19를 참조하십시오.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>카탈로그 번호 S7653</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>카탈로그 번호 P0662</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>카탈로그 번호 S7907</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>카탈로그 번호 M2773</td><td></td></tr><tr><td>NGM 플레이트 2</ 프로토콜은 strong></td><td></td><td></td><td>2see reference19를 참조하십시오.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마</td><td>카탈로그 번호 S7653</td><td></td></tr><tr><td>펩톤&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>카탈로그 번호 211677</td><td></td></tr><tr><td>트립톤&nbsp;</td><td>Acros Organics</td><td>카탈로그 번호 611845000</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>카탈로그 번호 214040</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>카탈로그 번호 M2773</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>카탈로그 번호 C3881</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤&nbsp;</td><td>시그마</td><td>카탈로그 번호 C8667</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat. 번호 P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>Cat. 번호 P0662</td><td></td></tr><tr><td>RNAi plates3</td><td></td><td></td><td>3see reference21 참조.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마</td><td>카탈로그 번호 S7653</td><td></td></tr><tr><td>펩톤&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>카탈로그 번호 211677</td><td></td></tr><tr><td>트립톤&nbsp;</td><td>Acros Organics</td><td>카탈로그 번호 611845000</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>카탈로그 번호 214040</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>카탈로그 번호 M2773</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>카탈로그 번호 C3881</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤&nbsp;</td><td>시그마</td><td>카탈로그 번호 C8667</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4&nbsp;</td><td>시그마</td><td>카탈로그 번호 P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>카탈로그 번호 P0662</td><td></td></tr><tr><td>IPTG&nbsp;</td><td>US Biological</td><td>고양이 번호 I8500</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>고양이 번호 BP2648</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>카탈로그 번호 SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>차아염소산나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>카탈로그 번호 50371500</td><td></td></tr><tr><td>Bacteria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 박테리아</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT115 박테리아</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>게놈 와이드 RNAi 라이브러리</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ahringer 게놈 와이드 RNAi 공급 라이브러리 (ref21,58,59)</td><td>출처 BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C. elegans ORF-RNAi 공급 라이브러리 (ref60)</td><td>출처 BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging related</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>MP Biomedicals,LLG</td><td>Cat. no. 193917</td><td></td></tr><tr><td> 재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vacuum Grease Silicone</td><td>Beckman</td><td>Cat. no. 335148</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>카탈로그 번호 4448</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플레이트, 6 웰&nbsp;</td><td>코닝 Inc.</td><td>카탈로그 번호 08-772-33</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SMZ-U 해부 현미경(Nikon)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SZX12 해부 현미경(Olympus), 고출력 스테레오 형광 부착물(Kramer Scientific), Q 캡처 소프트웨어가 있는 CCD 카메라 및 X-Cite 형광 램프(Photonic Solutions) 장착.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TCS SL 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경(Leica Microsystem)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECLIPSE Ti-E 도립 현미경(Nikon)</td><td></td><td></td><td></td>에 장착된 C2 레이저 스캐닝 컨포칼</tr></tbody></table>

세포내 루멘 morphogenesis 그리고 vivo에서 편광 막 속 단일 셀에 대 한 모델로 선 충 c. excretory 운하: gfp 융해, rnai 상호 작용 화면 및 이미징 라벨

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

4 선 충 C. 배설 운하는 좁은 튜브를 거의 동등 하 게 멀리 확장된 세포내 endotubes 구축 하 고 막 및 submembraneous 루멘 안정화와 함께 단일 셀에서 동물의 길이 통해 확장 꼭대기 캐릭터의 골격입니다. 배설 셀 확장의 길이 약 2, 000 번 드 노 보 편광 막 속, 세포내 루멘 morphogenesis vivo에서 평가 대 한 독특한이 모델을 만드는이 운하를 생성 및 단 세포 tubulogenesis입니다. 여기에 제시 된 프로토콜 표준 라벨, 이득 및 손실-의-기능 유전자 또는 RNA 간섭 (RNAi) 결합 하는 방법을 보여줍니다-, 그리고를 사용 하 여이 모델 기능 분자 수준에서이 프로세스를 분석 하 고 시각적으로 해 부 현미경 접근. 표기 방법의 예를 들어, 프로토콜 tubulogenesis의 실시간 분석을 위한 유전자 변형 동물 형광 성 융해 단백질의 생성을 설명합니다. 유전 접근의 예를 들어, 그것은 함수 이득 낭 성 운하 형을 수정 하도록 설계 된 시각적 RNAi 기반 상호 작용 스크린의 핵심 포인트를 강조 표시 합니다. 특정 방법을 설명 하는 방법: 레이블 및 형광 단백질; 표현 하 여 운하를 시각화 타겟된 RNAi 라이브러리를 구성 하 고 전략을 RNAi 운하 morphogenesis;의 분자 분석에 대 한 심사 시각적으로 고기;의 수정 평가 형광 현미경 검사 법;를 해 부하 여 점수 confocal 현미경 검사 법;에 의해 더 높은 해상도에서 subcellular 운하 구성 요소 특징 그리고 시각적 매개 변수를 측정. 방식은 확인 및 intracellular 루멘 phylogenetically 보존된 과정에 참여 하 고 단 세포 유전자에 대 한 선 충 C. 배설 채널의 활용에 관심이 있는 탐정에 대 한 유용 morphogenesis 튜브.

