Name: Zebrafish Spermatogonia 전체 Testes 바늘의 cryopreservation 몰입 울트라-빠른 냉각 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: 배우세요 제브라피시 고환 전체를 바늘 침지 유리화법으로 초저온 동결 보존하는 방법을. 5개 계통에서 재현성을 확인하고 정자 소멸로 생식세포 분리를 간소화하여 생식생물학 연구에 활용합니다.

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이 연구는 국가 연구, 개발 및 혁신 사무실의 헝가리 (그랜트는 ÁH를 116912), 비용 사무실에 의해 지원 되었다 (음식과 농업 비용 액션 FA1205: AQUAGAMETE), Stipendium Hungaricum 장학금 프로그램 (ZM 부여)와 새 헝가리 국가 우수 Predoctoral 친교 (EK 부여).

여기에 설명 된 모든 메서드는 헝가리 동물 복지 법률에 의해 승인 되었습니다.
1. 시 약 준비
<ol><li>재고 솔루션<ol>
<li>그것은 완전히 해소 될 때까지 잘 dH2오 믹스의 1 mL에 트 레 할 로스가 수화물의 0.378 g를 추가 하 여 1 M 트 레 할 로스를 준비 합니다.</li>
		<li>그것은 완전히 해소 될 때까지 잘 dH2오 믹스의 1 mL에 자당의 0.342 g를 추가 하 여 1 M 자당을 준비 합니다.</li>
		<li>그것은 완전히 해소 될 때까지 잘 HEPES의 0.238 g dH2오 믹스의 1 mL에 추가 하 여 1 M HEPES를 준비 합니다.</li>
		<li>PBS의 5 mL을 100 mg을 추가 하 여 20 mg/mL 콜라 (290 U/mg)를 준비 합니다. 그것은 디졸브 때까지 철저 하 게 혼합. 0.2 µ m 필터를 통해 살 균 필터입니다. 0.2 mL PCR에 aliquot 50 µ L 튜브와-20 ° c.에 동결</li>
		<li>15 mg/mL의 트립 신 준비 (~ 10000 U/mg) 5 ml PBS의 75 밀리 그램을 추가 하 여. 그것은 디졸브 때까지 철저 하 게 혼합. 0.2 µ m 필터를 통해 살 균 필터입니다. 0.2 mL PCR에 aliquot 50 µ L 튜브와-20 ° c.에 동결</li>
		<li>1 mg/mL DNase 준비 나 (~ 3000 U/mg) PBS의 5 mL에 5 mg을 추가 하 여. 그것은 디졸브 때까지 철저 하 게 혼합. 0.2 µ m 필터를 통해 살 균 필터입니다. 0.2 mL PCR에 aliquot 50 µ L 튜브와-20 ° c.에 동결</li>
		<li>PBS의 10 mL을 trypan 파랑의 40 mg을 추가 하 여 0.4 %trypan 블루를 준비 합니다. 0.2 µ m 필터를 통해 살 균 필터입니다. 1.5 mL 튜브에 aliquot 1 mL입니다.</li>
		<li>200 mg/L MS 준비-222 (Tricaine 메탄 된) 그것은 완전히 해소 될 때까지 잘 dH2오 믹스의 1 L에 MS-222의 200 밀리 그램을 추가 하 여. 또한, MS-222 솔루션 7.0의 중립 pH에 탄산을 버퍼링 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vitrification 위한 솔루션<ol>
<li>재래식 솔루션 (ES) 준비: 메탄올 (MeOH; 1.5 M)의 121.5 µ L를 혼합 하 여 ES의 2 개 mL를 준비 프로필 렌 글리콜 (PG; 1.5 M)의 220 µ L FBS (10%), 트 레 할 로스 재고 솔루션 (0.1 m M), HEPES 재고 솔루션 (25mm) 50 µ L 2로 L-15의 1208.5 µ L의 200 µ L의 200 µ L mL 튜브입니다.</li>
		<li>Vitrification 솔루션 (VS)를 준비: PG (M 3), 디 메 틸 sulfoxide의 426 µ L의 439 µ L를 혼합 하 여 대의 2 개 mL를 준비 (나2그래서; 3 M), 200 µ L FBS (10%), 트 레 할 로스 재고 솔루션 (0.1 m M), HEPES의 50 µ L의 200 µ L의 재고 솔루션 (25 밀리미터) 및에 L-15의 685 µ L를 2 mL 튜브입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>온난화에 대 한 솔루션<ol>
<li>지구 온난화 솔루션 1 (WS1) 준비: FBS (10%), 자당 재고 솔루션 (3 M)의 450 µ L의 150 µ L를 혼합 하 여 2 mL 튜브에 WS1의 1.5 mL를 준비 및 L-15의 900 µ L.</li>
		<li>지구 온난화 솔루션 2 (WS2) 준비: FBS (10%), 자당 재고 솔루션 (1 M)의 150 µ L의 150 µ L를 혼합 하 여 2 mL 튜브에서 1.5 mL WS2의 준비 및 L-15의 1200 µ L.</li>
