Name: 주소 지정이 가능한 물방울 Microarrays 단일 셀에서 단백질을 계산 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: 학습하세요 주소 지정이 가능한 물방울 마이크로어레이(ADMs)를 이용한 단일 세포 단백질 정량화 방법을. 이 기술은 암 세포주에서 p53 단백질 발현 이질성을 분석하여 단일 세포 수준의 단백질 역학 연구에 활용됩니다.

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ASR는 실험 설계, 프로토콜을 개발 하 고 데이터를 분석. SC와 PS 셀 크기 실험을 수행. ASR와 OC는 원고를 썼다. 저자는 기꺼이 인정 하는 교수 데이비드 R. Klug의 지원 장비에 대 한 액세스를 제공 하고자 합니다. 저자는 제국 대학 고급 Hackspace 제조 및 프로토타이핑 시설에 대 한 액세스를 감사 하 고 싶습니다.

<ol><li>Willison, K. R., Klug, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+single+cell+and+single+molecule+proteomics+for+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).</li>
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<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
<li>Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+molecules+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+%28TIRFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> Cold Spring Harb. Protoc. 5 (3), (2010).</li>
<li>Chen, D., Du, W., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+TIRF+microscopy+to+quantify+and+confirm+efficient+mass+transfer+at+the+substrate+surface+of+the+chemistrode%5BTitle%5D)+AND+%22New+J.+Phys%22%5BJournal%5D)">Using TIRF microscopy to quantify and confirm efficient mass transfer at the substrate surface of the chemistrode.</a> New J. Phys. 11 (31), 75017(2009).</li>
<li>Shi, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+proteomic+chip+for+profiling+intracellular+signaling+pathways+in+single+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (2), 419-424 (2012).</li>
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<li>Lee, Y. Y., Narayanan, K., Gao, S. J., Ying, J. Y. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/profile/Karthikeyan_Narayanan2/publication/257690809_Elucidating_drug_resistance_properties_in_scarce_cancer_stem_cells_using_droplet_microarray/links/554ac2700cf29752ee7c3360.pdf">Elucidating drug resistance properties in scarce cancer stem cells using droplet microarray.</a> Nano Today. 7 (1), 29-34 (2012).</li>
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<li>Salehi-Reyhani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+advantages+and+constraints+in+miniaturized+capture+assays+for+single+cell+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Scaling advantages and constraints in miniaturized capture assays for single cell protein analysis.</a> Lab Chip. 13 (11), 2066-2074 (2013).</li>
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<li>Womack, M. D., Kendall, D. A., MacDonald, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent+effects+on+enzyme+activity+and+solubilization+of+lipid+bilayer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+-+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes.</a> BBA - Biomembr. 733 (2), 210-215 (1983).</li>
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<li>Burgin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+of+protein+copy+number+using+a+single-molecule-sensitive+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification of protein copy number using a single-molecule-sensitive microarray.</a> Analyst. 139 (13), 3235(2014).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

주소 지정이 가능한 물방울 Microarrays는 양적 단일 세포 내 단백질의 절대 복사본 수를 결정 하는 과민 하 고 확장 가능한 방법.
일반적인 바인딩 수준을 제한 (NSB)이 낮은 가능한 탐지의 한계를 달성 하는 프로토콜 내에서 중요 합니다. 단백질 및 다른 생 화 확 적인 종 방울 내의 인터페이스의 수에 비 특히 묶는 수 있습니다-coverslip 표면, 항 체 자리와 기름/물 인터페이스. 단백질은 인터페이스 또는 자체 기름으로 분할 하 여 손실 될 수 있습니다. 우리는 4 %BSA 수성 방울에는 NSB는 프로토콜에 지정 된 항 체를 사용 하 여 단백질의 제한 수 나타났습니다. 양자 택일 단백질 목표 및 그들을 검출 하는 데 사용 하는 항 체는 다른 차단 방법, 그러한 비 이온 세제 또는 호환 계면 필요할 수 있습니다. 불 오일 또한 상한 기름으로 봉사에서 그들의 적합성에 대 한 테스트할 수 있습니다. 이러한 경우, 임계 micelle 농도 및 상한 오일의 밀도 같은 추가...

