Name: Macroinvertebrates 사용 하 여 그룹별 수생 rDNA 뇌관의 유전 직감 콘텐츠 분석을 위한 실험실 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-05T12:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 학습하세요 수생 소비자의 먹이 소비를 유전학적으로 분석하는 방법을 통해 영양 생태학 연구를 개선하는 기술입니다. Dikerogammarus villosus를 포함한 무척추동물 먹이 식별이 가능하며 침입종이 먹이 그물에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다.

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우리 감사는 연구소에서 Silke Classen 생태계 분석 및 평가 (gaiac), RWTH 아 헨이이 프로토콜에 사용 되는 그룹-특정 뇌관 세트의 설립에 있는 그녀의 원조에 대 한. 우리는 또한 감사 피터 마틴과 협력에 대 한 Kiel의 대학에서로 라 Schynawa 물 진드기 실험에. 우리는 또한 원활 하 게 실행 하 고 회사와 카탈로그 번호의 등록을 준비 하 고 실험실 유지에 대 한 기술 실험실 조 수를 감사 합니다. 이 작품은 독일 연구 재단 (DFG; 프로젝트 GE 2219/3-1)에 의해 지원 되었다.

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리는 동일한 견본의 다른 비 분자 분석 결합 될 수 있는 rDNA 지역에 대 한 그룹-특정 뇌관 통해 필드 샘플에서 약탈자 먹이 상호 작용의 PCR 기반 결정에 대 한 간단 하 고 비용 효율적인 방법 제시. 그러나, 몇 가지 중요 한 단계는 프로토콜 내에서 있다. 첫째, 사용 하는 뇌관의 특이성을 확보 필수적 이다. 둘째,는 위장의 준비 및 후속 DNA 추출 하는 동안 오염 및 창 자 콘텐츠 자료의 손실을 피하기 위해 결정적 이다. 크로스-샘플 오염 먹이 DNA의 거짓인 긍정적인 탐지를 이어질 수 있습니다, 하는 동안 창 소재는 거의 실종으로 이어질 수도 있습니다 콘텐츠 손실 먹이 종의 소비. 각 소 단위 및 분석 (제 2의 프로토콜) 사용 하는 서식 파일의 기능 효율성에 속하는 rDNA의 존재의 확인은 소비 하는 먹이 대 한 대표적인 정보 수집을 위한 필수적입니다. 이것은 특히 중요 한 소비자 먹이로 되어 먹이 그룹의 아무 DNA 검출된25,<sup cla...

