마우스 폐 전 절제술 및 보철물 삽입을 통한 내시경 표면 측정을위한 표준화 된 방법

이 절차의 전반적인 목표는 폐 절제술 및 보철물 이식 후 마우스 폐의 내부 표면적을 정확하게 측정하는 것입니다. 이 방법은 기계적 힘으로 유도된 성체 폐 재생 과정에서 폐의 형태학적 및 생리학적 기능을 분석하는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 주요 장점은 내부 폐 표면적을 정확하게 정량화하여 폐 기능 상태의 신뢰성과 재현성을 높일 수 있다는 점입니다.

기관 삽관 플랫폼 위에서 마우스의 복측이 노출되도록 하여 수술 준비를 합니다. 그런 다음 혀를 당겨내고 카테터 안내가 가능한 소동물용 후두경을 사용하여 성대를 검사합니다. 이어서 20 gauge 정맥 내 삽관 캐뉼라를 내각을 이루도록 하여 기관 내로 부드럽게 삽입합니다.

다음으로, 마우스를 우측 가측 와위로 눕힌 후 캐뉼라를 기계식 인공호흡기에 연결합니다. 흉부를 관찰하여 캐뉼라가 기관 내에 제대로 삽입되었는지 확인합니다. 흡기압은 12 cmH₂O로, 호흡수는 분당 120회로 설정합니다.

이제 베타딘(Betadine)과 70% ethanol을 교대로 최소 3회 세척하여 노출된 피부를 소독합니다. 그런 다음 제5 늑간 공간에 2~3cm 크기의 후외측 흉강 절개술을 실시하여 수술을 시작합니다. Noyes 스프링 가위를 사용하여 근육층을 절개합니다.

다음으로, 왼쪽 폐를 노출시키기 위해 1.5 centimeter 절개를 실시합니다. 수술 과정 전반에 걸쳐 필요에 따라 고온 소작기를 사용하여 지혈합니다. 그런 다음, 뭉툭한 팁의 핀셋으로 왼쪽 폐엽의 1/3을 흉강에서 들어 올리고, 면봉을 사용하여 왼쪽 폐 전체를 끌어냅니다.

이제 왼쪽 폐엽의 폐동맥과 기관지를 확인하고, 젖은 외과용 봉합사로 폐문 부위의 기관지와 혈관을 단단히 결찰합니다. 다음으로 결찰 부위에서 3~4mm 떨어진 지점에서 왼쪽 폐엽을 절제하되, 기흉을 유발할 수 있으므로 봉합사가 잘리지 않도록 주의하십시오. 마지막으로 봉합사 한 줄로 흉벽을 봉합합니다.

그 후, 3~4 mm 간격으로 5~6개의 단속 봉합을 사용하여 근육층과 피부층을 순차적으로 봉합합니다. 이때 수술용 봉합 바늘이 심장에 닿지 않도록 주의하십시오. 심천자는 치명적입니다.

마지막으로, 포비돈-요오드로 수술 부위를 소독합니다. 그런 다음, 마우스를 38 degrees Celsius 온열 패드 위에 놓습니다. 자가 호흡이 돌아올 때까지 인공호흡기를 계속 사용하십시오.

앞서 설명한 작업을 수행하되, 폐를 제거한 직후에 보형물을 삽입할 준비를 합니다. 뭉툭한 핀셋을 사용하여 타원형 실리콘 보형물의 중앙을 잡습니다. 그다음, 핀셋으로 갈비뼈를 잡아 흉강을 노출시킨 상태에서 보형물을 매우 조심스럽게 삽입합니다.

보형물의 전면부와 흉강 표면 사이의 45도 각도로 진입하십시오. 둔탁한 핀셋을 사용하여 보형물이 왼쪽 빈 흉강 내에 완전히 위치했는지 확인하십시오. 이제 흉부를 폐쇄하고 앞서 설명한 대로 마우스의 상태를 모니터링하십시오.