이 방법의 목표는 단일 셀 해상도 세포 인구에서 대상 단백질의 풍부에 있는 변화를 결정 하는. 단일 세포 분석은 전통적인 앙상블 생 화 확 적인 방법으로 사용할 수 없는 혜택을 제공 합니다. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 첫째, 단일 셀 수준 작업 전통 앙상블 생 화 확 적인 기술로 발생 하 셀 인구는 평균에 의해 그렇지 않으면 손실 될 것 이라고 그의 풍부한이 캡처할 수 있습니다. 대부분 작업 말 생 화 확 적인 방법의 사용 대량, 요구, 그들은 종종 할 때, 결과 생산 하는 세포의 수백만. 물론, 전체 세포 인구를 평가의 결과에 따라 다릅니다 여러 가지 요인, 예를 들어 단백질 식 단백질 풍부의 분포의 몇 가지 중요 한 기능을 놓칠 수 있습니다에서. 실용적인 관점에서 단일 셀 기술의 필요한 감도 있도록 생물 소재도 기능에 더 민감한 대량 기술에 대 한 충분 하지 않은 양의 작업 가능. 이것의 핵심 예제 희귀 한 종류의 세포 등 순환 종양 세포 (CTCs) 어디 그릴 10 CTCs 단일 7.5 mL 혈액에 존재 수도 보다도 가난한 전조 outlook 환자에 대 한 연구 이다. 6 여기 우리 항 체 microarray에 인쇄 된 항 체 기반 분석 결과 기름 덮인 방울 고용 감소 볼륨을 사용 하 여 단일 셀 단백질 측정을 수행 하는 데 필요한 방법론을 제시.
미세 물방울 플랫폼은 높은 처리량, 다양 한 생 화 확 적인 분석 실험을 수행 하기 위해 개별 방울에서 두 번째, 및 격리, 그리고 심지어 경작, 단일 셀 수 있는 방울의 수천을 생성할 수 있습니다. 드롭릿 기반 기술을 단일 세포 분석, 크게의 힘에 의해 주 었는 DropSeq10 와 inDrop11를 포함 하 여 주목할 만한 최근의 예제와 함께7,,89 증폭 기술입니다. 제한 된 양의 재료와 단백질에 대 한 증폭의 아무 방법 단일 셀 proteomics 특히 어려운 게.
방울 다양 한 방법으로 분석할 수 있습니다 그리고 형광 현미경 검사 법은 널리 사용 되 고 있다. 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 같은 단일 분자 기술을 형광 분자를를 탁월한 신호 대 잡음 비율을 시각화할 수 있습니다. 12 사라져 필드의 지 수 감퇴 때문만 fluorophores 높은 표면 (100nm의 순서 대로)에 흥분 TIRF에 만드는 복잡 한 혼합물에서 대상 분자의 소량을 검출에 좋은 전략. TIRF의 고유의 광학 단면 강도 또한 세척 단계를 방지 하는 데 도움이 하 고 시험 시간 및 복잡성의 한계. 그러나, TIRF 평면 서피스를 요구 하 고 TIRF 현미경 흐름에 작은 방울에 적용의 예 포함 이미지를 평면 표면 형성. 13 이 단일 셀 proteomic 기술을 종종 디자인 표면 움직일 캡처 에이전트 microarray 형태로 주위 미세 칩. 4 , 14
방울, 평면 표면, 소위 드롭릿 microarrays에 배열에서 형성 될지도 모른다. 15 , 16 , 17 편리 하 게 인덱스, 쉽게 시간이 지남에 모니터링, 개별적으로 다루어야 하 고, 필요한 경우 검색 하면 공간적 배열에 방울을 조직. 드롭릿 microarrays는 독립형 또는 microwell 구조에 의해 지원 되는 칩 당 요소 수천 마이크로 반응 기의 높은 밀도 얻을 수 있습니다. 18 , 19 , 20 그들은 형성 될지도 모른다 액체 처리 로봇, 잉크젯 관측 병, 순차적 증 착에 의해 microarrayers21,22,23,,2425, 문의 26 또는 그들은 superhydrophillic와 같은 표면에 자기 조립 수 명소 superhydrophobic 표면에 무늬. 27 , 28 , 29
