Name: 제자리에서 MHC tetramer 얼룩 및 정량 분석 위치, 풍부, 및 조직에서 항 원 특정 CD8 T 세포의 표현 형을 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 배우세요 제자리 MHC tetramer 염색 및 면역조직화학을 활용하여 조직 내 항원 특이 CD8 T 세포의 위치, 풍부함, 표현형을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 면역 반응 연구에 필수적입니다.

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1. 주 1: 신선한 조직 단면 및 기본 보육 <ol><li>메스를 사용 하 여 신선한 조직 (약 0.5 c m 폭 0.5 c m 키 큰) 작은 조각으로 잘라. 별도로 플런저를 각 조직 접착제 그리고 PBS에 4% 낮은 용융 agarose의 3-5 mL를 포함. 스티커를 사용 하 여 조직 정보와 플런저를 레이블을 지정 합니다. 공고히 하는 얼음 양동이에 냉장된 홀더에 넣어요.</li>
	<li>톰 및 설정 섹션을 200 µ m. 설치 톰 삽입 플런저에 면도날의 두께 톰 목욕에 조직으로 탑재.</li>
	<li>100 µ g/mL 또는 18.7 U/mL 헤 파 린 PBS RNA를 보존 하 고 하류 잠재적인 틱 응용 프로그램 허용에 추가 하 여 헤 파 린 (PBS-H)에 식 염 수 인산 염 버퍼를 준비 합니다. 덮고 냉장, 무 균 PBS.의 100-120 mL와 함께 포함 된 조직, 톰 목욕을 채우기 0-에 온도 유지 하기 위해 목욕을 PBS-H 아이스 큐브를 추가 2 ° C. 시작은 톰와 200 µ m 섹션으로 조직. 
	참고: 그것은 조직에서 조직 내의 세포 활동을 최소화 하기 위해 얼음에 냉장을 유지 하는 것이 중요 때 냉장은 신선한 조직 섹션에 쉽게 때문에 고. 다운스트림 흉내만 대 한 계획이 없습니다 경우 혼자 PBS를 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>또는 조직 (예: 창 및 폐), 톰으로 잘 잘라 하지 않는 조직으로 얇은 스트립으로 잘라 메스 또는 면도칼을 사용 200 µ m에 최대한 가까이.</li>
	<li>실험 샘플 정보 24-잘 조직 배양 접시의 뚜껑을 분류 하 고 해당 우물에서 조직 실 장소. 조직 약 실에는 섹션을 전송 하는 붓의 1 mL를 포함 하는 24-잘 조직 배양 접시의 우물에 설정 사용 냉장 PBS. 
	참고: 재사용 가능한 조직 챔버는 얼룩 시작 전에 여야 한다. 조직 실 14 mL 폴 리 프로필 렌 라운드 하단 스냅 캡 튜브를 사용 하 여 만들 수 있습니다 하 고 와이어 메쉬. 날카로운 면도칼 블레이드를 사용 하 여 14 mL 폴 리 프로필 렌 라운드 하단 스냅 캡 튜브의 바닥을 잘라. 튜브의 아래쪽에 있는 구멍에 맞게 원형에서 철 망을 잘라. 열 새 빨갛게 될 때까지 분 젠 버너를 사용 하 여 와이어 메쉬 원. 매우 신속 하 게 와이어 메쉬 원 뜨 고 메쉬에 튜브를 밀어. 와이어 메쉬는 튜브의 하단에 단단히 부착 하 고 다음에 날카로운 면도칼 블레이드를 사용 하 여 3 mL 마크 튜브의 상단을 신중 하 게 차단 확인 하십시오. 각 조직 챔버, 또는 잘 당 조직의 1 c m 2까지 3 조직 단면도 넣어. 교차 오염을 피하기 위해 서로 다른 항 체 조합 우물 사이의 하나 이상의 빈 잘 유지.</li>
	<li>진행 기본 tetramer와 항 체 조직 챔버로 모든 컷된 섹션의 전송 완료 후 즉시 얼룩. 섹션 빠져들, PBS-H의 1 mL에 항상 냉장 보관.</li>
	<li>0.5 µ g/mL FITC 활용, 펩 티 드 로드 MHC와 하룻밤 조직 단면도 품 어-난 tetramers 2% 정상 염소 혈 청 (NGS) PBS-H에 희석. 마우스 또는 다른 비 토끼 항 체가이 외피의 extracellular epitopes에 포함 (예: 쥐 안티 CD8 항 체 희석 2%와 PBS-h에서 1: 500 NGS). 각 잘에서 희석된 항 체의 1 mL를 배치. 
