Name: 모기 유 충에서 유전자의 기능 분석에 대 한 유전자 납품 벡터로 재조합 모기 Densovirus의 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: 배우세요 모기 유충에서 유전자 기능 분석을 위한 재조합 Aedes aegypti 덴소바이러스 유전자 전달 시스템을 사용하는 방법을. 이 기술은 높은 전달 효율과 장기적인 유전자 발현 조절을 가능하게 하여 모기 생물학 연구에 활용됩니다.

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저자는 국가 주요 연구 및 개발 프로그램의 중국에서 재정 지원을 인정 (샤 오 Guang 첸에 2016YFC1200500), 국립 자연 과학 재단의 중국 (81672054 및 81371846), 자연의 연구 팀 프로그램 광 (2014A030312016)의 과학 재단 하 고 광주 (201508020263)의 과학 및 기술 프로그램. 친절 하 게 촬영 및 p7NS1 GFP 플라스 미드를 제공 하 고 비판적으로이 원고를 읽고 우리는 기꺼이 교수 조나단 칼 슨 (콜로라도 주립 대학)을 인정 합니다.

모든 프로토콜 윤리 위원회의 남부 의료 대학에 의해 승인 했다.
 1. 인공 Intron 설계 참고:이 작업에 사용 되는 인공 intron는 65 길이, 및 순서에 혈압이 5 &#39;-GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG-3 &#39;.
<ol><li>Hpa 배치 나 제한 사이트 인공 intron의 양쪽 끝에 그래서 그 Hpa 나 소화 플라스 미드 ( 그림 1 참조)에서 intron을 해제할 수 있습니다.</li>
	<li>장소 두 Xba 나 제한 사이트는 intron에서 그래서 그 Xba 나 소화 작은 RNA 식 시퀀스를 삽입 하는 데 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>는 DNA 제조 업체에서 인공 intron의 전장 DNA 시퀀스의 화학 합성을 주문. 합성 DNA 생성은 표준 pUC19 플라스 미드에 클로닝에서. 
	참고: 인공 intron의 필수 구성 요소 포함 5를 포함 하 여 여러 합의 뉴클레오티드 요소, &#39; GUAAGAGU, UACUAAC, 폴 리 pyrimidine 순서 보존된 지점 포인트 시퀀스 (BPS) 시퀀스와 기증자 스플라이스 사이트 (DS) 로 (PPT) 10 시퀀스 UCUUC(U) 3 &#39;-수락자 스플라이스 사이트 (AS) 시퀀스 GAUAUCCUGCAG ( 그림 1 A). 두 개의 Xba 나 제한 사이트 DS와 작은 RNA 식 시퀀스를 삽입 하는 데 사용할 수 있는 BPS 사이 소개 되었다. 이 인공 intron 포유류와 모기 세포에서 효과적으로 결합 하는 능력 이전 확인된 14 되었습니다.</li>
</ol> 2. 설계는 인공 Intronic 작은 RNA 식 카세트 참고: overexpression 또는 생 miRNA의 최저, 전조 미르 미르 스폰지를 인코딩 시퀀스 DS와 BPS 사이 삽입 했다. 예를 들어, 봉사 애 albopictus aal-하자-7에서 생 전조 미르 미르 overexpression 및 최저 재조합 형 바이러스 성 벡터를 생성 선정 됐다. 반대로 let 7 스폰지는 앞에서 설명한 방법 15에 따라 설계 되었습니다. 애벌레에서 대상 유전자를 허물고, 우리 설계 된 특정 인공 미르 (amiRNA) 또는 온라인 소프트웨어 16 , 17;를 사용 하 여 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 순서 예를 들어, V ATPase 소 단위를 mRNA 역할을 (취득 no. AY864912)는이 연구에서 유전자를 대상으로 선정 됐다. amiRNA 것입니다 라고 하 amiVTP이. 사전-미르, 스폰지, amiRNA, 및 shRNA 모든 시퀀스 세부 사항을 보충 표 1에 설명 되어 있습니다.
<ol><li>전조 miRNAs, 미르 스폰지, 및 Xba와 shRNA의 전장 cDNA 시퀀스의 화학 합성 주문 나 DNA 제조 업체에서 양쪽 끝에 제한 사이트.</li>
	<li>정렬 된 DNA, 스핀 10000-14000 x DNA 블록을 포함 하는 관을 받은 후 g 모두 DNA 건조 되도록 1 분에 대 한 튜브의 하단에는.</li>
	<li>10 ng / µ L의 최종 농도 달성 하기 위해 DNase 무료 물에 말린된 DNA resuspend.</li>
	<li>소화 플라스 미드 백본 및 DNA 시퀀스를 Xba와 내가 1 시간 동안 37 ° C에서 그리고 다음 5 dephosphorylate &#39;와 종 아리 장 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (CIAP) 제조 업체에 따라 선형화 플라스 미드 등뼈의 끝 &#39; s 프로토콜 .</li>
	<li>65에서 60 분이 열에 의해 비활성화 CIAP ° c.</li>
	<li>는 1.0 %agarose 젤을 실행 하 고 선형화 등뼈를 잘라. 다음 제조 업체에 따라 젤 추출 키트를 사용 하 여 젤 조각에서 DNA를 추출 &#39; s 지침.</li>
	<li>Ligate 1 h. 22 ° C에서 backboneby T4 DNA 리가 (5 U / µ L)으로 DNA 조각</li>
	<li>유능한 대장균 (대장균)에 2.7 단계 세포 및 암 피 실린 (100 µ g/mL의 농도)에 포함 된 Lysogeny 국물 (파운드) 한 접시에 접시에서 결 찰 반응의 제품은 변환.
	<ol><li>수행 열 충격 방법 18를 사용 하 여 적절 한 대장균을 통해 변환 스트레인. 예를 들어 대장균 긴장 DH5α를 사용 하 여 열 충격 변화에 대 한.</li>
	</ol></li> <li>선택에서 단일 식민지 2.8 고 3 mL의 문화에서 품 어 농축 (100 µ g/mL의 농도)에서 중간 포함 암 피 실린.</li>
	<li>제조 업체에 따라 소형 예비 키트를 사용 하 여 세균성 문화에서 플라스 미드 DNA를 추출 &#39; s 지시. DNA 시퀀싱 회사 샘플 보내기. 
	참고: overexpression 또는 생 miRNA의 최저, 전조 미르 미르 스폰지를 인코딩 시퀀스 삽입 되었다 2 사이 Xba 나 사이트. 모든 미르 식 또는 스폰지 구조 400 보다 짧은 있어야 바이러스 19의 포장 제한 때문에 bp (바이러스 성 게놈 길이의 10%).</li>
