Name: 광학 Fractionator 표준 현미경 장비를 사용 하 여 마우스 Substantia Nigra에서 Dopaminergic 신경 수 stereological 추정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 배우세요 마우스 흑질에서 도파민성 신경 수를 표준 현미경 장비로 정량화하는 광학 프랙셔네이터 기법. 이 방법은 파킨슨병 전임상 연구에서 신경 손실을 평가하는 데 활용됩니다.

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저자는 그들의 전문 기술 지원; Keali 룀, 루이자 Frieß, 하이 케 멘 젤 감사 헬가 Brünner 동물 보호; 대 하 그리고 생성 및 ImageJ 소프트웨어에 대 한 광학 disector 그리드 플러그인의 배포에 대 한 Chistopher S. 병 동.

관심과 동물의 사용에 대 한 모든 해당 국제, 국가, 또는 기관 지침에 따라 했다. 프로토콜 Regierung 폰 인 운터 프랑 켄, 뷔르츠부르크, 독일에서 지방 자치 단체에 의해 승인 되었다.
 1. 조직 처리 및 Immunohistochemistry <ol><li>Euthanize 쥐 CO 2 또는 어떤 다른 승인 방법.</li>
	<li>Perfuse 6 12 주 된 C56Bl/6N 남성 쥐 transcardially 10 mL의 0.1 M 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 25 G 바늘과 주입 펌프를 사용 하 여 다음 0.1 M PBS에 4 %paraformaldehyde (PFA)의 70 mL. 
	주의: PFA는, 알레르기, 독성 및 발암 성.</li>
	<li>Bregma (그림 25, Paxinos 및 프랭클린 마우스 뇌 아틀라스 14)에서 +0.74 m m의 영역에서 두뇌 매트릭스 슬라이서와 코로나 비행기에 쥐의 뇌를 해 부.</li>
	<li>SN를 포함 하 여 4%에서 뇌의 등 쪽 부분 침수-고정을 위한 4 ° C에서 1 d 0.1 M PBS에 PFA.</li>
	<li>Cryo-보호에 대 한 30% 자당/0.1 mol PBS 솔루션 PFA 교환 하 고 다른 2 d 4에서 품 어 ° c.</li>
	<li>최적의 절삭 온도 (10 월)는 cryomold로 뇌의 등 쪽 부분 가득 넣어 컴파운드와 천천히 액체 드라이 아이스 냉각 isopentane는 조직의 동결. 
	주의: 드라이 아이스는 매우 추운 (-78 ° C); 드라이 아이스와 함께 작업 하면서, 장갑 등 개인 보호 장비 (PPE)를 사용 합니다. 드라이 아이스 증발 CO 2; 따라서, 연기 후드 작동.</li>
	<li>순차적으로 30 µ m cryo-섹션 코로나 비행기에서 잘라내어 Bregma (그림 51 Paxinos, 프랭클린 마우스 뇌 아틀라스 14)에서 2.46 m m에서 시작 및 끝 Bregma에서 4.04 m m 섹션을 수집 (그림 64, Paxinos 및 프랭클린 마우스 뇌 아틀라스 14).</li>
	<li>는 Cryoprotectant (30% 글리세롤, 30 %ethoxyethanol, 및 40 %PBS)-20 ° c.에로 채워진 튜브에 4 개의 시리즈를 저장 단면화 절차 동안 표시 오른쪽 반구 brainstem의 상위 영역에 작은 구멍을 puncturing.</li>
	<li>Immunohistochemical 얼룩, 선택 마우스 당 섹션의 한 시리즈. 10% 정상 염소 혈 청 (0.1 mol 통에 PBS에에서 NGS)/2% BSA/0.5% 세제 1 시간에 대 한 preincubate 부동성 섹션. 섹션 4에서 하룻밤 2% NGS/2% BSA/0.5% 세제 0.1 mol PBS에에서 희석 토끼 반대로 마우스 티로신 hydroxylase (TH, 1:1,000 희석) 항 체로 품 어 ° c.</li>
	토끼에 대 한 항 체 <li>적용 보조 Igs (1: 100 희석) 실 온에서 2 h 뒤 avidin/비오 틴 시 약 (1: 100 희석). 품 어와 3, 3-diaminobenzidine-tetrahydrochloride (한 덩어리) 및 H 2 O 2와 얼룩. 코팅된 개체 슬라이드에 얼룩 후 섹션을 탑재. 
	참고: 회 + dopaminergic SN 뉴런 그림 1a에 표시 됩니다. 얼룩 한 시리즈, 여 SN 동위 compacta (SNpc) 및 reticulata, 꼬리 부분에는 rostral에서 연장 13 SN 섹션의 평균은 동물 ( 그림 1b) 당 물 들 다. 섹션 120 µ m (1/4 시리즈)으로 구분 됩니다 ( 그림 1c). 
	주의: 소량은 의심 되는 발암 물질 이다. 그것은 접촉 및 흡입 독성입니다. 소량 작업 시 보호구를 사용.</li>
</ol> 2. 이미지의 수집 <li>캡처 일 immunohistochemically <ol>디지털 현미경에 결합 된 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 SN 섹션 스테인드. 1 시리즈의 각 섹션을 별도로 분석.</li>
	<li>이미징 소프트웨어의 스캔 슬라이드 옵션을 사용합니다. 높은-품질의 이미지 (그림 2)에 대 한 TIFF 형식으로 저장. 
	참고: 이미지 해상도 cm 당 312 픽셀.</li>
	<li>기자 &#34; 취득 &#34; 수집 창 (그림 2a) 여.</li>