이 프로토콜에는 시각과 분자로 분석 단 세포 tubulogenesis 및 단일 셀에서 세포내 루멘 morphogenesis C. 선 충 배설 운하를 사용 하는 방법을 설명 합니다. 성인 기 중반 embryogenesis의 시간에서 그들의 확장, 동안 4 개의 배설 운하 그들의 basolateral 및 그들의 canalicular 및 endosomal endomembrane 시스템을 제공 하는 독특한 모델을 함께 꼭대기/lumenal 막 확장 계속 드 노 보 의 비보에 분석 편광 막 속 (그림 1). 꼭대기 막 같은 subcellular 구성 요소, 세포질, 및 endosomal canalicular 소포 대 특정 형광 성 융해 단백질 (프로토콜 섹션 1에서에서 설명), 표현 하 여 구상 될 수 있다 그리고 그들은 서로 의해 구별 될 수 있다 더블 또는 트리플 (<stro...

C. 선 충 배설 운하 드 노 보 편광 막 속의 시각적 vivo에서 분석에 대 한 고유한 단일 셀 모델입니다. 이 프로토콜 표준 유전 RNAi 및 이미징 접근, 식별 및 분자 단 세포 tubulogenesis, 그리고 꼭대기 막 및 루멘 속 감독의 특성에 대 한 적응의 조합을 설명 합니다.

세포내 루멘 Morphogenesis 그리고 Vivo에서 편광 막 속 단일 셀에 대 한 모델로 선 충 C. Excretory 운하: GFP 융해, RNAi 상호 작용 화면 및 이미징 라벨

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

이러한 표준 절차 조합의 전반적인 목표는 C.elegans 배설관이 단세포관, 세포내 내강 및 de novo 편광 막 생물 발생의 생체 내 분석에 어떻게 사용될 수 있는지 보여주는 것입니다. 이 방법은 확장된 세포 내 내강이 어떻게 설정되는지 또는 정점 막을 확장하는 데 어떤 분자가 필요한지와 같은 세뇨관 형성 및 극성 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 모델 시스템의 주요 장점은 정점 대 기저 측막의 거대한 2000배 확장을 단일 세포에서 생체 내에서 육안으로 확인할 수 있다는 것입니다.일반적으로 이 모델을 처음 접하는 개인은 예쁜꼬마선충 배설관이 매우 얇고 삼투압 스트레스와 이미징에 필요한 조작에 민감하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 배설관(excretory canal tubulogenesis)에 관한 이 비디오는 편광된 막 생물 발생의 생체 내 분석을 위한 상호 정보 모델인 장 세뇨관 형성에 대한 비디오와 함께 제공됩니다. 라벨링과 관련하여, 함께 게재된 장 세뇨관 형성에 관한 비디오에서는 세포 성분을 형광 표지된 항체로 염색하는 대체 라벨링 절차에 대해 설명합니다.이 기술은 배설계에도 적용할 수 있습니다. 이 동영상은 형광 표지된 융합 단백질을 가진 동물을 사용한 실시간 이미징 분석을 설명합니다. GFP에 부착된 관심 유전자를 포함하는 플라스미드를 구성하는 방법 및 융합 단백질을 발현하는 형질전환 동물을 생성하는 방법은 텍스트에 설명되어 있습니다.이 프로토콜에는 또한 배구관 특이적 막 마커, 소기관 마커 및 프로모터의 예가 있습니다. 두 레이블 지정 절차에 대한 다른 리소스도 제공됩니다. 이 비디오에서는 GFP로 운하 세포질을 표지하고 낭포성 운하 표현형을 가진 형질전환 균주를 RNAi를 사용하여 변형자를 스크리닝합니다.표현형은 루멘 형태 형성 유전자인 ERM-1의 과발현에 의해 발생합니다. 암피실린과 테트라사이클린 플레이트에서 박테리아를 발현하는 RNAi의 하룻밤 사이에 성장한 상태에서 콜로니를 선택하고 600마이크로리터의 액체 LB 배지에 암피실린을 접종합니다. 이 튜브를 섭씨 37도의 셰이커에서 6시간 동안 배양합니다.액체 배양액에서 70마이크로리터 분취액을 6개의 웰 RNAi 플레이트의 웰에 복제 또는 삼중 세트로 파종합니다. 그런 다음 섭씨 20-22도에서 밤새 RNAi 플레이트를 배양합니다. 다음 날 아침, 3개의 L4 단계 웜을 선택하여 RNAi 플레이트의 각 웰에

the-c-elegans-excretory-canal-as-model-for-intracellular-lumen

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이미징 C. 엘레간스</emEpifluorescent 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 사용> 태아

이 문서는 선충류에 embryogenesis의 초기 이벤트의 시각화를위한 기술을...