</ol> 3. RAeaDV 구문 생성 하 플라스 미드 등뼈로 미르 또는 shRNA 식 카세트를 복제 참고: 촬영, 촬영 플라스 미드 포함 하는 AaeDV 게놈의 구성 하는 전염 성 클론 (3,981 nt) 19, 친절 하 게 교수 조나단 칼 슨에 의해 제공 되었다 고 이전 세부 사항 11에서 설명 하고있다. 비 구조 단백질 1 (NS1)를 표현 하는 p7NS1-DsRed-p7 발기인에서 빨간 형광 성 단백질 (DsRed) 융합 단백질 되었습니다 자세히 다른 14 설명. 인간 전용 미르-941-1 전조 20와 그것의 스폰지, 스크램블된 shRNA (CGACGACTATCGTGCAATTTCAAGAG AATTGCACGATAGTCGTCG), 또한 부정적인 제어로 AaeDV에 subcloned 했다.
<ol><li>Pre-미르, 스폰지, shRNA 또는 amiVTP 식 카세트 Hpa 사이트에 선의 촬영 플라스 미드 백본 프로토콜 단계 2.4 2.7에에서 설명 된 대로 AaeDV NS1 코딩 영역.</li>
	<li>유능한 대장균 세포 및 단계 2.8 2.10에서에서 설명한 대로 긍정적인 클론을 선택 Stbl3 DNA 변환.</li>
	<li>제조 업체에 따라 맥시 준비 키트를 사용 하 여 세균 세포에서 rAaeDV 플라스 미드 추출, 다음 &#39; s 지침. 
	참고: Stbl3 또는 Stbl4 대장균 세포 원치 않는 ITR 재결합을 최소화 하기 위해 rAaeDV DNA 변환에 대 한 활용 되어야 합니다. 맥시 prep rAaeDV 플라스 미드 DNA의 대량을 추출 하는 데 사용할 해야 (&#62; 100 µ g). 바이러스를 생성 하기 전에 rAaeDV 플라스 미드의 시퀀스 무결성 분석 해야 합니다 항상 여 DNA 시퀀싱 21.</li>
</ol> 4. RAaeDV 플라스 미드와 transfecting C6/36 셀 <ol><li>문화 C6/36 세포 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 매체 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 28 ° C 배양 기에서 1% 페니실린/스 포함.</li>
	<li>0 일에 접시 10 25 cm 2 문화 플라스 크에 세포 transfection 90-95%는 1:2 희석에 confluent 셀을 분할 하기 전에 18-20 h. 
	참고: 하루 1, 셀에 도달 해야 90-95% 합류.</li>
	<li>하루에 1, rAaeDV 플라스 미드 22 시리즈와 셀 transfect.
	<li><ol>Microcentrifuge 튜브에서 RPMI 1640 매체의 600 µ L에 10 µ g의 DNA를 희석 하 고 부드럽게 혼합. 한편, RPMI 1640 매체의 600 µ L 25 µ L 당 transfection transfection 시 약의 준비.</li>
		<li>품 실 온 (RT)에서 5-10 분 그런 다음, 1640-플라스 미드 DNA 혼합물에 1640 transfection 시 혼합물의 625 µ L를 추가.</li>
		<li>는 실시간에 20-30 분 동안이 혼합물을 품 어 Transfection, 전에 씻어 RPMI 1640 매체의 2 mL로 두 번 셀.</li>
		<li>RT 후 보육 (4.3.3 단계), 25 cm 2 문화 플라스 크를 the1640 transfection 시 DNA 플라스 미드 혼합물을 추가 하 고 28에서 6 h에 대 한 품 어 ° c.</li>
		<li>약 6 h 후 transfection에 제거 transfection 미디어 RPMI 1640 매체의 5 mL로 두 번 셀을 세척 하 고 10%와 RPMI 1640 매체 추가 FBS. 
		그러나 참고: rAaeDV Ae albopictus 애벌레 감염 (95%)의 높은 속도에서는,, 우리의 경험에서는, 감염 된 애벌레의 거의 50%에서 감염 없이 1 차 감염 사이트 (예를 들어, 항문 용의자와 다름 셀)에 제한 했다 보급 23. 따라서, 여러 조직에서 애벌레를 감염 시킬 필요가 있는 경우에, 형광 단백질을 표현 하는 결함이 재조합 바이러스 감염 사이트의 시각화 수 있도록 공동 감염 되어야 합니다. 예를 들어 DsRed을 표현 하는 결함이 있는 재조합 바이러스 생산, p7NS1-DsRed 위에서 설명한 절차에 따라 C6/36 세포로 도우미 플라스 미드와 공동 transfected 이어야 한다 (cotransfection 농도 비율 2:1 이어야 함).</li>
	</ol></li></ol> 5. 페 C6/36 세포에서 rAaeDV Virions 수확 <ol><li>수확 세포 transfection 후 5 일. 꺼내 려 하 고 5 mL 유리 dropper, 문화 매체를 위아래로 pipetting으로 요리에 셀 중단. 모든 셀 정지 균 15 mL 튜브에 전송.</li>
	<li>-80 ° C에서 드라이 아이스/에탄올 목욕 30 분에 고정 하 고 37에 녹여 다음 1 분에 대 한 ° C. 소용돌이 동결 및 해 동 절차 3 번 반복.</li>
	<li>원심 4 °C.Collect은 상쾌한에 20 분 동안 4800 x g에서 샘플 하 고 펠 릿을 삭제. 그런 다음는 상쾌한 통과 0.22 μ m 일회용 주사기 필터. 최종 정제 virion-80에서 주식 약 수 및 저장소 ° c. 
	참고: 반복된 freeze-thaw 주기 방지.</li>
</ol> 6. RAaeDV 측정 <ol><li>준비 DNA 표준. 선형화 Hpa와 모든 rAaeDV 플라스 미드 나, 젤 추출 키트 24 소화 제품을 정화.</li>
	<li>절대 양적 표준 곡선을 생성 하 고 앞에서 설명한 방법 25에 따라 바이러스 titer 측정.</li>
</ol> 7. 모기 변환 <ol><li>세척 100 1 세인트 탈피 Ae albopictus 애벌레 세 번 사용 하 여 이온 물, 그리고 다음, 95 이온된 물 들어 있는 비 커에 애벌레를 전송. RAaeDV 주식 (최종 농도 10 복사본/10ml x 1.00)의 5 mL을 추가.</li>
	<li>품 어 24 28 ° c, h 이온된 수를 사용 하 여 시간 3 애벌레를 세척 하 고 다음 애벌레는 접시에 다시 전송 하 고 정기적으로 피드.</li>
	<li>모니터링 정량 또는 서쪽 오 점 (대표 결과 그림 3과 4에 나와 있습니다) 애벌레에 대상 유전자 발현의 수준. 
	참고: 형광 신호 검출 방식 보다 정확 하 게 감염 된 유 충을 사용할 수 있습니다. 예를 들어 DsRed을 표현 하는 재조합 형 바이러스에 감염 된 애벌레에서 형광 신호를 감지, 애벌레 수 오목 함 슬라이드에 배치 되며 감염 된 후 2 일까지 모든 8 h는 거꾸로 형광 현미경 관찰. 형광 애벌레 감지 되 면 이후 지속적인 관찰 수 있도록 개별 플라스틱 테스트 컵으로 분리 되어야 한다. 이 메서드를 사용 하 여 여러 조직 감염 된 애벌레를 확인할 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