약탈자 먹이 상호 작용, 영양 상호 작용 및 음식 웹 역동성의 대부분을 구성 하는 물질과 식품 웹 시간과 생태계 생태학의 주요 목표 중 하나는 사이 걸쳐 에너지의 플럭스 특성 주요 측면은 1. 소스 결정과 탄소와 영양소의 흐름 생태계2사이의 생태 연결의 이해 발전 이다. 그러나, 생태계, 강과 그들의 catchments 같은 생물3의 움직임에 의해 뿐만 아니라 유기 물질과 영양소의 용만 연결 되지 않습니다. 따라서, 그 시스템을 연결 하는 자원의 흐름을 방해 하는 서식 지 변경 변경할 수 있습니다 강력 하 게 두 생태계의 음식 웹 직접 뿐만 아니라 또한 간접적으로 포식 자-먹이 커뮤니티의 각각 구성 변경 하 여. 예를 들어, 음식 웹의 변화 한 포식 종 (예를 들어, 무지개 송어)4의 움직임에 연결 될 표시 되었습니다. 이러한 변화는 잠재적으로 생물 다양성 및 수생 생태계의 기능을 위협 한다. 따라서 필드에 약탈자 먹이 상호 작용 분석 인간 유발 환경 변화, 등 물 관리 관행, 수생 생태계의 네이티브 생물 다양성에 미치는 영향을 결정 필수적 이다.
영양 관계를 추적 하는 것은 어려운 복잡 한 시스템에서 이후 몇 가지 방법은 설립 되었습니다를 사용 하는 필드5에 있는 상호 작용을 먹이의 평가. 전통적으로, 조사 분야에서 상호 작용을 먹이 기의 해 부 용기에 먹이 남아의 시각적 식별에 기반 하 고 형태 론 적 먹이 다양성에 대 한 광범위 한 지식이 필요로. 비주얼 직감 콘텐츠 분석 소비자 (예: 계절 변화 다이어트에 랍스터6 와 물고기7,8 또는 먹이 환경 설정의 copepods의)의 여러 그룹의 리소스 사용에 대 한 통찰력을 제공 했다. 그러나, 소화의 물리적 과정 시각 직감 콘텐츠 분석 어려운 만들고 일반적으로 소프트 바디 먹이 유기 체9를 그리 워 합니다. 액체 섭취에 의해 먹이 종에 대 한 또는 집중적으로 그들의 음식 섭취, amphipods, 같은 전에 comminute 몇몇 무척 추 동물 소비자에 대 한 본질적인 내용에 먹이 종의 시각적 식별 불가능 한10입니다. 이러한 제한으로 인해 분자 분석 유망한 대안을 제공합니다.
분자 분석 이제 본질적인 내용에 신속 하 고 정확한 먹이 탐지를 허용 하는 일반적인 도구 되고있다. 이러한 기술의 범위는 다양 한: 단일 클론 항 체 또는 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 근거를 둔 전략은, 때문에 자주 사용 그들의 높은 특이성 및 감도11. 새로운 단일 클론 항 체의 개발은 시간 및 비용 집중, 그러므로, 다른 분자 기술에의 응용 프로그램은 더 유용 항 체11를 이미 존재 하지 않는 경우. 또 다른 일반적인 접근은 보편적인 뇌관을 사용 하 여 대부분의 종에서 존재 ribosomal ribonucleic 산 (RNA) 유전자 처럼 deoxyribonucleic 산 (DNA)의 증폭 세트12,13이다. 이 기술을 사용 하 여, 그것 불가능 자주 DNA14의 혼합된 소스 내에서 먹이 생물의 전체 범위를 식별 합니다. 이러한 단점을 피하기 위해 효과적인 접근 그룹 특정 뇌관을 사용 하 여 유전 직감 콘텐츠 분석에 대 한 설정입니다. 특정 대상 그룹의 DNA 영역만을 증폭 하 고 모든 다른 종15,16제외 하도록 설계 된, 그룹 전용 프라이 머 사용 없이 지정된 된 그룹의 분류학 수준에 먹이 생물의 식별 시간 및 비용 집약적인 보조 분석입니다. 그러나, 모든 콘텐츠 분석 직감, 같은 같은 분석만 먹이 행동의 스냅샷을 제공 합니다. 따라서, 분석 시간 통합 자연 추적기 (예를 들어, 안정 동위 원소)의 분자 용기 콘텐츠 분석을 결합 하는 것은 유익한1,2간주 됩니다.
여기, 약탈자 먹이 상호 작용 동일한 견본의 안정 동위 원소 분석 결합 될 핵 ribosomal DNA (rDNA) 지역에 대 한 그룹-특정 뇌관 세트를 사용 하 여 PCR 기반 조사에 대 한 자세한 방법을 설명 합니다. Agarose 젤 전기 이동 법을 통해 단일 먹이 그룹의 DNA의 탐지를 설명합니다. 또한, 선물이 해당 같은 그룹-특정 뇌관의 PCR 제품의 추가 다운스트림 분석 기회 뇌관 특이성 보다 높은 분류학 해상도 필요할 때마다. 때문에 단일 좌초 DNA (ssDNA) 양식 3 차 conformations 그들의 기본 시퀀스17에 의해 결정 되는 조각, 조각 같은 그룹-특정 뇌관에 의해 증폭에 작은 변화 구조적 변화에 이어질. 이러한 변화는 단일 가닥 구조 다형성 (SSCP) 분석 polyacrylamide 젤17,18, 먹이 생물 (종 수준)의 더 정확한 id를 사용 하 여 검색할 수 있습니다.
Agarose 젤 전기 이동 법 DNA 파편을 시각화 하 고 그들의 대략적인 길이19, 해상도 결정 하는 일반적이 고 저렴 한 도구는 DNA의 금액에 따라 달라 집니다 및 착 색 염료 사용20동안에. 일반적으로, 시각화는 곧장 앞으로 순수한 DNA 샘플을 작업할 때 하지만 잠재적으로 낮은 양의 먹이 소비자의 본질적인 내용에 DNA agarose 젤 전기 이동 법 결과의 점수 복잡 수 있습니다. 아직도,이 검색 메서드는 가능한 한 낮은 필드에서 소비자 표본 수를 화면 또는 몇 먹이 그룹, 하지만 점수에 합병증 샘플의 높은 숫자의 심사 여러 먹이 taxa 매우 시간이 집중 따라서 불가능. 더 민감한 검출 방법의 조각 조각21의 정확한 길이 결정 있습니다 모 세관 전기 이동 법을 통해 자동화 된 분석 이다. 여러 microsatellite 기반 연구 레이블로 다른 형광 성 염료를 사용 하 여 그것이 감지 하 여 자동된 조각 분석22,23에 의해 다른 파편의 유사한 길이 결정 24. 따라서, 우리 또한 현재 여러 먹이에서 DNA의 병렬 검색에 대 한 자세한 프로토콜 레이블된 그룹-특정 뇌관 세트와 자동화 된 시퀀서와 자동된 조각 분석을 통해 감지 PCR를 사용 하 여 그룹. 또한, 우리는 자동된 조각 분석을 통해 먹이 DNA의 검출 방식은 또한 섭취 한 먹이의 상대 정량화를 가능 하 게 보여주는 사례 연구에서 결과 제시.

