Name: 외상 성 부상에 의해 영향을 하는 뇌 영역의 정위 적 아틀라스 유도 레이저 캡처 기정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 배우세요 외상성 뇌손상 영향을 받는 쥐 뇌 특정 영역에서 세포를 분리하는 레이저 캡처 현미절단법을 활용한 분자 분석 기술입니다. 이 방법은 전두엽과 해마 등에서 유전자 및 microRNA 발현을 정밀하게 연구할 수 있게 합니다.

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우리는이 원고를 편집 하는 그녀의 도움에 대 한 섬 너 엘리자베스를 인정 하 고 싶습니다. 이 프로젝트에 대 한 자금 의해 제공 했다 일부는 무디 프로젝트 변환 외상 성 뇌 부상 연구 및 RO1NS052532 HLH 하.

참고: 관리 및 활용에 대 한 국가 학회 건강 가이드의 지시에 따라 모든 동물 실험 기관 동물 관리 및 사용 텍사스 의학 지점, Galveston, 텍사스의 대학 위원회에 의해 승인 실험 동물 (8 판, 국가 연구 위원회).
 1. 조직 컬렉션, 지역 식별 및 단면화 <ol><li>주제 성인, 남성, Sprague-Dawley 쥐, 대략 6 주 오래 된, 250-300 g, 실험 유체 타악기 부상, 쉬 마무 라 외에 설명 된 대로. 4.</li> <li>실험 TBI 후 24 시간 고통 없이 4%까지 깊이 취 isoflurane 농도와 챔버에 배치 하 여 동물을 안락사. 잘린 여 죽음을 보장, 두뇌, 소비 세 및 즉시 가루 드라이 아이스에 동결. 단면까지-80 ° C 냉장고에 머리를 고정 하는 게.</li>
	<li>이전 transcriptional 분석을 포함 하는 모든 LCM 프로시저에 오염 및 RNA 저하에 대 한 위험을 완화 하려면 제거 세제 RNase와 모든 표면을 청소. 
	참고: 얼룩, cryostat 어디 조직 구분은, 사용 하는 지역과 LCM 장치 주변 지역 포함이 청소.</li>
	<li>Cryostat-20에 냉각에 스토리지 및 장소에서 뇌 조직의 검색 ° C. 허용 뇌 ~ 10 분 cryostat 챔버의 온도에 equilibrate</li>
	<li>는 Cryostat 무대 위에 거 즈 시트를 뇌 복 부 측을 놓습니다. 깨끗 한, RNase 무료 면도날으로 잘라 후부 부분 소 뇌에 그냥 rostral (수 저장 하거나 삭제) 시 chiasm (그리고) 그냥 앞쪽 부분.</li>
	<li>두 개의 별도 cryomolds로 최적의 절삭 온도 (10 월) 매체의 작은 금액을 놓습니다. 두뇌 (및 포함 하는 정면 협회 피 질 (FrA) 핵 accumbens 코어 (AcbC)) cryomolds 앞쪽 측면에 아래로 놓습니다. 충분 한 10 월 매체 조직을 커버를 추가 합니다.
	<ol><li>마 (Hp) 및 suprachiasmatic 핵 (SCN) 포함 하는 뇌 조직으로이 단계를 반복.</li>
		<li>는 cryostat에서 ~ 20 분 동안 완전히 동결 OCT 매체 허용.</li>
	</ol></li> <li>조직과 10 월 중간 완전히 고정 하 고, 일단 장착 머리에 시비 거는 작은 양의 10 월 누르고 언된 cryomolds 장착 머리에 조직 포함. 허용 형 조직을 포함 하는 머리에 단단히 부착 되도록 완전히 동결 OCT.</li>
	<li>단면 마운트 헤드 첨부 파일 보안 하 고 나사를 조입니다. 섹션 고르게 잘라 되도록 조정 레버 cryostat 블레이드 관련 절단 각도 조정.</li>
	<li>30 µ m 섹션 두께 설정합니다. 단면화 이용 및 AcbC를 포함 하는 조직 블록 때 먼저 단면화 대뇌 피 질은 분명 때까지 하 고 다음 시작 수집 시작.</li>
	<li>두어서 부드럽게 sectioned 조직 위에 실내 온도 폴 리 에틸렌 napthalate (펜) 막 슬라이드는 프랑스에 대 한 보조 모터 피 질 (M2까지 쥐 뇌 아틀라스 12, 섹션 및 수집 뇌 참조 섹션 ) Bregma 5.16 m m에 도달.