그것은 두 rAaeDV 건설을 제한 하는 주요 장벽을 극복 하는 것이 중요입니다. 첫 번째 결함 재조합 바이러스의 생산 이다. 그것은 알려졌다 적절 하 게 표현 하는 벡터 크기의 GFP 단백질; 전갈 곤충 전용 neurotoxins20 등 외국 유전자 MDV를 사용할 수 있습니다. 그러나, 건설 전략에 MDV ORFs 삽입 또는 세 유전자를 대체 하는 일단 virions 형성할 수 없습니다 독립적으로 도우미 플라스 미드 누락 된 필수적인 바이러스 성 단백질 공급 cotransfected 하지 않으면. 결함이 있는 바이러스는 비보에 결함이 있는 유전자와 모기에 발생 하는 보조 전송에 종사 하는 수 없습니다. 우리의 결과 모기로 외국 유전자의 효율적인 배달을 사용 하도록 결함이 있는 유전자와 MDVs의 한계를 극복할 수 있는 새로운 패러다임을 제공 하 여 intronic 식 전략을 확인 합니다.
두 번째는 바이러스 성 capsid의 크기에 의해 부과 된 재조합 형 바...

모기-품 어진 질병 말라리아, 황열병, 뎅기열, zika 발열 등은 계속 글로벌 전염 성 질병 부담1,2의 중요 한 일부분을 담당 하는 주요 국제 공중 보건 문제입니다. 벡터에 대 한 응답에 사용 된, 전통적인 살충제 모기 품 어진 질병의 예방에 대 한 지속 가능한 통합된 모기 제어 전략의 주요 구성 요소입니다. 그러나, 이러한 전략 상대적으로 효과 없는 또는 관련된 부정적인 환경에 미치는 영향 뿐만 아니라 모기 인구3,4내성의 진화로 인해 원하지 않는 것을 입증 했다. 이러한 이유로, 모기의 다른 방법에 대 한 긴급 한 필요 제어 및 불 임 남성 모기를 생산 하는 유전자 변형 방법의 사용 이며 병원 체 저항 모기의 릴리스 유망한 새로운 제어 전략으로 발현. 개발 효과적인 새로운 컨트롤 방법, vivo에서 유전자 전달 모기 유전자 기능의 포괄적인 분석에 대 한 안전 하 고 효과적인 방법으로 필요한 같은.
플라스 미드 DNA, 더블의 직접 microinjection RNA (dsRNA) 좌초 또는 작은 간섭 RNA (siRNA)는 가장 일반적으로 사용 되 vivo에서 유전자 전달 방법 모기에. 사실, 모기의 유전자 변형 종자의 생산 여전히 태아 microinjection5,,67의 과정에 의존 합니다. 그러나, microinjection는 몇 가지 제한이 있습니다. 첫째,이 기술은 기술적으로 요구 하 고 복잡 한 절차를 포함 한다. 둘째, 주입 하면 태아, 애벌레, pupae, 및 성인 대상 생물의 생존에 직접적인 영향을 실제 모욕. 셋째, 대부분 수 중 서식 지에서 살고 먹 운동 특성을가지고 있기 때문에 microinjection에 대 한 모기 유 충을 무력화 하기가 어렵습니다. 넷째, 1st-2nd 탈피 애벌레의 크기는 10-에 20 배 작은 4번째 보다 탈피 및 오래 된 애벌레, 그리고 전 손톱 더 섬세 한. 이러한 기능 1st-2nd 탈피 애벌레 이전 단계에서 그들에 비해 조작 하기 어려울. 결합, 이러한 요소는 애벌레 (약 5%) 성인8에 비해 감소 후 주입 생존 율에 기여 한다. 바이러스 성 기반 전달 시스템 관련된 extracellular와 세포 장벽을 극복 하기 위해 개발 되었습니다. 이러한 시스템 쉬운 조작, 높은 변환 효율, 장기와 강력한 식의 수준과 영구 효과 vivo에서생산 하는 것의 이점이 있다. 따라서, 유전자 전달 시스템 활용 레트로 바이러스, lentiviruses, adenoviruses 널리 되었습니다 사용 모델 종 inmammalian 세포 라인. Sindbis 바이러스 식 시스템 이전 성인 모기;에 유전자 기능을 분석 하는 데 사용 되었다는 그러나 biosafety 관심사 외, 주입은 여전히 바이러스 감염9필요한 과정. DsRNA 해결책에 애벌레를 몸을 담글 하 여 구두 납품은으로 알려졌다 이전 가능한 전달 방법으로, 비록 작은 RNA 기능 분석10위해 적당 하다. 그래서, 효과적인 바이러스 전달 방법 아직도 모기에 대 한 개발 해야 합니다.
모기 densoviruses (MDVs) Parvoviridae, 그리고 Brevidensovirus11속에서 하나를 제외한 모든가 Densovirinae subfamily의 일부입니다. MDV virions 비 싸여 있으며 단일 가닥 DNA (ssDNA) 게놈과 icosahedral capsid의 구성 (20 nm 직경에서). 바이러스 성 게놈 크기에 약 4kb 이며 호스트 세포의 핵 내에서 복제 됩니다. MDVs 환경에서 상대적으로 안정 하 고 모기에 대 한 높은 특이성으로 좁은 호스트 범위를 보여. 이 바이러스를 확산 하 고 모기 인구에서 자연스럽 게 지속 가능성 있고 거의 모든 장기와 조직 midgut, 말 tubules, 뚱뚱한 몸, 근육, 신경, 그리고 침 샘12를 포함 하 여 이러한 곤충의 침입 수 있습니다.
그대로 MDV 유전자를 플라스 미드 기반의 전염 성 클론; 생성 하 플라스 미드 벡터에 subcloned 수 있습니다. 이러한 모기 세포에 배달, 바이러스 성 게놈 플라스 미드 벡터에서 추출 되 고 전염 성 바이러스 입자를 생산 됩니다. MDV 작은 ssDNA 게놈 있기 때문에, 전염 성 클론은 쉽게 건설 하 고 바이러스 성 게놈 쉽게 조작된11,13를 수 있습니다. 이러한 특성 모기 생물학 검토를 위해 귀중 한 에이전트 MDV 확인 합니다. 그러나, 바이러스 성 게놈 시퀀스의 거의 모든 바이러스 확산을 위해 필수적 이다, 때문에 교체를 통해 재조합 바이러스의 생성 또는 외국 유전자의 삽입 하면 손실 바이러스 성 포장 및/또는 복제 능력에 만듭니다 있는 유전자 납품 벡터로 MDVs의 개발에 대 한 장벽 했다. 여기, 우리는 인공 intronic 작은 RNA 식 전략을 사용 하 여 시스템을 개발 비 결함 rAaeDV vivo에서 RNA 배달은 쉽게 플라스 미드 건설의 이점 및 생성할 수 있는 기능 바이러스의 유지 보수를 보고 야생 형 바이러스에 대 한 필요 없이 호스트 세포에 안정적이 고 장기적인 식입니다. 또한이 메서드는 애벌레의 쉬운 변환에 대 한 수 있습니다.
다음 단계에 대 한 프로토콜은이 연구에서 설명 하는: 1) rAaeDVs 인코딩 intronic 작은 RNA 식 카세트, C6/36 포장 셀을 사용 하 여 재조합 바이러스 입자의 2) 생산의 디자인 라인, 셀 무료의 3) 정량 분석 rAaeDV 게놈 숫자, 및 4 복사) Ae albopictus 애벌레 애벌레 서식 지의 물 몸으로 바이러스의 직접 소개에 의해의 감염. 전반적으로,이 작품에는 특정 작은 RNAs 또는 대상 유전자 overexpressed 하거나 수 개발된 MDV 전달 시스템을 사용 하 여 모기 애벌레에 뜨 시연 했다.