<table><tbody><tr><td>액체 질소</td><td>Any</td><td>NA</td><td>거대 무척추 동물의 현장 샘플을 실험실로 운송하기 위해.</td></tr><tr><td>1.5 ml 반응 튜브 - Safelock</td><td>Any</td><td>NA</td><td>현장에서 소비자 표본을 수집하고 이후 액체 질소 반응 튜브에서 보존하기 위해 반드시 PCR을 세척할 필요는 없습니다. 튜브가 폭발하는 것을 방지하려면 튜브의 뚜껑을 바늘로 뚫어야 합니다.</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Any</td><td>NA</td><td>: 확대가 관심있는 소비자의 크기의 위장관을 준비하기에 적합한지 확인하십시오.</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Any</td><td>NA</td><td>입체 현미경 아래에서 소비자 표본의 위장관을 해부합니다.</td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 foceps : Dumont 집게 No. 7</td><td>Bioform</td><td>B40d</td><td>이 구부러진 스테인레스 스틸 집게는 때때로 위장관에 구멍을 뚫지 않고 구부러진 부분 사이에 고정 된 표본을 유지하는 데 매우 헬풀 할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>스테인리스강 초점: Dumont 집게 Electronic No. 5</td><td>Bioform</td><td>B40b</td><td>이 미세한 스테인리스강 집게는 소비자 표본의 위장관 준비에 이상적입니다.</td></tr><tr><td>DNA-ExitusPlus</td><td>AppliChem</td><td>A7409,1000RF</td><td>DNA 및 RNA 오염 제거를 위한 오염 제거 솔루션</td></tr><tr><td>보풀 없는 종이 타월</td><td>모든</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>실험실 저울</td><td>모든</td><td>NA</td><td>정밀도는 0.01g 이상이어야 합니다.</td></tr><tr><td>마이크로리터 피펫(0.5-10/10-100/50-200/100-1000 &mu; L)</td> <td>모든</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock 튜브 2.0 ml</td><td>VWR</td><td>211-2165</td><td>이 raction 튜브에는 DNA, DNase, RNase 및 PCR 억제제가 없는 것이 중요합니다(PCR clean)!</td></tr><tr><td>Safe-Lock 튜브 1.5 ml</td><td>VWR</td><td>211-2164</td><td>이 raction 튜브에는 DNA, DNase, RNase 및 PCR 억제제(PCR clean)가 없는 것이 중요합니다!</td></tr><tr><td>염화나트륨 &ge; 99.5%, P.A., ACS, ISO</td><td>CARLROTH</td><td>3957.3</td><td>염 추출 버퍼(SEB) 및 DNA 추출에 필요한 5M NaCl 용액.</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris</td><td>carlroth</td><td>4855.2</td><td>염 추출 완충액 (SEB) 및 TBE 완충액</td></tr><tr><td>Microlitre 피펫 (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 &mu; L)</td><td>carlroth</td><td>8043.1</td><td>염 추출 완충액(SEB) 및 TBE 완충액</td></tr><tr><td>붕산 &ge; 99.8 %, P.A., ACS, ISO</td><td>CARLROTH</td><td>6943.2</td><td>TBE 버퍼. 상업적으로 이용 가능한 TBE 버퍼를 얻은 경우에는 필요하지 않습니다.</td></tr><tr><td>나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)</td> <td>carlroth</td><td>4360.1</td><td>DNA</td></tr><tr><td>단백질 분해 효소 K lyophil 추출용.</td><td>carlroth</td><td>7528.1</td><td>10mg/ml를 함유한 작업 용액을 준비합니다.</td></tr><tr><td>시료의 균질화를 위한</td> <td>TissueLyser II</td><td>Quiagen</td><td>85300</td> 비드 밀.</tr><tr><td>스테인레스 스틸 비즈, 5mm</td><td>Quiagen</td><td>69989</td><td>샘플의 균질화용.</td></tr><tr><td>가열 Thermoshaker</td><td>Any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>모든</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>냉장 원심분리기: himac CT 15 RE</td><td>Hitachi</td><td>NA</td><td>DNA 추출 중 원심분리에 사용되는 냉장 원심분리기(프로토콜 1).</td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>칼로스</td><td>6752.5</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 99.8 %, p.a.</td><td>모든</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Water 분자생물학 등급(ddH2O)</td><td>AppliChem</td><td>A7398,1000</td><td>뉴클레아제가 없는(스트림 멸균 및 DEPC 처리) DNA의 재현탁액에 사용되며 원고 내에서 ddH2O를 참조할 때마다</td></tr><tr><td>Unmodified Olegonucleotides</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td>NA</td><td>Primers unlabeled</td></tr><tr><td>Modified olegonucleotides</td><td>Metabion International AG</td><td>NA</td><td>프라이머 라벨링</td></tr><tr><td>peqGOLD Taq 올 인클루시브</td><td>VWR Peqlab</td><td>01-1000</td><td>Taq 모두 포함 PCR 반응 혼합물(반응 버퍼 Y 및 S, dNTP 및 MgCl2)용</td></tr> <tr><td>Primus 96 고급 그래디언트 열순환기 또는 peqStar96x 범용 그래디언</td>트 <td>Peqlab</td><td>NA</td><td>프라이머 세트는 원래 Primus 96 고급 그래디언트 열순환기에 설정되었습니다. 이 사이클러는 꽤 오래되었기 때문에 peqSta96x(이전 모델도 시뮬레이션할 수 있음)를 사용하여 동일한 조건에서 프라이머 세트가 효율적이고 구체적인지 확인했습니다. 그러나 테스트 결과 프라이머가 잘 작동하고 구형 기계의 시뮬레이션을 사용하지 않고도 여전히 특이적(Koester et al. 2013 참조)인 것으로 나타났습니다.</td></tr><tr><td>표준 96 웰 PCR 플레이트</td><td>VWR Peqlab</td><td>732-2879</td><td>PCR 반응에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>로우 프로파일 튜브 스트라이프 0.15 ml 플랫 캡 스트라이프</td><td>VWR Peqlab</td><td>732-3223</td><td>PCR 플레이트를 닫는 데 사용되는 캡 스트라이프.