염두에 두고 이러한 고려 하 여 지정 드롭릿 Microarrays (Adm) 양적 다양성, 공간적 접근성 및 드롭릿 microarrays의 감소 볼륨을 단일 분자 TIRF 현미경의 감도와 결합 하도록 설계 되었습니다. 단백질 풍부를 측정 합니다. 5 Adm 다음 증발을 방지 하기 위해 기름으로 출장 하는 항 체 microarray에 단일 셀을 포함 하는 작은 물방울 microarray를 형성 하는 단일 세포 분석 가능 작은 물방울의 볼륨은 온 칩 valving 연속 흐름 마이크로에 의해 그렇지 않으면 달성 될 것 이다 샘플 손실을 방지 하기 위해 개별. 30 단일 셀에서 대상 단백질의 절대 크기가 매우 작습니다. 그러나, 작은 물방울의 감소 볼륨 수 있습니다 상대적으로 높은 지역 농도 샌드위치 항 체 분석 결과 사용 하 여 검색-뚜렷한 지역에서 또는 표면에 묶는 단백질을 캡처에 자리 항 체 움직일 수 에 붙일 이라는 탐지 항 체 방울 볼륨에 존재. 레이블 없는 접근 방식으로 (즉 단백질 대상 직접 표시 될 필요가 없습니다), Adm 처리 혈액 등의 기본 소스에서 세포 분석에 일반적으로 적용 되는, 잘 문화에서 셀 뿐만 아니라 aspirates와 해리 종양 생 검 필요 하 고 그들의 lysates입니다.
약물에 응답, 예를 들어에 결정에 중요 하다 단백질 풍부에서 셀 인구 변화 측정 및 세포 기능 및 통로, 평가 부분 모집단에 대 한 통찰력을 제공 하는 데 도움이 됩니다 및 그들의 행동 뿐만 아니라, 그렇지 않으면 대량 방법으로 마스크는 드문 이벤트를 식별. 이 프로토콜 생산 주소 드롭릿 microarrays를 사용 하 여 양적 인간 암 세포에서 전사 인자 p53의 풍부를 결정 하는 방법을 설명 하 고 p53 화학요법 약물에 대 한 응답에서의 역할을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다. 대상 단백질 캡처 및 탐지 항 체의 선택에 의해 결정 되 고 더 또는 다른 목표를 포함 하도록 수정할 수 있습니다. 기름으로 뒤덮인 10 nL 방울 수동으로 배열 하 일반 실험실 소모품에서 동심 노즐 통합 간단한 장치를 구축 안내 됩니다. 전체 실험 과정은 각 방울 lysed 다음 단일 셀와 단일 분자 해상도 TIRF 현미경을 사용 하 여 결정 하는 단백질의 표현 로드 그것에 의하여 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td><강>세포 배양</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10010015</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 고포도당</td><td>시그마</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>바이오크롬</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 플라스크</td><td>코닝</td><td>SIAL0639</td><td></td></tr><tr><td>트립신/EDTA</td><td>Biochrom</td><td>L2153</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Microarray</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcontact Arrayer</td><td>DigiLab, 영국</td><td>OmniGrid Micro</td><td></td></tr><tr><td>Microcontact pin</td><td>ArrayIt, 미국</td><td>946MP2</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips (Nexterion)</td><td>Schott, 유럽</td><td>1098523</td><td>크기(mm): 65.0 x 25.0; 두께 (mm) 0.17</td></tr><tr><td>p53 캡처 항체</td><td>Enzo</td><td>ADI-960-070</td><td></td></tr><tr><td>p53 검출 항체, Alexa Fluor 488 표지</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td>재고 농도 200&mu; g/mL</td></tr><tr><td>식염수-구연산나트륨 