Name: 수평 한 전체적인 거치 : 피부의 두껍고, 3 차원 조직 단면도를위한 비발 한 가공 그리고 화상 진찰 의정서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 배우세요 두꺼운 3차원 피부 조직 단면을 위한 비발한 가공 및 공초점 현미경 영상 프로토콜을. 이 방법은 항원성과 구조적 완전성을 보존하여 쥐 피부의 모낭과 근육을 완전하게 시각화하고 복잡한 조직 구조를 연구하는 데 도움을 줍니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

저자는 Thermo-Fisher Scientific의 후원을 인정하고 공 촛점 이미지 수집 중 지원을 위해 Kings College London의 Nikon Imaging Center에 감사드립니다.

모든 동물 실험은 지역 윤리 승인을 받아야하며 영국 정부 본국 면허 조건에 따라 수행되었습니다. 1. 피부 수확 및 냉동 보존 <ol><li> 준비. <ol><li> 1 % 인산 버퍼 식염수 (PBS) 25 ML와 4 % PFA 및 두 100mm 문화 요리 25 ML와 하나의 100mm 문화 요리를 준비합니다. </li><li> 최적의 절삭 온도 컴파운드 (OCT)로 직사각형 껍질을 벗기는 초저온을 3 분의 2까지 채 웁니다. </li><li> 저온 냉각 장치가 나중에 배치 될 수있는 금속 플레이트를 -80 ° C의 냉동 장치에 놓습니다. </li></ol></li><li> 피부 수확, 고정 및 냉동 보존. <ol><li> 마른 전기 면도기로 동물 시체의 등쪽 부위를 자릅니다. 참고 :이 예제에서는 출생 후의 21 일 야생형 마우스를 사용했습니다. </li><li> 피부에 관심있는 부위를 수확하십시오. 참고 : 마우스 피부의 등쪽 부위 ( <stron그림 1a)에는 균등하게 간격을두고 정렬 된 모낭의 비율이 가장 높으므로 절편을위한 최적의 방향이 있습니다. 피부가 아닌 조직의 제거는 필요하지 않지만 필요한 경우 수행 할 수 있습니다. </li><li> 수확 한 피부를 냉동 크기의 바닥에 맞게 적당한 크기의 직사각형 조각으로 잘라내어 모근 입자의 방향 성장을 고려하십시오. 주 : 초소형 스킨 슬라이스는 초보자가 다루기가 쉽기 때문에 인큐베이터 및 장착 과정에서 뒤죽박죽이 될 가능성이 적습니다. 여기에 표시된 예제는 ~ 1cm 2 의 등 지느러미 영역으로, 22 x 30 x 20 mm의 청색 결정 ( 그림 2a )에 들어 있습니다. </li><li> 피부 샘플 ( 그림 1b )의 두께에 따라 10-30 분 동안 4 % PFA 25 ML에 실온에서 피부를 고정. </li><li> 25 mL의 PBS로 2 번 피부 샘플을 씻으십시오.각각 최소 5 분 동안 ( 그림 1b ). </li><li> 종이 타올에 스킨 샘플을 담가서 과도한 PBS 조직을 조심스럽게 배수하십시오. 그러면 얼어 붙는 과정에서 결정화를 일으킬 수 있으며 cryosectioning 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 참고 : 표준 자당 기울기가 필요하지 않습니다. 그러나 이는 사용자의 재량에 따라 프로토콜에 통합 될 수도 있습니다. </li><li> 각 피부 샘플에 대한 모낭의 방향을 알고 있어야합니다. 시각 보조를 위해 해부 현미경을 사용하십시오 (특히 프로토콜을 처음 수행하는 사람). 피부 샘플을 OCT로 채워진 크라이 놀드에 넣고 포셉을 사용하여 잘린 머리카락의 표면에 부착 된 기포를 제거하여 피부의 모든 부위를 OCT로 평형시킵니다 ( 그림 2a 및 2b ). </li><li> OCT가 채워진 블록의 바닥에 피부를 밀어서 바닥과 평평하게 놓습니다. 참고 : 피부는 어떤 방향으로도 배향 될 수 있습니다.머리카락의 알갱이가 적절한 절단 과정에 대해 언급되는 한 오래 지속됩니다. cryosolding은 블록이 cryosectioning을 위해 cryostat에 부착 될 때 방향이 바뀔 것이다. 이 단계는 저온 유지 장치 절단의 후속 방향을 결정하기 때문에 냉동 표준에서 모낭의 방향을 표시하십시오. </li><li> 조직의 부동 및 탈락을 피하기 위해 -80 ° C의 냉동고에있는 금속판에 저온 차단 장치를 옮기십시오. </li><li> 보이지 않는 공기 방울이 피부가 초저온 물체의 표면으로 올라갈 수 있으므로 냉동 과정을 모니터링하여 초저온의 바닥에있는 피부의 방향을 유지합니다. 참고 : 냉동 조직이있는 Cryomold는 -80 ° C에서 1 년 이상 보관할 수 있으며 추가 섹션을 위해 재사용 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol><img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig1.jpg" /> 그림 1. 마우스 스킨 수집 및 고정. </strong&gt; ( a ) 동물 시체의 등쪽 부위에서 피부 조직을 수확했다. 이 영역의 모낭은 균등하게 간격을두고 배열되어 있으며 따라서 화살표로 표시된 바와 같이 절단 중에 최적의 방향을 허용합니다. ( b ) 크리오 몰드에 맞는 적절한 크기의 사각형을 절단 한 후, 피부 조직을 4 % PFA에서 15 분간 고정시키고 각각 5 분 동안 PBS로 2 회 세척 하였다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 2. 두꺼운 조직 횡단면 <ol><li> 저온 유지 장치에 장착 할 준비 및 조직 방향. <ol><li> 15 ML의 PBS와 100mm 문화 요리를 준비합니다. 저온 저장 장치에 쉽게 접근 할 수있는 곳에 놓으십시오. 또한, 웰당 2.5 ML의 PBS와 12 잘 접시를 준비; se의 장기 보관을위한 샘플에 따른 라벨4 ℃에서. 포셉을 사용하여 섹션을 처리하십시오. </li><li> -20 ° C에 저온 유지 장치의 온도를 조정하십시오. 참고 : 온도는 절단에 영향을 줄 수 있지만 -20 ° C에서 시작하는 것이 좋습니다. </li><li> 두 개의 모낭이 두꺼운 섹션을 얻으려면 절편을 150 μm 두께로 자르십시오. 참고 : 섹션의 두께는 사용자의 요구와 분석에 사용되는 현미경의 한계에 따라 달라질 수 있습니다. 참고 : 샘플의 방향은 모발이 적절한 방향으로 피부 절편을 얻는 데 중요합니다. 이것은 저온 유지 장치 블록에 올바르게 장착하여 이루어집니다. 단면 평면이 모낭의 방향과 평행한지 확인하십시오 ( 그림 2c ). 이전에 언급했듯이 스킨 샘플에서 단면 평면의 정확한 방향은 이미지의 품질을 결정하는 중요한 단계입니다.나중 단계. </li></ol></li></ol><img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig2.jpg" /> 그림 2. Embedding, cryopreservation 및 sectioning. ( a ) 흑색 화살표로 표시된 크리오 몰드에서 머리 여포 (HF) 방향을 표시하는 것은 cryosectioning 동안 적절한 방향에 중요합니다. ( b ) 단면 모서리는 모낭의 전체 길이가 그대로 유지되는 섹션을 생성하기 위해 모낭 오리 엔테이션과 정렬해야합니다. ( c ) 섹션은 모낭의 방향에 따라 검은 모서리 방향으로 절단되었습니다 냉동고. ( d ) 두꺼운 조직 단면을 금속 집게로 수집하고 ( e ) 1x PBS가 들어있는 100mm 배양 접시에 옮겼다. ( f ) 실온에서, PBS는 OC를 용해시킨다.티. 흰색 화살표로 표시된 것처럼 두꺼운 조직 단면을 둘러싸는 화합물. 섹션은 PBS에서 자유롭게 부유됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="2"><li> Cryosectioning. <ol><li> 저온 유지 장치를 사용하여 섹션을 자르십시오. 삽입 된 피부 조각을 포함하는 OCT를 집게를 사용하여 집게를 사용하십시오 ( 그림 2d ). 