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DOI: 10.3791/56128-v
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
This study presents a cost-effective method for inducing mechanical injury to segmental nerves in Drosophila larvae, allowing for visualization and quantification of neurodegeneration at the neuromuscular junction (NMJ). By utilizing this approach, researchers can investigate the cellular events associated with neurodegeneration, providing crucial insights into the underlying mechanisms of neuronal injury.
여기에 우리는 세 번째 instar 애벌레의 neuromuscular 접합 (NMJ)에서 모터 뉴런의 신경 퇴화를 시각화하고 계량하기 위해 초파리 유충의 분절 신경을 손상시키는 간단하고 널리 액세스 할 수있는 방법을 설명합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 초파리 유충에서 운동 뉴런의 기계적 손상을 유도하는 것입니다. 이 방법은 신경 퇴행으로 이어지는 세포 이벤트의 시간적 순서와 같은 신경 퇴행성 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 저렴하고 대부분의 초파리 실험실에서 이미 보유하고 있는 장비를 사용한다는 것입니다.
이 기술의 의미는 신경 퇴행을 유발하는 분자 메커니즘에 대한 이해로 확장됩니다. 프로토콜을 시작하려면 섭씨 25도에서 배양된 떠돌이 세 번째 instar 유충이 들어 있는 초파리 바이알 또는 병에서 두 번째 또는 세 번째 instar 유충 10개를 선택합니다. 집게를 사용하여 집게나 붓으로 개별 유충을 압축하지 않고 조심스럽게 집습니다.
차가운 1x PBS가 들어 있는 유리 접시에 10마리의 유충을 직접 넣어 음식물 찌꺼기를 제거하고 유충의 운동을 늦춥니다. 세 번째 instar 유충은 앞쪽 가지 첨탑으로 식별하고 두 번째 instar 유충은 더 작은 크기와 곤봉 모양의 앞쪽 첨탑으로 식별합니다. 각 유충을 CO2 마취 장치에 놓습니다.
해부 현미경으로 각 유충을 조심스럽게 등쪽으로 굴려 큐티클 전체의 분절 신경을 시각화합니다. 상처를 입기 전에 큐티클을 통해 분절 신경을 시각화하기 위해 각 유충을 등쪽으로 조심스럽게 굴리는 것이 중요합니다. 입 고리에서 시작하여 애벌레 길이의 약 1/2에서 2/3 지점에 집게 크기를 조절합니다.
일단 위치를 잡으면 앞두부 크기가 5인 분절 신경을 포함하는 복부 표피의 약 1/3을 꼬집습니다. 유충의 분절 신경이 손상되지 않도록 하려면 분절 신경을 부술 수 있을 만큼 충분한 힘을 가하되 큐티클은 그대로 두십시오. 정확한 힘의 양을 결정하려면 10 마리의 유충을 부수고 5 시간 후 사망률이 50 % 미만이되도록하십시오.부상 후 유충을 약 0.5g의 효모 페이스트가 들어있는 과일 주스 한천 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다.
각 유충을 배치하여 앞쪽 끝이 효모 페이스트에 오도록 하여 계속 먹이를 줍니다. 효모 페이스트와 부상당한 유충 10마리가 들어 있는 한천 플레이트를 100 x 15mm의 빈 페트리 접시 바닥에 놓습니다. 페트리 접시를 젖은 종이 타월로 덮고 종이 타월이 유충이나 한천 플레이트에 닿지 않도록 합니다.
그런 다음 페트리 접시를 실온의 밀폐 용기에 넣습니다. 마지막으로, 부상 후 지정된 기간이 지난 후 해부를 위해 유충을 회수합니다. 부상 전, 야생형 신경근 연접(Wild-type neuromuscular junctions, NMJ)은 전체 NMJ에 걸쳐 시냅스후 마커 Dlg에 인접한 시냅스전 활성 영역 마커 Brp를 보여줍니다.
분절 신경의 기계적 손상은 중등도에서 중증의 신경 퇴행을 유발할 수 있으며, Dlg로 염색된 부톤에는 현재 시냅스전 활성 영역 단백질인 Brp가 결핍되어 있습니다. 개발 후, 이 기술은 신경 세포 손상을 연구하는 연구자들이 초파리의 신경근 접합부에서 신경 퇴행으로 이어지는 세포 사건의 시간적 순서를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.
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