	<li>설정 합니다 binning &#34; 2 &#34; 회색조 이미지. 
	참고: 컬러 사진 대신 회색조 이미지의 인수 최종 스택 이미지 파일 (그림 2a)의 크기를 줄입니다.</li>
	<li>클릭 &#34; 라이브 쇼 &#34; 섹션의 라이브 이미지를 보여주는 새 창을 열려면 수집 창에서 (그림 2 a와 b).</li>
	<li>클릭 &#34; 단계 &#34; 수집 창에서. 선택 &#34; 슬라이드 스캔 &#34; 드롭다운 메뉴 및 확인란 (그림 2c). 
	참고: 그러면 수집 및 z-비행기, 13 μ의 전체 범위에서 1 µ m의 연속 이미지 사이의 거리를 사용 하 여 스택 이미지의 수집 뿐만 아니라 x, y 평면에 고도의 확대 SN 이미지 (630 X 배율)의 맞춤 m.</li> <li>SN에 대 한 검색을 2.5 X 목표를 선택 합니다.</li>
	<li>X. 63 목표 변경</li>
	<li>왼쪽된 상단 (TopLeft) (그림 2c) 및 오른쪽 아래 모서리 (LowRight) (그림 2d) 섹션의 클릭 하 여 정의 &#34; 세트. &#34;</li>
	<li>클릭 &#34; Z 시리즈 &#34; 확인 하 고는 &#34; Z-비행기 시리즈 &#34; 상자 (그림 2e).</li>
	<li>결정 3 개의 무작위로 선택 된 계산에서 섹션의 실제 탑재 된 두께 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 섹션 당 사이트. 클릭이 &#34; 보기 상단 오프셋 &#34; 정의 섹션 (그림 2e)의 상단을 클릭 &#34; 중지 보기 톱 &#34; (그림 2f). 그 후, 클릭 &#34; 보기 아래쪽 오프셋 &#34; (그림 2f)를 클릭 하 고 &#34; 중지 보기 하단 &#34; (그림 2 g). 섹션의 두께 적어 둡니다.</li>
	<li>빼기 3 µ m (가드 영역) 위에서 오프셋 하 고 최고 오프셋된 슬롯 (그림 2 h)에 결과 입력 합니다. 13 µ m (광 disector의 높이) 최고 오프셋된 수에서 뺍니다 고 맨 아래 오프셋된 슬롯 (그림 2i)에 결과 입력 합니다. 다음 매개 변수를 선택 합니다: 단계, 14; 크기, 1.00 (그림 2i). 
	참고:이 연속 이미지 사이의 1 µ m 거리 13 µ m의 z 평면에 두께에 해당.</li>
	<li>(그림 2j) 파일을 저장할 디렉터리를 선택 합니다.</li>
	<li>클릭 &#34; 시퀀스 &#34; (그림 2j) 수집을 시작 하.</li>
	<li>클릭 &#34; 처리 &#34; 고 다음과 같은 매개 변수 선택: &#34; 모든 비행기 &#34;에서 &#34; 순서; &#34; &#34; 몽타주; &#34;와 &#34; 빠른 &#34; 및 &#34; 바느질 &#34; 상자, 10% (그림 2)의 이미지 중복. 시작을 클릭 하 여 이미지를 &#34; 시작 &#34;. 
	참고: 분석에 대 한 스택 이미지 생성 됩니다 (그림 2 l, 그림 3a -e).</li>
</ol> 3. Stereological 평가 순서 <ol><li>NIH ImageJ 소프트웨어 버전 4.7 사용 하 여 SN 스택 이미지의 분석을 수행.</li>
	<li>ImageJ.nih.gov 웹사이트에서 필요한 두 개의 플러그인 다운로드:는 &#34; 그리드 오버레이 &#34; 플러그인 15와 &#34; 셀 카운터 &#34; 플러그인 16. 설명 된 대로 두 플러그인 설치.</li>
	<li>편견된 stereological 평가 대 한 다음과 같은 세 매개 변수 정의: 그리드 크기 130 x 130 µ m; 계산 프레임, 50 x 50 µ m; 광 disector 높이, 13 & #181, m.</li>
	<li>클릭 하 여 이미지를 열고 &#34; 파일 &#34; &#8594; &#34; 오픈 &#34; (그림 4a)를 사용 하 여 이미지 축척을 설정에 &#34; 분석 &#34; &#8594; &#34; 비율 설정 &#34; 명령 (그림 4b). 이 단계에 대 한 정의 된 크기에서에서 변경 픽셀 µ m (그림 4c). 
	참고: 분석 된 이미지에 대 한 425 픽셀 100 µ m에 해당.</li>
	<li>선택은 &#34; 플러그인 &#34; &#8594; &#34; 그리드 &#34; &#8594; &#34; 격자 유형: 라인 &#34; 그리드를 무작위로 삽입 하는 명령. 검사는 &#34; 임의의 오프셋 &#34; 상자. 130 µ m x 130 µ m으로 grid (그리드 사각형) 내 하나의 사각형의 크기를 정의 = 16900 µ m 2 ( 그림 3b 및 그림 4 d 및 e).</li>
	<li>변경 이미지에서 유형 16-비트 RGB 색상 (클릭 &#34; 이미지 &#34; &#8594; &#34; 유형 &#34; &#8594; &#34; RGB 색상 &#34;) (그림 4 층). Baquet 외에 설명 된 대로 SNpc를, 찾습니다 17.와 SNpc를 둘러싸 자는 &#34; 페인트 브러시 도구 &#34; (브러쉬 폭: 11) ( 그림 3 c 및 그림 4 g -난).</li>
	<li>실행 취소는 &#34; 비율 설정 &#34; 클릭 하 여 명령 &#34; 분석 &#34; &#8594; &#34; 비율 설정 &#34; &#8594; &#34; 제거 규모를 클릭 &#34; (그림 4j -l) 오히려 픽셀에 계산의 성능을 사용할 수 있도록 µ m 보다.</li>