		<li>지구 온난화 솔루션 3 (WS3) 준비: WS2 2 mL 튜브에서 1.5 mL 혼합 150 µ L FBS (10%)에 의해 준비 및 L-15의 1350 µ L.</li>
	</ol>
</li>
	<li>소화 솔루션 준비: 각 샘플 콜라 재고 솔루션 (2 mg/mL)의 50 µ L, trypsin 재고 솔루션 (1.5 mg/mL)의 50 µ L를 혼합 하 여 소화 솔루션의 500 µ L를 준비, 대 한 DNase의 10 µ L I (20 µ g/mL) 및 2 ml에서 L-15의 390 µ L 튜브.</li>
	<li>해 부 도구 얻기:가 위, microscissors, 핀셋, 곡선된 핀셋, 그리고 침술 바늘.</li>
</ol>2. 고환 컬렉션
<ol><li>200 mg/L와 MS를 포함 하는 접시에 그것을 배치 하 여 물고기를 안락사-222 (pH = 7). 해 부와 함께 계속 하기 전에 아가미 이동 중지 하 고 저 산소 증에 의해 죽음을 보장 하기 위해 그 순간부터 그 이상 10 분 통과 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>종이 타월에 아 티 하 여 물고기를 말리 고 해 매트에 등 쪽의 측면에 배치.<ol>
<li>첫째로 쉽게 해 부에 대 한 골반과 가슴 지 느 러 미를 잘라.</li>
		<li>수평으로 가슴 지 느 러 미 사이의 물고기의 뱃속에는 피부를 싹 둑 하 고 항문 지 느 러 미까지 피부와 뱃속을 따라 기본 근육을 잘라.</li>
		<li>물고기의 몸에 구멍을 열고 바늘으로 해 부 매트에 왼쪽 및 오른쪽 몸 벽을 고정 합니다. 참고: Testes 수영 방광 (그림 1)의 양쪽에 위장 기관 위에 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>오염을 방지 하기 위해, 할 하지 꺼내 위장 기관, 하지만 부드럽게 한쪽에 밀어와 반대 측에서는 고환 제거. Testes 체 벽에 연결 된 그래서 신중 하 게 그들을 제거 하 고 microscissors에 의해 연결 복을 잘라.</li>
	<li>또한, 오염 방지 하기 위하여 첫째로 소독 testes 2 s, 그리고 다음 장소에 대 한 70% 에탄올에 넣어 얼음에 96 잘 접시에 L-15에 그들. 참고: 필요한 경우 지방 조직에서 크고 깨끗 한 testes 혈액 혈관을 정확 하 게는 stereomicroscope에서</li>
</ol>3. 고환 조직 울트라-빠른 냉각
<ol><li>마크 바늘 샘플에 따라 적절 한 레이블 입력 하 고 평형 (ES)와 vitrification 솔루션 (VS) 준비.</li>
	<li>살 균 침술 바늘에 잘 더 큰 접시 또는 접시와 핀 2 ~ 3 testes (이상의 바늘의 크기에 따라) testes를 전송.<ol>
<li>첫째 곡선된 핀셋 위에 고환 위치. 고환 가운데 바늘의 포인트를 놓고 조심 스럽게는 핀셋으로는 고환 위쪽으로 당겨.</li>
		<li>고환, puncturing 후 부드럽게 당겨 위쪽으로 바늘의 위쪽. Testes 서로에서 분리 되어 그리고 그들은 하지 떨어지고는 또는 아래로 슬라이딩 다는 것을 확인 하십시오.</li>
		<li>장소 2 mL 튜브에 고정 된 고환과 바늘 가득 L-15 vitrification까지 (25 ˚C;에서 저장 시간 초과 하지 않아야 합니다 1 시간). 주: 바늘에 고환을 고정 빨리 밖으로 건조에서 testes을 방지 하기 위해 수행 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>재래식 솔루션으로 고환과 바늘을 전송 하 고 25˚C에서 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>Vitrification 솔루션으로 바늘을 전송 하 고 30 품 어 25˚C에서 s.</li>
	<li>Vitrification 솔루션에서 바늘을 제거, 신속 하 고 부드럽게 살 균 종이 타월에 의해 조직에서 나머지 솔루션을 흡수. 주의 사용 하 여 종이 타월에 집착 하거나 떨어지 testes를 피하기 위해.</li>
	<li>신속 하 게 스티로폼 상자에 배치 하는 액체 질소에 바늘을 놓습니다. 참고: 조직의 액체 질소 증기에 노출에 신속 하 게이 단계를 수행 액체 질소의 낮은 볼륨을 사용 하 여 샘플의 교차 오염을 방지 하기 위해.</li>
	<li>5-10 분에 대 한 닫힌된 스티로폼 상자에 액체 질소에 바늘을 두십시오.</li>
	<li>쿨 열된 4.5 mL cryotube와 같은 상자에서 그것의 모자.</li>
	<li>5-10 분 후 액체 질소의 표면 아래에 별도 cryotube에 각 바늘을 전송 하 고는 cryotube를 닫습니다. 주의: 항상 때 보호복 (절연된 장갑) 등을 사용 노출 심한 동상으로 이어질 수 있습니다 액체 질소와 협력.</li>