참고 : 최적의 시편 포지셔닝을 위해 X, Y 및 Z 축을 따라 독립적으로 이동하고 조정할 수있는 저온 유지 장치를 사용하십시오. 이를 통해 이상적으로 정렬 된 조직 단면을 생성 할 수 있습니다. </li><li> PBS로 채워진 100mm 문화 접시에 저온 저장 장치에서 절편을 옮기고 다음 조각을 계속합니다. 슬라이드에 샘플을 채취하지 마십시오 ( 그림 2e ). 참고 : 실온에서 PBS는 용해됩니다OCT는 포셉으로 다루기 쉬운 피부 조각을 남겨 둡니다 ( 그림 2f ). 참고 : 100 μm 두께의 많은 조직 절편을 용해한 후 100 mm 배양 접시에 신선한 PBS가 필요할 수 있으므로 그에 따라 변경할 수 있습니다. </li><li> 겸자를 사용하여 2.5 ML의 PBS ( 그림 3a , 왼쪽)로 가득 12 잘 접시에 올바르게 표시된 우물로 이동 피부 섹션을 전송합니다. 참고 : 4 ° C에서 샘플을 최소 2 일 동안 보관할 수 있습니다. 절단 후 피부를 함유 한 OCT 블록을 장기간 보관하려면 신선한 OCT 액 적을 사용하여 절단 표면을 밀봉하십시오. OCT 액 적의 냉동 후 사용 된 OCT 블록을 파라 필름에 싸서 -80 ° C 냉동고 . </li></ol></li></ol> 3. 면역 형광성 라벨링. <ol><li> Leas에서 0.5 % 탈지 분유, 0.25 % 생선 피부 젤라틴 및 0.5 % Triton X-100을 보충 한 PBS 완충액을 준비합니다t 2 h를 사전에 설명한대로 5 . 참고 : 염색 완충액을 반복적으로 사용하기 위해 항균 보존을 위해 나트륨 아자 이드를 PB 완충액에 첨가 할 수 있습니다. </li><li> 라벨 1.5 ML microcentrifuge 튜브와 튜브 당 PB 버퍼 500 μL를 추가합니다. 조심스럽게 포셉을 사용하여 PBS에서 피부 조각을 차단 용 PB 버퍼가 들어있는 별도의 튜브로 옮깁니다 ( 그림 3a , 오른쪽). 모든 스킨 슬라이스가 완전히 잠겼는지 확인하십시오. 미세 원심 분리 튜브를 시시 로커에 놓고 상온에서 1 시간 동안 조직 무결성을 방해하지 않는 분당 10 회 이상의 진동을 발생 시키십시오. 참고 : 톱니 모양의 로커에서 속도가 분당 10 번의 진동을 초과하지 않는 것이 중요합니다. 톱니 모양의 로커가 꼬임을 유발할 수 있기 때문입니다. <ol><li> 미세 원심 분리 튜브 당 하나 이상의 슬라이스를 추가하는 것은 가능하지만 항체를 절약하려면 튜브 당 하나의 슬라이스 만 배치하십시오. 항체 사용을 줄이려면 볼륨을 사용하십시오.250 μL. 참고 : 필요할 경우, 예를 들어 96- 웰 플레이트로 마이크로 원심 분리 튜브를 대체하십시오. 그러나, 1.5-mL 미세 원심 분리 튜브에 두꺼운 조직 단면을 배치하면 향상된 액체 섭동으로 인해 조직에 가장 효과적인 항체 침투가 가능합니다. </li></ol></li><li> 각 피부 슬라이스에 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브를 별도로 레이블 및 PB 버퍼 및 기본 항체의 적절한 금액의 500 μL를 추가합니다. 차단 1 시간 후 항체가 들어있는 새롭게 준비된 튜브에 피부 조각을 옮깁니다. 4에서 조각을 품어 ° C 밤새. 참고 :이 예제에서는 다음과 같은 기본 항체가 사용되었습니다 : 1:50의 농도에서 FITC 쥐 항 - 인간 CD49f와 1 : 100의 농도에서 염소 항 마우스 / 쥐 integrin 알파 8. </li><li> 다음날, 시료 당 PBS 500 μL가 들어있는 2 개의 분리 된 1.5 mL 미세 원심 분리 튜브를 준비하십시오. 실내 온도에서 1 시간 동안 피부 조각을 2 번 씻으십시오.이자형. </li><li> 적용 가능한 2 차 항체 및 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)의 적절한 농도로 PB 버퍼 500 μL를 포함하는 별도의 1.5 ML microcentrifuge 튜브를 준비합니다. 참고 :이 예제에서 사용되는 보조 항체는 1 : 500의 농도에서 Alexa Fluor 488 당나귀 항 - 래트 IgG 및 Alexa Fluor 555 당나귀 항 염소 IgG입니다. DAPI는 1 : 100의 농도로 사용되었다. </li><li> 조심스럽게 보조 항체와 DAPI가 들어있는 PB 버퍼에 피부 샘플을 옮기고 로터 또는 쉐이커에서 저속으로 1 시간 동안 실온에서 피부 조각을 품어 라. </li><li> 최대 4 일 동안 2 차 항체와 DAPI가 포함 된 PB 완충액에 4 ° C로 슬라이스를 보관하십시오. 나트륨 아자 이드가 PBS에 추가되는 경우 더 오래 걸릴 수 있습니다. </li></ol><img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig3.jpg" /> 그림 3. Immunofluorescent 라벨 부착 및 장착. ( a ) 부동 조직 단면은 4 ℃에서 최소 2 일 동안 12- 웰 플레이트에 저장할 수 있습니다. immunofluorescent (IF) 표시하기 전에 화살표 1에 표시된 바와 같이 차단을위한 PB 버퍼가 포함 된 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 관심있는 조직 단면을 전송하십시오. IF 라벨 들어, 3 단계에서 정교한 다중 단계 절차를 준수합니다. 각 단계 3의 일부는 화살표 2로 표시된 1 차 항체 용액, 2 차 항체 용액 또는 세척 완충액을 함유하는 새로 제조 된 미세 원심 분리 튜브 내로 조직 단면을 조심스럽게 옮길 것을 요구한다. ( b ) IF 표지 후, 섹션은 해부 현미경의 도움을 사용하여 글리세롤의 물방울에서 풀리고 평평합니다. ( c ) 일단 조직 횡단면이 커버 슬립의 바닥에 완전히 편평하게되면, 일정한 현미경 슬라이드가 단면을 장착하는데 사용된다. <a이 그림의 더 큰 버전을 보려면 href = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig3large.jpg&quot;target = &quot;_ blank&quot;&gt; 여기를 클릭하십시오. 4. 현미경 시각화를위한 설치 <ol><li> 이미징하기 전에 PBS의 500 μL를 포함하는 별도의 microcentrifuge 튜브에 피부 조각을 전송하여 2 차 항체와 DAPI를 씻어냅니다. </li><li> 1000 μL 피펫을 사용하지만, 점도가 높은 글리세롤의 적절한 피펫 팅을 가능하게하려면 피펫 팁의 첫 번째 0.5 cm를 자릅니다. 해부 현미경 ( 그림 3b ) 아래 어두운 배경 위에 22 x 50mm coverslip를 놓으십시오. </li><li> 100 % 글리세롤 한 방울을 커버 슬립에 첨가하십시오 ( 그림 3b ). microcentrifuge 튜브에서 피부 조각을 글리세롤 물방울로 옮깁니다. 해부 현미경과 뾰족한 집게를 사용하여 조심스럽게 구겨져있는 피부 조각을 푸십시오. 참고 : 슬라이스가 gly에 떠있을 때cerol 물방울, 그것은 정상적인 모양으로 돌아갈 수있는 조직의 자연적인 성향을 coaxing하여 untangled 수 있습니다. 슬라이스의 부 자연스러운 직선화를 강요하지 마십시오. 슬라이스가 조직에 손상을 줄 수 있습니다. </li><li> 피부 단면의 전체 길이가 커버 슬립에서 적절하게 배향되고 평평 해지면 티슈를 장착하십시오. 정기적 인 현미경 슬라이드를 사용하십시오. 이 단계는 스킨 슬라이스를 직선화합니다. 참고 : 공기 함몰을 피하십시오 ( 그림 3c ). </li><li> 다음 2 일 이내에 글리세롤 장착 피부 섹션을 이미지하십시오. 참고 : 장기간 보관하면 조직 및 영상 품질에 부정적인 영향을 미칩니다. 이 예제에서 모든 이미지는 20x 대물 렌즈를 사용하여 직립 공 촛점 현미경으로 획득했습니다. </li></ol>

