외상 성 부상에 의해 영향을 하는 뇌 영역의 정위 적 아틀라스 유도 레이저 캡처 기정

이 레이저 캡처 미세해부 프로토콜의 전반적인 목표는 분자 분석을 위해 외상성 뇌 손상의 영향을 받은 특정 뇌 영역에서 세포를 수집하는 것입니다. 저는 헬렌 헬미치 박사입니다. 텍사스 대학교 의과대학의 인간 병태생리학 및 중개 의학 프로그램의 학생인 제 대학원 조교인 Harris Weisz는 뇌 손상 연구에서 레이저 캡처 현미해부 방법을 어떻게 사용하는지 시연할 예정입니다.

이 방법은 실행 기능을 제어하는 전두엽 피질(frontal cortex)과 같은 개별 뇌 영역에서 TBI로 인한 변화의 메커니즘과 결과를 설명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그리고 메모리 의존 과정에 중요한 해마. 이 기술의 주요 장점은 동일한 뇌의 여러 개별 뇌 영역 또는 개별 세포 유형에 대한 질병 과정의 영향을 연구할 수 있다는 것입니다.

전사 분석을 포함하는 LCM 절차 전에 RNace 제거 세제로 모든 표면을 청소하여 오염 및 RNA 분해 위험을 완화하십시오. 저장소에서 뇌 조직을 회수합니다. 그리고 섭씨 영하 20도까지 냉각된 시로스타트에 넣으십시오.

뇌가 약 10분 동안 저온 유지 챔버의 온도와 평형을 이루도록 합니다. 뇌를 배쪽이 위로 향하게 하여 저온 유지 장치 단계 위에 있는 거즈 시트에 놓습니다. 깨끗한 RNA를 사용하여 면도날을 사용하여 소뇌 바로 앞쪽에 있는 뒤쪽 부분과 시신경 바로 앞쪽 부분을 잘라냅니다.

소량의 최적 절단 온도 매체를 두 개의 개별 크라이오 몰드에 넣습니다. 전두엽 연관 피질과 측좌핵 코어를 포함하는 뇌를 하나의 극저온 주형 내부가 아래로 향하게 놓습니다. 조직을 덮을 수 있을 만큼 충분한 OCT 배지를 추가합니다.

해마와 시교차상핵(suprachiasmatic nucleus)을 포함하는 뇌 조직 조각으로 이 단계를 반복합니다. OCT 배지를 저온 유지 장치에서 약 20분 동안 완전히 동결시킵니다. 조직과 OCT 배지가 완전히 얼면 마운팅 헤드에 소량의 OTC를 짜냅니다.

얼어붙은 크라이오몰드를 마운팅 헤드에 누르고 OCT가 완전히 얼도록 하여 조직을 포함하는 몰드가 헤드에 단단히 부착되도록 합니다. 헤드 부착물을 섹션 마운트에 고정하고 나사를 조입니다. 조정 레버를 사용하여 저온 유지 장치 블레이드와 관련하여 절단 각도를 조정하여 섹션이 균일하게 절단되도록 합니다.

단면 두께를 30미크론으로 설정합니다. 해마와 SEN을 포함하는 조직 블록을 절편화할 때, 제3심실이 뚜렷해지면 시신경이 브레그마 0.48mm에서 평평해질 때까지 절편화합니다. 그런 다음 절편된 조직 위에 실온 폴리에틸렌 나프탈레이트 멤브레인 슬라이드를 부드럽게 배치하여 이 지점에서 SEM에 대한 절편을 수집합니다.

조직과 OTC가 슬라이드에 완전히 녹았는지 확인하여 슬라이드에 대한 접착력을 시각적으로 확인합니다. 조직 절편이 있는 모든 슬라이드는 염색될 때까지 저온 유지 장치에 보관하십시오. supraoptic decussation이 시작될 때 bregma 0.72mm에서 수집 절편을 중지합니다.

해마 채취의 경우, 과립 세포층 치상 회랑의 뿔이 브레그마 3.00mm에서 보일 때까지 절단합니다. 해마 CA 하위 필드가 브레그마 4.78mm의 관상 절편에서 융합될 때까지 절편을 수집합니다. 이를 통해 개두술 및 부상 부위 아래의 해마를 완전히 수집할 수 있습니다.

염색하기 전에 RNase 제거 세제로 화학 흄 후드에서 모든 식기와 염색 부위를 세척하십시오. 저온 유지 장치에서 측면 랙을 가져와 흄 후드에 놓습니다. 슬라이드를 30초 동안 따뜻하게 합니다.