	<li>화면 (그림 4 m)를 확인 하 고 이미지 파일 저장 ImageJ (그림 4n)으로 새 파일을 엽니다. 선택 &#34; 포인트 &#34; (그림 4o)와 25 (그림 4 p)의 브러시 폭. 그 연락처는 SN 광학 disector (그림 4 분기)의 배치에 대 한 모든 그리드 사각형을 표시 합니다. 개요 SN 부분적으로 또는 완전히 지역화 된 모든 광학 disectors에 셀 수의 분석을 수행.</li>
	<li>SN의 부분을 포함 한 그리드 사각형을 선택 합니다. ImageJ는 x와 y를 정의 하에 커서를 놓고이 사각형의 왼쪽된 위 모퉁이 좌표 (4r 그림)와 함께 시작 하는 측정. 
	참고: 광 disector를 사용 하 여 위치에 대 한 삽입 됩니다 좌표는 &#34; 광학 disector 위치 &#34; (그림 4s), 4 단계에서 설명한 대로.</li>
	<li>, 스프레드시트 서식 파일을 사용 하 여 광학 disector 위치를 계산 &#34; 광학 disector 위치, &#34; 4 단계에서 설명한 대로.</li>
	<li>보정 광학 disector (매크로 추가 파일 크리스토퍼 S. 구 음)를 클릭 하 여 &#34; 플러그인 &#34; &#8594; &#34; 매크로 &#34; &#8594; &#34; 편집 &#34; (그림 4t), 열은 &#34; opt_dis_ grid.txt &#34; (4u 그림) 파일, 그리고 정의의 크기는 &#34; usergrid &#34; x, y 차원 광학 disector (그림 4v)의 해당 픽셀에. 50 µ m x 50 µ m의 크기를 선택 하는 usergrid의 1 개의 측의 크기는 212.5 픽셀 (픽셀 50 x 4.25)로 정의 됩니다.</li>
	<li>광학 disector (그림 4v)의 중심을 정의 하는 ImageX와 ImageY 좌표를 삽입 하 여 스택 이미지에서 광학 disector의 위치를 결정 합니다. 매크로 실행 (&#34; 매크로 &#34; &#8594; &#34; 실행 매크로 &#34;) (그림 4w). 
	참고: 격자 ( 3d 그림 및 그림 4 x) 스택 이미지에서 사라져 버릴 것 이다. Z-평면 ( 3e 그림 및 그림 4 x)에서 이동할 때 광 disector 유지 됩니다.</li>
	<li>선택 &#34; 플러그인 &#34; &#8594; &#34; 셀 카운터 &#34; 셀 카운터 플러그인 (그림 4y) 시작. 셀 카운터를 초기화 하 고 표식 유형 (그림 4z)를 선택 합니다. 이미지에 확대 (클릭 &#34; + &#34;) 200%의 확대에 핸드폰 번호의 stereological 평가 수행 하는 고.</li>
	<li>식별 dopaminergic 신경 perikarya 그들의 둥근 또는 ovoid 모양 및 셀 크기 ( 그림 1a). Stereological 규칙을 사용 하 여 셀의 수를 계량. 
	참고: 광 disector 3 차원 큐브 ( 그림 5a) 이기 때문에, 왼쪽, 앞으로 제외 측 및 큐브 (빨간색)의 최고의 측면 정의 합니다. 따라서, 돈 &#39; t 수 회 + 셀 레드 라인 (왼쪽 및 전면) 또는 상단 측면의 접촉으로 그 어 서. 준비 된 스프레드시트 파일에는 셀의 결과 추가 &#34;의 세포 수 계산 &#34; (5 단계).</li>
	<li>SN 이미지에 따라 계산 다음 셀 개수에 대 한 광학 disector를 다음 그리드 스퀘어 사용 하 여 x, y 단계 overlying 그리드 ( 그림 5b)의 크기와 &#34; 광학 disector 위치 &#34; 4 단계에서 설명한 대로 스프레드시트 서식 파일.</li>
	<li>셀 번호 사용의 추정을 수행는 &#34;의 세포 수 계산 &#34; 스프레드시트 (5 단계).</li>
</ol> 4. 광학 Disector 위치를 사용 하 여 계산 된 &#34; 광 Disector 위치 &#34; 스프레드시트 서식 파일 <ol><li>계산 크기와 SN (윤곽선 overlying 그리드에 배치 각 광 disector의 위치 그림 5b) 사용 하는 &#34; 광학 disector position.xlsx &#34; 스프레드시트 파일 (파일 추가).</li>
	<li>삽입 µ m, 당 픽셀의 변환에 의해 정의 된 대로 &#34; 비율 설정 &#34; 명령의 노란색 표시 된 위치에는 &#34; 광학 disector position.xlsx &#34; 파일 ( 그림 6a와 보충 파일 ).</li>
	<li>광학 disector의 계획 된 크기와 삽입 (µ m)에서 1 개의 측의 길이 의해 정의 된 overlying 그리드의 모눈 정사각형의 크기 오렌지 표시 위치. 
	참고: 결과 주황색 상자 옆에 있는 빨간 상자에 묘사 된다.</li>
	<li>시작 지점으로 결정 했다 SN 윤곽선 그리드 사각형으로 시작 (하나의 그리드 사각형 선정 되었다로 시작 되기 위하여는, 단계 3.9에서 같이 위의).</li>
	<li>삽입 x 및 y 좌표를 기준으로 측정 단계는 파일의 녹색 상자에 3.9에서 (이러한 값, x, y 좌표를 사용 하 여이 첫 번째 사각형 내에서 광학 disector의 센터 계산 되 고 결과 파란색 상자에 묘사에 대 한). Opt_dis_grid.txt 매크로 (추가 파일) 실행.</li>
	<li>첫 번째 그리드 사각형 (갈색 상자) 기준으로 그리드 스퀘어 거리 (사각형의 수 측정)를 삽입 하 여 x, y 좌표 연속 광 disectors의 계산. 