<ol><li>Plikus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+dermal+BMP+signalling+regulates+stem+cell+activation+during+hair+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration.</a> Nature. 451 (7176), 340-344 (2008).</li>
<li>Zhang, Y. V., Cheong, J., Ciapurin, N., McDermitt, D. J., Tumbar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+self-renewal+and+differentiation+phases+in+the+niche+of+infrequently+dividing+hair+follicle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct self-renewal and differentiation phases in the niche of infrequently dividing hair follicle stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (3), 267-278 (2009).</li>
<li>Jensen, U. B., Lowell, S., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatial+relationship+between+stem+cells+and+their+progeny+in+the+basal+layer+of+human+epidermis%3A+a+new+view+based+on+whole-mount+labelling+and+lineage+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The spatial relationship between stem cells and their progeny in the basal layer of human epidermis: a new view based on whole-mount labelling and lineage analysis.</a> Development. 126 (11), 2409-2418 (1999).</li>
<li>Braun, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment%3A+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li>
<li>Driskell, R. R., Giangreco, A., Jensen, K. B., Mulder, K. W., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2-positive+dermal+papilla+cells+specify+hair+follicle+type+in+mammalian+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sox2-positive dermal papilla cells specify hair follicle type in mammalian epidermis.</a> Development. 136 (16), 2815-2823 (2009).</li>
<li>Niculescu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+ablation+of+integrin+alpha-6+in+mouse+epidermis+leads+to+skin+fragility+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Conditional ablation of integrin alpha-6 in mouse epidermis leads to skin fragility and inflammation.</a> Eur J Cell Biol. 90 (2-3), 270-277 (2011).</li>
<li>Fujiwara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basement+membrane+of+hair+follicle+stem+cells+is+a+muscle+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche.</a> Cell. 144 (4), 577-589 (2011).</li>
<li>Desciak, E. B., Maloney, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artifacts+in+frozen+section+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatol+Surg%22%5BJournal%5D)">Artifacts in frozen section preparation.</a> Dermatol Surg. 26 (5), 500-504 (2000).</li>
<li>Driskell, R., Jahoda, C. A., Chuong, C. M., Watt, F., Horsley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+dermal+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Defining dermal adipose tissue.</a> Exp Dermatol. 23 (9), 629-631 (2014).</li>
<li>Driskell, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+fibroblast+lineages+determine+dermal+architecture+in+skin+development+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair.</a> Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).</li>
<li>Snippert, H. J., Schepers, A. G., Delconte, G., Siersema, P. D., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slide+preparation+for+single-cell-resolution+imaging+of+fluorescent+proteins+in+their+three-dimensional+near-native+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Slide preparation for single-cell-resolution imaging of fluorescent proteins in their three-dimensional near-native environment.</a> Nat Protoc. 6 (8), 1221-1228 (2011).</li>
<li>Sada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+cellular+lineage+hierarchy+in+the+interfollicular+epidermis+of+adult+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Defining the cellular lineage hierarchy in the interfollicular epidermis of adult skin.</a> Nat Cell Biol. 18 (6), 619-631 (2016).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23722210">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li>
<li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replacement+of+Lost+Lgr5-Positive+Stem+Cells+through+Plasticity+of+Their+Enterocyte-Lineage+Daughters%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters.</a> Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).</li>
</ol>

