모기 유 충에서 유전자의 기능 분석에 대 한 유전자 납품 벡터로 재조합 모기 Densovirus의 사용

본 절차의 전반적인 목표는 재조합 모기 덴소바이러스를 유전자 전달체로 사용하여 모기 유충의 유전자 기능을 분석하는 것입니다. 이 방법은 관련 세포 외 및 세포 내 장벽을 극복하는 방법과 같이 바이러스 기반 전달 시스템의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이러한 기술의 주요 장점은 조작이 쉽고, 형질전환 효율이 높으며, 발현이 장기적이고 강력하고, 생체 내(in vivo)에서 지속적인 효과를 생성할 수 있다는 점입니다.

본 연구는 개발된 덴소바이러스(densovirus) 전달 시스템을 이용하여 모기 유충에서 특정 소형 RNA 또는 표적 유전자를 과발현시키거나 넉다운(knock down)할 수 있음을 입증하였습니다. 이 기술은 유충의 형질 도입을 용이하게 하므로, 설명된 발현 전략을 모기 생물학 연구에 적용하여 그 활용 범위를 확장할 수 있습니다. 해당 실험 절차의 시연은 저희 연구실의 박사 과정 후보자인 Pei-Wen Liu가 진행하겠습니다.

함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로, 전구체 miRNA, miRNA 스펀지 및 shRNA의 전체 길이 cDNA 서열에 대한 화학적 합성을 주문하는 것으로 시작하십시오. 주문한 DNA를 수령한 후, DNA 블록이 포함된 튜브를 원심분리하여 건조된 DNA가 모두 튜브 바닥에 모이도록 합니다. 그런 다음, DNase-free water로 DNA를 재현탁하여 최종 농도를 10 nanograms per microliter로 맞추십시오.

플라스미드 백본과 cDNA 서열을 절단하기 위해 XbaI 6 µL를 첨가하고, 반응물을 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후, 제조사의 지침에 따라 송아지 장 유래 알칼리성 인산가수분해효소(calf-intestinal alkaline phosphatase)를 사용하여 선형화된 플라스미드 백본의 5' 말단을 탈인산화합니다. 효율적인 패키징을 위해 게놈 크기는 야생형 모기 densovirus 게놈 길이의 110%에 해당하는 4,400 nucleotide를 초과해서는 안 되며, 또는 400 nucleotide 이하의 인트론성 microRNA 발현 서열을 Aedes aegypti 게놈에 도입할 수 있습니다.

다음으로, 65°C에서 알칼리성 포스파타아제를 열불활성화합니다. 그 후, 1% 아가로스 겔에서 DNA를 전기영동하고 선형화된 백본을 절단합니다. 제조사의 지침에 따라 겔 추출 키트를 사용하여 겔 조각에서 DNA를 추출합니다.

추출된 DNA 단편을 T4 DNA ligase를 사용하여 백본에 결찰합니다. 그런 다음, 열 충격법을 이용하여 결찰 반응 생성물을 컴피턴트 DH5-alpha E.coli 세포에 형질전환시킵니다. 형질전환된 박테리아를 100 micrograms per milliliter의 ampicillin이 함유된 LB agar 플레이트에 도말합니다.

다음 날, 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고, 100 µg/mL의 ampicillin이 포함된 3 mL의 강화 배지를 사용하여 스타터 배양액을 만듭니다. 마지막으로, 제조사의 지침에 따라 miniprep 키트를 사용하여 박테리아 배양액에서 플라스미드 DNA를 추출합니다. 확인을 위해 DNA 샘플을 DNA 시퀀싱 업체로 보냅니다.

인공 인트론 소형 RNA 발현 카세트에 대해 설명한 방법을 사용하여, pUCA 플라스미드 백본의 AaeDV NS1 코딩 영역 내 HpaI 부위에 pre-miRNA 또는 shRNA를 결찰합니다. DH5-alpha 세포 대신 Stbl3 컴피턴트 E.coli 세포에 DNA를 형질전환합니다. 그 다음, 형질전환된 세포를 100 micrograms per milliliter의 ampicillin이 포함된 LB agar 플레이트에 도말하고, 양성 클론으로부터 스타터 배양액을 준비합니다. 이후, 제조사의 지침에 따라 maxiprep 키트를 사용하여 박테리아 세포로부터 rAaeDV 플라스미드를 추출합니다.

0일 차에, 90~95% 합류도(confluence)에 도달한 C6/36 세포 플라스크를 1:2 비율로 나누어 10개의 T-25 배양 플라스크에 분주합니다. 플라스크를 28°C에서 18~20시간 동안 배양하여 다시 90~95% 합류도에 도달하게 합니다.