	참고: + x: 그리드 사각형은 오른쪽; -x: 그리드 사각형은 왼쪽; + y: 그리드-광장은 아래쪽에 위치 하 고 있습니다. -y: 그리드 사각형은 상단에 위치 하 고 있습니다. 결과 회색 상자에 표시 됩니다.</li>
</ol> 5. 셀 번호를 사용 하 여 추정은 &#34; 세포 수 계산 &#34; 스프레드시트 <ol><li>계산 수식을 사용 하 여 동물 (N) 당 회 + SN 셀의 예상된 수 출판 서쪽 외 알., 1991 년 3, 어디 &#8721; Q - 일 + 신경 한 뇌 섹션의 모든 광학 disectors에 계산의 총 수로 정의 됩니다. 
	참고: 측정된 두께 (t) 섹션의 관련 광학 disector (h)의 높이 방정식에 포함 됩니다. 지역 샘플링 분수 (asf) 표 (x, y 단계)의 사각형 크기 내에서 광학 disector (광 disector) 프레임 크기의 영역 (A)의 비율으로 정의 된다 (광 disector/A x, y 단계) ( 그림 3b), 그리고 섹션 샘플링 분수 (ssf) 전체 직렬 컷된 두뇌의 섹션의 비율으로 정의 됩니다: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56103/56103eq1.jpg" /> 양적 높은 품질을 보장 하기 위해 추정 계수 오류 (CE) 0.10 보다 낮은 되어야 합니다. Keuker 외에 의해 수식을 사용 하 여 CE 확인., 2001 년 10: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56103/56103eq2.jpg" /></li> <li>각각의 SN 내 휴대폰 번호 stereological 추정에 대 한 마우스, 마우스 당 생성 된 시리즈의 총 수, 광 disector, x, y 영역 광학 disector (µ m 2: 광 disector), x, y 영역 (x, y 단계 모눈 정사각형의 높이 대 한 지정 된 정보를 삽입 µ m 2에), 평균 측정 (µ m)에서 사용 하 여 노란색 상자에 섹션의 두께 &#34; 셀 count.xlsx의 계산 &#34; 스프레드시트 ( 그림 6b 파일 및 보조 파일 ).</li>
	<li>같은 동물에서 각 SN 섹션 5 단계에서 설명한 대로 분석.</li>
	<li>삽입 셀 카운트 회색 상자에 각 광 disector 한 SN 섹션을 참조를 사용 하 여 각 줄에서 &#34; 셀 count.xlsx의 계산 &#34; 스프레드시트 파일 (파일 추가). 
	참고: 예상된 휴대폰 번호 및 계산 된 CE 파란색 상자 ( 그림 6b)에서 묘사 된다.</li>
</ol> 6. 상업적으로 사용 가능한 Stereology 시스템을 사용 하 여 셀 번호의 추정 <ol><li>시작 dopaminergic SNpc의 추정 셀 번호를 클릭 하 여 &#34; 프로브 &#34; &#8594; &#34; 광학 Fractionator 워크플로 &#34; 광학 Fractionator 여 워크플로 창. 
	참고: 새 창이 나타납니다-SN의 새 시리즈 계산 될 것 이다 확인.</li>
	<li>클릭 하 여 일 + SN 섹션의 새로운 시리즈를 시작 &#34; 새로운 주제를 시작 &#34; 팝업 창에서.</li>
	<li>광학 Fractionator 워크플로의 다른 단계를 통해 이동합니다. 첫 번째 단계에서 주제를 설정 합니다. 이 위해 조사를 삽입 &#39; s 이름, 주제, &#39; s 이름 (SN 그룹), 및 기타 유용한 정보. 이 SN에 대 한 계산 섹션의 숫자를 삽입 합니다. 잘라 조직 단면도의 두께 삽입 합니다. 4이 경우에 섹션 간격을 삽입 합니다. 시작으로 임의로 결정된 섹션 번호 삽입.</li>
	<li>두 번째 단계에서 설정 낮은 확대 (2 X 목표)을 선택 현미경 &#34; 탄 창 렌즈 X 2 &#34; 메뉴에서.</li>
	<li>Baquet 외에 설명 된 대로 SNpc은 마우스 왼쪽된 버튼으로 관심 영역을 추적 3 단계에서., 2009 17.</li>
	<li>4 단계에서 높은 확대에 현미경을 설정합니다. 이 위해 100 X 목표를 변경 하 고 선택 &#34; 100 X 매기 렌즈 &#34; 드롭다운 메뉴에서.</li>
	<li>5 단계에서 초점을 맞춤 으로써 섹션의 하단을 상단에 탑재 된 두께 측정.</li>
	<li>단계에서 6, 50 x 50 µ m로 계산 프레임 크기를 정의; 광학 disector (x, y)의 크기입니다.</li>
	<li>7 단계에서 체계적인 무작위 샘플링 (SRS) 격자의 크기 130 x 130 µ m 설정.</li>
	<li>8 단계에서 3 µ m 감시 영역을 입력.</li>
	<li>9 단계에서 설정을 저장.</li>
	<li>는 마지막으로, 광학 Fractionator 워크플로의 단계 10에서에서 SRS 격자 내에서 광학 disectors의 각 목 + dopaminergic 셀을 계산합니다. 이 클릭 하 여 시작 된 &#34; 계산 &#34; 버튼.</li>
	<li>클릭 한 부분을 마치고는 &#34; 다음 섹션 시작 &#34; 같은 SN 시리즈의 다음 SN 섹션의 광학 Fractionator 워크플로 시작 하는 버튼.</li>
	<li>1 SN 시리즈의 마지막 SN 섹션 계량 되었습니다 때 클릭 &#34; 나 &#39; ve 완료 센다. &#34;</li>
	<li>클릭 합니다 &#34; 결과 보기 &#34; stereology 샘플링의 결과 표시 하려면 단추.</li>
</ol>