저자는이 원고의 출판물이 Thermo-Fisher Scientific Inc.에 의해 지원되었음을 공개하고자합니다.

여기에서는 기존 냉동 섹션에 비해 몇 가지 장점이 있는 "수평 전체 마운트" 기술을 제시합니다. 우리 기술의 한 가지 장점은 표준 조직학 장비와 공초점 현미경으로 쉽게 수행할 수 있다는 것입니다. 둘째, 조직 무결성은 표준 냉동 절개와 비교할 때 우수한 방식으로 보존됩니다. 예를 들어, 피하층 내의 지방세포(즉, 진피 백색지방세포(DWAT))9는 표준 냉동절개에서 심각하게 파괴되어 지방이 풍부한 조직을 연구하는 것이 불가능합니다. 우리의 기술은 이 층의 지방세포에 대한 완전한 분석을 허용하며 지방세포 함량이 높은 다른 조직에 적용될 수 있습니다. 또한, 이를 통해 계통 추적 연구에서 중간엽 세포의 검출이 개선될 수 있습니다 2,10.
표준 냉동 절개는 본질적으로 공초점 현미경을 통해 조직의 실제 3D 측면을 결코 드러낼 수 없습니다. 이는 모낭과 그 하부 구조가 고전적인 냉동절편에 사용되는 표준 두께인 10μm를 초과하는 깊이를 횡단할 수 있기 때문에 두꺼운 절편이 피부 분석에 유리하다는 것을 의미합니다. 우리는 예를 들어 장과 뇌와 같은 다른 조직이 조직을 3D 구조로 보는 것과 관련하여 유사한 문제를 가지고 있다는 사실에 흥미를 느낍니다 2,7,11,12,13. 흥미롭게도 우리의 기술은 이미 장의 특정 응용 분야에 사용하기에 유익한 것으로 나타났습니다14. 우리는 수평 전체 마운트 프로토콜이 3D 분석이 필요한 다른 조직에 적용할 가능성이 있다고 믿습니다.

