August 2nd, 2017
이 작품은 공 촛점 이미징 양식의 완전한 착취를 가능하게 두께, 3 차원 조직 단면 분석을위한 새로운 처리 및 이미징 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 항원 성을 보존하고 피부 조직 및 잠재적으로 다른 조직 유형을 분석하는 강력한 시스템을 나타냅니다.
이 조직학 및 이미징 프로토콜의 전반적인 목표는 컨포칼 이미징 방식을 최대한 활용할 수 있도록 피부의 에피톨 항원성과 구조적 무결성을 보존하는 강력한 시스템을 제시하는 것입니다. 이 방법은 복잡한 3차원 조직 구조 내에서 모든 유형의 세포의 특성을 검사해야 하는 경우 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 표준 조직학 기법과 비교했을 때 이 기법의 주요 장점은 견고하고 수행하기 쉽다는 것입니다.
또한 이 프로토콜은 컨포칼 현미경 검사에서 3차원 분석을 완벽하게 보완합니다. 먼저 쥐의 등쪽 내측 영역에서 채취한 피부를 직사각형 조각으로 다듬습니다. 각 조각은 cryomold의 바닥에 맞을 수 있는 크기여야 합니다.
22mm x 30mm x 20mm cryomold에 맞는 1제곱센티미터 면적의 등쪽 피부가 여기에 설명되어 있습니다. 고정 후 세척된 피부를 OCT로 채워진 금형의 바닥으로 밀어 바닥과 같은 높이가 되도록 합니다. cryomold에서 모낭 방향을 표시하면 cryo stat cut의 방향이 결정됩니다.
극저온 블록을 영하 80도의 냉동고에 있는 금속판으로 옮겨 조직의 부유 및 탈구를 방지합니다. 보이지 않는 기포로 인해 피부가 cryomold의 표면으로 올라갈 수 있으므로 동결 과정을 모니터링하여 cryomold의 바닥에서 피부의 방향을 유지하십시오. 절편면을 따라 cryomold에 표시된 대로 모낭 방향의 cryostat 단계에 frozen cryoblock을 고정하는 것으로 시작합니다.
저온 유지 장치에서 정확한 모낭 방향을 적절하게 조정하는 것은 매우 중요한데, 이 단계는 모낭의 전체 길이가 손상되지 않은 피부 절편을 생성하는 단면을 결정하기 때문입니다. 저온 유지 장치를 사용하여 100미크론 단면을 자릅니다. 집게로 박힌 피부 조각 주위의 OCT를 잡고 저온 유지 장치에서 나온 부분을 PBS로 채워진 100mm 배양물로 옮깁니다.
실온에서 PBS는 OCT를 용해시켜 집게로 쉽게 다룰 수 있는 피부 조각을 남깁니다. 절편 후 집게를 사용하여 떠 있는 피부 절편을 2.5ml의 PBS가 포함된 12웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 먼저 라벨링된 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 500마이크로리터의 PB 버퍼를 추가하여 면역형광 라벨링을 시작합니다.
집게를 조심스럽게 사용하여 12웰 플레이트의 피부 조각을 차단을 위해 튜브로 옮깁니다. 모든 스킨 슬라이스가 완전히 잠겼는지 확인합니다. 마이크로 원심분리기 튜브를 실온에서 1시간 동안 분당 10회 이하의 진동으로 시쏘 로커에 놓습니다.
각 피부 절편에 대해 별도의 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 라벨을 붙이고 적절한 양의 1차 항체를 함유한 500마이크로리터의 PB 완충액을 추가합니다. 차단 1시간 후, 피부 조각을 항체가 들어 있는 새로 준비된 튜브로 옮깁니다. 섭씨 4도에서 로커에서 저속으로 밤새 조각을 배양합니다.