<table><tbody><tr><td>원심분리기 기계</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004260</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 시스템</td><td>Beckman Coulter</td><td>363118</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET 겔 추출 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0691</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. 플라스미드 미디 키트</td><td>Omega Biotech</td><td>D6904</td><td></td></tr><tr><td>정제 한천</td><td>OXOID</td><td>LP0028A</td><td></td></tr><tr><td>FastAP 감열성 알칼리 포스파타아제(1 U/&micro; L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest HpaI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD1034</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest XbaI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0684</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase (5 U/&micro; L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>TransStbl3 화학적으로 유능한 세포</td><td>베이징 Transgen Biotech</td><td>CD521-01</td><td></td></tr><tr><td>암피실린&nbsp;</td><td>Beijing Tiangen Biotech</td><td>RT501</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Promega</td><td>MC5008</td><td></td></tr><tr><td>SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)</td><td>베이징 Tiangen Biotech</td><td>FP205</td><td></td></tr></tbody></table>

모기 유 충에서 유전자의 기능 분석에 대 한 유전자 납품 벡터로 재조합 모기 densovirus의 사용

Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae

Vivo에서 microinjection 개별 모기의 유전자 기능 분석을 위한 가장 일반적으로 사용 되 진 전송 기술입니다. 그러나,이 방법을 기술적으로 요구 하는 작업이 더 필요 하 고 그들의 작은 크기, 상대적으로 얇고 깨지기 쉬운 표 피 및 높은 사망률, 그것의 응용 프로그램을 제한 하는 애벌레에서 사용 하는 경우에 특히 복잡 한 절차를 포함. 반면, 유전자 배달에 대 한 바이러스 성 벡터 extracellular와 세포 장벽을 극복 하 개발 되었습니다. 이러한 시스템 쉬운 조작, 높은 유전자 전달 효율, 유전자 발현의 장기적인 유지 관리 및 영구 효과 vivo에서생산 하는 것의 이점이 있다. 모기 densoviruses (MDVs)는 효과적으로 모기 세포;로 외국 핵 산을 제공할 수 있는 모기 관련, 작은 단일 가닥 DNA 바이러스 그러나, 교체 또는 일반적으로 재조합 바이러스를 만드는 외국 유전자의 삽입으로 배달 벡터가이 바이러스의 개발에 장애가 포장 또는 복제 능력의 손실을 발생 합니다.
여기, 우리가 아닌 결함 재조합 Aedes aegypti densovirus (AaeDV) vivo에서 전달 시스템을 개발 하는 인공 intronic 작은 RNA 식 전략을 사용 하 여 보고 합니다. 건설, 포장 및 rAaeDV 벡터의 정량 분석 그리고 애벌레 감염에 대 한 자세한 절차를 설명 합니다.
이 학문은 설명 한다, 처음으로 비 결함 재조합 MDV 마이크로 RNA (miRNA) 식 시스템 개발, 따라서 모기에서 유전자의 기능 분석을 위한 강력한 도구를 제공 하 고 기본 설정의 타당성은 모기 품 어진 질병을 제어 하기 위한 바이러스 paratransgenesis의 응용 프로그램. 우리는 Aedes albopictus 1세인트 탈피 애벌레 감염 될 수 쉽게 그리고 효과적으로 사이트를 사육 하는 애벌레의 물 본문에 바이러스를 도입 하 여와 개발된 rAaeDVs overexpress 또는 노크 하는 데 사용 될 수 입증 된 유전자 모기의 기능 분석을 위한 도구를 제공 하는 유 충에 특정 대상 유전자의 표현.