현미경 영상 장비의 혁명은 정교하고 고해상도 영상 장비를 제공합니다. 그러나, 완전한 3 차원 (3D) 조직 단면의 현미경 이미지를 획득 할 때, 표본 준비는 상당한 도전을 제시하며 이미지 품질을 정의하는 데있어 제한 요소가 될 수 있습니다. 각각의 개별 단계는 표적 단백질의 조직 형태 및 항원 성을 보존하고, 가공에 의해 유발 된 인공물을 최소화하고, 최종 이미지 품질을 최대화하기 위해 신중한 고려가 필요하다. 예를 들어, 전통적인 피부 분석에서는 표정과 진피를 볼 수있는 이미지가 필요합니다. 모공은 적절하게 배향되어 있으며, 줄기 세포 구획을 피부 항상성 1 , 2에 해부학 적으로 분석 할 수 있습니다. 이것은 피부가 어떻게 매립되고 절단되는지에 대한 철저한 집중이 필요합니다. 중요하게, 모낭은 더 두꺼울 수 있습니다100 μm 이상으로 표준 파라핀이나 동결 절편 두께를 크게 능가하므로 전체 장착 또는 두꺼운 단면 3 , 4 , 5에 비해 분석 표준이 낮아집니다. 종합하여, 현미경 분석을위한 표본 준비의 각 단계는 이미지 분석에 영향을주는 중요한 결정 요소입니다. 여기서 &quot;수평 전체 마운트 (horizontal whole mount)&quot;라고 부르는 두껍고 3D 인 조직 단면 분석을위한 새로운 처리 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 항원 성을 유지하고 표준 공 촛점 이미징 장비를 사용하여 피부의 두꺼운 부분을 최대한 활용할 수 있습니다. 조직 수확 및 파라 포름 알데히드 (PFA)를 기반으로 한 저온 보존 (단계 1), 저온 저장 장치로 100 μm 두께의 조직 단면 생성 (단계 1)을 포함한 두꺼운 조직 단면 처리 및 이미징을위한 스킨 사용에 대한 완벽한 안내서입니다. 2), 면역 형광성 라벨링 및 마운팅 (단계 3 및 4). 대표적인 결과는이 프로토콜의 잠재적 인 사용자를위한 &quot;수평 전체 마운트&quot;의 장점을 강조하는 두 가지 별개의 조직 학적 준비 기술 (고전적 절제 및 두꺼운 3D 조직 교차 절삭)의 공 촛점 이미지를 비교합니다.

<table><tbody><tr><td>냉수 생선 피부에서 추출한</td><td></td> PBS <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>수제</td></tr> 젤라틴 Sigma G7765 250ML <tr><td>글리세롤</td><td>BDH 실험실 용품</td><td>444482V</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. 화합물</td><td>VWR 화학 물질</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way 임베딩 금형</td><td>Sigma</td><td>E6032-1CS</td><td>Square S-22</td></tr><tr><td>무지방 분유</td><td>바이오 베이직 주식회사</td><td>NB0669</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>500ML</td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Human CD49f</td><td>BD Pharmingen 555735</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse/Rat Integrin alpha 8 항체</td><td>R& D Systems</td><td>AF4076</td><td></td></tr>, <tr><td>Alexa Fluor 488, 당나귀 안티-랫, IgG</td><td>Life Technologies</td>, <td>A21208</td><td></td></tr>, <tr><td>Alexa Fluor 555, 당나귀 안티-염소, IgG</td><td>Life Technologies</td>, <td>A21432</td><td></td></tr>, <tr><td>CryoStar NX70</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>100mm, 배양 접시</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>일회용 메스,</td><td>Swann-Morton</td><td>Ref, 0501</td><td></td></tr><tr><td>뾰족한 금속 집게</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>VWR</td><td>211-2130</td><td></td></tr><tr><td>12 웰 플레이트</td><td>시그마</td><td>CLS3513</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ul 및 1000 ul 피펫</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1000&micro; l XL 눈금이 매겨진 TipOne 여과기 끝 (메마른)</td> <td>Star Lab</td><td>S1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>20&micro; l 비스듬한 TipOne 필터 팁(멸균)</td><td>Star Lab</td><td>S1120-1810</td><td></td></tr><tr><td>흔들리는 셰이커 플레이트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드, menzel Glaeser</td><td>Thermos Scientific</td><td>631-9483</td><td>Superfrost Plus</td></tr><tr><td>커버 안경, Menzel Glaeser</td><td>Thermos Scientific</td><td>MENZBB024060AB</td><td>24 x 60mm</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