완충액</td><td>Gibco</td><td>15557-044</td><td></td></tr><tr><td>베타인</td><td>시그마</td><td>61962</td><td></td></tr><tr><td>도데실황산나트륨</td><td>시그마</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>384 웰 플레이트(저용량)</td><td>시그마</td><td>CLS4511</td><td></td></tr><tr><td>질소 가스 실린더</td><td>BOC</td><td>산업용 등급, 무</td><td></td>산소</tr><tr><td><강>이름</강함></td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</strong</td></tr><tr><td>>Droplets</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Eppendorf</td><td>Patchman NP2</td><td></td></tr><tr><td>수동 마이크로인젝터</td><td>Eppendorf</td><td>CellTram Vario</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Origio, 덴마크</td><td>MBB-FP-L-0</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>KD Scientific</td><td>KDS-210</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; L 주사기</td><td>Hamilton</td><td>81020</td><td>가스 밀폐, PTFE Luer lock</td></tr><tr><td>1 mL 주사기</td><td>Hamilton</td><td>81327</td><td>가스 밀폐, PTFE Luer lock</td></tr><tr><td>실리콘 아이솔레이터</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR24R-A-0.5</td><td>6x4 웰 실리콘 아이솔레이터 (접착제 포함</td></tr>) <tr><td>레이저 커터</td><td>VersaLASE</td><td>VLS2.30 CO2 Laser 3W</td><td>맞춤형 아이솔레이터</td></tr><tr><td>레이저 절단 용 1mm 두께의 아크릴 시트</td><td></td><td>맞춤형 절연체의 레이저 절단을 위한</td>Weatherall-UK <td>Clarex Precision Sheet 001</td></tr><tr><td>접착 시트</td><td>3M</td><td></td>은 <td>마이크로어레이 커버슬립에 맞춤형 절연체를 부착하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>슈퍼 글루</td><td>록타이트</td><td>LOCPFG3T</td><td></td></tr><tr><td>150 &mu; m ID/360 &뮤; m OD 용융 실리카 튜브</td><td>IDEX</td><td>FS-115</td><td></td></tr><tr><td>1.0 mm ID/1/16" OD PFA 튜빙</td><td>IDEX</td><td>1503</td><td></td></tr><tr><td>0.014" 아이디/0.062" OD PTFE 튜빙</td><td>Kinesis</td><td>008T16-100</td><td></td></tr><tr><td>1.0mm ID/2.0mm OD FEP 튜빙</td><td>IDEX</td><td>1673</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP9700100</td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>시그마</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>초순수</td><td>Millipore, 독일</td><td>MilliQ</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td> 