제자리에서 MHC tetramer 얼룩 및 정량 분석 위치, 풍부, 및 조직에서 항 원 특정 CD8 T 세포의 표현 형을

본 절차의 전반적인 목표는 관심 조직 내에서 항원 특이적 CD8 양성 T 세포의 위치, 풍부도 및 표현형을 결정하는 것입니다. 이 방법은 거의 모든 항원 특이적 CD8 T 세포와 모든 조직을 대상으로 위치 확인, 정량화 및 표현형 분석 수단을 제공함으로써 CD8 T 세포에 관한 질문에 신속하게 답할 수 있도록 돕습니다. 이 기술의 주요 장점은 관심 조직 내의 다른 세포 및 구조와 비교하여 항원 특이적 CD8 양성 T 세포의 공간적 분포를 결정할 수 있다는 점입니다.

Shengbin Li와 함께 절차를 시연할 사람은 Gwantwa Mwakalundwa입니다. 절차 첫째 날에는 메스를 사용하여 신선한 조직을 약 0.5 x 0.5 centimeter 크기의 조각으로 자릅니다. 여기서는 붉은털원숭이의 비장 조직이 사용되었습니다.

각 조직 조각을 플런저 상단 중앙에 각각 접착제로 고정하고, PBS에 희석된 따뜻한 4% low melting agarose 3~5 mL에 샘플을 매립합니다. 플런저에 해당 조직 정보를 표시합니다. 그런 다음, 샘플을 아이스 버킷 안의 냉각 홀더에 넣습니다.

한천이 응고되면 마이크로톰의 전원을 켜고 두께 설정을 200마이크로미터로 맞춥니다. 새 면도날을 장착한 후, 플런저를 마이크로톰 배스에 삽입합니다. 마이크로톰 배스에 새로 조제한 PBS-H 100~200밀리리터를 채우고, 온도를 0~2도 사이로 유지하기 위해 PBS-H 얼음 조각을 추가합니다.

200 µm 두께의 절편을 얻은 후, 붓을 사용하여 각 절편 주변의 한천을 제거하고, 1 mL의 냉각된 PBS-H가 들어 있는 24웰 조직 배양 플레이트의 개별 웰 내 조직 챔버로 샘플을 옮깁니다. 모든 샘플을 확보하면, 2% normal goat serum가 첨가된 PBS-H에 희석된 1 mL의 fit 결합 펩타이드 로딩 MHC class one tetramer 내에서 조직 절편을 4 °C로 하룻밤 동안 로킹하며 배양합니다. 다음 날 아침, 각 조직 챔버를 1 mL의 신선하고 냉각된 PBS-H가 들어 있는 새로운 24웰 플레이트의 개별 웰로 옮겨 20분 동안 둡니다.

두 번째 세척 후, 신선한 4% paraformaldehyde 1 mL에서 상온으로 2시간 동안 절편을 고정합니다. 이어서 차가운 PBS-H로 5분씩 두 번 세척합니다. 0.01 M urea가 담긴 새로운 24웰 플레이트로 절편을 옮기고, urea가 끓을 때까지 약 10초씩 세 번 전자레인지로 가열합니다.

샘플의 투과화 및 블로킹을 위해, 0.3% triton x100 세제와 2% normal goat serum이 첨가된 PBS-H 함유 블로킹 용액에 절편을 넣고 4°C의 로커에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후, 조직 챔버를 rabbit anti-fitc 항체, mouse antihuman CD 항체 및 rat antihuman CD3 항체가 포함된 용액 1 mL가 들어 있는 새로운 24 웰 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 샘플을 로킹하며 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

3일 차에, 4°C에서 신선한 PBS-H로 섹션을 3회 세척하며, 각 세척당 최소 20분 동안 수행합니다. 그 후, 적절한 형광 접합 2차 항체와 함께 빛이 차단된 상태에서 최대 3일 동안 최종 배양을 진행합니다. 3차 항체 배양이 끝나면, 신선한 PBS-H로 20분씩 3회 헹구고, 붓을 사용하여 각 조직 챔버에서 샘플을 유리 현미경 슬라이드로 옮깁니다. 각 섹션에 형광 보존제가 첨가된 마운팅 매질을 도포하고 커버 슬립으로 샘플을 덮습니다.

그 후, 슬라이드를 빛이 차단된 슬라이드 보관함에 넣어 20 °C에서 보관하십시오. 이미징 당일에 첫 번째 슬라이드를 공초점 현미경의 스테이지 위에 올리고, 조직 샘플 표지에 사용된 각 형광체에 적절한 레이저와 필터를 선택하십시오. 20x 대물렌즈를 사용하여, 각각의 형광 채널에서 3 µm 간격으로 z-시리즈를 순차적으로 획득하며, 여러 개의 800 x 800 픽셀 시야에서 촬영하십시오.

그 다음, 수집된 시야들을 몽타주로 구성하고 각 몽타주 이미지를 해당 조직 샘플에 기반한 이름으로 저장합니다. 이 대표 이미지들에서는 SIV 펩타이드가 로딩된 MHC class one 테트라머로 염색된 절편과, 동일한 조직에서 무관한 펩타이드가 로딩된 MHC class one 테트라머로 염색된 절편을 비교하여 테트라머 염색의 특이성을 입증합니다. 이 이미지들에서 SIV 펩타이드가 로딩된 MHC class one 테트라머로 염색된 바이러스 특이적 T 세포는 T 세포 서브셋 마커인 CD8은 공동 염색되지만, B 세포에서 발현되는 세포 표면 단백질인 CD20은 염색되지 않습니다.

이 몽타주는 림프절의 서로 다른 해부학적 구획에서 특정 표현형을 가진 테트라머 염색 세포를 정량화하기 위해 여러 공초점 z-시리즈 시야를 합쳐 제작되었습니다. 이 확대 이미지는 IGM 염색으로 구분된 B 세포 여포를 포함하는 림프절 몽타주의 특정 영역을 강조합니다. T 세포 활성화 및 증식 마커인 KI67을 공동 발현하는 일부 세포를 포함하여, MHC class one 테트라머 염색 세포가 B 세포 여포 내부와 외부에서 검출되는 것을 확인할 수 있습니다.

이 염색 조합을 통해 SIV 특이적 CD8 양성 T 세포의 활성화 및 증식 상태뿐만 아니라, 2차 림프 조직 내에서의 위치를 결정할 수 있습니다. 숙달된 후 적절하게 수행한다면, 이 기술은 약 5일 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 성공적인 염색을 위해서는 신선한 조직을 사용하는 것이 매우 중요하다는 점을 기억하십시오.

샘플 수확 후 24시간 이내에 처리하고, 고정 전까지 냉장 상태로 유지하십시오. 이 영상을 시청하고 나면, 관심 조직 내 항원 특이적 CD8 양성 T 세포의 위치, 풍부도 및 표현형을 결정하기 위한 테트라머 염색 및 면역조직화학법 수행 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 감염성 물질을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으며, 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 날카로운 도구의 사용을 제한하는 등 노출을 방지하기 위한 예방 조치를 이 절차를 수행하는 동안 항상 취해야 함을 잊지 마십시오.