	<ol><li>시각적으로 검사 하는 경우 조직 및 10 월 슬라이드에 완전히 녹아 슬라이드에 부착을 보장. 얼룩까지 있는 cryostat 조직 단면도 있는 모든 슬라이드를 저장.</li>
	</ol></li> <li>구분 (aca) 전방 commissure 표시 됩니다 Bregma 1.80 m m에서 지금 명백한 측면 심 (LV) 아래 하나의 완전 한 commissure에 통합 될 때까지 계속.</li>
	<li>Bregma에 aca와 연결 하는 정 맥 주사까지 수집 섹션 표시 0.84 m m.</li>
	<li>FrA를 AcbC 단면을 완료 하면, 탑재 된 조직 블록을 제거 하 고 HP와 SCN을 포함 하는 블록을 바꿉니다.</li>
	<li>는 그리고 병합 됩니다 Bregma에-0.48 m m, 제 3 심 (3V) 명백한 될 때까지 섹션.</li>
	<li>수집 섹션-0.72 m m, supraoptic decussation (sox) 시작 될 때 Bregma까지이 시점에서 SCN. 
	참고: 그것은 그리고를 통해 더 많은 조직 단면도는 SCN은 쉽게 통과 수집 해야 할 수 있습니다.</li>
	<li>HP 컬렉션에 대 한 섹션까지과 립 세포의 뿔이 이랑 (GrDG) 레이어는 가시 Bregma에 명백한-3.00 m m.</li>
	<li>수집 섹션 hippocampal CA 하위 Bregma에 코로나 섹션 융합 하는 때까지-4.78 m m. 이 세부 craniotomy 부상 사이트에서 해 마의 완전 한 컬렉션에 대 한 수. 
	참고:이 실습에서 이전 간행물 같이, 가장 부상된 셀이이 범위 내에서 명백한 되며 유전자 또는 예측에 관한 식 분석에 적합.</li>
</ol> 2. 프로토콜을 얼룩이 RNase 제거 세제와 화학 증기 두건에서 얼룩 지역 및 <ol><li>이전 모든 얼룩, 세척에 식기. 오염으로 인 한 RNA 저하의 위험을 완화 하는이 준비.</li>
	<li>준비 모든 착 색 시 약 및 nuclease에 솔루션 무료 물.</li>
	<li>는 Cryostat 및 증기 두건에서 장소에 저장 하는 슬라이드의 랙 걸릴. 솔루션 (nuclease 무료 물 준비) 다음과 같이 얼룩으로 그들 30 s. 장소에 대 한 따뜻한 슬라이드 수: 75% EtOH nuclease 무료 1 분 1 분, 1 분 동안 1 %cresyl 바이올렛, 30 nuclease 무료 물 물 s, nuclease 무료 물 30 s 95% EtOH 30 s, 100% EtOH 30 s, 3 분, 크 실 렌 및 크 실 렌 3 분 위한</li>
	<li>선반 증기 두건에서 실 온에서 10 분 더 이상으로 보다에 대 한 건조를 허용 합니다. 또는, 빨리 건조 Rnase 무료 진공 desiccator에 선반 장소. 건조 되 면, LCM에 즉시 진행.</li>
</ol> 3. 정위 적 아틀라스 유도 레이저 캡처 기정 LCM 시스템 <ol><li>RNA 분석에 대 한 어떤 LCM 절차를 시작 하기 전에 닦아 컬렉션 영역과 RNase 제거 세제와 100% 장치 주변 EtOH.</li>
	<li>에 IR 레이저 단위를 생성 하는 기본, 현미경을 켜기 전에 전원 스위치를 플립 하 고 시스템 소프트웨어를 바탕 화면에서 시작 하기 전에 초기화을. 
	참고:이 순서로 완료 하지 소프트웨어 인식 하지 것입니다 현미경.</li>
	<li>소프트웨어는 부팅 하 고 그것의 초기화 단계를 통해 실행, 눌러는 &#34; 현재 단계 &#34; 소프트웨어에 단추 &#34; 설치 패널. &#34; 모듈 단계 어디 LCM 매크로 모자와 슬라이드 수 로드 하 고 로드 하는 위치로 이동 합니다.</li>
	<li>오른쪽으로 직면 하 고 반투명 가장자리 펜 막 슬라이드 (최대 한 번에 3) 홀더를 배치. 