회사</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Microscopy & </td> 인코딩된 XY 스테이지가 있는 광학<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TIRF 현미경</td><td>일본 Nikon, 일본</td><td>Nikon Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD</td><td>Andor Technologies, 아일랜드</td><td>IXON DU-897E</td><td></td></tr><tr><td>레이저 여기 소스</td><td>Vortran, 미국</td><td>Stradus 488-50</td><td></td></tr><tr><td>광학 용해 레이저 소스</td><td>Continuum, 미국</td><td>Surelite SLI-10</td><td></td></tr><tr><td>현미경 TIRF</td><td>Chroma, 미국</td>용 필터 큐브 광학 용해 레이저 2000, 영국 <td>z488bp</td><td></td></tr><tr><td>현미경 필터 큐브</td><td></td><td>LPD01-532R-25</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>피지</td><td>오픈 소스</td><td></td><td>이미지 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>버전 7.14 이상</td><td>이미지 분석 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

주소 지정이 가능한 물방울 microarrays 단일 셀에서 단백질을 계산

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

종종 세포 행동 및 세포질 응답 마스킹 복잡 한 인구 내의 풍부한 단일 셀 동작 결과 평균으로 많은 세포의 반응을 함께 풀링된는 인구 수준에서 분석 된다. 단일 셀 단백질 검출 및 정량화 기술 최근 몇 년 동안에 주목할 만한 영향을 만들었습니다. 여기는 주소 드롭릿 microarrays는 실용적이 고 유연한 단일 세포 분석 플랫폼에 설명 합니다. 이 연구는 단일 셀 해상도 대상 단백질의 절대 복사 번호 수 있습니다 측정 하는 방법을 설명 합니다. 종양 억제기 p53 아닌 건강 한 p53 식 패턴을 전시 총 경우의 50% 이상으로 인간의 암에 가장 일반적으로 돌연변이 유전자입니다. 프로토콜을 식에 변화를 정확 하 게 결정을 단일 분자 해상도 10 nL 방울은 단일 인간의 암 세포는 격리 하 고 p53 단백질의 복사본 수를 측정 만드는 단계를 설명 합니다. 에 모든 셀 형식을 기본 자료를 포함 하 여 관심사의 어떤 대상 단백질의 절대 복사본 수를 결정 하는 메서드를 적용할 수 있습니다.

P53의 절대 기저 단백질 복사본 수 인간 결 장 암 세포 선, 될 셀에에서 단일 셀 해상도로 결정 되었다. 어떻게 p53 식 여러 자릿수로 동안 다를 수 있으며 휴식 될 세포 인구 내에서 셀 크기와 단백질 복사 번호 약하게 긍정적인 상관관계를 보여 보여 줍니다.
주소 지정이 가능한 물방울 Microarrays 수성 방울 항 체 자리 위치에서 적절 하 게 석유와 때 형성 된다. 여기, 방울 민감한 p53 단백질 분석 결과 지원합니다. Coverslips 캡처 항 체 점이 연락처 microarrayer 핀을 사용 하 여 배열 됩니다. 안티-p53 캡처 항 체 상용 ELISA 테스트 키트에서 가져온 것입니다. 인쇄 조건 캡처 명소 했다 자리 당 6.2 ± 0.5 x 105 단백질의 최대 캡처 용량을 가진 직경에 있는 약 100 µ m 되도록 했다....

여기 선물이 주소 드롭릿 microarrays (Adm), 작은 물방울 배열 기반 메서드 단일 셀에 절대 단백질 풍부를 확인할 수 있습니다. Adm의 기능 인간 암 세포 선에서 종양 억제기 단백질 p53의 표현에이 특성을 설명 합니다.