	참고: 한다 주의 일부 향상 및 일부 MHC tetramers T 세포 수용 체 4 , 21을 억제할 수 있는으로 CD8 항 체를 선택할 때. 쥐 안티 인간 CD8 항 체 여기에 설명 된 불안정 하 고 때로는 다소 약한 얼룩에 결과. 여기에 트리플 라벨 때문에 유일한 비 토끼와 비 마우스 CD8 항 체 테스트 그 얼룩진된 붉은 털 원숭이 CD8 T 세포에 대 한 사용 됩니다.</li>
	<li>잘 당 솔루션의 1 mL를 사용 하 여 1 차적인 항 체 및 모든 후속 외피와 수행이 락 플랫폼에 접시와 4 ° C에서 모든 후속 외피. 
	참고: 조직 해야 플 로트 자유롭게 챔버에.</li>
</ol> 2. 주 2: 고정 및 보조 보육 <ol><li>기본 부 화 후 씻어 냉장된 PBS-H 20 분의 1 mL로 두 번 섹션 각 세척. 조직 실 냉장된 PBS-H 해당 우물의 1 mL를 포함 하는 다른 24-잘 조직 문화 접시에 전송 하 여이 작업을 수행. 
	참고: 수 조직 챔버 사이 이동할 때 다른 한 실험 샘플에서 내용을 똑 하지 않도록 주의 하십시오. 모든 후속 외피와 세척, 마찬가지로 적절 한 솔루션을 포함 하는 깨끗 한 접시에 조직 챔버를 전송 합니다. 조직 실에 섹션에서 섹션 조직 챔버의 측면에 붙어 얻을 할 다는 것을 확인 하는 절차 동안 모니터링 해야 합니다. 그들은 솔루션에 다시 그들을 밀어, 경우.</li>
	<li>신선한 PBS 버퍼링 4 %paraformaldehyde 실 온에서 2 h의 1 mL와 섹션 수정 (않는 이상 해결 되지). 차가운 PBS-h 5 분에 두 번 세척 
	주의: Paraformaldehyde은 독성; 적절 한 개인 보호 장비를 착용. 
	참고: 항 원 복구 및 permeabilization 세포내 epitopes를 감지 해야, 항 검색할 수 있습니다 paraformaldehyde 고정 후 0.01 mol 요소에 섹션을 끓는.</li>
	<li>0.01 mol 요소를 포함 하는 24-잘 배양 배지로 섹션을 전송 하 고 렌지에이 접시를 놓습니다. 3 번 약 10 대 한 섹션을 삶아 s 30의 총 각, s. 
	참고: 매우 조심, 비등으로 솔루션 우물에서 섹션을 강제로 수 있습니다. 이 경우를 사용 하 여 그림 붓 섹션 조직 챔버의 측면에서 또는 접시의 뚜껑에서 다시 적절 한 조직 챔버의 바닥에.</li>
	<li>이전 이차 항 체 외피를 permeabilize 및 PBS-H, 0.3% 세제 (PBS-H-T), 그리고 2% 차단 솔루션에 그들을 배양 하 여 조직 단면도 차단 1 h와 4 ° C. 수행 후속 항 체 외피에 대 한 로커에 NGS PBS-H-T/2% NGS.</li>
	<li>보조 부 화에 대 한 전송 조직 실에서 섹션 PBS-H-T/2% NGS에 토끼 안티 FITC 항 체 희석 1:10,000를 포함 하는 우물. 밤새 품 어.</li>
	<li>수행 counterstaining 사용 하 여 마우스 안티-CD20 항 체 희석 PBS-H-T/2% NGS에서 1: 200. 이 옵션에 대 한 검색에서 epitopes 필요한 경우, 셀, 침투 및 위에서 설명한 대로이 부 화 하기 전에 차단.</li>
</ol> 3. 제 3 일: 3 차 인큐베이션 <ol><li>두 번째 부 화 후 20 분 이상 4 ° C에서 PBS-H에 세 번 섹션을 씻어</li>
	<li>붙일 표시 (예, 염소 안티 토끼 활용 된 염소 반대로 쥐 활용된까지 붉은 염료, 녹색 노란색과 염소 반대로 마우스 활용된 녹색 염료 항 체 희석된 1:5, 000, 항 체와 적절 한 최종 부 화 수행 1:5, 000, 그리고 1:2, 000, PBS-H-T/2% NGS에 각각,). 밤새 품 어. 
	참고:이 시점에서,는 인큐베이션 확장할 수 있습니다 최대 3 일 동안 필요한 경우. 섹션을이 incu 동안 판 틴 호 일에 감싸서 빛 으로부터 보호 유지bation 단계 이후, 빛 냉각 fluorophores.</li>