크레실 바이올렛으로 섹션을 염색하고 식염수로 투명하게 염색합니다. 스테인드 슬라이드 랙을 흄 후드의 실온에서 10분 이상 자연 건조하지 마십시오. 건조되면 즉시 LCM으로 진행하십시오.

RNA 분석을 위한 LCM 절차를 시작하기 전에 RNAse 제거 세제와 100% 에탄올로 채취 영역과 장치 주변을 닦아냅니다. 현미경 베이스를 켜기 전에 적외선 레이저 생성 장치의 전원 스위치를 뒤집고 데스크탑에서 소프트웨어를 시작하기 전에 시스템이 초기화되도록 합니다. 소프트웨어가 부팅되고 실행되면 초기화 단계가 수행되지만 소프트웨어 설정 패널을 열고 현재 단계 버튼을 누릅니다.

모듈식 스테이지는 LCM 매크로 캡 및 슬라이드를 적재 및 오프로드하는 위치로 이동합니다. 최대 3개의 펜 멤브레인 슬라이드를 젖빛 가장자리가 오른쪽을 향하도록 홀더에 넣습니다. 해당 슬라이드 옆에 있는 캡 및 슬라이드 처리 영역을 선택하고 MEM 확인란을 클릭하여 멤브레인 유리 슬라이드가 로드되었음을 소프트웨어에 알립니다.

그런 다음 먼저 캡처할 슬라이드를 클릭합니다. 캡 배치를 위한 조직 위치 및 방향에 대한 바둑판식 이미지를 캡처하려면 도구 모음에서 이미지를 선택하고 개요 획득을 선택합니다. 바둑판식 이미지의 영역 위에 커서를 놓고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭한 다음 Place cap at region center를 선택합니다.

소프트웨어가 선택한 위치에 자동으로 캡을 놓습니다. 적외선 및 UV 레이저를 찾은 후 선택 도구 창에서 자유형 그리기 옵션을 선택합니다. 터치 스크린 스타일러스를 사용하여 관심 영역의 둘레를 그리면서 터치 스크린과 스타일러스 헤드 사이의 접촉을 잃지

시작점과 끝점을 함께 연결해야 합니다. 해마 수집을 위해 레이저는 브레그마 3.00mm에서 시작하여 CA1, CA2 및 CA3 해마 하위 필드를 캡처하고 완전히 형성된 치상회(dentate gyrus)의 과립층을 형태학적 식별의 물리적 랜드마크로 사용합니다. 채취 후 LCM 매크로 캡을 QC 위치로 이동하고 UV 절단 조직이 멤브레인에 부착되어 있는지 육안으로 확인하여 완전한 조직 부착을 검사합니다.

UV 레이저는 조직 전체를 절단해야 합니다. 그렇게 하지 않으면 조직이 LCM 캡에 불완전하게 부착되는 결과를 초래할 수 있습니다. 그런 다음 각 캡을 100마이크로리터의 세포 리수스 완충액이 들어 있는 RNAse가 없는 0.5밀리리터의 얇은 벽 반응 튜브에 빠르게 넣습니다.

완전한 리수스를 확인하기 위해 샘플을 잠시 소용돌이치고 다운스트림 게놈 분석을 수행할 준비가 될 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 다음은 LCM 시스템의 적외선 및 UV 레이저 기능을 사용하여 부상 부위의 외측 측에서 수집된 조직 절편의 대표적인 이미지입니다. 이것은 전두엽 연합 피질의 영역입니다.

이 이미지는 수집 후 동일한 지역을 보여줍니다. 그리고 이것은 채취 후 뚜껑에 있는 조직입니다. 이 이미지는 치상회(dentate gyrus)의 중력층(granual layer)의 완전히 형성된 뿔(horns) 옆에 위치한 해마(hippocampus)의 CA1, CA2 및 CA3 파라미탈층(parameatal layer)의 구성 요소를 보여줍니다.

CA2 및 CA3 영역을 수집했으며 이러한 세포 집단을 캡에서 볼 수 있습니다. 여기서, 전방(anterior commissure)에 대한 핵 accumbens core proximal adrostral의 영역이 표적으로 삼았으며, 캡에 충실하게 재현되어 있었다. 마지막으로, 시상(supraoptic chiasm)에 대한 시교차상핵(suprachiasmatic nucleus rostral)은 TBI 후 LCM에 의해 포획되었습니다.

이 기술을 완전히 익히면 약 8시간 안에 하나의 뇌를 처리하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에는 조직 처리, 염색 및 LCM이 포함됩니다. 이 절차에 따라 메틸화 패턴 또는 미세닉 발현에 관한 질문에 답하기 위해 후성유전학적 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 동일한 뇌의 여러 뇌 영역에서 LCM을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.