주소 지정이 가능한 물방울 Microarrays 단일 셀에서 단백질을 계산

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

본 실험의 전체적인 목표는 단일 세포 해상도로 표적 단백질의 절대 단백질 복제 수를 결정하는 것입니다. 단일 세포 기술을 통해 센트럴 도그마와 관련된 단백질의 거동을 더 잘 이해할 수 있으며, 조절되는 유전자 발현의 정확한 정량을 도울 수 있습니다. 단일 세포 수준에서 작업하면 전통적인 생화학적 기술에서 발생하는 평균화 과정으로 인해 손실될 수 있는 세포 집단의 풍부한 이질성을 포착할 수 있습니다.일반적으로, 단일 세포 분석의 민감도나 각 세포 내 단정 단백질 양의 제한으로 인해 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 어려움을 겪을 수 있습니다. 저희는 이후의 추가 분석을 위해 샘플링이 용이한 단일 세포 단백질 분석을 수행하고자 하는 필요성에서 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 칩을 제작하고 항체 마이크로어레이를 프린팅하는 것으로 이 절차를 시작하십시오.장치를 준비하려면, 내경 150 $\mu\text{m}$, 외경 360 $\mu\text{m}$인 융합 실리카 튜빙(fused silica tubing) 100 mm 길이를 내경 1 mm, 외경 1/16인치인 PFA 튜빙 40 mm 길이에 2 mm가 돌출될 때까지 삽입합니다. 이렇게 하면 동심 노즐이 형성됩니다. 10 $\mu\text{L}$ 피펫 팁 끝에 시아노아크릴레이트(cyanoacrylate) 접착제를 얇게 바른 후, 이를 40 mm 길이의 PFA 튜빙 안에 삽입합니다.필요한 경우, 접착제가 굳기 전에 노즐 끝으로 2 mm가 돌출되도록 융합 실리카 튜브의 위치를 조정하십시오. 융합 실리카 모세관의 반대쪽 끝을 내경 0.014인치, 외경 0.062인치의 200 mm 길이 PTFE 튜브 끝에 삽입하십시오. 이를 인산완충식염수에 4% 소혈청알부민을 섞어 채운 100 µL Hamilton 시린지와 연결하십시오.다음으로 내경 1mm, 외경 2mm, 길이 400mm의 FEP 튜빙을 200µL 피펫 팁에 밀봉될 때까지 삽입합니다. 다른 200µL 피펫 팁에 시아노아크릴레이트 접착제를 얇게 바른 후, 이를 첫 번째 팁 속으로 밀어 넣어 튜빙을 고정합니다. 그런 다음 FEP 튜빙의 열린 끝부분을 미네랄 오일이 채워진 1mL Hamilton 시린지에 연결합니다.200 µL 피펫 팁 어셈블리를 동심 노즐의 10 µL 피펫 팁에 삽입하십시오. 다음으로, 100 µL 시린지에 4% PBSA 블로킹 용액을 채우십시오. 수성 튜브를 다시 연결하고 블로킹 용액으로 플러싱하십시오.총 세 번의 세척이 되도록 이 과정을 두 번 더 반복합니다. 그런 다음 100-µL 주사기에 4% PBSA에 희석된 0.125-µg/L 검출 항체 용액을 채우고 튜브를 다시 연결합니다. 검출 항체 용액 25-µL를 분주하여 튜브 내의 블로킹 용액을 교체합니다.모든 튜브와 노즐이 오일로 채워질 때까지 미네랄 오일로 오일 튜브를 세척하십시오. 그런 다음 1-milliliter 시린지에 미네랄 오일을 다시 채우고 튜브를 다시 연결하십시오. 마지막으로, 튜브와 노즐 어셈블리를 XYZ 조작기에 고정하십시오.주소 지정 가능 드롭렛을 형성하려면 칩을 현미경 스테이지에 고정하십시오. 자동 현미경 제어 소프트웨어를 사용하여 어레이 내 각 스폿의 현미경 스테이지 좌표를 기록합니다. 다음으로, 현미경 스테이지에 XYZ 조작기를 설정하십시오.각 주사기를 독립적으로 작동시켜야 하므로 서로 다른 주사기 펌프에 장착하십시오. 노즐을 50~60도 각도로 배치하십시오. 그런 다음 수성액 주사기 펌프는 100 µL/min의 속도로 10 nL를 분사하도록 설정하고, 오일 주사기 펌프는 100 µL/min의 속도로 5 µL를 분산하도록 설정하십시오.