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Peqlab</td><td>35-1020</td><td>겔 전기영동에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>마이크로파</td><td>모든</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>원추형 플라스크</td><td>모든</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>측정 실린더</td><td>모든</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>수평 전기 영동 장치 및 이빨이 있는 각 빗</td><td>모든</td><td>NA</td><td>아가로스 젤 전기 영동용.</td></tr><tr><td>전기영동 전원 공급 장치 PS3002</td><td>Life Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드 용액 1 %</td><td>carlroth</td><td>2218.1</td><td>아가로스 젤용 염색조를 준비하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>포름아미드</td><td>carlroth</td><td>6749.1</td><td>SSCP 분석을 위한 변성 완충액에 필요.</td></tr><tr><td>Bromphenol blue</td><td>AppliChem</td><td>A3640.0010</td><td>아가로즈 젤 전기영동을 위한 로딩 염료에 필요합니다.</td></tr><tr><td>설탕</td><td>carlroth</td><td>4621.1</td><td>아가로스 겔 전기영동을 위한 로딩 염료에 필요합니다.</td></tr><tr><td>100 bp-DNA-Ladder extended</td><td>carlroth</td><td>T835.1</td><td>아가로스 겔 전기영동을 위한 크기 표준.</td></tr><tr><td>UV-문서화 시스템</td><td>Any</td><td>NA</td><td>겔 전기영동 결과를 시각화합니다.</td></tr><tr><td>Rotiphorese NF-아크릴아미드/비스 용액 40%(29:1)</td><td>carlroth</td><td>A121.1</td><td>폴리아크릴아미드 겔 제조용.</td></tr><tr><td>암모늄 퍼 옥시 디설페이</td>트 <td>칼로스</td><td>9592.2</td><td>폴리 아크릴 아미드 겔의 제조.</td></tr><tr><td>폴드백 클립(32mm)</td><td>Any</td><td>NA</td><td>폴리아크릴아미드 겔 제조용.</td></tr><tr><td>사각형 모양의 플라스틱 상자 (21 > 6.5 &times; 5 cm)</td><td>모든</td><td>NA</td><td>폴리 아크릴 아미드 겔의 제조.</td></tr><tr><td>테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)</td><td>칼로스</td><td>23.67.1</td><td>폴리아크릴아미드 겔 제조용.</td></tr><tr><td>Beaker</td><td>Any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>RC 10 디지털 냉각기</td><td>VWR</td><td>462-0138</td><td>폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용한 SSCP 분석용.</td></tr><tr><td>수직 전기영동 장치 P10DS (OWL 분리 시스템)</td><td>VWR</td><td>700-2361</td><td>폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용한 SSCP 분석용.</td></tr><tr><td>노치 유리판</td><td>VWR</td><td>730-0261</td><td>폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용한 SSCP 분석용.</td></tr><tr><td>빈 유리판</td><td>VWR</td><td>730-0260</td><td>폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용한 SSCP 분석용.</td></tr><tr><td>스페이서</td><td>VWR</td><td>730-0262</td><td>폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용한 SSCP 분석용.</td></tr><tr><td>25개의 이빨이 있는 빗</td><td>VWR</td><td>730-0294</td><td>폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용한 SSCP 분석용.</td></tr><tr><td>쉐이킹 플랫폼</td><td>Any</td><td>NA</td><td>염색조의 지속적인 쉐이킹을 위해.</td></tr><tr><td>GelStar 핵산 염색제(Lonza Rockland, Inc.)</td><td>Biozym</td><td>850535 (50535)</td> <td>폴리 아크릴 아미드 겔의 염색.</td></tr><tr><td>GenomeLab DNA 크기 표준 키트 400bp</td><td>AB Sciex</td><td>608098</td><td>자동 단편 분석용. 배치 B를 위한 크기 stanard.</td></tr><tr><td>GenomeLab DNA 크기 표준 키트 600bp</td><td>AB Sciex</td><td>608095</td><td>자동 단편 분석용. 배치 A를 위한 stanard 크기.</td></tr><tr><td>시료 로딩 솔루션 (SLS)</td><td>AB Sciex</td><td>608082</td><td>자동 단편 분석용.</td></tr><tr><td>시퀀징 플레이트 - 96 웰 폴리프로필렌 PCR 마이크로플레이트</td><td>Costar</td><td>6551</td><td>자동 단편 분석용.</td></tr><tr><td>플레이트 원심분리기, PerfectSpin P</td><td>VWR Peqlab</td><td>NA</td><td>미니 플레이트 원심분리기는 PCR 제품을 스핀다운하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>버퍼 플레이트 - 96 웰 EIA/RIA 투명 평면 바닥 폴리스티렌 처리되지 않음 마이크로플레이트</td><td>Corning</td><td>9017</td><td>자동 단편 분석용.</td></tr><tr><td>GenomeLab 분리 완충액</td><td>AB Sciex</td><td>608012</td><td>자동 단편 분석용.</td></tr><tr><td>분리 겔 - LPAI</td><td>AB Sciex</td><td>608010</td><td>자동 단편 분석용.</td></tr><tr><td>Sequenzer - CEQ8000 유전자 분석 시스템</td><td>Beckman Coulter</td><td>NA</td><td>자동 단편 분석용.</td></tr><tr><td>GeneMarker V1.95</td><td>Softgenetics</td><td>NA</td><td>자동화된 단편 분석 결과를 분석합니다.</td></tr></tbody></table>