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</ol>

C. W. I. 즈 제약, LLC 및 TEVA; 과학 보드에서 제공 하는 Ipsen, 즈, LLC는, 제약과 엘 러간, Inc.;에서 여행에 대 한 자금 지원을 받고 있다 제출된 작품 외부 스피커 honoraria Merz, TEVA, 엘 러간, i n c.에서 받았다. J. V. 보스턴 과학, Medtronic, 및 AbbVie에 대 한 컨설턴트 역임 했다 고 제출된 작품 밖에 honoraria Medtronic, 보스턴 과학, AbbVie, Bial, 엘 러간, 및 GlobalKinetics에서 받고 있다.

Stereology는 조직 처리를 시작합니다. SN 조직의 직렬 절단 stereological 분석 하는 동안 섹션의 손실을 방지 하기 위해 신중 하 게 수행 되어야 합니다. 또한, 하나의 필수 단계 stereology 수행할 때 SN 왼쪽에서 오른쪽을 구별 하기 위해 한 반구를 표시 하는. Brainstem의 상단 부분에 작은 구멍을 배치 제시 연구에서 최상의 결과 생성. 또한, 조직이 광학 fractionator 방법 요구 작업 이후 약 30-40 µ m 보다는 더 일반적으로 immunohistochemistry, 항 체 및 다른 외피 유체 조직 침투 동안에 사용 하는 5-10 µ m의 두꺼운 부분에서 잘라 immunohistochemical 얼룩 해야 합니다 보장 되어야, 같은 세제를 사용 하 여.
Immunohistochemical dopaminergic 신경 TH 항 체를 사용 하 여에 대 한 얼룩 라벨 SN 신경으로 복 부 tegmental 지역 (VTA), SN에서 ...

신경 세포 수의 부 량은 neurodegeneration substantia nigra (SN)1,2에서 레벨을 전 임상 파 킨 슨 병 연구에. 관심의 영역에 셀 수의 편견된 stereological 추정 금3,,45으로 간주 됩니다.
편견된 stereology의 도래 하기 전에 섹션에서 신경 세포의 수는 뉴런 섹션에 광경에와 서 가변 확률에 대 한 수정 계산된 셀 프로 파일을 조작 하 여 평가 했다. 가장 일반적으로 사용 되는 방법 중 하나는 아베 크롬 비6에 의해 설명 된 정량된 셀의 정정 했다. 이 방법은 세포 조각 같은 셀의 인접 한 얇은 섹션에서 발견 되는 경우 여러 번 측정할 수는 계정에 걸릴 하려고 했습니다. 따라서, 아베 크롬 비와 다른 저자 모양, 크기, 및 계산된 셀7,8의 방향에 대 한 정의 요구 하는 방정식을 생성. 그러나, 이러한 가정 일반적으로 하지 실현 되었고 따라서 실제 휴대폰 번호 (즉, 바이어스)에서 체계적인 오류 및 분기에 led. 또한, 바이어스 추가 샘플링3으로 줄일 수 없습니다.
Stereological 광학 fractionator를 사용 하 여 셀 수 추정에 대 한 수학적 원리 직접 정의 3 차원 볼륨에 직접 셀 숫자를 추정에 적용 됩니다. 이 방법의 장점은 그것은 모양, 크기, 및 계산 셀의 방향에 대 한 가정을 포함 하지 않습니다. 따라서, 예상된 핸드폰 번호는 참 값에 가까운 고 가까이 샘플 크기가 증가 (즉, 편견)3. Stereology 편견 메서드를 계속 사용 하는 경우 많은 규칙을 따라야 합니다, 때문에 준비-사용 상업 stereology 시스템 개발 되었습니다 (검토를 위해 참조 슈 미 츠, 호프, 20054). 전문된 stereology 시스템 디자인-기반 stereological 메서드 구현 선험적 정의 프로브와 샘플링 방식을 모양, 크기, 공간 배급, 및의 방향에서 독립을 이끌어 내는 stereological 평가 분석 된4,9에 셀. 그러나, 상용 stereology 시스템 비싸다; 이 새로운 연구에서 제한할 수 있습니다.
이 연구의 목표는 SN, 광학 fractionator 메서드를 사용 하 고 표준 현미경 장비 (즉, 빛을 사용 하 여 마우스에서 dopaminergic 셀의 디자인 기반 stereological 추정에 대 한 사용 가능한 기술을 개발 했다 현미경, 표준 현미경 소프트웨어 및는 자동화 한 x, y, z 단계). 이 위해, 마우스 뇌 조직 처리 하는 방법과 편견된 stereology 디자인-기반을 사용 하 여 SN 셀 숫자를 예측 하는 방법에 대 한 단계별 가이드를 제시 합니다. 또한, 예상된 셀 숫자의 계산 및 오류 (CE)의 계수에 대 한 템플릿은 제공 합니다.
여기에 설명 된 메서드는 SN의 분석에 국한 되지 않습니다 하지만 마우스 또는 쥐 뇌의 해부학 적 정의 다른 영역에 사용 하기 위해 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 편견된 stereology 마10 과 로커 스 coeruleus11신경 세포 숫자를 추정 사용 되었습니다. 또한, 신경, 이다12 와 microglia13, 등 다른 세포 유형 뿐만 평가 될 수 있다. 따라서,이 방법은 그들의 연구에서 편견된 stereology를 구현 하고자 하지만 많은 stereology 시스템을 구입 하는 돈 지출 하고자 하는 과학자에 게 유용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Paxinos 마우스 아틀라</td><td></td><td></td>스 <td>The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz</td></tr><tr><td>brain matrix slicer mouse</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS 001-1</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Merck</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>sucrose /D(+) Saccharose</td><td>Roth</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>이소 펜탄</td><td>로스</td><td>3927.1</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>머크</td><td>1040931000</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>시그마 알드리치</td><td>32205-1L</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>phosphate buffered saline 성분 : </강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>나트륨 클로라이드</td><td>시그마 알드리치</td><td>31434-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>인산이수소</td>칼륨 <td>머크</td><td>1048731000</td><td></td></tr><tr><td>인산이수소나트륨 이수화물</td><td>머크</td><td>1065801000</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>머크</td><td>1049360500</td><td></td></tr><tr><td>일반 염소 혈청</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마</td><td>A4503-100G</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마 알드리치</td><td>X100-100ml</td><td>세제</td></tr><tr><td>3,3-디아미노벤지딘-테트라하이드로클로라이드/DAB 정제 10mg pH 7.0</td><td>Kem En Tec</td><td>4170</td><td></td></tr><tr><td>H2O2/ 과산화수소 30%</td><td>Merck</td><td>1072090250</td><td></td></tr><tr><td>avidin/biotin 시약</td><td>Thermo Scientific</td><td>32050</td><td>Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100</td></tr><tr><td>rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody</td><td></td><td>Abcam Ab112</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L</td><td>vector laboratories</td><td>BA-1000</td><td>1:100</td></tr><tr><td>StereoInvestigator version 11.07</td><td>MBF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BX53 microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visiview</td><td>Visitron Systems GmbH</td><td>3.3.0.2</td><td></td></tr><tr><td>Axiophot2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td>NIH</td><td>버전 4.7</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-TEK</td><td>OCT Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>드라이 아이스</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>그리드 오버레이 플러그인</td><td>Wayne Rasband</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html</td></tr><tr><td>셀 카운터 플러그인</td><td>Kurt de Vos</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).&nbsp;</td></tr><tr><td>광학 이분리기 매크로</td><td>Christopher Ward</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6N 수컷 마우스</td><td>Charles River, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus 코팅 개체 슬라이드</td><td>Langenbrinck, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25G 바늘 Microlance 3</td><td>BD</td><td>300400</td><td></td></tr><tr><td>REGLO 아날로그 주입 펌프</td><td>Ismatec</td><td>ISM 829</td><td></td></tr><tr><td>StereoInvestigator 시스템</td><td></td><td></td><td>StereoInvestigator 버전 11.07</td></tr><tr><td>BX53 현미경</td><td></td><td></td><td>BX53 현미경</td></tr><tr><td>자체 분류 stereology</td><td></td><td></td><td>Visiview</td></tr><tr><td>Axiophot2</td><td></td><td></td><td>Axiophot2</td></tr></tbody></table>