노즐 끝에 액체 방울이 보일 때까지 수성 용액을 분주합니다. 먼지가 없는 와이프로 방울을 가볍게 닦아 제거합니다. 자동 현미경 제어 소프트웨어를 사용하여 현미경 스테이지 좌표를 어레이의 항체 스팟으로 설정하고 커버슬립 표면에 초점을 맞춥니다.노즐을 정렬할 때 항체 스팟이 흐트러지지 않도록 주의하십시오. 특히 세심한 주의를 기울여 현미경을 통해 유리 모세관 팁이 접근하는 모습을 관찰해야 합니다. 스팟을 건드리지 않도록 주의하면서 XYZ 조작기를 사용하여 동심 노즐의 유리 모세관 팁을 항체 스팟의 측면에 정렬하십시오.정렬이 완료되면, 10 nanoliters의 수용액을 분사합니다. 스테이지를 움직이지 않은 상태에서, 수용액을 덮을 수 있도록 5 µL의 오일을 분사합니다. 노즐을 천천히 들어 올려 액적에서 떼어낸 후 다음 웰로 이동합니다.어레이의 모든 항체 스팟에 대해 이 단계를 반복합니다. 30분 후, 자동 현미경 제어 소프트웨어를 사용하여 어레이의 모든 스팟을 이미지화함으로써 세포를 로딩하기 전 각 항체 스팟에 결합된 단일 분자의 배경을 결정합니다. 주소 지정 가능 드롭렛에 세포를 로딩하기 위해, 10% FDS가 포함된 L-15 배지 내의 0.125 µg/mL 검출 항체 용액에 세포를 부유시켰습니다.단일 세포 현탁액을 확보하기 위해 세포 용액을 40-micron-pitch 세포 스트레이너로 필터링합니다. 마이크로매니퓰레이터와 마이크로모세관을 사용하여 세포 저장소에서 주소 지정 가능 액적(addressable droplets)으로 단일 세포를 로드합니다. 10x 대물렌즈로 관찰하며 마이크로인젝터를 사용하여 세포 저장소에서 단일 세포를 마이크로모세관으로 흡입합니다.조이스틱을 사용하여 수동으로 조작하여, 전자 매니퓰레이터 스테이지의 배출 기능을 통해 자동으로 분주합니다. 마이크로피펫을 위로 이동시켜 칩의 1-millimeter 높이에서 벗어나도록 제거합니다. 자동 현미경 제어 소프트웨어를 사용하여 스테이지 좌표를 지정된 액적의 좌표로 설정합니다.마이크로피펫을 저장된 Z 위치로 되돌려 주입합니다. 조이스틱을 사용하여 수동으로 수행하거나, 전자 매니퓰레이터 스테이지를 사용하는 경우 자동으로 수행합니다. 레이저 유도 용해로 인한 기계적 공정은 액적 가장자리에 에멀션을 형성할 수 있으며, 더 높은 펄스 에너지는 액적을 완전히 파괴할 수 있습니다.적절한 용해 펄스 에너지를 최소한으로 유지하고, 세포가 액적의 가장자리에 직접 배치되지 않도록 하십시오. 마이크로인젝터를 사용하여 어드레서블 액적에 세포를 분주하십시오. 명시야 현미경을 사용하여 액적 내 세포를 이미지화하며, 필요한 경우 형광 이미징을 함께 수행하십시오.또한 단분자 TIRF 현미경을 사용하여 어레이의 모든 스폿을 이미지화하십시오. 어드레서블 드롭렛 내의 세포에 초점을 맞춥니다. 세포 위치 근처에 6-nanosecond 레이저 펄스를 단일 회 조사하여 완전한 광학적 용해를 유도하십시오.각 세포가 용해된 시간을 기록하십시오. 처음 30분 동안은 10분마다, 이후 60분 동안은 20분마다 모든 스팟에 대해 TIRF 현미경을 사용하여 단일 분자 이미지를 획득하십시오. 평형 상태에서 결합된 단백질의 양에만 관심이 있는 경우, 칩을 실온에서 90분 동안 배양한 후 모든 스팟의 이미지를 촬영하십시오.혼잡하지 않은 항체 스팟에 대해 단일 분자 계수를 수행하려면, 용해 전에 획득한 배경 이미지를 불러오십시오. Fiji에서 배경 이미지를 선택합니다. 이미지 메뉴에서 'Duplicate'를 선택하여 배경을 복제합니다.그다음 복제된 이미지를 선택하고 프로세스 필터(process filters) 탭에서 가우시안 흐림(Gaussian blur)을 선택한 후 반경을 50-pixel로 지정합니다. 프로세스(process) 메뉴로 이동하여 이미지 계산기(image calculator)를 선택합니다. 