RAaeDV 건설을 위한 전략 결함이 rAaeDV 벡터 모기 애벌레에 DsRed 유전자를 표현 하기 위해 생성 되었습니다. 결과 플라스 미드 부사장 단백질 삭제 (그림 1A) 함께 NS1 DsRed 융합 단백질 카세트를 포함. rAaeDV 미르에 대 한 식 구문을 포함 하는 플라스 미드, 미르 스폰지, shRNA 및 amiRNA 설계 되었습니다 ( 그림 1B참조). 예를 들어 rAaeDV 벡터 모기 애벌레에 있는 aal-하자-7 overexpress 생성 했다. 결과 플라스 미드 바이러스 NS1 exon (그림 1B)에서 intronic 사전-aal-하자-7 카세트 포함. RAaeDV 벡...

우리는 비 결함 재조합 Aedes aegypti densovirus (AaeDV) vivo에서 전달 시스템을 개발 하는 인공 intronic 작은 RNA 식 전략을 사용 하 여 보고 합니다. 건설, 포장, 및 애벌레 감염에 관해서는 뿐만 아니라 rAaeDV 벡터의 정량 분석에 대 한 자세한 절차를 설명 합니다.

모기 유 충에서 유전자의 기능 분석에 대 한 유전자 납품 벡터로 재조합 모기 Densovirus의 사용

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method ...

