2017년 7월 26일
내부 폐 표면적 (ISA)은 폐 질환 및 부상 유발 폐포 재생에서 폐 형태 및 생리학을 평가하는 데 중요한 기준입니다. 폐 절제술 및 인공 삽입물 마우스 모델에서 ISA의 측정 편향을 최소화 할 수있는 표준화 된 방법을 설명합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 폐절제술 및 보철물 이식 후 마우스 폐의 내부 표면적을 정확하게 측정하는 것입니다. 이 방법은 기계적 힘에 의한 성인 폐 재생에서 폐의 형태학적 및 생리학적 기능을 분석하는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 주요 장점은 내부 폐 표면적을 정확하게 정량화하여 폐 기능 상태의 신뢰성과 재현성을 높일 수 있다는 것입니다.
복부 쪽에 접근할 수 있는 삽관 플랫폼에서 수술을 위해 마우스를 준비합니다. 그런 다음 혀를 뽑고 유도 카테터와 호환되는 작은 동물 후두경으로 성대를 검사합니다. 그런 다음 20게이지 정맥 삽관 캐뉼라를 내부 각도로 기관에 부드럽게 삽입합니다.
다음으로, 마우스를 오른쪽 측면 누운 위치에 놓고 캐뉼라를 기계식 인공호흡기에 연결합니다. 흉부를 관찰하여 캐뉼라가 기관에 삽입되었는지 판단합니다. 흡기 압력을 수심 12cm로 설정하고 호흡수를 분당 120회 호흡으로 설정합니다.
이제 베타딘과 70% 에탄올을 교대로 3회 이상 번갈아 가며 노출된 피부를 청소하십시오. 그런 다음 5번째 늑간 공간을 2-3cm 후방으로 절개하는 것으로 수술을 시작합니다. Noyes 스프링 가위를 사용하여 근육 조직을 관통하십시오.
다음으로 1.5cm 절개를 하여 왼쪽 폐가 드러납니다. 수술 내내 필요에 따라 고온 소작기를 사용하여 출혈을 멈춥니다. 그런 다음 뭉툭한 집게로 가슴에서 왼쪽 폐엽의 1/3을 들어 올리고 면봉을 사용하여 왼쪽 폐 전체를 빼냅니다.
이제 왼쪽 폐엽의 폐동맥과 기관지를 확인하고 물에 적신 수술 봉합사로 문턱의 기관지와 혈관을 단단히 결찰합니다. 다음으로, 결찰부에서 3-4mm 떨어진 왼쪽 폐엽을 잘라내고, 기흉을 유발할 수 있는 봉합사가 절단되지 않도록 주의합니다. 다음으로 하나의 봉합사로 흉벽을 닫습니다.
그런 다음 3-4mm 간격으로 5-6개의 단속 봉합사를 사용하여 근육층과 피부층을 순차적으로 꿰매십시오. 수술용 봉합사 바늘이 심장에서 멀리 떨어지지 않도록 하십시오. 심장 천자는 치명적입니다.
마지막으로 포비돈 요오드로 수술 부위를 소독한다. 그런 다음 섭씨 38도의 열 패드에 마우스를 놓습니다. 자발 호흡이 돌아올 때까지 인공호흡기를 계속 사용하십시오.
앞서 설명한 수술을 수행하되 폐를 제거한 직후 보철물을 삽입할 준비를 합니다. 무딘 집게를 사용하여 타원형 실리콘 보철물의 중심을 잡습니다. 다음으로, 집게로 갈비뼈를 잡고 흉강을 드러내면서 보철물을 매우 부드럽게 삽입합니다.
보철물의 정면 평면과 흉부 표면 사이에 45도 각도로 진입합니다. 뭉툭한 집게를 사용하여 보철물이 왼쪽의 빈 흉강 내에 완전히 있는지 확인합니다. 이제 상자를 닫고 앞에서 설명한 대로 마우스를 모니터링하십시오.
이 절차를 위해 10ml 혈청학 피펫에서 제거한 플런저, 바늘 어댑터가 있는 40cm 길이의 유연한 튜브, 유량 제어 밸브 및 18게이지 바늘로 구성된 맞춤형 팽창 튜브를 조립합니다. 조립이 완료되면 테이프를 사용하여 피펫을 사이드보드에 고정합니다. 피펫 상단과 벤치 사이의 거리는 30cm 이상이어야 합니다.