</ol> 4. 제 4 일: 장착 섹션 <ol><li>세척 섹션 3 회 PBS-H에 20 분 이상 
	참고: 다운스트림 분 19에 대 한 계획, tetramers 및 장소에서 항 체를 확보 하 고 다음 두 번으로 PBS-5 분에 대 한 섹션을 씻어 1 시간에 대 한 4 %paraformaldehyde 섹션 수정. 
	주의: Paraformaldehyde은 독성; 적절 한 개인 보호 장비를 착용.</li>
	<li>는 현미경 슬라이드를 섹션을 전송 하는 붓을 사용 합니다. 조직을 너무 많이 찌 르 지 않기로 조심. 글리세롤/젤라틴 포함 4 mg/mL n 틸 gallate 또는 fluorophore 방부 제를 포함 하는 다른 설치 매체와 함께 각 섹션을 코트. 커버는 coverslip로.</li>
	<li>-20에서 슬라이드 빛 보호 컨테이너에 슬라이드를 저장 ° C. 조직 문화 접시를 헹 구 고 알코올을 사용 하 여 뚜껑에 레이블을 제거. 
	참고: 접시를 다시 사용할 수 있습니다.</li>
</ol> 5. Confocal 현미경 이미지의 수집 <ol><li>confocal 현미경, 각 fluorophore ( 그림 1A와 B)에 대 한 적절 한 레이저와 필터를 사용 하 여 고해상도 이미지를 캡처. 
	참고:이 예제에서는 confocal 현미경 사용 되었다 (재료의 표 참조). 이미지는 녹색 노란색 표시 된 항 원 특정 T 세포, 녹색 표시 CD20 표현 B 셀, 10% 전력에서 488 nm 레이저와 CD8 T 세포까지 붉은 표시에 대 한 15% 전력에서 640 nm 레이저에 대 한 20% 전력에서 561 nm 레이저를 사용 하 여 수집 되었다. 목표와 0.8의 숫자 조리개 X 20을 사용 했다.</li>
	<li>는 순차적으로 여러 800 x 800 픽셀 분야에서 3 개의 채널 간격으로 z-시리즈 3 µ m (또는 다른)를 수집합니다. 수집 된 필드의 몽타주 구성 ( 그림 1C -E). 해당 슬라이드의 정보에 따라 각 몽타주 이미지 이름을 지정 하 고 분석을 위해 저장.</li>
	<li>양적 이미지 분석 각각 confocal 현미경 분석 및 정량화 소프트웨어를 사용 하 여 또는 ImageJ를 사용 하 여 수행.</li>
</ol> 6. 양적 이미지 분석 참고: 양적 이미지 분석 confocal 현미경 분석 및 정량화 소프트웨어를 사용 하 여 수행할 수 있습니다 또는 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여. 여기, ImageJ 예제로 사용 되었습니다.
ImageJ 창 ( 그림 2A)에 그것을 드래그 하 여 <ol>는 confocal <li>오픈 몽타주. 
	참고: ImageJ 직접 많은 다른 confocal 현미경에 의해 수집 된 몽타주를 열 수 있습니다. 몽타주 ImageJ에서 직접 열 수 없습니다, 선택한 z-스캔 그것을 열려면 TIFF 파일로 내보냅니다</li>
	<li>선택한 z-검색 분석에 대 한 복제 (&#34; 이미지 &#34;-&#62; &#34; 복제 &#34;) ( 그림 2B).</li>
	<li>다른 채널 분할 (&#34; 이미지 &#34;-&#62; &#34; 색상 &#34;-&#62; &#34; 분할 채널 &#34;) ( 그림 2C).</li>
	<li>객관적 눌러 ROI 관리자에 그것을 추가 하는 해당 채널에서 정량 분석에 대 한 투자 수익을 그릴 &#34; T &#34; 키보드에. 면적 측정. 
	참고: ImageJ의 ROI 관리자에서는 지역 µ m 2 ( 그림 2D).</li>
	<li>형광 밝기 및 대비의 분석 채널을 조정 (&#34; 이미지 &#34;-&#62; &#34; 조정 &#34;-&#62; &#34; 밝기/대비 &#34;) ( 그림 2E).</li>
	<li>평평 이미지에 ROI (&#34; ROI 관리자 &#34;-&#62; &#34; 결합 &#34;) ( 그림 2F).</li>
	<li>계량 사용 하 여 이미지에 긍정적인 세포는 &#34; 다 지점 &#34; 도구 ( 그림 2G).</li>
</ol>