macroinvertebrates 사용 하 여 그룹별 수생 rdna 뇌관의 유전 직감 콘텐츠 분석을 위한 실험실 프로토콜

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

음식 웹 분석 생태계의 더 나은 이해를 위해 근본적 이다. 예를 들어 식품 웹 상호 작용 비 원주민 종족의 침공으로 인 한 심한 변화를 받을 수 있습니다. 그러나, 필드 약탈자 먹이 상호 작용의 정확한 식별 대부분의 경우에서 어렵습니다. 이러한 분석은 종종 본질적인 내용에 대 한 시각적 평가 또는 안정 동위 원소 비율 (δ15N 그리고 δ13C)의 분석 기반으로 합니다. 이러한 방법이 필요 포괄적인 지식에 대해, 각각, morphologic 다양성 또는 개별 먹이 생물, 먹이 생물의 정확한 식별에서 장애물을 선도에서 동위 원소 서명. 단식, 섭취 및 먹이 생물의 소화 어려울 특정 종의 식별 하기 때문에 비주얼 직감 콘텐츠 분석 특히 부드러운 바디 먹이 생물을 과소 평가. 따라서, 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 기반 전략, 예를 들어 그룹-특정 뇌관의 사용 설정, 식품 웹 상호 작용의 수사를 위한 강력한 도구를 제공 합니다. 여기, 우리가 핵 ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA)에 대 한 그룹-특정 뇌관 세트를 사용 하 여 필드에서 macroinvertebrate 소비자의 본질적인 내용을 조사 하기 위해 상세한 프로토콜을 설명 합니다. DNA 수 (작은 taxa)의 경우 전체 표본에서 추출 하거나 표본 수집 분야에서의 본질적인 내용. 존재와 DNA의 기능 효율성 테스트 개인에서 직접 확인 될 필요가 보편적인 뇌관을 사용 하 여 DNA의 각 소 단위를 대상으로 설정. 우리는 또한 소비 먹이 후속 단일 가닥 구조 다형성 (SSCP) 분석 polyacrylamide 젤을 사용 하 여 수정 되지 않은 그룹 특정 한 뇌관으로 PCR 통해 종 수준 추가 결합 결정 될 수 있다 보여줍니다. 또한, 우리는 레이블로 다른 형광 성 염료를 사용 하 여 자동된 조각 분석을 통해 여러 창 콘텐츠 샘플에서 다른 먹이 그룹의 DNA 파편에 대 한 병렬 심사 수 보여줍니다.

우리는 성공적으로 다른 연구에서 다이어트 분석이 프로토콜에 설명 된 단계를 사용 합니다. 이 섹션에서 우리는 프로토콜의 다른 섹션의 적용을 설명 하는 예제를 제시.
예를 들어, 저자28 및 SSCP 분석에 의해 PCR 제품의 추가 다운스트림 분석의 잠재력에 의해 설립 하는 그룹-특정 뇌관 세트의 효과 설명 하는 먹이 실험 실시 했다. 포식 자와 먹이로 체니스 종 애벌레로 Dikerogammarus villosus 의 개인 라인 backwaters 카를스루에 (독일) 근처에서 체포 했다. 실험실에서 포식 자와 먹이 taxa는 20 ° C에서 필터링 된 스트림 물에 별도로 보관 했다 하 고 36 시간 동안 굶 어 했다. 실험에 대 한 amphipod 표본 필터링 된 스트림 물 (100 mL) ...

Macroinvertebrates의 가장 일반적인 직감 콘텐츠 분석은 시각. 먹이 생물의 형태학 상 다양성에 대 한 강렬한 지식을 요구, 그들은 부드러운 바디 먹이 놓치지 고, 때문에 먹이의 강한 분쇄, amphipods를 포함 한 어떤 유기 체에 대 한 거의 불가능 하다. 우리는 macroinvertebrate에 대 한 자세한, 소설 유전 접근 먹이 amphipods의 식단에 식별을 제공 합니다.