	<li>Cryotube 금속 지팡이에 놓고 최대한 빨리 cryobank 용기에 배치. 샘플 용기 저장에서 저장 dewar 추가 사용까지.</li>
</ol>4. 지구 온난화 절차
<ol><li>별도로 각 바늘을 따뜻한. 25 ° c.에 모든 지구 온난화 솔루션 이어야 한다</li>
	<li>금속 지팡이에서 cryotube를 분리 하 고 스티로폼 상자에 저장 된 액체 질소로 급락.</li>
	<li>액체 질소 증기 (집게를 사용 하 여)에 cryotube을 열고 액체 질소에 바늘을 해제 합니다.</li>
	<li>첫 번째 지구 온난화 솔루션으로 매우 빠르게 바늘을 전송 하 고 (25 ° C)에서 1 분 동안 품 어. 신속 하 게 전송 하는 동안 공기에 그것의 온난화 방지 하기 위해 바늘을 전송 해야 합니다.</li>
	<li>두 번째 지구 온난화 솔루션으로 바늘을 전송 하 고 (25 ° C)에서 3 분 동안 품 어.</li>
	<li>3 지구 온난화 솔루션으로 바늘을 전송 하 고 (25 ° C)에서 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>곡선된 핀셋으로 그들을 아래쪽으로 밀어 바늘에서 testes를 놓습니다. 별도 우물 (96 잘 접시)에 개별적으로 각 따뜻하게 고환 L-15 10% 보충의 250 µ L로 가득 장소 FBS. 우물 샘플에 따르면 개는 다는 것을 확인 하십시오. 모든 샘플은 따뜻하게 될 때까지 얼음에 잘 접시까지 추가 작업을 계속.</li>
</ol>5. 조직 소화
<ol><li>각 샘플에 별도 2 mL 튜브 분리 솔루션의 500 µ L를 준비 합니다. 이 샘플의 코드에 따라 튜브 라벨. 실 온에서 5 분 동안 준비 된 분리 솔루션을 품 어.</li>
	<li>따뜻하게 조직 소화 솔루션에 추가 하 고 작은 위 적어도 30 움직임에 의해 그것을 작은 조각으로 잘라.</li>
	<li>25 ˚C에서 90 분 떨고 접시에 잘라 조직 품 어.</li>
	<li>FBS의 L-15 및 100 µ L의 400 µ L을 추가 하 여 소화 프로세스를 중지 (10% FBS v/v). 짧게 솔루션을 동요 하 고 실 온에서 1 분 동안 품 어.</li>
	<li>1.5 mL 튜브에 50 µ m 필터를 통해 얻은 솔루션을 필터링 합니다. 튜브를 따라 레이블을 지정 합니다.</li>
	<li>25 ˚C에서 10 분 동안 200 × g에서 필터링된 솔루션 원심</li>
	<li>조심 스럽게 제거는 상쾌한 고 L15 10% 보충의 20 µ L에서 펠 릿 resuspend FBS. 펠 릿은 완전히 용 해 될 때까지 수동으로 튜브를 흔들. 추가 사용까지 얼음에 또는 4 ˚C에서 셀 정지를 유지.</li>
</ol>6. 생존 능력 평가 셀 계산
<ol><li>세포 현 탁 액 및 레이블이 표시 된 0.2 mL PCR 튜브에 0.4 %trypan 블루 솔루션의 5 µ L의 혼합 5 µ L. 다른 볼륨을 사용 하는 경우 1:1 남아의 희석 비율.</li>
	<li>실 온 (25 ° C)에서 1 ~ 3 분이 서 스 펜이 션을 품 어.</li>
	<li>현미경 hemocytometer에 각 샘플의 생존 능력을 확인 합니다.</li>
	<li>라이브 셀 (trypan 블루 흠 없는) 15 필드 수를 계산 합니다. 세포 현 탁 액의 20 µ m에 있는 셀의 총 수를 계산 합니다. 현 탁 액은 지금 모든 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 준비. 참고: 큰 신체 크기와 다른 종족에 대 한 절차를 최적화 하는 때 동등한 무게의 고환 조각을 사용 합니다. 모든 실험적인 그룹에 대 한 한 개인에서 testes를 사용 하 여 결과에 개별 가변성을 피하기 위하여. Zebrafish, 경우 우리 이용 했다는 사실에 왼쪽 및 오른쪽 고환 생식 세포13 의 동일한 (또는 매우 유사한) 번호를 포함 해야 합니다 (대표 결과 참조). 왼쪽된 고환은 오른쪽 고환 vitrified/예 열 동안 제어로 유지 되었다. 생존 비율 계산 했다 신선한 고환에서 격리 하는 셀의 수에 비해 vitrified 따뜻하게 고환에서 격리 하는 셀의 수.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 연구의 주요 목적은 바늘에 맞게 몰입 울트라-빠른 냉각 절차 조류 및 포유류 종10,11,12 물고기 고환 (zebrafish 모델의 cryopreservation를 개발 했다 유기 체)입니다. Zebrafish 유전 자원의 cryopreservation에 관한 이전 연구의 대부분 zebrafish 정자2,,34의 cryopreservation에 주로 집중 되었다. 그러나, 성숙한 oocytes에서 배아의 cryopreservation 프로토콜 개발 하지 않은, 아직 일부 최근 연구 초기 단계 oocytes의 그 cryopreservation 입증 하더라도 그럴듯한<sup class="xref"...