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</ol>

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인도 표준시 IHC와 결합 감지, 특성화, 및 항 원 특정 CD8 T 세포 다른 셀 및 조직 구조는 컨텍스트 네이티브 환경에서 측정을 위한 필수적인 도구를 제공 합니다. 여기, 우리는 인도 표준시 IHC, 이어서 양적 이미지 분석, 위치, 풍요, 붉은 털 원숭이에서 림프절에 항 원 특정 CD8 T 세포의 표현 형을 결정을 함께 결합에 대 한 자세한 절차를 설명 합니다. 적용된 인간, 마우스, 또는 어떤 MHC에 대 한 다른 종 조직 수 비슷한 얼룩-내가 tetramers 사용할 수 있습니다. 또한, 펩 티 드 MHC 종류 II tetramer 또는 dextramer 얼룩 수행할 수 있습니다 상대적으로 비슷한 방법론을 사용 하 여 조직4,,56,7, 항 원 특정 CD4 T 세포를 <s...

T 세포는 감지 및 바이러스에 감염 된 세포를 제거, 면역을 방지, B-세포 및 플라스마 세포 생산의 항 체, 그리고 감지 하 고 암 세포를 제거에 도움을 포함 하 여 많은 면역학 프로세스에 중요 합니다. 펩 티 드/MHC의 개발 종류 I 항 원 특정의 얼룩 CD8 T 세포1 와 MHC 클래스 II tetramer 얼룩이 지기의 CD4 T 세포2 의 cytometry로 최근 개발에 우리의 능력을 연구 하 고 이해 혁명 tetramer는 T 세포의 immunobiology입니다. 수량 및 항 원 특정 T 세포의 표현 형을 결정 하는 데 매우 유용한, cytometry 다른 세포와 조직, 그리고 현재 구조에 항 원 특정 T 세포의 공간 지 방화의 검출에 대 한 허용 하지 않습니다. T 세포를 추출 하는 피의 기술 필요한 cytometry에 제한 했다 비 림프 조직3에 효과.
우리와 다른 펩 티 드 로드 MHC 클래스 I 및 클래스 II tetramer 또는 multimer 시 약 조직4,,56,7, 항 원 특정 CD8와 CD4 T 세포 얼룩 사용 방법이 개발 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13.이 IST 메서드 위치, 풍부, 및 조직에서 항 원 특정 CD8와 CD4 T 세포의 표현 형의 결정에 대 한 허용 및 다른 세포와 조직에 구조 세포를 감지 하는 수단을 제공. 우리의 그룹은 광범위 하 게 사용 하는 MHC-나 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 연구-유인원 면역 결핍 바이러스 (SIV)-얼룩 tetramer HIV와 SIV immunopathogenesis의 이해를 얻기 위해 림프, 생식 기, 그리고 직장 조직에서 특정 CD8 T 세포 그리고 성공적인 예방 접종 전략14,15,,1617의 상관 관계를 식별 합니다. 또한, 우리 또한 개발 현장에서 교 잡 (ISH) 지역화 및 바이러스 관련 CD8 T 세포와 바이러스에 감염 된 세포를 계량 IST를 결합 하는 기술 조직에서 그리고 vivo에서 이펙터 대상 수준을 결정 하 18 , 19.
여기, 우리는 MHC 펩 티 드 로드를 사용 하 여 프로토콜을 설명-난 tetramers 얼룩 신선한 조직 섹션에 항 원 특정 CD8 T 세포에 counterstain 조직 IHC를 사용 하 여 특정 조직 구획에서 특정 고기에 포함 된 셀을 계량 하 고. 이 절차는 리 외., 어떤 우리가 결정 위치, 풍부, 및 림프 조직에 SIV 전용 T 세포의 표현 형 원숭이20에서 만성 SIV 감염 시에 의해 우리의 최근 게시물에 사용 된 것과 동일 합니다.
이 절차에 대 한 신선한 조직 구분 되며 MHC 펩 티 드 로드와 하룻밤 incubated-난 tetramers fluorescein 안산 분자 (FITC)에 활용. 그들은 다음 paraformaldehyde에 고정 됩니다. 조직, 고정 후 MHC tetramers에서 신호는 토끼 안티 FITC 항 체를 사용 하 고 붙일 태그-토끼 IgG 항 체, 바인딩된 tetramers에서 신호 증폭을 함께 알을 품을 증폭. IHC는 인도 표준시와 함께에서 항 원 특정 T 세포와 주변 셀을 특성화 하는 데 사용 됩니다. 셀의 또는 세포 외 공간에서 표면에 epitopes를 인식 하는 항 체는 tetramers와 기본 인큐베이션에 포함 됩니다. 세포내 epitopes를 인식 하는 항 체 얼룩이 지기 전에 세포 벽의 침투가 필요 합니다. 얼룩진된 조직 단면도 confocal 현미경을 사용 하 여 몇 군데는 고 confocal 소프트웨어를 사용 하 여 분석. 레이블이 지정 된 셀은 공초점 현미경 소프트웨어 또는 ImageJ를 사용 하 여 정량. 설명된 프로토콜 있는 MHC에 대 한 기본적으로 모든 조직에 항 원 특정 CD8 T 셀 얼룩을 사용할 수 있습니다-난 tetramers 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>MHC-I 단량체</td><td>NIH 테트라머 핵심 시설</td><td></td><td>MHC-테트라머 제제용 재료</td></tr><tr><td>ExtrAvidin-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2716</td><td>MHC-테트라머 제제용 재료</td></tr><tr><td>일반 염소 혈청</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>저용융 아가로스</td><td>Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>헤파린</td><td>시그마-알드리치</td><td></td><td></td>SLBL6391V</tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6878</td><td></td></tr><tr><td>요소</td><td>J.T.Baker</td><td>4204-05</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤 젤라틴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBH2672V</td><td></td></tr><tr><td>n-프로필 갈레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>rat-a-h-CD8 (1:500)</td><td>Acris</td><td>0714</td><td>항체 불안정, 일회용 냉동 분취 사용</td></tr><tr><td>m-a-h-CD20 (1:500)</td><td>NOVOCASTRA</td><td>6026819</td><td></td></tr><tr><td>m-a-h-Ki67 (1:500)</td><td>Vector</td><td>6022201</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-m-A488 (1:2,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>124083</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-rb-Cy3 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>106232</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-rat-Cy5 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>118088</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>86579</td><td></td></tr><tr><td>Compresstome: VF-300 Microtome</td><td>Precisionary Instruments, LLC</td><td>1079</td><td></td></tr><tr><td>Quick Set Instant Adhesive</td><td>Loctite</td><td>46551</td><td></td></tr><tr><td>24-well flat bottomed tissue culture plates</td><td>Falcon</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Globe scienfitic Inc.</td><td>#1321</td><td></td></tr><tr><td>면도기&nbsp; 칼날</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Feather 일회용 메스</td><td>FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD.</td><td>No. 21</td><td></td></tr><tr><td>라운드 붓 #2</td><td>PRINCETON ART & 브러시 CO.</td><td>4350R</td><td>면도기</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>FV10-ASW_Viewer4.0</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr>로 필요에 따라 트리밍 가능</tbody></table>