본 절차를 위해 10 mL 혈청 피펫에서 분리한 플런저, 니들 어댑터가 달린 40 cm 길이의 유연한 튜브, 유량 조절 밸브 및 18 gauge 바늘로 구성된 맞춤형 팽창 튜브를 조립하십시오. 조립이 완료되면 피펫을 테이프로 사이드보드에 고정합니다. 피펫 상단과 벤치 사이의 거리는 최소 30 cm가 되어야 합니다.

마취제를 주입하여 마우스를 안락사시킨 후, 멸균된 보드에 고정하고 흉부를 조심스럽게 열어 흉골을 절제하고 폐엽을 노출시킵니다. 그 다음, 기관을 노출시킵니다. 이어서, 팽창 튜브를 새로 제조한 4% PFA로 채우고 튜브 내의 모든 기포를 제거합니다.

그 다음, 기관에 바늘을 삽입합니다. 누출을 방지하기 위해 혈관 클립으로 기관을 집어 고정합니다. 이제 25 centimeters of water의 일정한 경폐압으로 고정액을 주입하여 폐를 팽창시킵니다.

완전한 팽창을 위해 폐를 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 팽창 후, 고정액의 부피 변위량을 기록합니다. 이제 기관을 결찰하고 주변 결합 조직으로부터 폐를 손상 없이 조심스럽게 분리합니다.

가위로 조심스럽게 절단하십시오. 다음으로, 4% PFA가 채워진 50 mL 원추형 튜브에 폐를 넣고 쉐이커에서 부드럽게 흔들어주며 4 °C에서 12시간 동안 고정하십시오. 그 후 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 처리 및 염색 과정을 진행하십시오.

MLI를 정량화하려면 20배 배율의 명시야(bright-field)에서 수집한 절편 내 조영제 이미지를 사용하십시오. 서로 다른 세 개의 폐 절편에서 각각 약 1제곱밀리미터 크기의 겹치지 않는 시야를 무작위로 총 15개 선택한 후 이를 분석하십시오. 동맥, 정맥, 주요 기도 또는 폐포관이 없는 영역만 사용하십시오.

분석을 위해, 자 도구를 사용하여 선택된 각 영역 위에 10 by 10 그리드를 그립니다. 그러면 그리드 선 사이의 간격은 약 100 microns가 됩니다. 그 다음, 인접한 두 폐포 상피 사이의 길이를 선을 따라 가로지르는 절편으로 찾습니다.

예를 들어, 양방향 화살표는 길이를 나타냅니다. 각 격자선을 따라 이러한 모든 길이를 측정하며, MLI는 이 절편 길이들의 평균값입니다. 기술된 프로토콜을 사용하여, PNX 처리된 마우스와 보철물이 이식된 마우스를 비교하였습니다.

8주령의 CD-1 수컷 생쥐를 사용하였으며, 왼쪽 폐엽을 절제하였습니다. 보철물은 왼쪽 폐엽의 크기와 모양을 모방하여 제작되었으며, 왼쪽 폐엽을 제거한 후 흉강 내에 삽입되었습니다. 수술 14일 후, 맞춤 제작된 팽창 튜브를 사용하여 남아 있는 오른쪽 폐의 내부 부피를 측정하였습니다.

PNX 처리를 받은 생쥐 5마리의 우폐 평균 부피는 약 1.4 milliliters였으며, 이는 보형물을 이식한 생쥐 5마리의 1.05 milliliters보다 유의하게 컸습니다. 나머지 우폐의 MLI 값 또한 유의하게 더 컸습니다. 이러한 파라미터를 사용하여 폐 내부 표면적을 계산한 결과, 보형물을 이식한 생쥐에서 유의하게 더 작은 것으로 나타났습니다.

이 영상을 시청하고 나면, 기계적 힘으로 유도된 폐포 재생 마우스 모델의 내부 폐 표면적을 계산하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.