수평 한 전체적인 거치 : 피부의 두껍고, 3 차원 조직 단면도를위한 비발 한 가공 그리고 화상 진찰 의정서

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

과학적 논증을 뒷받침하는 현미경 이미지를 생성하기 위해 관심 조직을 처리하는 것은 어려울 수 있습니다. 고품질 현미경 이미지의 획득은 현미경의 품질뿐만 아니라 종종 여러 가지 중요한 동작이나 단계를 포함하는 조직 처리 방법에도 달려 있습니다. 또한, 피부 및 다른 조직에서의 중간 엽 세포 유형은 조직 준비 및 영상화를위한 새로운 도전 과제이다. 여기, 우리는 조직 수확에서 현미경으로 완전한 과정을 제시한다. &quot;수평 전체 마운트 (horizontal whole mount)&quot;라고 불리는 우리의 기술은 초보자들이 신속하게 능숙해질 수 있고 저온 유지 장치로 절단 된 60-300 μm 두께의 섹션에서 항원 보존과 검출을 가능하게합니다. 이 두께의 섹션은 3 차원 환경에서 조직 마이크로 아키텍처의 향상된 시각화를 제공합니다. 또한, 프로토콜은 중간 엽 세포를 보존 할 때 이미지 품질을 향상시키는 방식으로표준 저온 유지 장치 또는 파라핀 절편과 비교하여 면역 염색의 효능 및 안정성을 증가시킵니다. 우리는이 프로토콜이 피부 및 다른 조직 및 기관을 시각화하는 모든 실험실에 도움이 될 것으로 믿습니다.

우리 기술의 장점을 강조하기 위해 우리는 두꺼운 3D 조직 교차 절삭 기법 인 &quot;수평 전체 마운트&quot;를 기존의 고정 된 섹션과 비교했습니다. 고전 냉동 섹션은 이전에 설명한대로 잘라 5 . 현미경 이미지에서 표피에 대한 시각적 구조를 제공하기 위해, 우리는 integrin alpha-6 (Itga6)에 대해 면역 염색을하였으며, 이것은 표피 세포를 기저막 6에 고정시키는 성분이다. 우리는 또한 인테그린 알파 - 8 7 (또한 &quot;소름&quot;로 알려진) 경직을 담당하는 arrector의 필리 근육 (APM)를 표시. 고전적인 동결 절편에서 Itga6로 시각화 된 대부분의 모낭은 전체 길이에 따라 절개되지 않았으며, 수평 전체 마운트에 비해 섹션 당 우세하게 불완전한 모낭을 생성했습니다 ( 그림 4a -4d </strong&gt;). 두꺼운 조직 단면은 기존의 10-μm 섹션에 비해 더 많은 Z- 스택 레이어를 획득 할 수 있으므로보다 완벽한 3D 이미지를 구현할 수 있습니다. 이것은 모낭과 위에있는 기저막과 관련된 APM의 무결성을 연구 할 때 더욱 분명 해집니다. 고전적인 절제술에서, APM의 광대 한 부분은 분류되었다 ( 그림 4a - 4d ). 또한 cryosections가 잘 알려진 냉동 동결 해물 인 따뜻한 유리 슬라이드에 부착되었을 때 지방 세포의 파괴와 비교하여 피하 지방실의 조직 무결성이 수평 전체 마운트에서 보존됩니다 ( 그림 4a - b , 피하 지방 영역) 8 . <img alt="그림 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig4.jpg" /> 그림 4. 수평 전체클래식 cryosection에 비해 nt. (a) 고전적 수득 피부는 10 μm의 두께 (B)를 100 ㎛의 두께의 3 차원 조직 단면이 인테그린 알파 6 (Itga6)로 표지하고, 인테그린 알파 8 (Itga8) 시각화 표피 실과 arrector 필리 근육 저온부 로 나타났다. 두꺼운 조직 단면의 이미지는 큰 Z 스택의 최대 투영으로 표시됩니다. 흰색 프레임은 ( c ) 클래식 및 ( d ) 수평 전체 마운트 섹션에 표시되는 확대 된 영역을 나타냅니다. ( e ) 손상되지 않은 모낭과 ( f ) 손상되지 않은 근력 약근 근육은 고전 및 수평 전체 마운트 섹션에서 정량화되었다. 눈금 막대는 100 μm를 나타냅니다. 데이터는 평균 ± 표준 오차 (SEM)로 표시됩니다. 생물학적 복제 ( n = 3) 당 하나의 섹션을 정량화했습니다. 페어링되지 않은 t- 테스트 * P &lt;0.05, *** P &lt;0.0005. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 작품은 공 촛점 이미징 양식의 완전한 착취를 가능하게 두께, 3 차원 조직 단면 분석을위한 새로운 처리 및 이미징 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 항원 성을 보존하고 피부 조직 및 잠재적으로 다른 조직 유형을 분석하는 강력한 시스템을 나타냅니다.