본 절차의 전반적인 목표는 재조합 모기 덴소바이러스를 유전자 전달체로 사용하여 모기 유충의 유전자 기능을 분석하는 것입니다. 이 방법은 관련 세포 외 및 세포 내 장벽을 극복하는 방법과 같이 바이러스 기반 전달 시스템의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이러한 기술의 주요 장점은 조작이 쉽고, 형질전환 효율이 높으며, 발현이 장기적이고 강력하고, 생체 내(in vivo)에서 지속적인 효과를 생성할 수 있다는 점입니다.본 연구는 개발된 덴소바이러스(densovirus) 전달 시스템을 이용하여 모기 유충에서 특정 소형 RNA 또는 표적 유전자를 과발현시키거나 넉다운(knock down)할 수 있음을 입증하였습니다. 이 기술은 유충의 형질 도입을 용이하게 하므로, 설명된 발현 전략을 모기 생물학 연구에 적용하여 그 활용 범위를 확장할 수 있습니다. 해당 실험 절차의 시연은 저희 연구실의 박사 과정 후보자인 Pei-Wen Liu가 진행하겠습니다.함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로, 전구체 miRNA, miRNA 스펀지 및 shRNA의 전체 길이 cDNA 서열에 대한 화학적 합성을 주문하는 것으로 시작하십시오. 주문한 DNA를 수령한 후, DNA 블록이 포함된 튜브를 원심분리하여 건조된 DNA가 모두 튜브 바닥에 모이도록 합니다. 그런 다음, DNase-free water로 DNA를 재현탁하여 최종 농도를 10 nanograms per microliter로 맞추십시오.플라스미드 백본과 cDNA 서열을 절단하기 위해 XbaI 6 µL를 첨가하고, 반응물을 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후, 제조사의 지침에 따라 송아지 장 유래 알칼리성 인산가수분해효소(calf-intestinal alkaline phosphatase)를 사용하여 선형화된 플라스미드 백본의 5' 말단을 탈인산화합니다. 효율적인 패키징을 위해 게놈 크기는 야생형 모기 densovirus 게놈 길이의 110%에 해당하는 4,400 nucleotide를 초과해서는 안 되며, 또는 400 nucleotide 이하의 인트론성 microRNA 발현 서열을 Aedes aegypti 게놈에 도입할 수 있습니다.다음으로, 65°C에서 알칼리성 포스파타아제를 열불활성화합니다. 그 후, 1% 아가로스 겔에서 DNA를 전기영동하고 선형화된 백본을 절단합니다. 제조사의 지침에 따라 겔 추출 키트를 사용하여 겔 조각에서 DNA를 추출합니다.추출된 DNA 단편을 T4 DNA ligase를 사용하여 백본에 결찰합니다. 그런 다음, 열 충격법을 이용하여 결찰 반응 생성물을 컴피턴트 DH5-alpha E.coli 세포에 형질전환시킵니다. 형질전환된 박테리아를 100 micrograms per milliliter의 ampicillin이 함유된 LB agar 플레이트에 도말합니다.다음 날, 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고, 100 µg/mL의 ampicillin이 포함된 3 mL의 강화 배지를 사용하여 스타터 배양액을 만듭니다. 마지막으로, 제조사의 지침에 따라 miniprep 키트를 사용하여 박테리아 배양액에서 플라스미드 DNA를 추출합니다. 확인을 위해 DNA 샘플을 DNA 시퀀싱 업체로 보냅니다.인공 인트론 소형 RNA 발현 카세트에 대해 설명한 방법을 사용하여, pUCA 플라스미드 백본의 AaeDV NS1 코딩 영역 내 HpaI 부위에 pre-miRNA 또는 shRNA를 결찰합니다. DH5-alpha 세포 대신 Stbl3 컴피턴트 E.coli 세포에 DNA를 형질전환합니다. 그 다음, 형질전환된 세포를 100 micrograms per milliliter의 ampicillin이 포함된 LB agar 플레이트에 도말하고, 양성 클론으로부터 스타터 배양액을 준비합니다. 이후, 제조사의 지침에 따라 maxiprep 키트를 사용하여 박테리아 세포로부터 rAaeDV 플라스미드를 추출합니다.0일 차에, 90~95% 합류도(confluence)에 도달한 C6/36 세포 플라스크를 1:2 비율로 나누어 10개의 T-25 배양 플라스크에 분주합니다. 플라스크를 28°C에서 18~20시간 동안 배양하여 다시 90~95% 합류도에 도달하게 합니다.1일 차에 생성된 rAaeDV 플라스미드를 세포에 형질전환합니다. 