여기서 연산 방식은 나누기(divide)로 지정하고 필요한 이미지를 선택한 다음, 새 창 만들기(create new window)와 32-bit 결과(32-bit result) 확인란을 선택합니다.이미지의 각 픽셀에서 1을 뺍니다. 그런 다음 배경 플랫 이미지의 네 모서리 중 어느 한 곳에서 50픽셀 x 50픽셀 영역을 선택합니다. 'analyze and measure'를 선택하여 픽셀 강도의 표준 편차를 측정합니다.이미지 조정(image adjust)에서 임계값(threshold)을 선택하고 하한 임계값 레벨을 3 표준편차로 설정하십시오. 분절된 이미지 SM 마스크에서 크기가 4~9 제곱 픽셀이 아니거나 원형도(circularity)가 0.5~1 범위가 아닌 모든 객체의 픽셀 강도 값을 0으로 설정하십시오. 이를 위해 분석(analyze)을 선택한 후 입자 분석(analyze particles)을 선택하고 크기와 원형도를 지정하십시오.동일한 항체 스팟에 대해, 용해 후 획득한 시계열 이미지 프레임 전체에 대해 데이터 분석 단계를 로드하고 반복하십시오. 단일 분자 이미지의 대표적인 결과에서, 배경 이미지의 신호는 형광 표지된 검출 항체가 표면 및 항체 스팟에 비특이적으로 결합하는 수준이 낮음을 보여줍니다. 확대된 삽입 이미지는 빨간색 화살표로 표시된 단일 분자들을 보여줍니다.BE 인간 결장암 세포에서 p53의 풀다운(pulldown)을 나타내는 전형적인 이미지 또한 제시되어 있습니다. 이 일련의 이미지들은 항체 지점(spot)에 p53 단백질이 축적되는 것을 보여줍니다. 기지의 농도를 가진 재조합 단백질을 사용하여 얻은 검량선을 이용해 각 지점의 단분자 수치를 분석 부피 내 표적 단백질 수로 변환하며, 이는 단일 세포 복제수(copy number)를 암시합니다.수평 빨간 점선은 비특이적 결합 수준을 나타냅니다. BE 암세포의 기저 p53 단백질 발현은 일부 세포의 p53 단백질 발현이 최빈값보다 현저히 높은 롱테일 감마 유사 분포를 보입니다. 여기에서 p53 단백질 발현은 용해 전 측정된 세포 직경으로부터 계산된 세포 부피의 함수로 도식화되었습니다.결과는 이들 세포에서 p53 단백질의 최소 농도가 유지됨을 나타냅니다. 이 영상을 시청한 후에는 단일 세포 해상도로 표적 단백질의 풍부도를 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 생물학적 세포를 다룰 때는 단백질이 분해될 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 4시간 이내에 완료할 수 있으며, 환자의 일차 시료를 분석하는 프로토콜에 통합하여 사용할 수 있습니다. 단일 세포 기술은 세포의 기능과 행동에 대한 통찰력을 제공할 뿐만 아니라, 두 방법 모두에서 놓칠 수 있는 희귀한 이벤트를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 p53 및 유방암 세포주의 생물학적 특성에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 라벨링 없이 다른 질병 연구에도 적용할 수 있어 환자 시료 유래 일차 세포 연구에 유용합니다.이 절차를 마친 후, 표적 RNA와 단백질 발현의 상관관계 확인과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 양자점 PCR과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 단백질의 절대 복제 수를 측정하는 것은 생물수학자 및 계산 과학자들이 생물학적 모델을 뒷받침하는 데 있어 매우 유용할 것입니다.

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주소 지정이 가능한 물방울 Microarrays 단일 셀에서 단백질을 계산

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