1일 차에 생성된 rAaeDV 플라스미드를 세포에 형질전환합니다. 이를 위해 10 µg의 DNA를 600 µL의 RPMI-1640 배지에 희석하고 용액을 부드럽게 섞습니다. 동시에 형질전환 1회당 600 µL의 RPMI-1640 배지와 25 µL의 형질전환 시약을 준비합니다.

세포를 DNA와 함께 실온에서 5~10분 동안 배양합니다. 그다음, 플라스미드 DNA 혼합물에 RPMI-1640 형질전환 시약 혼합물 625 µL를 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 20~30분 동안 배양합니다. 배양 후, 세포를 RPMI-1640 배지로 두 번 세척한 다음, 각 T-25 배양 플라스크에 형질전환 혼합물을 첨가합니다.

세포를 transfection 혼합물에 넣고 28°C에서 6시간 동안 배양합니다. 6시간 후, transfection 배지를 제거하고 5mL의 RPMI-1640 배지로 세포를 두 번 세척한 다음, 10% FBS가 함유된 신선한 RPMI-1640 배지를 추가합니다. transfection 5일 후, 5mL 유리 드롭퍼를 사용하여 배양액으로 피펫팅을 반복함으로써 디쉬 내의 세포를 떼어내어 현탁시킵니다.

각 플라스크의 세포 현탁액을 각각의 멸균된 50-milliliter 튜브로 옮깁니다. 고역가 의존성 바이러스를 수확하려면 트랜스펙션 후 5일 동안 세포를 배양해야 합니다. 개별 튜브를 -80 °C 또는 드라이아이스-에탄올 배스에서 30분 동안 냉동합니다.

그 후, 37 °C에서 빠르게 해동하고, 세포 현탁액을 1분 동안 볼텍싱합니다. 다음으로, 원심분리한 시료에서 상층액을 수집하고 펠렛은 폐기합니다. 그런 다음, 상층액을 0.22 µm 일회용 시린지 필터로 여과합니다.

최종 정제된 비리온 스톡을 분주하여 -80 °C에서 보관하십시오. 1차령 A. albopictus 유충 100마리를 탈이온수로 3회 세척합니다. 그런 다음, 유충을 탈이온수 95 mL가 담긴 비커로 옮깁니다.

rAaeDV 스톡 5 mL를 첨가하고, 유충을 28 °C에서 24시간 동안 배양합니다. 유충 감염을 성공시키려면, 높은 감염률을 보장하기 위해 유충이 감염 바이러스 입자와 함께 24~36시간 동안 유지되는 것이 필수적입니다. 배양 후, 탈이온수로 유충을 3회 세척한 다음, 유충을 다시 플레이트로 옮깁니다. 유충에게 정기적으로 먹이를 공급합니다. 표준 기술을 사용하여 quantitative PCR 또는 western blot으로 유충 내 표적 유전자 발현 수준을 모니터링합니다.

본 예시에서는 과발현을 나타내는 aal-let-7 발현 카세트를 포함하는 재조합 바이러스에 감염된 1령 유충 100마리를 대상으로 내인성 miRNA 발현을 분석하였습니다.

anti-let-7 작제물의 효율성이 오른쪽에 제시되어 있으며, 이는 해당 작제물의 넉다운 능력을 강조합니다. rAaeDV 벡터의 V-ATPase mRNA 넉다운 효율을 모니터링하기 위해, 총 100마리의 1령 유충이 서식지 수조에 바이러스를 첨가하는 방식으로 서로 다른 유형의 rAaeDV를 동일한 양으로 처리되었습니다. V-ATPase mRNA 수준은 miRNA를 발현하는 rAaeDV와 인트론성 shRNA를 발현하는 rAaeDV에 의해 상당히 감소되었습니다.

본 결과는 결함이 있는 게놈을 가진 모기 덴소바이러스(densovirus)의 한계를 극복하여 외래 유전자를 모기 내로 효율적으로 전달할 수 있는 새로운 패러다임인 인트론 발현 전략을 입증합니다. 이 절차를 수행할 때, 400 nt 이하의 인트론 마이크로RNA(microRNA) 발현 카세트만이 Aedes aegypti 덴소바이러스 게놈에 삽입될 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 이후 이 기술은 모기 유전자의 기능 분석을 위해 마이크로RNA 및 표적 유전자를 과발현하거나 억제할 수 있는 비결함 재조합 모기 덴소바이러스 생산 연구의 길을 열었습니다.

이 영상을 시청하고 나면, 개발된 모기 덴소바이러스 전달 시스템을 사용하여 모기 유충의 유전자 기능을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.