다음 날, 500마이크로리터의 PBS가 들어 있는 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 슬라이스를 옮기고 로커에서 실온에서 1시간 동안 세척합니다. 그런 다음 적절한 농도의 2차 항체와 DAPI가 함유된 500마이크로리터의 PB 완충액이 들어 있는 별도의 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 슬라이스를 옮깁니다. 실온에서 rocking과 함께 1시간 동안 배양하고, 원하는 경우 추가 처리 때까지 섭씨 4도에서 최대 4일 동안 샘플을 보관할 수 있습니다.
이미징하기 전에 피부 절편을 500마이크로리터 PBS가 포함된 별도의 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 2차 항체와 DAPI를 세척합니다. 그런 다음 22 밀리리터 x 50 밀리리터 커버 슬립을 해부 현미경 아래의 어두운 배경에 놓습니다. 다음으로, 팁 끝이 잘린 상태에서 1, 000 마이크로 리터 피펫을 사용하여 커버 슬립에 100 % 글리세롤 한 방울을 추가합니다.
미세 원심분리기 튜브의 피부 조각을 글리세롤 방울로 옮깁니다. 그런 다음 해부 현미경을 통해 보면서 뾰족한 집게를 사용하여 글리세롤에 떠 있는 동안 자연스러운 모양으로 다시 끌어당겨 말린 피부 조각을 조심스럽게 풀어냅니다. 조직에 손상을 줄 수 있으므로 슬라이스를 부자연스럽게 펴도록 강요하지 마십시오.
섹션의 전체 길이가 적절하게 방향이 지정되고 덮개 슬립에서 평평해지면 미끄러집니다. 일반 현미경 슬라이드에 조직을 장착하면 이 단계를 통해 피부 절편을 더욱 곧게 펴게 됩니다. 다음 이틀 이내에 글리세롤이 장착된 피부 부분을 이미지화합니다.
이 이미지는 표피 구획과 지시 필리 근육을 각각 시각화하기 위해 인테그린 알파 6 및 인테그린 알파 8로 표시된 10미크론 두께의 고전적으로 얻은 피부 동결 절편을 보여줍니다. 이 100미크론 두께의 3D 조직 단면은 동일한 방식으로 라벨링되었습니다. 표시된 이미지는 큰 z 스택의 최대 투영입니다.
두 이미지의 세부 사항은 여기에서 나란히 비교되며, 고전적인 동결 절편에서 integrin alpha six로 시각화된 대부분의 모낭은 전체 길이를 따라 절편화되지 않아 수평 전체 마운트와 비교하여 단면당 주로 불완전한 모낭을 생성합니다. 온전한 모낭과 온전한 arrector pili 근육은 고전적 및 수평 홈 마운트 섹션 모두에서 정량화되었습니다. 생물학적 복제에 대한 한 섹션은 여기에서 볼 수 있듯이 정량화되었으며, 전체 마운트 섹션은 온전한 여포와 arrector pili 근육의 비율이 더 높습니다.
일단 마스터하면 이 동결 절제 기술은 분당 15개 이상의 속도로 수행할 수 있으며, 장착이 올바르게 수행된 경우 완벽하게 방향의 샘플을 얻을 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 3차원 환경에서 두꺼운 조직 단면을 처리하고 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
이 연구는 완전한 공초점 이미징 모달리티의 활용을 가능하게 하는 두께가 두꺼운 3차원 조직 단면 분석을 위한 새로운 처리 및 이미징 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 항원성을 보존하고 피부 조직학 및 잠재적으로 다른 조직 유형을 분석하는 견고한 시스템을 대표합니다.
Robust three-dimensional tissue imaging is critical for accurate target validation and mechanistic de-risking in early-stage dermatological and tissue biology research. The horizontal whole mount protocol enables high-fidelity visualization of intact skin microarchitecture, supporting predictive confidence in phenotypic and cellular analyses. This capability strengthens translational continuity from discovery through preclinical model development in skin and potentially other tissue systems.
This protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, enabling high-content imaging and quantitative analysis of tissue architecture for target validation and phenotypic screening.