이를 위해 10 µg의 DNA를 600 µL의 RPMI-1640 배지에 희석하고 용액을 부드럽게 섞습니다. 동시에 형질전환 1회당 600 µL의 RPMI-1640 배지와 25 µL의 형질전환 시약을 준비합니다.세포를 DNA와 함께 실온에서 5~10분 동안 배양합니다. 그다음, 플라스미드 DNA 혼합물에 RPMI-1640 형질전환 시약 혼합물 625 µL를 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 20~30분 동안 배양합니다. 배양 후, 세포를 RPMI-1640 배지로 두 번 세척한 다음, 각 T-25 배양 플라스크에 형질전환 혼합물을 첨가합니다.세포를 transfection 혼합물에 넣고 28°C에서 6시간 동안 배양합니다. 6시간 후, transfection 배지를 제거하고 5mL의 RPMI-1640 배지로 세포를 두 번 세척한 다음, 10% FBS가 함유된 신선한 RPMI-1640 배지를 추가합니다. transfection 5일 후, 5mL 유리 드롭퍼를 사용하여 배양액으로 피펫팅을 반복함으로써 디쉬 내의 세포를 떼어내어 현탁시킵니다.각 플라스크의 세포 현탁액을 각각의 멸균된 50-milliliter 튜브로 옮깁니다. 고역가 의존성 바이러스를 수확하려면 트랜스펙션 후 5일 동안 세포를 배양해야 합니다. 개별 튜브를 -80 °C 또는 드라이아이스-에탄올 배스에서 30분 동안 냉동합니다.그 후, 37 °C에서 빠르게 해동하고, 세포 현탁액을 1분 동안 볼텍싱합니다. 다음으로, 원심분리한 시료에서 상층액을 수집하고 펠렛은 폐기합니다. 그런 다음, 상층액을 0.22 µm 일회용 시린지 필터로 여과합니다.최종 정제된 비리온 스톡을 분주하여 -80 °C에서 보관하십시오. 1차령 A. albopictus 유충 100마리를 탈이온수로 3회 세척합니다. 그런 다음, 유충을 탈이온수 95 mL가 담긴 비커로 옮깁니다.rAaeDV 스톡 5 mL를 첨가하고, 유충을 28 °C에서 24시간 동안 배양합니다. 유충 감염을 성공시키려면, 높은 감염률을 보장하기 위해 유충이 감염 바이러스 입자와 함께 24~36시간 동안 유지되는 것이 필수적입니다. 배양 후, 탈이온수로 유충을 3회 세척한 다음, 유충을 다시 플레이트로 옮깁니다. 유충에게 정기적으로 먹이를 공급합니다. 표준 기술을 사용하여 quantitative PCR 또는 western blot으로 유충 내 표적 유전자 발현 수준을 모니터링합니다.본 예시에서는 과발현을 나타내는 aal-let-7 발현 카세트를 포함하는 재조합 바이러스에 감염된 1령 유충 100마리를 대상으로 내인성 miRNA 발현을 분석하였습니다.anti-let-7 작제물의 효율성이 오른쪽에 제시되어 있으며, 이는 해당 작제물의 넉다운 능력을 강조합니다. rAaeDV 벡터의 V-ATPase mRNA 넉다운 효율을 모니터링하기 위해, 총 100마리의 1령 유충이 서식지 수조에 바이러스를 첨가하는 방식으로 서로 다른 유형의 rAaeDV를 동일한 양으로 처리되었습니다. V-ATPase mRNA 수준은 miRNA를 발현하는 rAaeDV와 인트론성 shRNA를 발현하는 rAaeDV에 의해 상당히 감소되었습니다.본 결과는 결함이 있는 게놈을 가진 모기 덴소바이러스(densovirus)의 한계를 극복하여 외래 유전자를 모기 내로 효율적으로 전달할 수 있는 새로운 패러다임인 인트론 발현 전략을 입증합니다. 이 절차를 수행할 때, 400 nt 이하의 인트론 마이크로RNA(microRNA) 발현 카세트만이 Aedes aegypti 덴소바이러스 게놈에 삽입될 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 이후 이 기술은 모기 유전자의 기능 분석을 위해 마이크로RNA 및 표적 유전자를 과발현하거나 억제할 수 있는 비결함 재조합 모기 덴소바이러스 생산 연구의 길을 열었습니다.이 영상을 시청하고 나면, 개발된 모기 덴소바이러스 전달 시스템을 사용하여 모기 유충의 유전자 기능을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

역방향 유전자 접근 방법은 모기에 벡터 병원균하는 유전자 underly 저항을 결정하는 매우 유용하게 입증했습니다. 이 비디오 프로토콜은 뎅그열 바이러스를 항구 여성 A. aegypti 모기로 dsRNA를 주입하기 위해 제임스 연구실에서 사용하는 방법을 보여줍니다. , 주사 바늘을 보정 사출 설정을 조작하고, 흉부에 dsRNA를 주입에 대한 기술은 그림이다.