생명 공학 및 과학 소설 동향은 쥐, 초파리, zebrafish의 모형 유기 체 생물 의학에 및 다른 과학1로 사용 하는 다른 종의 새로운 돌연변이 라인의 수천의 창조에 이르렀다. 또한, 새로운 기술을 개발 하 고 사용할 수 있게 되는, 돌연변이 라인의 숫자는 꾸준히2증가. 식민지를 번 식 유지의 일반적인 관행을 넘어 유전 자원의 안전한 저장에 대 한 필요성을이 끈다. 시간이 무기한 기간에 대 한 유전 자원의 안전한 저장을 수 있는 방법으로 cryopreservation 장점이 많은 생식 시즌의 확장 circumvents broodstock, 지속적인 유지 관리를 위해 필요 하 고 그것은 더 많은 비용-와 같은 고 효율적인 노동2.
정자 cryopreservation는 지난 몇 년 동안2,3,4 중 개발에 대 한 프로토콜 zebrafish 남성 유전 물질의 성공적인 저장소에 대 한 기회를 제공 합니다. 그러나, 계란이 나 생선에는 태아의 cryopreservation 불가능 아직 그들의 복잡 한 구조와 노 른 자 물자의 다량. 최근, 원시 생식 세포 (PGCs) 또는 spermatogonial 줄기 세포 (SSCs) 이식의 연습 이식5후 정자와 난 기능으로 개발 하 여이 방 벽을 우회를 제공 합니다. 따라서, SSCs의 cryopreservation 희귀 하 고 귀중 한 유전자 자원의 보존에 새로운 프론티어를 제공합니다.
Cryopreservation 많은 장점을 제공, 비록 느린 속도 동결 과정 세포 손상2로 이어질 수 있는 몇 가지 조건을 생성 합니다. 이러한 세포와 extracellular 얼음 대형, 탈수, cryoprotectant 독성 등이 포함 됩니다. 세포내 얼음 손상 세포, extracellular 얼음 셀의 기계적 분쇄 동안 느린 속도 동결 세포에서 물 보급 탈수6으로 이어질 수 있습니다 하는 동안 발생할 수 있습니다. 최근, 얼음 대형의 부정적인 효과 방지 하는 기술로 vitrification 물고기 gametes7,,89의 cryopreservation에 적용 되었습니다. 통해 내부 및 외부 미디어 얼음7,10에 crystalizing 없이 비정 질/유리 상태로 설정 하는 매우 빠른 냉각 기법을 제공 합니다. 고환 및 난소 조직의 성공적인 vitrification 조류 및 포유류 종10,,1112, 따라서 물고기, 뿐만에서 자사의 응용 프로그램에 대 한 가능성을 열어 입증 되었습니다.
이 연구에서 우리 전체 zebrafish testes의 cryopreservation 바늘 몰입 vitrification (NIV) 절차를 제시. 오염 및 다른 세포, 특히 정 충의 낮은 존재와 상대적으로 높은 양의 초기 생식 세포 생성 cryopreservation 과정 없이 zebrafish 초기 세균 세포 절연에 대 한 신뢰할 수 있는 방법을 설명 합니다. 우리의 지식 최선을이 물고기 gonadal 조직과 zebrafish 생식 세포의 초 급속 한 냉각에 대 한 상세한 시각화 된 프로토콜을 설명 하는 첫 번째 연구 이다. 또한, 방법의 반복성 5 다른 zebrafish 긴장에서 설명 된다: AB 야생 타입, 캐스퍼 (로-/-; nacre-/-), 레오 파 드 (레오t1/t1), 바사 [Tg (vas::eGFP)]와 Wilms 종양 [Tg (wt1b::eGFP 1)] 유전자 변형 라인.