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

이 조직학 및 이미징 프로토콜의 전반적인 목표는 피부의 항원성과 구조적 무결성을 보존하여 공초점 이미징 양식을 최대한 활용할 수 있는 견고한 시스템을 제시하는 것입니다. 이 방법은 복잡한 3차원 조직 구조 내에서 모든 유형의 세포 특성을 조사해야 하는 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 표준 조직학 기술과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 견고하고 수행하기 쉽다는 점입니다.또한, 이 프로토콜은 공초점 현미경의 3차원 분석을 완벽하게 보완합니다. 먼저 마우스의 등쪽 중앙 부위에서 채취한 피부를 직사각형 모양으로 다듬으십시오. 각 조각의 크기는 크라이오몰드(cryomold) 바닥에 맞게 조절해야 합니다.여기 22 mm x 30 mm x 20 mm 크기의 cryomold에 들어가는 1 cm² 면적의 등 쪽 피부 조직이 제시되어 있습니다. 고정 후, 세척된 피부를 OCT가 채워진 mold 바닥으로 밀어 넣어 바닥에 밀착되게 합니다. cryostat 절단 방향을 결정하므로, cryomold에 모낭의 방향을 표시하십시오.조직의 부유 및 위치 이탈을 방지하기 위해 cryo block을 -80°C 냉동고 내의 금속판 위에 옮깁니다. 보이지 않는 기포로 인해 피부가 cryomold 표면으로 떠오를 수 있으므로, cryomold 바닥에서 피부의 방향이 유지되도록 동결 과정을 모니터링하십시오. cryomold의 절단면을 따라 표시된 모낭 방향에 맞춰 동결된 cryoblock을 cryostat 스테이지에 고정하는 것으로 시작합니다.모낭의 전체 길이를 온전히 보존하는 피부 절편을 생성하는 절단면은 이 단계에서 결정되므로, 크라이오스탯(cryostat)에서 모낭의 정확한 방향을 적절히 조정하는 것이 매우 중요합니다. 크라이오스탯을 사용하여 100 micron 두께의 절편을 자릅니다. 핀셋으로 피부 조직이 매몰된 주변의 OCT를 잡고, 절편을 크라이오스탯에서 꺼내 PBS가 채워진 100 millimeter 배양 용기로 옮깁니다.실온에서 PBS는 OCT를 녹여 제거하며, 이렇게 하면 핀셋으로 다루기 쉬운 피부 절편이 남습니다. 절편 제작 후, 핀셋을 사용하여 떠 있는 피부 절편을 2.5 milliliters의 PBS가 담긴 12 well plate의 웰로 옮깁니다. 먼저 라벨이 붙은 1.5 milliliter microcentrifuge tube에 500 microliters의 PB buffer를 추가하여 면역형광 표지를 시작합니다.포셉을 사용하여 12-웰 플레이트에서 피부 절편을 블로킹용 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 모든 피부 절편이 완전히 잠겼는지 확인하십시오. 마이크로원심분리 튜브를 시소 로커(see saw rocker)에 올려놓고, 실온에서 분당 10회 이하의 진동으로 1시간 동안 반응시킵니다.각 피부 절편을 위해 1.5 milliliter 마이크로원심분리 튜브에 라벨을 부착하고, 적절한 양의 1차 항체가 포함된 PB 버퍼 500 microliters를 넣습니다. 1시간 동안 블로킹을 수행한 후, 피부 절편을 항체가 들어 있는 새로 준비한 튜브로 옮깁니다. 절편을 rocker 위에서 저속으로 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 절편들을 500 µL의 PBS가 들어 있는 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮기고 로커(rocker) 위에서 실온으로 1시간 동안 세척합니다. 그 후, 절편들을 적절한 농도의 2차 항체와 DAPI가 포함된 500 µL의 PB 버퍼가 들어 있는 별도의 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다. 로킹 상태로 실온에서 1시간 동안 배양하며, 필요한 경우 추가 처리를 위해 4 °C에서 최대 4일 동안 샘플을 보관할 수 있습니다.이미징 전, 2차 항체와 DAPI를 세척하기 위해 피부 절편을 500 µL의 PBS가 담긴 각각의 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음, 해부 현미경 하의 어두운 배경 위에 22 mm x 50 mm 커버 슬립을 놓습니다. 다음으로, 팁 끝을 잘라낸 1,000 µL 피펫을 사용하여 커버 슬립 위에 100% glycerol 한 방울을 떨어뜨립니다.마이크로원심분리기 튜브에서 피부 절편을 글리세롤 방울 위로 옮깁니다. 그런 다음, 해부 현미경으로 관찰하면서 끝이 뾰족한 핀셋을 사용하여 글리세롤에 띄워진 상태에서 말려 있는 피부 절편을 부드럽게 달래어 원래의 모양으로 조심스럽게 폅니다. 조직에 손상을 줄 수 있으므로 절편을 억지로 펴지 마십시오.절편의 전체 길이가 커버슬립 위에서 적절하게 정렬되고 펴졌는지 확인합니다. 조직을 일반 현미경 슬라이드에 마운팅하며, 이 단계에서 피부 절편이 더욱 곧게 펴지게 됩니다. 글리세롤로 마운팅된 피부 절편의 이미지는 향후 2일 이내에 촬영하십시오.이 이미지는 표피 구획과 입모근을 각각 시각화하기 위해 integrin alpha six 및 integrin alpha eight로 염색한 10 micron 두께의 전형적인 피부 동결 절편을 보여줍니다. 이 100 micron 두께의 3D 조직 횡단면 또한 동일한 방식으로 염색되었습니다. 표시된 이미지는 대형 z-stack의 최대 투영 영상입니다.두 이미지의 세부 사항을 여기에서 나란히 비교하였습니다. 일반적인 동결 절편의 경우, integrin alpha six로 시각화된 대부분의 모낭이 전체 길이를 따라 절단되지 않아, 수평 전체 마운트(whole mount)와 비교했을 때 절편당 불완전한 모낭이 주로 생성되었습니다. 일반 절편과 수평 전체 마운트 절편 모두에서 온전한 모낭과 온전한 입모근의 수를 정량화하였습니다. 생물학적 반복 실험을 위해 하나의 절편을 정량화하였으며, 여기에서 볼 수 있듯이 전체 마운트 절편에서 온전한 모낭과 입모근의 비율이 더 높게 나타났습니다.이 동결 절편 제작 기술을 숙달하면, 마운팅이 정확하게 수행되었을 때 샘플의 방향을 완벽하게 유지하면서 분당 15개 이상의 절편을 제작하는 속도로 작업을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 3차원 환경에서 두꺼운 조직 횡단면을 처리하고 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

horizontal-whole-mount-novel-processing-imaging-protocol-for-thick

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

고통스러운 신경 병증 (PN)의 통각 intraepidermal 신경 섬유 (IENFs)의 변화를 연구하기 위해, 우리는 직접 통각 IENFs에서 관찰 입체 형태 변화를 검사 할 수 프로토콜을 개발했다. IENFs의 3 차원 분석은 PN에 IENF의 형태 학적 변화를 평가하는 잠재력을 가지고있다.