광학 fractionator 표준 현미경 장비를 사용 하 여 마우스 substantia nigra에서 dopaminergic 신경 수 stereological 추정

Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

전 임상 파 킨 슨 병 연구에 substantia nigra에서 dopaminergic 신경 손실의 정량화를 포함 하 여 nigrostriatal로 분석은 필수적입니다. 총 dopaminergic 신경 세포 숫자를 예상 하려면 편견된 stereology 광학 fractionator 메서드를 사용 하 여 현재 이라고 여겨진다 금 표준. 광학 fractionator 메서드 뒤에 이론은 복잡 하 고 stereology 전문된 장비 없이 달성 하기 어렵습니다, 때문에 필요한 소프트웨어를 포함 하는 여러 상용 완료 stereology 시스템 존재, 순전히 있기 때문에 셀에 대 한 이유를 계산. 이 보고서에 dopaminergic 신경 세포의 stereological 추정 가벼운 현미경을 포함 하 여 표준 현미경 장비를 사용 하 여 계산에 대 한 방법을 설명 합니다 이후 특수 stereology 설치 구입은 항상 가능 하 고, 여러 가지 이유로, 한 이미징 소프트웨어와 분석에 대 한 컴퓨터 개체 테이블 (x, y, z 평면)를 자동화. 단계별 설명은 광학 fractionator 메서드를 사용 하 여 stereological 정량화를 수행 하는 방법에 부여 되 고 예상된 셀 개수 계산에 대 한 사전 프로그램 된 파일 제공 됩니다. 이 방법의 정확도 평가, 하 상용 stereology 장치에서 가져온 데이터에 대 한 비교는 수행 되었다. 유사한 핸드폰 번호가 프로토콜과 stereology 장치를 사용 하 여 따라서 편견된 stereology이이 프로토콜의 정밀도 보여주는 발견 됐다.

제시 방법, 일 + 오른쪽 SN 7,363 및 7,987 세포 사이 원거리로 하 고, SN, 왼쪽에서 dopaminergic 신경의 예상된 번호를 사용 하 여 7,446 및 7,904 세포 사이. 따라서, dopaminergic 신경 (± SEM)의 평균 수 SN 오른쪽과 왼쪽 SN 7,675 ± 66에 대 한 7,647 ± 83 셀 이었다. 각 동물에 대 한 계산 된 CE는 0.08 보다 낮은 (범위: 0.073 0.079) (그림 7). 상업적으로 사용 가능 하 고 전문 stereology 시스템과이 메서드의 comparability 확인, SN 핸드폰 번호 stereology 설치 (그림 8)를 사용 하 여 정량도 했다. 세 매개 변수 했다: 그리드 크기, 130 x 130 µ m; 계산 프레임, 50 x 50 µ m; 100 x 가드 영역, 3 µ m. 섹션...

이 작업 표준 현미경 장비 (즉, 가벼운 현미경 자동화 개체 테이블 (x, y, z를 사용 하 여 마우스 substantia nigra에서 dopaminergic 신경 세포 숫자의 편견된 stereological 추정에 대 한 단계별 프로토콜 제공 비행기), 그리고 디지털 이미지 분석을 위한 공개 소프트웨어.

광학 Fractionator 표준 현미경 장비를 사용 하 여 마우스 Substantia Nigra에서 Dopaminergic 신경 수 stereological 추정