<table><tbody><tr><td>Leibovitz 매체 (L-15)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1518</td><td>L-글루타민</td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td> 보충<td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>트리카인 메탄 설포 네이트 (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>Acros 유기물</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Trehalose</td><td>Acros Organics</td><td>99-20-7</td><td>Dihydrate</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Reanal</td><td>20740-0-08-65</td><td></td></tr><tr><td>프로필렌 글리콜</td><td>Reanal</td><td>08860-1-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Reanal</td><td>00190-1-01-65</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Gibco</td><td>9001-12-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8003</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Panreac AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>200ml PBS 용액 제조용</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td> 정제</tr></tbody></table>

zebrafish spermatogonia 전체 testes 바늘의 cryopreservation 몰입 울트라-빠른 냉각

Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

생명 공학 및 과학의 현재 동향 breeding 식민지 유지의 일반적인 관행을 넘어 유전 자원의 안전한 저장을 위한 새로운 방법에 대 한 필요성에 따라서 선도 모델 생물에서 새로운 라인의 수천의 창조 될. 이 연구의 주요 목적은 바늘에 맞게 vitrification (NIV) 절차 전체 zebrafish testes cryopreserve에 몰입 했다. 전체 testes에 의해 초기 단계 세균 세포의 cryopreservation 이니라 제공 합니다 zebrafish의 스토리지에 대 한 가능성 유전 자원, 특히 이후 이식 후 그들은 둘 다 남성과 여성 gametes로 성숙 수 있습니다. 침술 바늘, 두 cryoprotective 미디어 (평형 솔루션 1.5 M 메탄올 및 1.5 M 프로필 렌 글리콜; 및 vitrification 솔루션 3 M 디 메 틸 sulfoxide 및 3 M 프로필 렌 글리콜을 포함)에 equilibrated에 testes excised 했다 그리고 액체 질소에 뛰어들었다. 샘플 3 결과 지구 온난화 솔루션의 시리즈에는 예 열 했다. 이 기술의 주요 장점은 다운스트림 조작; 촉진 따뜻하게 testes의 소화 후 (1) 정 충의 부족은 (2) 매우 빠른 따라서 냉각 및 cryoprotectants; 그들의 독성을 줄일 필요 농도 감소를 극대화 하는 액체 질소에 조직의 최적의 노출 사용 냉각 (3) 동기 여러 testes의, 노출에 cryoprotectants 액체 질소; 그리고 (4) 반복성의 5 개의 다른 zebrafish 긴장에서 50% 이상의 생존 여 시연.

평균적으로, 초기 단계 세균 세포는 하나의 신선한 zebrafish 고환에서 격리 수 물고기의 크기에 따라 40, 000와 200000 셀 사이의 다양 합니다. 모든 5 종자에 신선한 zebrafish testes 소화 때 초기 생식 세포만 셀 셀 정지 (그림 2)에 아니었다. 초기 단계 세균 세포 옆에 수많은 정 충도 발견 됐다. 다른 한편으로, cryopreserved testes의 소화 후 훨씬 적은 정 충 했다. 정 충이 매우 빠른 냉각 프로토콜 생존 하지 않습니다 그리고 초기 단계 세균 세포의 많은 청소기 정지 이며 소화 과정 제거 그들은 가장 가능성이 있다는 표시.
3 AB zebrafish 남성 (일방통행 ANOVA의 신선한 testes를 소화 하 여 한 개인의 왼쪽 및 오른쪽 고환 (1 ± 0.5...

이 연구의 주요 목적은 바늘에 맞게 vitrification (NIV) 절차 전체 zebrafish testes cryopreserve에 몰입 했다. 또한, 5 개의 다른 zebrafish 긴장에서 방법의 반복성 시험 되었다.