제자리에서 mhc tetramer 얼룩 및 정량 분석 위치, 풍부, 및 조직에서 항 원 특정 cd8 t 세포의 표현 형을

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

T 세포는 감지 및 바이러스에 감염 된 세포를 제거, 면역을 방지, B-세포 및 플라스마 세포 생산의 항 체, 그리고 감지 하 고 암 세포를 제거에 도움을 포함 하 여 많은 면역학 프로세스에 중요 합니다. Cytometry에 의해 분석 하는 항 원 특정 T 세포의 MHC tetramer 얼룩의 개발은 우리의 능력을 공부 하 고 이해 하는 T 세포의 immunobiology 혁명 있다. 수량 및 항 원 특정 T 세포의 표현 형을 결정 하는 데 매우 유용한, cytometry 다른 세포와 조직, 그리고 현재 피의 기술 구조에 항 원 특정 T 세포의 공간 지역화를 확인할 수 없습니다. T 추출 하 셀 필요 cytometry에 제한 했다 비 림프 조직에 효과. 제자리에서 MHC tetramer 얼룩 (IST) T 세포는 특정 조직에 대 한 관심의 항 원에 대 한 시각화 하는 기술입니다. Immunohistochemistry (IHC)와 함께, 인도 표준시 풍부, 위치, 및 조직에서 항 원 특정 CD8와 CD4 T 세포의 표현 형을 확인할 수 있습니다. 여기, 우리는 얼룩 특정 조직 구획 내에 있는 특정 고기와 항 원 특정 CD8 T 세포를 열거 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이러한 절차는 동일 우리 리 외., 권리에 의해 우리의 최근 게시물에 사용 하는 "낭 CD8에 의해 부분적으로 억제에 유인원 면역 결핍 바이러스 생성 세포+ 세포 에 비보." 그들은 지역화, 표현 형, 하는 데 사용 될 수 있기 때문에 본질적으로 어떤 항 원 특정 CD8 T 세포는 MHC tetramers 사용할 수 있습니다, 어떤 조직에서 계량 설명 하는 방법을 광범위 하 게 적용 됩니다.