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 표준 현미경 장비를 사용하여 마우스 SN 내 도파민성 세포 수의 설계 기반 입체 분석적 추정 방법을 설명하는 것입니다. 이 방법은 설계 기반의 비편향적 입체 분석법을 이용하여 전임상 파킨슨병 연구를 위한 마우스 흑질의 도파민성 뉴런 수를 추정하는 데 유용합니다. 이 기술의 주요 장점은 시판되는 완전한 입체 분석 설정 장비 없이도 표준 현미경 장비만으로 수행 가능하다는 것입니다.실험 절차 시연은 제 실험실의 기술자인 Louisa Friez가 맡아 진행하겠습니다. 우선 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정된 마우스 뇌를 브레인 매트릭스(brain matrix)에 넣고 bregma로부터 +0.74 mm 지점에서 절단하는 것으로 시작합니다. SN을 포함한 뇌의 미측(caudal) 부분을 0.1 M 4% PFA에 옮겨 4 °C에서 하룻밤 동안 고정합니다.다음 날, PFA를 0.1 M PBS 내의 30% sucrose로 교체하고 4°C에서 이틀 더 배양하여 시료를 동결 보호합니다. 이틀 후 뇌 조직이 sucrose 용액 속으로 가라앉으면, OCT compound(optimal cutting temperature compound)가 채워진 Cryomold에 조직을 넣고 액체 드라이아이스로 냉각된 isopentane에서 천천히 동결시킵니다. 크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 관상면(coronal plane)으로 30 µm 두께의 동결 절편을 연속적으로 제작합니다.뇌줄기의 상단 영역에 작은 구멍을 뚫어 우뇌 반구를 표시합니다. bregma로부터 -2.46 mm 지점에서 시작하여 4.04 mm 지점에서 끝나는 네 세트의 절편을 수집합니다. 각 절편 세트를 동결 보호제가 채워진 튜브로 옮겨 -20 °C에서 보관합니다.현미경에 연결된 이미징 소프트웨어를 사용하여 tyrosine hydroxylase 면역조직화학 염색이 된 SN 절편의 디지털 이미지를 캡처합니다. 먼저 절편당 무작위로 선택된 3곳의 계수 지점에서 절편의 실제 장착 높이와 두께를 측정합니다. 우선 'view top offset'을 클릭하여 절편의 상단을 정의합니다.그런 다음 stop view top을 클릭하십시오. 이어서 view bottom offset을 클릭한 후 stop view bottom을 클릭하십시오. 절편의 두께를 기록하십시오.상단 오프셋에서 3 µm를 빼서 가드 존(guard zone)을 계산한 후, 그 결과를 상단 오프셋 입력란에 입력하십시오. 그다지 상단 오프셋 값에서 광학 절단기(optical dissector)의 높이인 13 µm를 뺀 후, 그 결과를 하단 오프셋 입력란에 입력하십시오. 파라미터는 14단계(steps 14), 크기 1.00(size 1.00)으로 선택하십시오.파일을 저장할 디렉토리를 선택하십시오. 획득을 시작하려면 sequence를 클릭하십시오. 이미지 획득이 완료되면 processing을 클릭하고, sequence의 모든 평면(all planes), montage, 그리고 fast 및 stitching 확인란을 선택한 후 이미지 중첩(overlap)을 10%로 설정하십시오. start를 클릭하여 이미지 스티칭을 시작하십시오.이를 통해 분석을 위한 스택 이미지를 생성할 수 있습니다. 우선, 파일(file)의 열기(open)를 클릭하여 이미지를 엽니다. 분석(analyze)의 척도 설정(set scale) 명령을 사용하여 이미지 스케일을 설정하십시오.이 단계부터 정의된 크기 단위를 픽셀에서 마이크론으로 변경하십시오. 플러그인, 그리드, 그리드 유형-선(grid type lines) 명령을 차례로 선택하여 그리드를 무작위로 삽입합니다. 이때 랜덤 오프셋(random offset) 확인란을 선택하십시오.그리드 내 한 칸의 크기를 130 microns x 130 microns로 설정하여 16,900 square microns가 되도록 합니다. 이미지-정렬-RGB color 순으로 클릭하여 이미지 유형을 16-bit에서 RGB color로 변경합니다. substantia nigra pars compacta를 찾습니다.브러시 너비를 11로 설정한 페인트브러시 도구를 사용하여 해당 영역을 원으로 둘러쌉니다. Analyze를 클릭한 다음 Set Scale을 선택하고, Remove Scale을 클릭하여 설정된 스케일을 취소함으로써 마이크론 대신 픽셀 단위로 계산하도록 합니다. 스크린샷을 찍어 이미지 파일을 저장하고, ImageJ에서 새 파일을 엽니다.브러시를 선택하고 브러시 너비를 25로 설정하십시오. 광학 분절기(optical dissector) 배치를 위해 SN과 접촉하는 모든 그리드 사각형을 표시하십시오. SN의 일부가 포함된 그리드 사각형 하나를 선택하십시오. ImageJ의 커서로 해당 사각형의 왼쪽 상단 모서리를 측정하여 시작 x 및 y 좌표를 정의하십시오.optical dissector position이라는 제목의 스프레드시트 템플릿을 선택하여 광학 디섹터 위치(optical dissector position)를 계산하십시오. 그런 다음 프로토콜의 서술 부분에 설명된 대로 cell count 계산 스프레드시트를 사용하여 세포 수를 추정하십시오. 이 저배율 이미지는 도파민성 뉴런을 위해 TH 염색을 수행한 마우스 뇌의 단면을 보여줍니다.고배율 사진은 TH 양성 도파민성 뉴런을 보여줍니다. 삽입도는 상자 표시된 영역을 확대하여 보여줍니다. 이 이미지는 쥐의 SN 전체를 앞쪽(rostral)부터 뒤쪽(caudal)까지 포함하는 TH 염색 SN 절편의 한 시리즈를 보여줍니다.각 절편은 다음 절편과 120 microns 간격으로 분리되어 있습니다. 마우스 SN의 좌우측에 있는 TH 양성 뉴런의 수는 본 영상에서 제시된 방법과 시판되는 스테레올로지 시스템을 사용하여 추정되었습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 두 방법 모두 유사한 세포 수 측정 결과를 보였으며 데이터 세트 간에 유의미한 차이는 없었습니다.파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안에는 보호 장갑과 같은 개인 보호 장구를 착용하는 등의 예방 조치를 항상 취해야 함을 잊지 마십시오. 이 영상을 시청한 후면, 광학 분획법(optical fraction method)과 표준 현미경 장비를 사용하여 생쥐의 흑질(substantia nigra) 내 도파민성 뉴런 수를 비편향적 입체 조직학적 방법으로 추정하는 법을 충분히 이해하게 될 것입니다.

stereological-estimation-dopaminergic-neuron-number-mouse-substantia

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

도파민은 분명히 세포 기관 및 도파민 뉴런의 dendrites을 포함 midbrain의 핵에서 규제하고 있습니다. 여기 substantia nigra (SN)과 설치류의 복부 tegmental 지역 (VTA)의 midbrain의 핵에 도파민 규정에 따라서 절개 및 샘플 처리 결과를 극대화하는 접근 방식과 결론 및 통찰력을 설명합니다.