Zebrafish Spermatogonia 전체 Testes 바늘의 cryopreservation 몰입 울트라-빠른 냉각

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

냉동보존은 적어도 인간의 관점에서 무한한 기간 동안 저온에서 살아있는 세포와 조직을 유지할 수 있는 가능성을 제공합니다. 유리화 동결은 결정성 얼음의 형성 및 그와 관련된 손상 없이 유리와 같은 무정형 상태로 초급속 냉각하는 냉동보존의 한 형태입니다. 본 영상에서는 제브라피쉬 정소 전체의 유리화 동결 프로토콜을 제시하며, 이를 통해 적절한 수용체에 이식할 생식 세포원으로 추후 사용될 때까지 안전하게 보관할 수 있습니다.현재의 유리화 동결 프로토콜은 생식 줄기세포 조작과 관련하여 완만 동결 프로토콜보다 한 가지 중요한 장점을 가지고 있습니다. 그것은 유리화 동결 및 해동 후, 정자가 사멸하고 조정되어 세포 현탁액 내에 존재하지 않게 된다는 점입니다. 따라서 해동 후 생식 세포를 별도로 분리할 필요가 없습니다.이는 후속 조작을 용이하게 합니다. pH 7의 200 mg/L MS-222가 담긴 접시에 물고기를 넣어 안락사시킵니다. 해부를 계속하기 전에 아가미의 움직임이 멈췄는지 확인하고, 저산소증으로 인한 사망을 확실히 하기 위해 그 시점으로부터 최소 10분이 지났는지 확인하십시오.종이 타월로 가볍게 두드려 물고기의 물기를 제거한 후, 해부 매트 위에 등 쪽이 아래로 가도록 놓습니다. 우선, 해부를 쉽게 하기 위해 골반지느러미와 가슴지느러미를 잘라냅니다. 가슴지느러미 사이의 물고기 배 쪽 피부를 가로로 절개하고, 항문지느러미까지 배를 따라 피부와 하부 근육을 절개합니다.물고기의 체강을 열고 좌우 체벽을 바늘로 해부 매트에 고정합니다. 정소는 부레 양쪽의 위장관 기관 위에 위치합니다. 오염을 방지하기 위해 위장관 기관을 꺼내지 말고, 이를 한쪽으로 살짝 밀어낸 후 반대편에서 정소를 제거하십시오.정소는 체벽에 연결되어 있으므로 조심스럽게 제거하고, 미세 가위로 연결된 복막을 절단합니다. 또한, 오염을 방지하기 위해 먼저 정소를 70% ethanol에 2초 동안 넣어 멸균한 다음, 얼음 위에 놓인 96-well plate의 L-15에 넣습니다. 샘플 유형에 따라 니들에 적절한 라벨을 표시하고, 평형 및 유리화 용액을 준비합니다.정소들을 더 큰 웰 플레이트나 디쉬로 옮기고, 바늘의 크기에 따라 멸균된 침술용 바늘에 정소를 3개 이상 꽂습니다. 먼저, 곡선형 핀셋 위에 정소를 놓습니다. 바늘의 끝을 정소 중앙에 두고 핀셋으로 정소를 조심스럽게 위로 끌어올립니다.고환을 찔러 고정한 후, 바늘 상단 방향으로 부드럽게 끌어올립니다. 고환들이 서로 분리되어 있으며, 아래로 떨어지거나 미끄러지지 않는지 확인하십시오. 고환이 고정된 바늘을 25°C에서 유리화가 이루어질 때까지 L-15가 채워진 Tubulator Eppendorf 튜브에 넣습니다.보관 시간은 1시간을 초과해서는 안 됩니다. 정소가 부착된 바늘을 평형화 용액으로 옮기고 25°C에서 5분 동안 배양하십시오. 바늘을 유리화 용액으로 옮기고 25°C에서 30초 동안 배양하십시오.유리화 용액에서 바늘을 제거합니다. 멸균 종이 타월을 사용하여 조직에 남아 있는 용액을 빠르고 부드럽게 흡수시킵니다. 고환이 종이 타월에 달라붙거나 떨어지지 않도록 주의하십시오.바늘을 스티로폼 박스 안의 액체 질소에 빠르게 넣습니다. 닫힌 스티로폼 박스의 액체 질소 속에 바늘을 5~10분 동안 둡니다. 같은 박스에서 뚜껑을 열어둔 4.5 milliliter 크라이오튜브와 캡을 미리 냉각시킵니다.5~10분 후, 액체 질소 표면 아래에서 각 니들을 각각의 크라이오튜브로 옮기고 크라이오튜브를 닫습니다. 크라이오튜브를 금속 캔에 올린 후 가능한 한 빠르게 크라이오뱅크 캐니스터에 넣습니다. 샘플을 추후 사용할 때까지 캐니스터 보관 서랍에 보관합니다.각 니들을 개별적으로 가온합니다. 모든 가온 용액은 25°C여야 합니다. 금속 케인에서 크라이오튜브를 분리하여 스티로폼 박스에 보관된 액체 질소에 담급니다.포셉을 사용하여 액체 질소 기상에서 크라이오튜브를 열고, 니들을 액체 질소 속으로 떨어뜨립니다. 