	참고: 잘못 된 방향에서 보유자에 배치 하는 경우 소프트웨어 않을 수 있습니다 원하는 적외선 또는 자외선 절단 영역을 제대로 인식할 수.</li>
	<li>클릭은 &#34; Mem &#34;에 체크는 &#34; 모자와 슬라이드 처리 영역 &#34; (즉, A, B 또는 C) 각각 슬라이드 옆. 이 단계는 슬라이드 막 유리 슬라이드 인지 나타냅니다. 다음 먼저 캡처할 원하는 슬라이드를 클릭 합니다.</li>
	<li>조직 위치에 대 한 타일된 이미지와 모자 게재 위치에 대 한 방향 카메라를 만들기 위해 선택 &#34; 이미지 &#34; 선택 하 고 도구 모음에서 &#34; 취득 개요. &#34; 
	참고: 사용자가 수집 되 고 조직에 익숙한 경우이 단계를 생략할 수 있습니다 위치 수동 스크롤 볼을 사용 하 여는 &#34; 지역 센터 &#34; 컬렉션에 대 한.</li>
	<li>타일된 이미지 (또는 타일된 이미지 없이 상대 위치) 영역에 커서를 놓고 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 선택 &#34; 장소 모자에서 지역 센터. &#34; 소프트웨어는 자동으로 놓고 모자를 선택한 위치.</li>
	<li>위치 선택. 
	참고: IR 레이저 제대로 정렬 되 고 유일한 지역 관광 명소는 소프트웨어에 의해 누워 있다 데리 러 것입니다 수 있도록 그것은 해야 합니다 있는 진행 하기 전에.
	<ol>
		<li>이동 지역 내의 없는 조직 존재 합니다. 클릭 &#34; 나 &#34;에 &#34; Microdissect 도구 창 &#34; 선택은 &#34; IR 찾기 &#34; 탭. 창에서 화재 IR 레이저 발사 되 고 반점의 크기를 평가 하기 위해 총 IR 테스트.</li>
		<li>커서, IR 자리 및 선택 중간 클릭 마우스 오른쪽 &#34; 있는 IR 자리. &#34; 
		참고: IR 광선의 강도와 크기 바뀔 수 있다 수동으로 변경 하 여는 &#34; 전력, 직경, 또는 기간 &#34; 각 크기 지정자 또는 대화 상자 아래쪽에 슬라이딩 스케일을 이동 하 여. 몇 가지 테스트 샷 적절 한 크기를 위해 해 고 할 수 있습니다. IR 레이저 모자 변경 또는 슬라이드의 위치 전환 때마다 다시 위치 해야.</li>
		<li>UV에 대 한 선택 하 여 UV 레이저를 찾습니다,는 &#34; UV 찾기 &#34; 대화 상자에 탭. 
		참고: UV 레이저와 적외선 레이저 한 마음으로 이동, 이므로 지속적으로 다시 찾아 UV 레이저 위치 변경 때마다 필요가 없습니다.</li>
	</ol></li> <li>선택은 &#34; 자유 그리기 &#34; 옵션은 &#34; 선택 도구 창 &#34;. 터치 스크린 스타일러스를 사용 하 여 터치 스크린 및 스타일러스 머리 사이의 접촉을 잃게 하지 않도록 하면서 관심 영역의 둘레의 주위에 그립니다. 시작 그리고 종점을 함께 연결 확인. 
	참고: IR 관광 명소 것입니다 운영할 수 자동으로 소프트웨어를 통해 하지만 사용자 조직 모자 UV 절삭 수행 된 후으로 준수 되도록 추가적인 관광 명소 누워 하도록 선택할 수 있습니다.</li>
	<li>이용에 대 한 컬렉션 수행 M2 피 Bregma 5.16 m m에 나타날 때까지 대뇌 피 질의 조직의 총 레이저 캡처. 
	참고: 프랑스 또는 특정 셀의 특정 부분만 수집 되도록 수정 될 수 있습니다이 세부.</li>
	<li>위한 AcbC 컬렉션, 레이저 캡처는 aca에 근접에 있는 지역 가까운. 