그림 1 에 confocal 이미지 공초점 현미경을 사용 하 여 수집 하는 방법을 보여 줍니다. 그림 2 에서는 양적 이미지 분석을 ImageJ를 사용 하 여 보여 줍니다. 그림 3 과 4 대표 이미지는 SIV에서 림프절 조직의 감염 CD20 항 체와 MHC tetramers, CD8 항 체, 얼룩진 붉은 털 원숭이 쇼 그리고 MHC tetramer 얼룩의 특이성을 설명 하기 위해 제공. 그림 3 비교 MHC 종류 I tetramers 펩 티 드 MHC 클래스와 얼룩이 나 같은 조직에서 섹션에 비해 SIV에서 로드 tetramers 로드는 무관 한 펩 티 드. 그림 4 셀 MHC/SIV-펩타이드 te...

여기, 우리가 immunohistochemistry 지역화, 표현 형, 및 조직에서 항 원 특정 T 세포의 양을 결정 하에 현장에서 MHC tetramer 얼룩 결합 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 다른 세포 유형 및 조직 구조 항 원 특정 CD8 T 세포의 공간 및 phenotypic 특성을 결정 하는 데 사용 됩니다.

제자리에서 MHC tetramer 얼룩 및 정량 분석 위치, 풍부, 및 조직에서 항 원 특정 CD8 T 세포의 표현 형을

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

본 절차의 전반적인 목표는 관심 조직 내에서 항원 특이적 CD8 양성 T 세포의 위치, 풍부도 및 표현형을 결정하는 것입니다. 이 방법은 거의 모든 항원 특이적 CD8 T 세포와 모든 조직을 대상으로 위치 확인, 정량화 및 표현형 분석 수단을 제공함으로써 CD8 T 세포에 관한 질문에 신속하게 답할 수 있도록 돕습니다. 이 기술의 주요 장점은 관심 조직 내의 다른 세포 및 구조와 비교하여 항원 특이적 CD8 양성 T 세포의 공간적 분포를 결정할 수 있다는 점입니다.Shengbin Li와 함께 절차를 시연할 사람은 Gwantwa Mwakalundwa입니다. 절차 첫째 날에는 메스를 사용하여 신선한 조직을 약 0.5 x 0.5 centimeter 크기의 조각으로 자릅니다. 여기서는 붉은털원숭이의 비장 조직이 사용되었습니다.각 조직 조각을 플런저 상단 중앙에 각각 접착제로 고정하고, PBS에 희석된 따뜻한 4% low melting agarose 3~5 mL에 샘플을 매립합니다. 플런저에 해당 조직 정보를 표시합니다. 그런 다음, 샘플을 아이스 버킷 안의 냉각 홀더에 넣습니다.한천이 응고되면 마이크로톰의 전원을 켜고 두께 설정을 200마이크로미터로 맞춥니다. 새 면도날을 장착한 후, 플런저를 마이크로톰 배스에 삽입합니다. 마이크로톰 배스에 새로 조제한 PBS-H 100~200밀리리터를 채우고, 온도를 0~2도 사이로 유지하기 위해 PBS-H 얼음 조각을 추가합니다.200 µm 두께의 절편을 얻은 후, 붓을 사용하여 각 절편 주변의 한천을 제거하고, 1 mL의 냉각된 PBS-H가 들어 있는 24웰 조직 배양 플레이트의 개별 웰 내 조직 챔버로 샘플을 옮깁니다. 모든 샘플을 확보하면, 2% normal goat serum가 첨가된 PBS-H에 희석된 1 mL의 fit 결합 펩타이드 로딩 MHC class one tetramer 내에서 조직 절편을 4 °C로 하룻밤 동안 로킹하며 배양합니다. 다음 날 아침, 각 조직 챔버를 1 mL의 신선하고 냉각된 PBS-H가 들어 있는 새로운 24웰 플레이트의 개별 웰로 옮겨 20분 동안 둡니다.두 번째 세척 후, 신선한 4% paraformaldehyde 1 mL에서 상온으로 2시간 동안 절편을 고정합니다. 이어서 차가운 PBS-H로 5분씩 두 번 세척합니다. 0.01 M urea가 담긴 새로운 24웰 플레이트로 절편을 옮기고, urea가 끓을 때까지 약 10초씩 세 번 전자레인지로 가열합니다.샘플의 투과화 및 블로킹을 위해, 0.3% triton x100 세제와 2% normal goat serum이 첨가된 PBS-H 함유 블로킹 용액에 절편을 넣고 4°C의 로커에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후, 조직 챔버를 rabbit anti-fitc 항체, mouse antihuman CD 항체 및 rat antihuman CD3 항체가 포함된 용액 1 mL가 들어 있는 새로운 24 웰 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 샘플을 로킹하며 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.3일 차에, 4°C에서 신선한 PBS-H로 섹션을 3회 세척하며, 각 세척당 최소 20분 동안 수행합니다. 그 후, 적절한 형광 접합 2차 항체와 함께 빛이 차단된 상태에서 최대 3일 동안 최종 배양을 진행합니다. 3차 항체 배양이 끝나면, 신선한 PBS-H로 20분씩 3회 헹구고, 붓을 사용하여 각 조직 챔버에서 샘플을 유리 현미경 슬라이드로 옮깁니다. 각 섹션에 형광 보존제가 첨가된 마운팅 매질을 도포하고 커버 슬립으로 샘플을 덮습니다.그 후, 슬라이드를 빛이 차단된 슬라이드 보관함에 넣어 20 °C에서 보관하십시오. 이미징 당일에 첫 번째 슬라이드를 공초점 현미경의 스테이지 위에 올리고, 조직 샘플 표지에 사용된 각 형광체에 적절한 레이저와 필터를 선택하십시오. 20x 대물렌즈를 사용하여, 각각의 형광 채널에서 3 µm 간격으로 z-시리즈를 순차적으로 획득하며, 여러 개의 800 x 800 픽셀 시야에서 촬영하십시오.그 다음, 수집된 시야들을 몽타주로 구성하고 각 몽타주 이미지를 해당 조직 샘플에 기반한 이름으로 저장합니다. 이 대표 이미지들에서는 SIV 펩타이드가 로딩된 MHC class one 테트라머로 염색된 절편과, 동일한 조직에서 무관한 펩타이드가 로딩된 MHC class one 테트라머로 염색된 절편을 비교하여 테트라머 염색의 특이성을 입증합니다. 이 이미지들에서 SIV 펩타이드가 로딩된 MHC class one 테트라머로 염색된 바이러스 특이적 T 세포는 T 세포 서브셋 마커인 CD8은 공동 염색되지만, B 세포에서 발현되는 세포 표면 단백질인 CD20은 염색되지 않습니다.이 몽타주는 림프절의 서로 다른 해부학적 구획에서 특정 표현형을 가진 테트라머 염색 세포를 정량화하기 위해 여러 공초점 z-시리즈 시야를 합쳐 제작되었습니다. 이 확대 이미지는 IGM 염색으로 구분된 B 세포 여포를 포함하는 림프절 몽타주의 특정 영역을 강조합니다. T 세포 활성화 및 증식 마커인 KI67을 공동 발현하는 일부 세포를 포함하여, MHC class one 테트라머 염색 세포가 B 세포 여포 내부와 외부에서 검출되는 것을 확인할 수 있습니다.이 염색 조합을 통해 SIV 특이적 CD8 양성 T 세포의 활성화 및 증식 상태뿐만 아니라, 2차 림프 조직 내에서의 위치를 결정할 수 있습니다. 숙달된 후 적절하게 수행한다면, 이 기술은 약 5일 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 성공적인 염색을 위해서는 신선한 조직을 사용하는 것이 매우 중요하다는 점을 기억하십시오.샘플 수확 후 24시간 이내에 처리하고, 고정 전까지 냉장 상태로 유지하십시오. 이 영상을 시청하고 나면, 관심 조직 내 항원 특이적 CD8 양성 T 세포의 위치, 풍부도 및 표현형을 결정하기 위한 테트라머 염색 및 면역조직화학법 수행 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 감염성 물질을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으며, 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 날카로운 도구의 사용을 제한하는 등 노출을 방지하기 위한 예방 조치를 이 절차를 수행하는 동안 항상 취해야 함을 잊지 마십시오.

