광학 Fractionator 표준 현미경 장비를 사용 하 여 마우스 Substantia Nigra에서 Dopaminergic 신경 수 stereological 추정

이 프로토콜의 전반적인 목표는 표준 현미경 장비를 사용하여 마우스 SN의 도파민 세포 수에 대한 설계 기반 입체 추정을 설명하는 것입니다. 이 방법은 설계 기반 편향되지 않은 입체학을 사용하여 전임상 파킨슨병 연구를 위해 생쥐 substantia nigra의 도파민 뉴런 수를 추정하는 데 유용합니다. 이 기술의 주요 장점은 상업적으로 이용 가능한 완전한 stereology 설정이 필요 없이 표준 현미경 장비로 달성할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 기술자인 Louisa Friez입니다. 파라포름알데히드가 고정된 쥐의 뇌를 뇌 매트릭스에 넣고 브레그마에서 0.74mm를 더한 절단으로 시작합니다. SN을 포함한 뇌의 꼬리 부분을 0.1 어금니에서 4% PFA로 옮기고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 고정합니다.

다음날, PFA를 0.1 어금니 PBS에서 30 % 자당으로 교환하고 섭씨 4도에서 2 일 동안 더 배양하여 샘플을 극저온 보호합니다. 이틀 후 뇌가 자당에 가라앉으면 조직을 최적의 절단 온도 화합물로 채워진 극저온 몰드에 넣고 액체 드라이 아이스로 냉각된 이소펜탄에서 조직을 천천히 동결합니다. 저온 유지 장치를 사용하여 코로나 평면에서 30미크론 극저온 절편을 연속적으로 절단합니다.

뇌간의 상부 영역에 작은 구멍을 뚫어 오른쪽 반구를 표시합니다. 브레그마에서 영하 2.46mm에서 시작하여 브레그마에서 4.04mm에서 끝나는 4개의 일련의 섹션을 수집합니다. 각 일련의 섹션을 동결 방지제로 채워진 튜브로 옮기고 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.

현미경에 연결된 이미징 소프트웨어를 사용하여 티로신 하이드록실라제 면역조직화학적으로 염색된 SN 절편의 디지털 이미지를 캡처합니다. 먼저 단면당 무작위로 선택된 3개의 계수 사이트에서 단면의 실제 장착과 두께를 결정합니다. 먼저 뷰 상단 오프셋을 클릭하여 단면의 상단을 정의합니다.

그런 다음 보기 중지를 맨 위로 클릭합니다. 그런 다음 view bottom offset을 클릭한 다음 stop view bottom을 클릭합니다. 섹션의 두께를 기록하십시오.

맨 위 간격띄우기에서 3미크론을 빼서 보호 영역을 계산하고 그 결과를 맨 위 간격띄우기 상자에 입력합니다. 그런 다음 상단 오프셋 번호에서 광학 해부기의 13미크론 높이를 빼고 결과를 하단 오프셋 상자에 입력합니다. 다음 매개 변수, 14단계, 크기 1.00을 선택합니다.

파일을 저장할 디렉토리를 선택합니다. 시퀀스를 클릭하여 수집을 시작합니다. 이미지를 획득한 후 처리를 클릭하고 다음 매개변수를 선택하고 시퀀스, 몽타주 및 이미지 겹침이 10%인 고속 및 스티칭 상자의 모든 평면을 선택합니다. 시작을 클릭하여 이미지를 스티칭하기 시작합니다.

이렇게 하면 분석을 위한 스택 이미지가 생성됩니다. 시작하려면 파일을 클릭하고 열어 이미지를 엽니다. analyze 및 set scale 명령을 사용하여 이미지 배율을 설정합니다.

이 단계에서 정의된 크기를 픽셀에서 미크론으로 변경합니다. 플러그인을 선택한 다음 그리드를 선택한 다음 그리드 유형 선 명령을 선택하여 그리드를 무작위로 삽입합니다. 임의 오프셋 상자를 선택합니다.

그리드 내에서 한 정사각형의 크기를 130미크론 x 130미크론으로 정의하여 16, 900제곱 미크론과 같습니다. 이미지를 클릭하여 이미지 유형을 16비트에서 RGB 색상으로 변경한 다음 RGB 색상을 입력합니다. substantia nigra pars compacta를 찾습니다.

브러시 너비 11을 사용하여 페인트 브러시 도구로 영역을 둘러쌉니다. analyze(분석)를 클릭하고 scale set(스케일을 설정)를 클릭한 다음 scale을 클릭하여 제거하여 scale (스케일)을 클릭하여 set scale 명령을 실행 취소하여 미크론이 아닌 픽셀 단위로 계산합니다. 스크린샷을 찍고 이미지 파일을 저장한 다음 ImageJ로 새 파일을 엽니다.

브러시를 선택하고 브러시 너비를 25로 지정합니다. 광학 해부기의 배치를 위해 SN과 접촉하는 모든 그리드 사각형을 표시합니다. SN의 일부를 포함하는 그리드 사각형 하나를 선택합니다. ImageJ에서 커서를 사용하여 사각형의 왼쪽 위 모서리를 측정하여 시작 x 및 y 좌표를 정의합니다.

Optical Disectia position(광학 해부 위치)이라는 스프레드시트 템플릿을 선택하고 광학 해부 위치를 계산합니다. 그런 다음 프로토콜의 작성된 부분에 설명된 대로 셀 수 스프레드시트의 계산을 사용하여 셀 수를 추정합니다. 이 저출력 이미지는 도파민성 뉴런에 대한 TH 염색 후 쥐 뇌의 단면을 보여줍니다.

더 높은 배율은 TH 양성 도파민 뉴런을 나타냅니다. 삽입은 증가된 배율에서 박스형 영역을 보여줍니다. 이 이미지는 주부에서 꼬리까지 전체 마우스 SN을 덮고 있는 일련의 TH 염색된 SN 단면을 보여줍니다.

각 섹션은 연속 섹션과 120미크론으로 분리됩니다. 오른쪽 및 왼쪽 마우스 SN의 TH 양성 뉴런 수는 이 비디오에 표시된 방법과 상업적으로 이용 가능한 stereology 시스템을 사용하여 추정되었습니다. 여기에서 볼 수 있듯이 두 방법 모두 유사한 세포 수를 생성했으며 데이터 세트 간에 큰 차이는 없었습니다.

파라포름알데히드로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 보호 장갑과 같은 개인 보호 장비 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오. 이 비디오를 시청한 후에는 광학 분획법과 표준 현미경 장비를 사용하여 생쥐 흑질의 도파민 뉴런 수에 대한 편향되지 않은 입체 추정을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.