여성 A. aegypti 모기에의 dsRNA의 분사

역방향 유전자 접근 방법은 모기에 벡터 병원균하는 유전자 underly 저항을 결정하는 매우 유용하게 입증했습니다. 이 비디오 프로토콜은 말라리아 기생충을 항구 아노 펠 레스 모기 gambiae로 dsRNA를 주입하기 위해 Dimo​​poulos 연구실에서 사용하는 방법을 보여줍니다. 사출 설정을 조작하고 흉부에 dsRNA를 주입 기술은 그림이다.

성인 모기 (A. gambiae)에서 RNAi의 Assays을위한 프로토콜

이 인터뷰에서, 조지는 Plasmodium falciparum Dimo​​poulos 및 뎅그열 바이러스 감염을 방지하기 위해 모기에 의해 사용되는 생리적 메커니즘에 초점을 맞추고 있습니다. 설명이 방법은 주요 내화물 유전자에 대해 제공됩니다, 벡터 병원균에 대한 저항력을 부여하는 그 유전자는, 모기에 식별 방법과이 지식은 말라리아 기생충이나 뎅그열 바이러스를 가지고 수없는 유전자 변형 모기를 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

더 나은 모스키토 구축 : A. gambiae 및 A. aegypti 모기에 말라리아와 뎅그열 발열 저항을 사용 유전자를 확인

Oligonucleotides은 특히 모두 transfected 대상 유전자의 단일 염기 대체 사이트로 사용할 수...

옥내 핵산 - 수정 Oligonucleotides에 의해 Transfection 및 모기 세포 대상 유전자의 돌연변이 유발

이 프로토콜에서 우리는 함께 RNAi - 중재 유전자 입을를...

RNAi - 중재 유전자 최저 및<em&gt; VIVO에서</em성인 여자의&gt; 이뇨 분석<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; 모기

Source: Liu, P., et al. Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the process of isolating recombinant Aedes aegypti densovirus (rAaeDV) from infected mosquito-derived epithelial cells. The infected cells are collected and exposed to repeated freeze-thaw cycles for lysis. Lysate is centrifuged, and the supernatant containing viral particles is filtered, aliquoted, and...

Harvesting Recombinant Aedes aegypti Densovirus from Infected Cells

이 비디오에서는 배아 미세주입 기술을 통해 Anopheles gambiae 모기의 배아에 유전자 드라이브 구조를 전달하는 방법을 보여줍니다. 이 절차를 통해 상동 재조합을 통해 전달된 DNA 구조를 생식세포 세포에 통합하여 형질전환된 모기 개체군을 생성할 수 있습니다.

모기 배아 미세주입: 생식세포 돌연변이를 생성하기 위해 Anopheles gambiae의 배아 난황에 외인성 DNA를 전달하는 기술

여기서 우리는 유충 섭취 RNA 나노 입자 / 키토산의 사용을 통해 질병 벡터 모기 유전자 기능을 억제 간섭하는 절차를 설명한다.

질병 벡터 모기 유충의 키토산 / 간섭 RNA 나노 입자 중재 유전자 음소거

RNA interference (RNAi)는 유전자 기능을 밝히는 데 매우 유용한 도구입니다. 그러나 성체 이전 단계에서 RNAi를 사용하여 유전자를 표적으로 하는 능력은 주요 인간 말라리아 매개체인 Anopheles gambiae에서 제한됩니다. 번데기 발달 중 직접 주입을 통해 유전자 기능을 감소시키는 RNAi 프로토콜에 대해 설명합니다.

에 RNAi의 트리거 배달<em&gt; 아노 펠 레스 gambiae</em&gt; 번데기

이 프로토콜 우리가 표준화 하 고 몇 년 동안 모기와 집 파리의 hemolymph를 직접 핵 산의 특정 수량을 제공 하는 데 사용 하는 microinjection 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜 최소 주입 죽음 귀착되 고 통치의 복용량 상관 측정을 허용 한다.

재현할 수 dsRNA Microinjection 및 산란 검정 집 파리 모기에

이 양파르트 갈4-UAS 시스템은 Anopheles 감비아에서 기능성 유전 분석을 허용하는 제어된 스파티오 측량 방식으로 유전자 발현을 수정하기 위한 다목적 도구입니다. 이 시스템을 사용하기 위해 설명된 절차는 형광 단백질 마커 및 배아 고정을 위한 pupae의 반 표준화된 복제 전략, 섹스링 및 검열입니다.

Anopheles 감비아에서 기능 유전학을 위한 GAL4-UAS 시스템을 이용하십시오

배우세요 모기 유충에서 유전자 기능 분석을 위한 재조합 Aedes aegypti 덴소바이러스 유전자 전달 시스템을 사용하는 방법을. 이 기술은 높은 전달 효율과 장기적인 유전자 발현 조절을 가능하게 하여 모기 생물학 연구에 활용됩니다.

모기 유 충에서 유전자의 기능 분석에 대 한 유전자 납품 벡터로 재조합 모기 Densovirus의 사용

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