Macroinvertebrates 사용 하 여 그룹별 수생 rDNA 뇌관의 유전 직감 콘텐츠 분석을 위한 실험실 프로토콜

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 특히 야외 시료를 이용한 영양 생태학 연구를 개선하는 것입니다. 이 방법은 침입종이 영양 상호작용에 미치는 영향과 같이 먹이그물 생태학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 주요 장점은 동일한 표본에 대해 시간 통합적 영양 분석을 추가로 적용할 수 있으며, 사실상 모든 생태학자가 이 방법을 적용할 수 있다는 점입니다.우리는 수생 소비자의 먹이 섭취에 대한 통찰을 제공하기 위해 이 접근법을 확립했지만, 이는 저서성 대형 무척추동물 샘플 내의 종 구성을 결정하는 것과 같은 다른 목적으로도 적용될 수 있습니다. 실험 절차는 우리 실험실의 기술자인 Christian Sodemann이 시연하겠습니다. 이 실험을 시작하려면, 이전에 절제한 포식자의 위장관을 440 µL의 염 추출 완충액이 들어 있는 2 mL safe-lock 반응 튜브로 옮기십시오.DNA 추출 전까지 샘플을 즉시 -20 °C에서 냉동하십시오. 냉동고에서 샘플을 꺼낸 후, 포셉을 사용하여 각 샘플 튜브에 5 mL 스테인리스 스틸 비드를 하나씩 넣고, 샘플을 벤치 위 실온에 두어 해동시켜 DNA 추출을 시작하십시오. 비드 밀을 사용하여 15 Hz에서 1분 동안 샘플을 균질화하십시오.샘플을 짧게 원심 분리한 후, 10% SDS 90 µL와 10 mg/mL proteinase K 5 µL를 샘플에 첨가합니다. 다음으로 샘플을 충분히 볼텍싱하고, ThermoMixer를 사용하여 60 °C에서 400 rpm으로 지속적으로 흔들어주며 1시간 동안 배양합니다. 용해를 더욱 촉진하기 위해 배양하는 동안 10분마다 샘플을 볼텍싱합니다.짧게 원심 분리한 후, 각 샘플에 5 M sodium chloride 350 µL를 피펫으로 넣습니다. 샘플이 완전히 섞이도록 30초에서 1분 동안 볼텍싱합니다. 그 다음, 5 °C에서 16,200 ×g로 40분 동안 원심 분리합니다.원심분리기에서 샘플을 꺼낼 때 가장 중요한 점 중 하나는 비드가 움직여 이 단계에서 제거해야 할 모든 입자가 포함된 펠릿을 흐트러뜨리지 않도록 하는 것입니다. 다음으로, 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하면서 약 600 µL의 상층액을 새로운 1.5 mL 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 여기에 얼음처럼 차가운 이소프로판올 600 µL를 넣고, 튜브를 조심스럽게 몇 번 뒤집어 섞어줍니다.-20 °C에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 냉동고에서 샘플을 꺼낸 후, 상온에서 16,200 ×g로 20분 동안 원심분리합니다. 펠릿이 손실되지 않도록 주의하며 상층액을 제거하고, 티슈 페이퍼를 사용하여 튜브를 조심스럽게 건조시키십시오.이 DNA 함유 펠릿에 70% ice cold ethanol 200 µL를 첨가하고 실온에서 16,200 ×g로 10분 동안 원심분리하여 세척합니다. 상층액을 주의해서 제거하고, 보풀 없는 티슈를 사용하여 튜브를 조심스럽게 말립니다. 마지막으로, 8 µL로 맞춘 10 µL 파이펫을 사용하여 펠릿이 손상되지 않도록 주의하며 남은 상층액을 조심스럽게 제거합니다.에탄올이 모두 증발할 때까지 펠렛을 건조합니다. 그 후 nuclease-free water 50-100 µL를 첨가하고, 짧게 볼텍싱한 뒤 4 °C에서 하룻밤 동안 두어 펠렛을 용해시킵니다. 여기서 추출한 DNA 샘플의 기능적 효율성을 검증하기 위해, 각 식품원에 적합한 공통 프라이머 세트를 사용하여 PCR로 테스트합니다.1.5 또는 2.5 milliliter 반응 튜브에 프라이머, dNTP 믹스, 반응 버퍼, Taq DNA polymerase 및 정제수를 넣고 표준 반응 혼합물을 볼텍싱하는 것으로 시작합니다. 이제 각 DNA 샘플에 대해, PCR 플레이트 내의 표준 반응 혼합물 9 microliter에 해당하는 DNA 추출물 1 microliter를 옮깁니다. 플레이트를 닫고 써모사이클러에 넣은 후 PCR 프로그램을 시작합니다.PCR 반응이 완료된 후, 미니 원심분리기의 짧은 가동(short run) 옵션을 사용하여 PCR 산물을 가라앉힙니다. 그런 다음 각 PCR 산물 3 µL를 6배 농축 로딩 다이 1 µL와 혼합합니다. 이 샘플들을 미리 준비한 아가로스 겔의 겔 슬롯에 로딩합니다.크기 표준물질로 사용하기 위해 100 bp DNA ladder 1.5 µL를 겔의 한 슬롯에 로딩합니다. 