Macroinvertebrates 사용 하 여 그룹별 수생 rDNA 뇌관의 유전 직감 콘텐츠 분석을 위한 실험실 프로토콜

이 프로토콜의 전반적인 목표는 특히 현장 샘플에서 영양 생태학에 대한 조사를 개선하는 것입니다. 이 방법은 영양 상호작용에 대한 침입종의 영향과 같은 먹이 그물 생태학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 가장 큰 장점은 정확히 동일한 표본에 대한 영양 해석을 통합하는 데 더 많은 시간을 할애할 수 있고 거의 모든 생태학자가 적용할 수 있다는 추가 응용 프로그램입니다.

우리는 수생 소비자의 먹이 섭취에 대한 통찰력을 제공하기 위해 이 접근 방식을 확립했지만, 예를 들어 저서 대형무척추동물 샘플 내의 종 구성을 결정하는 것과 같은 다른 목적으로도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 우리 실험실의 기술자인 Christian Sodemann입니다. 이 실험을 시작하려면 이전에 절제된 포식자 위장관을 440마이크로리터의 염 추출 완충액이 들어 있는 2밀리리터 안전 잠금 반응 튜브로 옮깁니다.

DNA가 추출될 때까지 샘플을 섭씨 영하 20도에서 즉시 동결합니다. 냉동고에서 샘플을 꺼낸 후 집게를 사용하여 각 샘플 튜브에 5밀리리터 스테인리스 스틸 비드 하나를 추가하여 DNA 추출을 시작한 다음 샘플을 실온의 벤치에 두어 해동합니다. 비드 밀을 사용하여 15Hz에서 1분 동안 샘플을 균질화합니다.

샘플을 잠시 회전시킨 후 샘플에 10% SDS 90마이크로리터와 10밀리리터 단백질 분해 효소 K 10밀리그램 5마이크로리터를 추가합니다. 다음으로, 샘플을 완전히 와류로 배양하고 ThermoMixer에서 400rpm으로 지속적으로 흔들면서 섭씨 60도에서 1시간 동안 배양합니다. 용해를 더욱 촉진하려면 이 배양 동안 10분마다 샘플을 와류로 회전시킵니다.

짧은 원심분리 회전 후 350마이크로리터의 5몰 염화나트륨을 시료에 피펫팅합니다. 샘플을 완전히 혼합하기 위해 30초에서 1분 동안 소용돌이칩니다. 그런 다음 16, 200 회 g에서 섭씨 5도에서 40 분 동안 원심 분리기합니다.

따라서 원심분리기에서 샘플을 꺼낼 때 가장 중요한 것 중 하나는 비드가 움직이지 않고 단계에서 제거해야 하는 모든 입자가 포함된 펠릿을 방해하지 않도록 하는 것입니다. 다음으로, 약 600마이크로리터의 상등액을 새 1.5ml 튜브에 조심스럽게 옮기고 펠릿을 방해하지 않도록 합니다. 600마이크로리터의 얼음처럼 차가운 이소프로판올을 넣고 튜브를 조심스럽게 몇 번 뒤집습니다.

영하 20도의 온도에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 냉동실에서 샘플을 꺼낸 후 16, 200회 g의 실온에서 20분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 잃지 않도록 하면서 상등액을 버리고 티슈 페이퍼를 사용하여 튜브를 조심스럽게 건조시킵니다.

200 마이크로 리터의 70 % 얼음 차가운 에탄올을 첨가 한 다음 실온에서 10 분 동안 16, 200 배 g으로 원심 분리하여 이러한 DNA 함유 펠릿을 세척합니다. 상층액은 주의해서 버리고 보푸라기가 없는 티슈 페이퍼를 사용하여 튜브를 조심스럽게 건조시킵니다. 마지막으로, 8 마이크로 리터로 조정 된 10 마이크로 리터 피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않도록 남아있는 상층액을 조심스럽게 제거합니다.

모든 에탄올이 증발할 때까지 펠릿을 건조시킵니다. 그런 다음 50-100 마이크로 리터의 뉴클레아제가없는 물을 넣고 잠시 와류 한 다음 펠릿을 용해시키기 위해 밤새 섭씨 4도에서 두십시오. 여기에서 추출한 DNA 샘플의 기능적 효율성을 확인하려면 각 식품 공급원에 적합한 범용 프라이머 세트를 사용하여 PCR로 각 샘플을 테스트하십시오.

1.5 또는 2.5 millil 반응 튜브에 프라이머, dNTP 혼합물, 반응 완충액, Taq DNA 중합효소 및 정제수를 첨가하고 표준 반응 혼합물을 볼텍싱하는 것으로 시작합니다. 이제 각 DNA 샘플에 대해 1마이크로리터의 해당 DNA 추출물을 PCR 플레이트 내의 표준 반응 혼합물 9마이크로리터로 옮깁니다. 플레이트를 닫고 thermocycler에 넣고 PCR 프로그램을 시작하십시오.

PCR 반응이 완료된 후 미니 원심분리기의 단기 옵션을 사용하여 PCR 산물을 스핀다운합니다. 그런 다음 각 PCR 산물 3마이크로리터를 6배 로딩 염료 1마이크로리터와 혼합합니다. 이 샘플을 미리 준비된 아가로스 겔의 겔 슬롯에 로드합니다.