인간의 피부 생검에서 통각 Intraepidermal 신경 섬유의 3 차원 영상

우리는 세포로 구성된 거시 구조 수준에서 기관의 변화에 대한 연구를 용이하게하는 3 차원 (3D) 조직학 볼륨 재구성을위한 이미지 등록 접근 방식을 제시합니다. 이 접근법을 사용하여 야생형과 Igfbp7-null 유선의 3차원 변화를 연구했습니다.

3 차원 조직학 볼륨 및 마우스 유방 땀샘을 연구에의 응용의 재구성

이러한 모낭과 신경 엔딩으로 - - 공간 조직의 독특한 패턴을 전시 포유류의 피부 구조의 다양한 배열을 포함합니다. 플랫 마운트로 피부를 분석하는 것은 피부 구조의 전체 두께의 고해상도 이미지를 생성하기 위해이 조직의 2 차원 적 형상을 이용한다.

마우스의 피부와 모낭 패터닝 및 감각 축삭 형태학의 분석에의 응용의 평면 마운트 이미징

이 보고서는 전체 두께가 마우스 피부 생검을 명확하게하고, 3 차원의 단세포 해상도 단백질 발현 패턴 증식 세포 및 sebocytes 시각화 입방 프로토콜을 설명한다. 이 방법은 피부 해부학과 병리학의 정확한 평가를 가능하게하고, 유전자 변형 마우스 라인에서 비정상적인 표피 표현형의.

CUBIC 프로토콜 전체 마운트 피부 준비 단일 셀 해상도에서 단백질 발현을 시각화합니다

이 원고에서는 광물화된 조직의 동결된 절편에 대한 여러 차례의 형광 이미징에서 여러 차례의 반응 측정의 정렬된 복합 이미지를 생성하기 위해 고처리량 반자동 극저온 조직학 플랫폼을 제시합니다.

높은 처리량, 광물 조직의 멀티 이미지 Cryohistology

이 프로토콜은 MRI와 전체 심장 심근 조직의 3 차원 비교를위한 새로운 방법을 설명합니다. 이는 심근 경색의 만성 돼지 모델의 경색 경계 영역에서 심근 내 주입의 정확한 평가를 위해 설계되었습니다.

3D 전체 심장 심근 조직 분석

여기, 분기 morphogenesis 면역 세포 분포 뿐만 아니라 주변 신경 및 혈관의 패턴을 시각화 수 있습니다 전체 성인 마우스 귀 피부에 높은 해상도 전체 마운트 이미징 방법을 설명 합니다.

성인 귀 피부에 대 한 전체 실장 Confocal 현미경 검사 법: 신경-혈관 분기 Morphogenesis 및 면역 세포 분포를 연구 하는 모델 시스템

현재 연구의 초점은 지방 조직 아키텍처와 세포 구성의 3D 영상에 대 한 이상적인 방법으로 전체-마운트 immunostaining 및 시각화 기법을 설명 하.

전체-마운트 얼룩을 사용 하 여 3D 백색 지방 조직 구조의 시각화

여기에서는 감염 중 병원성 박테리아를 장기 전체에서 검출하고 형광 리포터 활동을 정량화할 수 있는 절차에 대해 설명합니다.

고분해능 3차원 전장기 단층촬영(High-resolution three-dimensional whole-organ tomography of microbial infections)

IBEX(Iterative-bleaching-extends-multiplexity)와 상용 뉴클레오티드 표지 분석(Click-iT EdU)의 조합은 고정된 냉동 쥐 조직 절편에서 매우 역동적인 과정에서 분열하는 세포 유형을 검출하고 분류할 수 있습니다. 또한 새로운 오픈 소스 이미지 처리 파이프라인은 처리량이 많은 이미지 획득 및 분석을 제공합니다.

조직 샘플의 피부 세포 표현형 및 증식 상태를 평가하기 위한 고처리량 이미징 및 분석 워크플로우

이 논문에서는 복막 전이의 3차원 구조를 특성화하기 위해 최적화된 다중 면역형광 프로토콜에 대해 설명합니다.

Iterative Bleaching Extends Multiplexity 접근법을 사용한 종양 함유 조직의 3차원 이미징

배우세요 두꺼운 3차원 피부 조직 단면을 위한 비발한 가공 및 공초점 현미경 영상 프로토콜을. 이 방법은 항원성과 구조적 완전성을 보존하여 쥐 피부의 모낭과 근육을 완전하게 시각화하고 복잡한 조직 구조를 연구하는 데 도움을 줍니다.

수평 한 전체적인 거치 : 피부의 두껍고, 3 차원 조직 단면도를위한 비발 한 가공 그리고 화상 진찰 의정서

더 많은 동영상 탐색