제자리에서 MHC tetramer 얼룩 및 정량 분석 위치, 풍부, 및 조직에서 항 원 특정 CD8 T 세포의 표현 형을

이 절차의 전반적인 목표는 관심 조직 내에서 항원 특이적 CD8 양성 T 세포의 위치, 풍부도 및 표현형을 결정하는 것입니다. 이 방법은 거의 모든 항원 특이적 CD8 T 세포 및 조직을 찾고, 정량화하고, 표현형을 분석할 수 있는 수단을 제공함으로써 CD8 T 세포에 대한 간단한 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 주요 장점은 관심 조직 내의 다른 세포 및 구조와 비교하여 항원 특이적 CD8 양성 T 세포의 공간 분포를 결정할 수 있다는 것입니다.

Shengbin Li와 함께 절차를 시연하는 것은 Gwantwa Mwakalundwa가 될 것입니다. 시술 첫날, 메스를 사용하여 신선한 조직을 약 0.5 x 0.5cm 조각으로 자릅니다. 여기에서는 붉은털 원숭이 비장 조직이 표시됩니다.

조직 조각을 플런저 상단 중간에 별도로 붙이고 PBS에서 따뜻한 4% 저용융 아가로스 3-5밀리리터에 샘플을 삽입합니다. 플런저에 관련 조직 정보를 레이블로 지정합니다. 그런 다음 샘플을 얼음 양동이에 담긴 냉장 홀더에 넣습니다.

한천이 응고되면 마이크로톰을 켜고 두께 설정을 200마이크로미터로 설정합니다. 새 면도날을 설치한 후 플런저를 마이크로톰 수조에 삽입합니다. 마이크로톰 욕조에 갓 준비한 PBS-H 100-200ml를 채우고 PBS-H 얼음 조각을 넣어 온도를 섭씨 0도에서 2도 사이로 유지합니다.

200마이크로미터 절편을 얻은 후 페인트 브러시를 사용하여 각 절편을 둘러싼 한천을 제거하고 샘플을 1밀리리터의 냉각된 PBS-H가 포함된 24웰 조직 배양 플레이트의 개별 웰 내의 개별 조직 챔버로 옮깁니다. 모든 샘플을 획득하면 조직 절편을 1 밀리리터의 적합 접합 펩타이드가 적재 된 MHC 클래스 1 사량체로 밤새 배양하고 섭씨 4도에서 2 % 정상 염소 혈청이 보충 된 PBS-H로 희석합니다. 다음 날 아침, 각 조직 챔버를 1밀리리터의 신선한 냉각 PBS-H가 들어 있는 새로운 24웰 플레이트의 개별 웰로 20분 동안 옮깁니다.

두 번째 세척 후 실온에서 2시간 동안 신선한 4% 파라포름알데히드 1ml에 섹션을 고정합니다. 그런 다음 차가운 PBS-H에서 5분 동안 두 번 세척합니다. 절편을 0.01 몰 우레아가 포함된 새로운 24웰 플레이트로 옮기고 요소가 끓을 때까지 매번 약 10초 동안 절편을 세 번 전자레인지에 돌립니다.

샘플을 투과화하고 차단하려면 0.3% 트리톤 x100 세제와 2% 일반 염소 혈청이 보충된 PBS-H가 함유된 차단 용액에서 섹션을 로커에서 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 조직 챔버를 토끼 항 fitc 항체, 마우스 항인간 CD 항체 및 쥐 항인간 CD3 항체를 포함하는 1 밀리리터의 용액을 포함하는 새로운 24 웰 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. rocking을 사용하여 섭씨 4도에서 밤새 샘플을 배양합니다.

3일차에는 섭씨 4도의 신선한 PBS-H로 세척당 최소 20분 동안 절편을 세 번 세척하고 빛으로부터 보호한 상태에서 최대 3일 동안 적절한 형광 접합 2차 항체로 최종 배양을 수행합니다. 3차 항체 배양이 끝나면 새 PBS-H에서 20분 동안 3회 세척하여 샘플을 헹구고 페인트 브러시를 사용하여 각 조직 챔버의 샘플을 유리 현미경 슬라이드로 옮깁니다. 각 섹션을 형광단 방부제가 보충된 장착 매체로 코팅하고 커버 슬립으로 샘플을 덮습니다.

그런 다음 슬라이드를 섭씨 20도의 빛으로 보호된 슬라이드 컨테이너에 보관하십시오. 이미징 당일, 첫 번째 슬라이드를 컨포칼 현미경의 스테이지에 놓고 조직 샘플을 라벨링하는 데 사용되는 각 형광단에 적합한 레이저와 필터를 선택합니다. 20x 대물렌즈를 사용하여 여러 800 x 800 픽셀 필드에서 각 형광단 채널에서 3미크론 간격으로 z 시리즈를 순차적으로 얻습니다.

그런 다음, 수집된 필드의 몽타주를 구성하고 각 몽타주 이미지를 해당 조직 샘플에 따라 이름으로 저장합니다. 이러한 대표적인 이미지에서, SIV 펩타이드가 로드된 MHC 클래스 1 테트라머로 염색된 절편을 관련 없는 펩타이드가 로드된 MHC 클래스 1 테트라머로 염색된 동일한 조직의 절편과 비교하여 테트라머 염색의 특이성을 입증합니다. 이 이미지에서 SIV 펩타이드가 로드된 MHC 클래스 1 사량체로 염색된 바이러스 특이적 T 세포는 T 세포 하위 집합 마커인 CD8에 대해 공동 염색하지만 B 세포에서 발현되는 세포 표면 단백질인 CD20은 함께 염색하지 않습니다.

이 몽타주는 여러 컨포칼 z 시리즈 필드에 대해 만들어졌으며, 이는 림프절의 특정 표현형과 다른 해부학적 구획을 가진 사합체 염색 세포의 정량화에 사용되었습니다. 이 확대된 이미지는 IGM 염색으로 묘사된 B 세포 여포를 포함하는 몽타주 림프절의 영역을 강조합니다. MHC 클래스 1 사량체 염색 세포, 그 중 일부는 T 세포 활성화 및 증식 마커를 공동 발현했으며, KI67은 B 세포 여포 내부 및 외부에서 검출 될 수 있습니다.

이 염색 조합을 통해 SIV 특이적 CD8 양성 T 세포의 활성화 및 증식 상태와 2차 림프 조직 내 국소화를 측정할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 약 5일 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 새로운 조직이 성공적인 염색에 중요하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

수확 후 24시간 이내에 샘플을 처리하고 고정할 때까지 냉장 상태로 유지합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 관심 조직에서 항원 특이적 CD8 양성 T 세포의 위치, 풍부도 및 표현형을 결정하기 위해 테트라머 염색 및 면역조직화학을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 감염원을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 날카로운 물건 사용을 제한하는 것과 같은 노출을 방지하기 위한 예방 조치를 항상 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.