니들을 첫 번째 가온 용액으로 매우 빠르게 옮겨 1분 동안 배양합니다. 이동 중에 공기 중에서 가온되는 것을 방지하기 위해 니들을 신속하게 옮겨야 합니다.바늘을 두 번째 가온 용액으로 옮기고 3분 동안 배양합니다. 이어서 바늘을 세 번째 가온 용액으로 옮겨 5분 동안 배양합니다. 곡면 핀셋을 사용하여 정소를 아래쪽으로 밀어내어 바늘에서 분리합니다.가온된 각 고환을 10% FPS가 첨가된 250 µL의 L-15가 채워진 개별 웰에 각각 넣습니다. 웰에 샘플에 맞게 라벨이 붙어 있는지 확인하십시오. 모든 샘플이 가온될 때까지, 그리고 다음 단계의 작업 전까지 웰 플레이트를 얼음에 보관하십시오.각 샘플에 대해 500 µL의 해리 용액을 별도의 2 mL 튜브에 준비합니다. 샘플 코드에 따라 튜브에 라벨을 붙입니다. 준비된 해리 용액을 실온에서 5분 동안 배양합니다.따뜻하게 데운 조직을 소화 용액에 넣고, 소형 가위로 최소 30회 이상 잘게 자릅니다. 조직을 진탕 플레이트 위에서 24 degrees의 온도로 90분 동안 배양합니다. L-15 400 microliters와 10%FPS 100 microliters를 첨가하여 소화 과정을 중단시킵니다.용액을 가볍게 흔든 후 실온에서 1분 동안 배양합니다. 얻어진 용액을 50-micron 필터로 걸러 1.5 milliliter 튜브에 담습니다. 튜브에 적절히 라벨을 붙입니다.여과된 용액을 25°C에서 200 G로 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 10% FPS가 첨가된 L-15 20 µL에 펠렛을 다시 부유시킵니다. 펠렛이 완전히 용해될 때까지 튜브를 수동으로 흔들어 줍니다.추후 사용 전까지 세포 현탁액을 얼음 위 또는 4°C에서 보관하십시오. 적절하게 라벨이 부착된 0.2 mL PCR 튜브에 세포 현탁액 5 µL와 0.4% trypan blue 용액 5 µL를 혼합하십시오. 다른 부피를 사용하는 경우, 1:1의 희석 비율이 유지되도록 하십시오.이 현탁액을 25°C에서 1~3분 동안 배양하십시오. 현미경하에서 헤모사이토미터를 사용하여 각 샘플의 생존력을 확인하십시오. 트립판 블루(trypan blue)로 염색되지 않은 살아있는 세포의 수를 15개 시야에서 측정하십시오.세포 현탁액 20 µL에 포함된 총 세포 수를 계산합니다. 이제 이 현탁액을 모든 후속 응용 단계에 사용할 수 있습니다. 평균적으로, 단일 신선한 제브라피시 정소에서 분리된 초기 단계 생식 세포 수는 물고기의 크기에 따라 40,000개에서 200,000개 사이로 다양합니다.본 연구에 사용된 모든 제브라피시 계통에서, 현재의 유리화 동결 프로토콜은 평균 50% 이상의 생존율을 나타냈습니다. 이는 제시된 프로토콜의 생존율과 재현성이 우수함을 나타냅니다. 5가지 모든 계통의 신선한 제브라피시 정소를 소화시켰을 때, 초기 단계의 생식 세포 외에도 수많은 정자가 함께 관찰되었습니다.냉동 보존된 정소의 소화 후 정자의 수가 훨씬 적게 나타났으며, 이는 정자가 해당 유리화 프로토콜에서 생존하지 못하며 소화 과정 중에 제거되었을 가능성이 매우 높음을 시사합니다. 본 연구에서 제시한 바늘 침지 유리화 프로토콜은 정소 조각의 냉동 보존에 있어 여러 가지 장점을 제공합니다. 첫째, 하나의 바늘에 여러 개의 조각을 고정할 수 있으므로, 동결 보호제와 액체 질소에 동시에 노출시킬 수 있습니다.또한, 이 방법을 통해 조직 조각에 부착되는 동결보호제의 양을 매우 낮게 유지할 수 있습니다. 따라서 냉각 및 가온 속도를 더 높일 수 있습니다. 한 가지 중요한 장점은 정자가 이 프로토콜에서 생존하지 못한다는 것이며, 결과적으로 세포 현탁액은 정원세포가 농축된 상태가 되어 이후의 응용 단계가 용이해집니다.하지만 질소로 인한 교차 오염의 가능성을 반드시 고려해야 합니다. 따라서 이 방법을 사용할 때는 액체 질소를 재사용해서는 안 됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이것은 zebrafish에 대한 높은 처리량 정자 cryopreservation 프로토콜입니다. 정자는이 프로토콜을 사용하면 이후의 체외 수정에 25 % 다산의 평균을 가지고 있으며, 수년 동안 안정 cryopreserved.