Substantia Nigra 및 복부 Tegmental 지역의 도파민 규정의 종합적인 프로파일

이 비디오는 알파-시누클레인 미리 형성된 섬유로 전처리된 배아 마우스 도파민 뉴런에서 알파-시누클레인 축적을 정량화하는 과정을 보여줍니다. 면역 형광을 사용하여 알파-시누클레인 응집체를 포함하는 도파민 뉴런을 고정, 염색 및 정량화하는 단계를 설명합니다.

Primary Embryonic Mouse Dopamine Neurons에서 알파-시누클레인 축적 연구

출처: Olesen, M. V., et al. 전기 경련 요법의 쥐 모델에서 세포 수를 추정하는 광학 분획기 기술. J. vis. exp. (2017).  이 비디오는 뇌 조직에서 새로 생성된 뉴런을 정량화하는 기술을 보여줍니다. Bromodeoxyuridine(BrdU) 표지된 뉴런을 포함하는 해마 조직 절편을 면역조직화학을 사용하여 염색한 후 광학 분획기 기술을 사용하여 조직 두께 전체에 걸쳐 정량화했습니다.

광학 분획기 기법을 사용하여 쥐의 뇌 조직에서 새로 생성된 뉴런 정량화

이 프로토콜은 성인 마우스의 적응 행동 및 뇌 복구의 기저에 있는 환경적으로 유발된 뇌 변화를 연구하기 위한 두 가지 다른 환경 조작과 동시 뇌 주입 프로토콜을 설명합니다.

성인 마우스의 중간 뇌 도파민 뉴런의 수의 환경 변조

파킨슨 병 (PD)에서 Substantia 그라 (SNC) 도파민 신경 세포는 운동 기능 장애로 이어지는, 퇴화. 여기에서 우리는 티로신 하이드 록 (TH) 프로모터 서열에 의해 구동 eGFP는 표현 마우스에서 복부 중뇌 신경 세포를 배양하는 문화에서 개별 형광 신경 세포를 수확하고, RNA-서열을 사용하여 사체를 측정하기위한 프로토콜을보고합니다.

RNA 시퀀싱 및 TH-프로모터 중심 eGFP는 표현을 사용하여 중간 뇌 문화에서 생활 도파민 뉴런의 신뢰성 확인

여기, 우리는 electroconvulsive 자극 후 쥐 해마에 새로운 뉴런의 형성과 그 생존을 계량하는 데 사용되는 stereological 방법, 광학 fractionator을 제시한다. 정확한 구현이 이루어질 때, 입체파 방법의 민감도와 효율성은 고정 된 미리 정해진 정밀도로 정확한 추정을 보장합니다.

전기 충격 요법의 쥐 모델에서 세포 수를 추정하기위한 광학적 분별 기 기술

핵 accumbens에 있는 도파민 D1-알파 수용 체의 식별은 중앙 신 경계 질환 중 D1 수용 체 역 기능을 명확히 중요 합니다. 우리는 새로운 RNA 제자리에서 교 잡 분석 결과 시각화 특정 뇌 영역에 하나의 RNA 분자를 수행.

탐지 기술 현장에서 혁신적인 RNA에 의해 설치류 핵 Accumbens에서 도파민 D1-알파 수용 체의 식별

여기, 우리 면역 형광 염색 법을 사용 하 여 마커 단백질, confocal 현미경 검사 법 및 컴퓨터 기반 분석 시 냅 스 단백질의 분포를 결정 하는 양적 접근 방식을 설명 합니다.

면역 형광 검사를 사용 하 여 마우스 뇌의 시 냅 스 단백질의 다른 유형의 분포를 측정

뇌 영역의 3차원 구조 내의 뉴런 섬유 길이는 특정 뉴런 구조적 무결성 또는 변성을 정량화하는 신뢰할 수 있는 파라미터이다. 본 문서는 예를 들어 마우스에서 Meynert의 핵 기저부 내에서 해 섬유 길이를 측정하는 입체 정량화 방법을 자세히 설명합니다.

마우스 뇌의 마이너트 핵 기저에서 콜린성 섬유 길이의 입체 추정

여기서, 우리는 1 차 마우스 도파민 뉴런에 신경 α-synuclein 축적을 연구하기 위하여 상세한 프로토콜을 제시합니다. 뉴런의 인광α-시뉴클레인 골재는 미리 형성된 α-시뉴클레인 피브릴로 유도된다. 면역형으로 표지된 세포와 편견없는 이미지 분석의 자동화된 이미징은 α-synuclein 축적을 억제하는 약물의 중간-고처리량 스크리닝에 적합한 강력한 프로토콜을 만듭니다.

1 차 배아 마우스 중뇌 도파민 뉴런에서 사전 형성 된 피브릴 유도 α-시뉴클레인 축적 연구

여기서 우리는 쥐 실질니그라 파스 콤팩트카에서 도파민성 뉴런 수의 반정적 측정을 위한 자동화된 방법을 제시한다.

자동 이미지 분석을 사용하여 설치류 모델의 실질적인 Nigra에서 도파민성 뉴런 밀도의 반정량 측정

배우세요 마우스 흑질에서 도파민성 신경 수를 표준 현미경 장비로 정량화하는 광학 프랙셔네이터 기법. 이 방법은 파킨슨병 전임상 연구에서 신경 손실을 평가하는 데 활용됩니다.

광학 Fractionator 표준 현미경 장비를 사용 하 여 마우스 Substantia Nigra에서 Dopaminergic 신경 수 stereological 추정

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