in-situ-mhc-tetramer-staining-quantitative-analysis-to-determine

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 절차는 정화를 보여주고 특정 항원 CD4 + 전체 말초혈 및 MHC 클래스 II의 tetramers을 사용하여 시각화에서 T 세포의 체외 확장 인치 Tetramers은 단일 항원 특이성 및 정의 MHC 클래스 II 제한과 T 세포의 직접적인 시각화를 허용합니다.

머릿속 항원 특정 CD4 + MHC 클래스 II Tetramers를 사용하여 T 세포

현장 tetramer의 얼룩과 현장 하이브리드화 (ISTH)의 결합 기술은 시각화, 매핑 및 분석들은 바이러스에 감염된 대상으로 바이러스에 특정한 CD8 + T 세포의 공간적 근접의 이러한 면역 effectors와 대상 사이의 양적 관계의 결정을 가능하게 감염 결과 수 있습니다.

동시에 바이러스 특정 CD8 + T 세포 바이러스에 감염된 세포를 시각화하는 기술 현장에서</em

에피토프 특정 T 세포의 낮은 주파수 인구를 분리하고 유동 세포 계측법을 기준으로 결과를 분석 MHC tetramers 및 자기 microbeads :이 프로토콜은 펩타이드의 사용을 설명합니다. 이 방법은에서 관심 내생 T 세포 인구의 직접적인 연구를...