높은 처리량 Zebrafish의 정자 Cryopreservation에 대한 방법과 체외에서 수정

이것은 바로 자외선 - inactivated 정자와 수정 후 두 번째 meiotic 부서 차단하여 gynogenetic의 diploid의 zebrafish의 배아 (단 유전적 기여 어머니의 유래 배아)를 생성하는 방법입니다. EP의 배아는 첫 번째 meiotic 부문 중 재조합에 의해 완전히 homozygous하지 않습니다, 그러나 그들은 재조합하여 centromere에서 분리되지 않은 모든 loci에 homozygous 있습니다.

초기 압력에 의해 Gynogenetic의 Diploid의 Zebrafish 만들기

이 비디오에서는 에틸렌 글리콜 및 디메틸 설폭사이드를 동결 보호제로, 극저온 빨대를 운반 시스템으로 사용하여 원하는 발달 단계에서 수확된 토끼 배아를 유리화하는 절차를 설명합니다. 유리화된 배아는 생존율이 높으며 사용할 때까지 장기간 보관할 수 있습니다.

극저온 빨대를 사용한 토끼 배아 유리화: 장기 보관을 위해 토끼 배아를 보존하기 위한 초고속 냉각 기술

제브라피쉬는 고등 척추동물과의 유전적 유사성으로 인해 발생 생물학 및 인간 질병 연구를 위한 강력한 모델 시스템입니다. 이 프로토콜은 초기 배발생에 필수적인 유전자의 열성 돌연변이를 식별하기 위한 전방 스크리닝 전략에 활용할 수 있는 반수체 제브라피시 배아를 만드는 방법론을 설명합니다.

반수체 제브라 피쉬 배아의 생산에 의해<em&gt; 체외</em&gt; 시비

심혈관 연구를 위한 제브라피쉬의 사용은 성인 심장에 대한 연구로 확장되고 있습니다. 이러한 응용 분야의 경우, 심장 조직을 빠르고 간단하게 분리하는 것이 사후 변화를 피하고 적절한 수의 샘플을 얻는 데 중요합니다. 여기에서는 성체 제브라피시 심장을 빠르고 재현 가능한 방법으로 해부할 수 있습니다.

높은 처리량 응용 프로그램에 대한 성인 Zebrafish의 마음의 복구

동물 연구에서는 반복적인 혈액 채취가 필요하고 중요합니다. 우리는 성체 제브라피시의 반복적인 혈액 채취를 위한 새롭고 치명적이지 않으며 신뢰할 수 있는 방법을 개발했으며, 이 방법을 포도당 대사를 포함한 혈액 생화학 연구에 적용했습니다.

성인 Zebrafish의에서 혈액 검사에 대한 반복 채혈

배수성 조작 수정 된 프로토콜은 초기 배아 세포질 분열에 한 사이클 실속을 유도하는 열 쇼크를 사용한다. 이 프로토콜은 제브라에서 설명되지만, 다른 종에도 적용 할 수있다.

열 충격이 치료와 제브라 피쉬 배아의 배수성 조작

여기에서, 우리는 zebrafish 배아 및 애벌레의 전체 준비에 있는 단백질의 형광 항체 중재한 검출을 위한 프로토콜을 제시합니다.

제브라피시 배아와 애벌레의 전체 마운트 면역항암화학

핵 표면 퍼짐은 만피증 도중 염색체 사건을 공부하기 위한 필수적인 공구입니다. 여기서 우리는 제브라피쉬 정자세포로부터 의한 1단계 진행 중에 메오성 염색체를 준비하고 시각화하는 방법을 시연한다.

제브라피쉬 정자세포에서 메오틱 염색체 스프레드 의 준비

여기서는 제브라피시 난소 여포에 여포 세포와 난소 세포를 분리하는 간단한 방법을 제시하여 제브라피시의 난소 발달에 대한 조사를 용이하게 합니다.

얼룩말 피시의 난소 여포에서 여포 세포와 난소 세포의 분리

CRISPR-Cas 기술은 게놈 편집 분야에 혁명을 일으켰습니다. 그러나 원하는 생식계열 편집을 찾고 분리하는 것은 여전히 주요 병목 현상으로 남아 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 표준 PCR, 제한 분해 및 겔 전기영동 기술을 사용하여 생식계열 편집을 위해 F0 CRISPR 주입 제브라피쉬 정자를 신속하게 스크리닝하는 강력한 방법을 설명합니다.

제브라피쉬에서 생식계열 편집의 신속한 분리를 위한 정자 스크리닝

배우세요 제브라피시 고환 전체를 바늘 침지 유리화법으로 초저온 동결 보존하는 방법을. 5개 계통에서 재현성을 확인하고 정자 소멸로 생식세포 분리를 간소화하여 생식생물학 연구에 활용합니다.

Zebrafish Spermatogonia 전체 Testes 바늘의 cryopreservation 몰입 울트라-빠른 냉각

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