전기영동 장치의 뚜껑을 닫고 전원 공급 장치에 연결한 후, cm당 100 V로 35분 동안 전기영동을 수행합니다. 전기영동이 끝나면 겔을 꺼내어 미리 준비된 염색조에 약 10분 동안 넣어둡니다.마지막으로, 염색조에서 겔을 꺼내 겔 분석 시스템(gel documentation system)에 놓고 매뉴얼에 따라 시각화합니다. 포식자의 장 내용물을 분석하려면 이전에 준비한 DNA 추출물 작업 용액을 사용하십시오. 16가지 먹이 그룹 특이적 프라이머 세트 각각에 대해 개별적으로 PCR 반응을 수행합니다.해당 먹이 그룹에 속하는 표본의 DNA를 포함하는 양성 대조군 하나와 포식자 종의 DNA를 포함하는 음성 대조군 하나를 포함하십시오. 시퀀싱 플레이트에 샘플을 로딩하여 할당 시퀀서(allotment sequencer)를 통해 검출할 때 서로 다른 샘플이 섞이는 것을 방지하고, 결과적으로 개별 소비처에 잘못된 결과를 할당하는 일을 막기 위해 각 PCR 플레이트 내의 샘플 배치를 정확하게 기록하는 것이 매우 중요합니다. 그 다음, 사용된 각 프라이머 세트에 맞는 특정 어닐링 온도와 사이클 횟수로 조정하여 앞서 설명한 것과 동일한 프로토콜로 PCR 반응을 수행하십시오.이 PCR 반응에서 증폭된 단편을 검출하기 위해, 자동 단편 분석을 A와 B의 두 배치로 나누어 수행합니다. 각 배치에 대해 샘플 로딩 솔루션(SLS)과 해당 크기 표준물질이 포함된 혼합액을 준비합니다. 그다음, 각 배치에 속하는 8개 PCR 반응의 냉동 보관된 PCR 산물을 암소 상태로 유지하며 해동합니다. 미니 원심분리기의 짧은 원심분리(short run) 옵션을 사용하여 튜브 하단으로 모아줍니다.시퀀싱 플레이트에서, 분석할 샘플 수에 해당하는 수의 웰에 각 샘플당 22 µL의 해당 SLS 크기 표준 혼합물을 분주합니다. 그런 다음, 8가지 PCR 반응의 PCR 산물을 각각 1 µL씩 플레이트의 해당 웰에 분주합니다. 이어서, 미니 플레이트 원심분리기의 short run 옵션을 사용하여 이 혼합물을 조심스럽게 원심분리합니다.그 후, 각 웰에 미네랄 오일 한 방울을 떨어뜨려 덮어줍니다. 그런 다음 버퍼 플레이트의 반응 웰에 250에서 300 µL의 DNA 분리 버퍼를 채웁니다. 제조사의 지침에 따라 모세관 시퀀서 소프트웨어를 사용하여 샘플 설정을 생성합니다.샘플 설정 내의 샘플 할당이 시퀀싱 플레이트의 샘플 할당과 일치하는지, 그리고 샘플 설정에 해당 배치를 처리하는 데 적합한 방법이 포함되어 있는지 확인하십시오. 결과를 분석할 때는 각 샘플의 전기영동도를 시각적으로 재확인하고, 각 마커 프라이머 세트에 대해 검출된 각 피크를 개별적으로 확인 또는 미확인하며, 마커 프라이머 세트 기준에 부합하지만 검출되지 않은 피크는 수동으로 삽입하고 잘못된 피크는 삭제하는 것이 중요합니다. 본 프로토콜에서 수행된 PCR 분석을 위해 설정된 그룹 특이적 프라이머 세트의 효율성을 결정하기 위한 먹이 실험을 실시한 후, 포식자의 위장관 DNA를 이용한 PCR 결과는 아가로스 겔 전기영동 및 단일 가닥 컨포메이션 다형성(SSCP) 분석을 통해 분석되었습니다.아가로스 겔 전기영동 결과, 이중 가닥 DNA의 단일 밴드가 나타났으며, 이는 연구 대상인 서로 다른 먹이 종들 간에 구분이 불가능했습니다. 이와 대조적으로, SSCP 전기영동은 장 내용물 샘플을 표준 샘플과 비교함으로써 서로 다른 먹이 종을 성공적으로 구분해 냈습니다. 먹이 섭식 실험 후 물진드기의 장에서 추출한 DNA를 먹이 섭취 후 서로 다른 시간대에 걸쳐 시퀀싱하였습니다.급이 후 1시간에서 50시간 사이에 검출된 먹이 DNA의 상대적 양이 유의하게 감소했습니다. 침입성 단각류인 Dikerogammarus villosus의 장에서 추출한 DNA를 대상으로 본 프로토콜에 기술된 16개의 그룹 특이적 프라이머 세트를 사용하여 대형 무척추동물 먹이 DNA를 테스트했습니다. D. villosus 장 내용물 중 16%만이 대상이 된 16가지 먹이 분류군 중 어느 하나에 속하는 DNA에 대해 양성 반응을 보였습니다.또한, 테스트한 12종의 먹이 분류군 DNA가 최소 하나 이상의 샘플에서 발견되었으며, 4종의 분류군 DNA는 전혀 검출되지 않았습니다. 이 절차를 시도할 때, 사용된 프라이머가 해당 시스템 내의 분류군에 특이적인지 확인하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 실험실에서 일상적으로 사용하는 방법들에 유전자 분석을 보완함으로써 먹이 그물 상호작용에 대한 연구를 확장하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 책자는 DNA를 추출하여 PCR과 RFLP 분석을 수행하여 물고기의 종류를 식별하기 위해 애질런트의 어종 식별 시스템을 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