펩타이드 : 에피토프 특정 T 세포의 MHC Tetramer 기반 강화

주요 조직 적합성 복합체 클래스 II dextramers 직접 염색으로 뇌와 심장 자기 반응성 CD4 T 세포를 감지하는 프로토콜은이 보고서에 설명되어 있습니다. 종합적인 분석을 위해, 시츄 항원 특이 CD4 + T 세포의 빈도를 열거하는 신뢰할 수있는 방법도 고안되어있다.

주요 조직 적합성 복잡한 클래스 II Dextramers을 사용하여 뇌와 심장에있는자가 반응 CD4 T 세포의 제자리 탐지에

쥐 백신 접종 모델에서 나노 입자를 사용한 면역에 대한 반응으로 항원 특이적 CD8+ T 세포의 확장을 모니터링하기 위한 전체 동물 이미징 및 유세포 분석 기반 기술에 대해 설명합니다.

나노 입자 백신 접종 후 분석 항원 특이 CD8 + T 세포 반응에 대한 전체 동물 이미징 및 유세포 기술

여기에서는 AIDS 바이러스를 붉은 털 원숭이 CD8 + T 세포를 열거하고 특성화하기위한 최적의 프로토콜을 제시한다. 이 문서에서는 HIV의 면역학 분야에뿐만 아니라, CD8 + T 세포 반응이 질병의 결과에 영향을 미치는 것으로 알려져있다 생물 의학 연구의 다른 영역뿐만 아니라 유용합니다.

유인원 면역 결핍 바이러스 특정 CD8 분석 + 펩티드 - MHC-I 테트라 머 염색에 의해 붉은 털 원숭이의 T 세포

종양 microenvironment 공부 immunotherapy 임상 응답의 전조 또는 예측 생체를 식별할 수 있습니다. 여기에 제시, 혁신적인 방법을 기반으로 현장에서 형광 multispectral 이미징 분석 하 고 CD8의 자동으로 다양 한 부분 모집단을 계산+ T 세포. 이 재현 하 고 신뢰할 수 있는 기술은 대형 코 호트 분석에 적합 합니다.

면역 형광 분석 및 Intratumoral+ PD-1 팀-3+ CD8의 정량화를 다중화+ T 세포

여기, 전 대 한 프로토콜 선물이 vivo 항 원 특정 CD8의 질적 검색+ T 세포. 분석은 단일 셀 정지 적은 양의 혈액 또는 기관에서 가능 합니다. 광범위 한 연구는 세포 독성 T 세포 응답 (예방 접종과 암 immunotherapy 연구)의 분석을 필요로 합니다.

반대로 벡터 및 안티 transgene 특정 CD8의 동시 정량화+ T 세포가 MHC를 통해 내가 Tetramer 바이러스 성 벡터와 예방 접종 후 얼룩

이 프로토콜 사용을 설명 합니다 단일 체인의 MHC 종류 I 인간 CD8 + T 세포 활성화의 분자 상호 작용을 조사 하기 위해 단지: 조작된 항 단일 체인을 표현 하는 세포의 생성, 인간 CD8 + T 세포 복제의 문화 그리고 T 세포 활성화 실험입니다.

공동-agonism 인간 CD8 + T 세포 활성화에 조사를 단일 체인 MHC 기술의 사용

이 기사에서는 이미지 분석 및 공간 분석과 결합된 수동 티라마이드 신호 증폭(TSA) 다중 면역형광(mIF)을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 실험실에서 사용할 수 있는 슬라이드 스캐너에 따라 슬라이드당 2-6개의 항원을 염색하기 위해 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 섹션과 함께 사용할 수 있습니다.

종양 미세 환경의 임상 및 생물학적 평가를 위한 공간 이미지 분석과 결합된 Multiplex Immunofluorescence

이 프로토콜은 포르말린 고정 파라핀 포매 조직 절편에서 단백질 이미징 질량 세포 분석을 통한 다중 mRNA 검출 방법론을 자세히 설명합니다.

이중 양식 분자 지도 제작: 다중 mRNA 검출과 단백질 이미징 질량 세포 분석의 통합

배우세요 제자리 MHC tetramer 염색 및 면역조직화학을 활용하여 조직 내 항원 특이 CD8 T 세포의 위치, 풍부함, 표현형을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 면역 반응 연구에 필수적입니다.

제자리에서 MHC tetramer 얼룩 및 정량 분석 위치, 풍부, 및 조직에서 항 원 특정 CD8 T 세포의 표현 형을

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