마취 주사로 마우스를 안락사시킨 후 멸균 보드에 고정하고 조심스럽게 가슴을 열어 흉골을 도려내고 폐엽을 노출시킵니다. 그런 다음 기관을 노출시킵니다. 다음으로, 팽창 튜브에 갓 만든 4% PFA를 채우고 튜브에서 모든 거품을 제거합니다.
그런 다음 바늘을 기관에 삽입합니다. 누출을 방지하려면 혈관 클립으로 기관을 클립하십시오. 이제 25cm의 물의 일정한 경폐압에서 고정액으로 폐를 팽창시킵니다.
완전한 팽창을 위해 실온에서 2시간 동안 폐를 배양합니다. 인플레이션 후, 고정액의 부피 변위에 주목하십시오. 이제 기관을 결찰하고 주변의 결합 조직으로부터 온전한 폐를 부드럽게 해부합니다.
가위를 사용하고 매우 부드럽습니다. 다음으로, 4% PFA로 채워진 50ml 원뿔형 튜브에 4%PFA를 채운 50ml 원뿔형 튜브에 셰이커를 가볍게 흔들면서 12시간 동안 폐를 배양합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 처리 및 염색을 진행합니다.
MLI를 정량화하려면 명시야에서 20배 배율로 수집된 섹션에 사용된 제제의 이미지를 사용합니다. 3개의 서로 다른 폐 절편에서 각각 약 1제곱밀리미터의 겹치지 않는 총 15개의 보기를 무작위로 선택한 다음 환기시킵니다. 동맥과 정맥, 주요 기도 또는 폐포관이 없는 영역만 사용하십시오.
분석을 위해 눈금자 도구를 사용하여 선택한 각 영역에 10 x 10 그리드를 그립니다. 따라서 그리드 선은 약 100미크론 떨어져 있습니다. 그런 다음, 인접한 두 개의 폐포 상피 사이의 길이로 선을 따라 절편을 찾습니다.
예를 들어, 양방향 화살표는 길이를 나타냅니다. 각 그리드 라인을 따라 이러한 모든 길이를 세고 MLI는 절편 길이의 평균 값입니다. 설명된 프로토콜을 사용하여 PNX 처리된 마우스를 보철 이식 마우스와 비교했습니다.
사용된 쥐는 8주 된 CD-1 수컷이었고 왼쪽 폐엽을 절제했습니다. 보철물은 왼쪽 폐엽의 크기와 모양을 모방하며 왼쪽 폐엽을 제거한 후 가슴에 삽입되었습니다. 수술 14일 후, 남아 있는 오른쪽 폐의 내부 용적을 측정하기 위해 맞춤형 팽창관을 사용했습니다.
PNX를 투여한 5마리의 쥐에서 우측 폐의 평균 부피는 약 1.4 밀리리터였는데, 이는 보철물을 이식한 5마리의 마우스에서 1.05 밀리리터로 훨씬 더 컸다. 나머지 우측 폐의 MLI 값도 유의하게 컸다. 이러한 매개변수를 사용하여 내부 폐 표면적을 계산한 결과 보철물을 이식한 마우스에서 훨씬 더 작은 것으로 나타났습니다.
이 비디오를 시청한 후에는 기계적 힘에 의한 폐포 재생 마우스 모델의 내부 폐 표면적을 계산하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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이 기사는 폐절제술 및 임플란트 삽입 후 마우스 모델에서 내부 폐 표면적(ISA)을 측정하는 표준화된 방법을 제시합니다. ISA의 정확한 정량화는 특히 폐 질환 및 재생의 맥락에서 폐 형태 및 생리를 이해하는 데 필수적입니다.
Accurate quantification of internal lung surface area (ISA) is critical for assessing respiratory function in pulmonary disease models and regeneration studies. This standardized method reduces observer bias in morphometric measurements, improving reliability and reproducibility in preclinical lung research. Enhanced measurement confidence supports mechanistic de-risking and predictive value in target validation for respiratory therapeutics.
The method integrates into discovery biology workflows by providing quantitative morphometric data that informs lead identification and preclinical advancement decisions in respiratory research.