상순 Embryogenesis의 시간 경과 현미경 Caenorhabditis 엘레간스

이 프로토콜은 이미지에 예쁜 꼬마 선충 배아의 조직 내에서 세포를 분할하는 방법에 대해 설명합니다. 여러 프로토콜은 초기 배아의 이미지 세포 분열에,이 프로토콜은 어떻게 중순 후반 배아 동안 개발 조직 내에서 세포 분열 이미지에 설명하는 방법을 설명하는 동안.

동안 Neuroblast 세포질 분열을 시각화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 배아

여기에서는 예쁜꼬마선충의 발달 과정을 추적하고 정량화하는 방법을 보여줍니다. 제시된 방법은 쉽게 구현할 수 있는 오픈 소스 도구를 기반으로 합니다. 3D 세포 모양 모델을 재구성하는 방법, 세포 내 구조를 수동으로 추적하는 방법, 피질 수축 흐름을 분석하는 방법을 보여줍니다.

의 발달 프로세스 추적 및 정량화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 오픈 소스 도구를 사용하여

투명 한 선 충 C. 소장"vivo에서 조직 챔버를" 다세포 tubulogenesis 동안 단일 세포 및 subcellular 수준 apicobasal 막과 루멘 속 공부에 대 한 될 수 있습니다. 이 프로토콜 표준 라벨을 결합 하는 방법을, RNAi/손실의 기능 유전자 및 분자 수준에서이 프로세스를 해 부 현미경 접근에 설명 합니다.

C. 선 충 장 한 모델으로 루멘 Morphogenesis 세포를 단일 세포 수준에서 Vivo에서 편광 막 속: 항 체 얼룩이 지기, RNAi 손실의 기능 분석 및 이미징 라벨

이 프로토콜 열 스트레스 단백질 핵 전 좌는 녹색 형광 단백질 (GFP) 퓨전 단백질 마커로 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)를 사용 하 여 추적 하는 방법을 보여 줍니다 얼룩. 프로토콜을 얼룩이 DAPI 빨리 고 GFP 단백질 subcellular 지 방화 신호 유지.

녹색 형광 단백질 태그와 4', 6-Diamidino-2-phenylindole 꼬마 선 충 에 얼룩이 단백질 Subcellular 지 방화를 감지

여기에서 우리는 생활 C 에서 고해상도 현미경, 전산 도구 및 단일 세포 라벨링을 사용 하 여 조합 접근법을 제시 합니다. 신경 발달 중에 단일 세포 역학을 이해 하는.

등방성 라이트 시트 현미경 검사 및 자동 세포 계보 분석을 통해 아닌 간 분해능을 통한 배아 발생 발생

이 작품은 한 번의 하룻밤 실행에 80-100 C. 예쁜 꼬마 배아에서 배아의 동시 3D 시간 경과 영상을 허용하는 반 높은 처리량 프로토콜을 설명합니다. 또한 데이터 분석을 간소화하기 위해 이미지 처리 및 시각화 도구가 포함되어 있습니다. 사용자 정의 리포터 균주와 이러한 방법의 조합은 배아 발생의 상세한 모니터링을 가능하게.

C. elegans 배아 개발을 분석하는 세미 고처리량 이미징 방법 및 데이터 시각화 툴킷

형광 표지된 엔드 결합 단백질을 사용하여 생체 내의 동적 마이크로투부레를 이미징하기 위한 프로토콜이 제시되었다. 우리는 C. elegans의후방 측측 마이크로투룰 (PLM) 뉴런에서 동적 마이크로 튜브를 라벨, 이미지 및 분석하는 방법을 설명했다.

생체 내 Caenorhabditis elegans 뉴런의 미세 투덜역학 및 오리엔테이션 평가

이 프로토콜은 최대 36 시간 동안 지속적인 식품 공급이있는 상태에서 C. elegans를 성장시키는 데 사용되는 간단한 미세 유체 칩 설계 및 미세 가공 방법론을 설명합니다. 성장 및 이미징 장치는 또한 며칠 동안 개발 중에 세포 및 하위 세포 프로세스의 간헐적 인 장기 고해상도 이미징을 가능하게합니다.

Caenorhabditis elegans의 장기 성장 및 이미징을위한 간단한 미세 유체 칩

이 프로토콜은 배아 후 발달 전반에 걸친 미세유체 기반 예쁜꼬마선충(C. elegans ) 타임랩스 이미징을 설명합니다.

모든 유충 단계에서 이미징하는 고해상도 C. elegans

배우세요 C. elegans 배설관을 이용한 단일 세포 내 루멘 형태발생 및 편광 막 생합성 분석 방법입니다. GFP 융합 단백질 라벨링과 RNAi 스크리닝을 통해 생체내 막 확장 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

세포내 루멘 Morphogenesis 그리고 Vivo에서 편광 막 속 단일 셀에 대 한 모델로 선 충 C. Excretory 운하: GFP 융해, RNAi 상호 작용 화면 및 이미징 라벨

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