DNA 기반의 어종 식별 프로토콜

스포 도프 테라 리토 랄리스의 가트와 연관된 활성 박테리아 여행자는 pyrosequencing 기법에 결합 안정 동위체 프로빙 (SIP)에 의해 결정되었다. 이 방법을 사용하여, 지역 사회 내에서 대사 활성 박테리아 종의 식별은 높은 해상도와 정밀도로 이루어졌다.

제너럴의 장내 대사 활성 박테리아의 식별<em&gt; 스포 도프 테라 리토 랄</em&gt; DNA 안정 동위 원소를 통해 사용 프로빙<sup&gt; 13</sup&gt; C-포도당

고해상도 용융 분석 (르마)와 함께 PCR은 제브라 피쉬의 유전자형에 신속하고 효율적인 방법으로 보여줍니다.

고해상도 용융 분석과 PCR을 이용하여 신속하고 효율적인 Zebrafish의 유전자형

실시간 PCR을 통해 해안 퇴적물의 박테리아 16S rRNA 유전자 및 전사체를 정량화하는 프로토콜이 제공됩니다. 이 방법론에는 DNA와 RNA의 공동 추출이 포함됩니다. DNA가 없는 RNA의 제조; 및 표준 곡선 구조를 포함한 RT-q-PCR을 통한 16S rRNA 유전자 및 전사체 정량화.

실시간 PCR에 의한 연안 퇴적물 및 정량 16S의 rRNA의 유전자 및 성적 증명서에서 동시 DNA-RNA 추출

우리는 높은 처리량 시퀀싱을 이용하여 단백질의 종합적인 단일 사이트 포화 돌연변이 라이브러리의 기능 평가를위한 프로토콜을 제시한다. 중요한 것은,이 방법은 라이브러리 구축 및 시퀀싱을 다중화하는 직교 프라이머 쌍을 사용한다. 암피실린의 임상 적 투여 량에서 선택 TEM-1 β-lactamase를를 사용하는 대표적인 결과가 제공된다.

높은 처리량 시퀀싱을 활용하여 전체 - 단백질 포화 돌연변이 유발 도서관의 기능 평가를위한 프로토콜

이 원고는 높은 처리량 16S rRNA amplicon 시퀀싱의 상세한 표준화 된 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 데이터 분석을 통해 배설물 샘플 컬렉션에서 시작 하는 통합, 제복 및 가능한, 저렴 한 프로토콜을 소개 합니다. 이 프로토콜에는 많은 수의 엄격한 표준 샘플의 분석 및 여러 가지 컨트롤 수 있습니다.

16S rRNA Amplicon 시퀀싱에 의해 배설물 미생물 특성화에 대 한 가이드 프로토콜

여기, 우리는 토양, rhizosphere, 및 루트 endosphere microbiomes amplicon 시퀀스 데이터를 얻기 위해 프로토콜을 설명 합니다. 이 정보 구성 및 플랜트 관련 미생물 커뮤니티의 다양성을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 다양 한 종의 식물 사용에 적합.

루트 미생물 탐색: 토양, Rhizosphere, 및 루트 Endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출

Zebrafish는 유전자 편집 기술의 출현으로 특히 생물 의학 연구에서 안정적인 유전자 모델 생물으로 사용 되었습니다. 애벌레 고기 예상 되는, DNA 추출 및 유전자 식별 전하실 수 있습니다. 여기, 꼬리 자르기, 빠르면 72 h 후 수정 하 여, zebrafish 애벌레에 대 한 효율적인 유전형 절차를 설명 합니다.

높은 처리량 DNA 추출 및 지 느 러 미 클리핑에 의해 3dpf Zebrafish 애벌레의 유전형

이 프로토콜은 시분큘러스 누두스 coelomic 유체에서 표적 유전자의 mRNA 발현 수준 및 공간 패턴을 검출하는 situ 혼성화 접근법에 효과적인 설명한다.

시분큘러스 누두스 Coelomic 유체에 대한 시투 혼성화

환경 DNA 분석법은 현장 데이터 수집이 시작되기 전에 엄격한 설계, 테스트, 최적화 및 검증이 필요합니다. 여기서, 우리는 환경 샘플에서 표적 종 DNA의 검출 및 정량화를 위한 종별, 프로브 기반 qPCR 분석의 각 단계를 통해 사용자를 취할 프로토콜을 제시한다.

환경 DNA 응용을 위한 종별 정량PCR 분석의 개발 및 시험

이 프로토콜은 남부 텍사스 해안 습지에서 주요 메탄 순환 유전자를 검출하고 공간 분포를 시각화하여 이러한 역동적인 생태계에서 메탄 조절과 메탄 조절이 환경에 미치는 영향에 대한 이해를 높입니다.

해안 습지에서 메탄 순환 미생물 역학 시각화

학습하세요 수생 소비자의 먹이 소비를 유전학적으로 분석하는 방법을 통해 영양 생태학 연구를 개선하는 기술입니다. Dikerogammarus villosus를 포함한 무척추동물 먹이 식별이 가능하며 침입종이 먹이 그물에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다.

Macroinvertebrates 사용 하 여 그룹별 수생 rDNA 뇌관의 유전 직감 콘텐츠 분석을 위한 실험실 프로토콜

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