1.5 마이크로리터의 100 염기쌍 DNA ladder를 크기 표준으로 겔의 한 슬롯에 로드합니다. 전기영동 장치의 뚜껑을 닫고 전원 공급 장치에 연결한 다음 젤을 100cm당 볼트로 35분 동안 실행합니다. 전기영동 실행 후 젤을 제거하고 미리 준비된 염색조에 약 10분 동안 넣습니다.

마지막으로, 염색조에서 젤을 제거하고 젤 문서화 시스템에 놓고 설명서에 따라 시각화합니다. 포식자의 내장 내용물을 분석하려면 미리 준비된 DNA 추출물 작업 용액을 사용하십시오. 16개의 먹이 그룹 특이적 프라이머 세트 각각에 대해 별도의 PCR 반응을 수행합니다.

각 먹이 그룹에 속하는 표본의 DNA를 가진 하나의 양성 대조군과 포식자 종의 DNA를 가진 하나의 음성 대조군을 포함합니다. 할당 염기서열분석기 검출을 위해 염기서열분석 플레이트에 시료를 적재하는 동안 서로 다른 시료가 풀링되는 것을 방지하고 궁극적으로 소비자 개인에게 잘못된 결과를 할당하는 것을 방지하기 위해 각 PCR 플레이트 내의 시료 할당을 정확하게 문서화하는 것이 중요합니다. 그런 다음 이전에 설명한 것과 동일한 프로토콜을 사용하여 사용된 각 프라이머 세트에 대한 특정 어닐링 온도 및 사이클 수에 맞게 조정된 PCR 반응을 실행합니다.

이러한 PCR 반응에서 증폭된 단편을 검출하려면 A 및 B의 두 배치에서 자동 단편 분석을 실행합니다.시료 로딩 용액 또는 SLS를 포함하는 혼합물과 각 배치에 대한 각각의 크기 표준을 준비합니다. 다음으로, 각 배치에 속하는 8개의 PCR 반응의 이전에 동결된 PCR 산물을 해동하여 어두운 곳에 보관합니다. 미니 원심분리기의 단기 실행 옵션을 사용하여 회전시킵니다.

염기서열분석 플레이트에서 분석할 샘플의 수에 해당하는 웰 수를 각 샘플에 대해 22마이크로리터의 각 SLS 크기 표준 혼합물로 로드합니다. 그런 다음 8개의 PCR 반응 각각에 대한 PCR 생성물 1마이크로리터를 플레이트의 각 웰에 로드합니다. 다음으로, 미니 플레이트 원심분리기의 단기 실행 옵션을 사용하여 이 혼합물을 조심스럽게 회전시킵니다.

그런 다음 미네랄 오일 한 방울로 각 우물을 덮으십시오. 그런 다음 버퍼 플레이트의 반응 웰에 250-300 마이크로리터의 DNA 분리 버퍼를 채웁니다. 모세관 시퀀서 소프트웨어를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 샘플 설정을 만듭니다.

Sample Setup 내의 Sample 할당이 Sequencing Plate의 Sample 할당과 일치하는지, 그리고 Sample Setup에 각 Batch를 처리하는 데 적합한 Method가 포함되어 있는지 확인하십시오. 결과를 분석할 때 각 샘플의 electropherogram을 육안으로 재확인하고, 각 marker primer set에 대해 호출된 각 peak를 개별적으로 확인/unconfirm하고, marker primer set의 기준에 맞는 uncalled peak를 수동으로 삽입하거나 잘못된 peak를 삭제하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에서 수행된 PCR 분석을 위해 확립된 그룹 특이적 프라이머 세트의 효과를 결정하기 위해 섭식 실험을 수행한 후, 포식자 위장관의 DNA를 사용한 PCR 결과를 아가로스 겔 전기영동과 단일 가닥 형태 다형성(SSCP)을 사용하여 분석했습니다.

아가로스 젤 전기영동은 이중 가닥 DNA의 단일 밴드를 밝혀냈는데, 이는 연구된 다른 먹이 종을 구별할 수 없었습니다. 이와는 대조적으로, SSCP 전기영동은 내장 내용물 샘플을 참조 샘플과 비교하여 서로 다른 먹이 종을 구별하는 데 성공했습니다. 먹이 실험 후 물 진드기의 장에서 추출한 DNA는 먹이 섭취 후 다른 시간대에 염기서열 분석을 수행했습니다.

먹이를 먹은 지 1시간에서 50시간 사이에, 검출된 먹이 DNA의 상대적인 양이 현저히 감소했다. 침입성 양서류인 Dikerogammarus villosus gut에서 추출한 DNA는 이 프로토콜에 설명된 16개의 그룹 특이적 프라이머 세트를 사용하여 거대 무척추 동물 먹이 DNA에 대해 테스트되었습니다. D.villosus 내장 내용물 중 16%만이 16개의 표적 먹이 분류군 중 하나에 속하는 DNA에 대해 양성이었습니다.

더욱이, 12개의 테스트된 먹이 분류군의 DNA는 적어도 하나의 샘플에서 발견된 반면, 4개 분류군의 DNA는 검출되지 않았다. 이 절차를 시도하는 동안 사용된 프라이머가 시스템 내의 분류군에 특정적이라는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 실험실에서 일상적으로 사용되는 방법을 유전자 분석으로 보완하여 영양 상호 작용에 대한 연구를 확장하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.