	코어와 쉘에 AcbC의 다른 기능을 수행 하 고 순수 독특합니다. 따라서 뇌 아틀라스 최대한 가까이 따르는 것이 중요 하다. 더 bregma 0.84 m m, 두 과거에서 수집 하는 것이 좋습니다 오는 아구 너무 밀접 하 게 서로와 연관 된다.</li>
	<li>Hp에 대 한 컬렉션, 레이저 캡처 CA 1, 2, 및 3 hippocampal 하위 Bregma 3.00 m m에서 시작 하 고 형태학 식별에 대 한 물리적 랜드마크로 완전히 구성 된 GrDG를 사용 하 여. 
	참고:이 연구의 목적을 위해 수집 하지 않습니다 Bregma 과거-4.78 m m, 수 수 시각적으로 경계선 지점으로 Hp 하위 융합 되 고 ventrally 포인트. 이 지역 선정 되었다 가장 부상 뉴런 부상 사이트 6 바로 아래 발견 될 수 있다.</li>
	<li>SCN 컬렉션, 먼저 시각적으로 식별 하는 및에 지 앉아서 다음 수집 밀도가 포장된 핵.</li>
	<li>지역 (위에 나열 된)의 컬렉션, 후 이동에 LCM 매크로 모자는 &#34; QC 위치 &#34; UV 컷 조직 시각적으로 함으로써 완전 한 조직의 준수 막에 연결에 대 한 검사. 신속 하 게 캡 ontoan RNase 무료 0.5 mL 얇은 벽으로 둘러싸인된 반응 관 세포 세포의 용 해 버퍼의 100 µ L를 포함 된 장소.</li>
	<li>소용돌이 샘플 짧게 완전 한 세포를 확인 하 고-80 ° c.에 저장 이 시점에서, LCM을 일시 중지할 수 있습니다 및 샘플 저장 될 때까지 다운스트림 게놈 분석 6.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

포유류 두뇌의 분자 연구, LCM는 필수적인 기법 되고있다. 이 문서에서는 LCM 시스템에 IR 및 UV 절단 레이저의 조합을 사용 하 여 포유류 두뇌의 모든 지역에서 게놈 변화를 캡처할 수 있습니다 보여 줍니다. 이 지역 cresyl 바이올렛 이나 되며, 오신 등 기존의 LCM 호환 얼룩 식별 포함 됩니다. 레이저 캡처 프로세스와 펜 막 슬라이드에 두꺼운 30 µ m 섹션에 LCM을 수행 하는 능력의 속도 뿐만 아니라 충분 한 양의 세포 샘플을 얻을 뿐만 아니라 모든 종류의 다운스트림에 대 한 적합 한 품질의 LCM 샘플에서 RNA를 분리 수 있습니다. 게놈 분석; 이러한 분석 등 microarrays16, PCR 배열17, 양적 실시간 PCR18.
우리의 데이터는 LCM 조직을 활용 하는 연구에 대 한 근거를 제공 합니다. 보면 그 미르-15b upregulated 해 마와 대뇌 피 질 (그림 4) 하지만 핵 accumbens에서 downregulated 이며 생물학적으로 두뇌에 있는 TBI의 차동 효과의 이해에 관련 될 수 있습니다. 이전 연구는 부상으로 대뇌 피 질의 신경 취약성 증가 부정적인 Bcl-219등 프로 생존 유전자를 통제 하는 몇몇 miRNAs의 overexpression에서 결과 제안 했다. 대상 검색 분석 쇼 Bcl-2 미르-15b;에 의해 또한 통제 된다 따라서, 우리의 데이터 제안 왜 기계 설명 두뇌의 특정 지역 (즉,, FCx) 선택적으로 TBI에 취약할 수 있습니다. 그것은 대부분 유전자 여러 miRNAs에 의해 통제 된다 유전자를 특정 대상에 어떤 한 미르에 변화를 상호 연결 하는 것은 어려운 기억 하는 것이 중요. 또한, 이러한 데이터를 나타내는 유전자와 예측에 관한 식에서 특정 변화 지역별 뇌 손상의 생체로 사용할 수 있습니다. 실제로, 우리는 현재이 데이터 사용 하 여 이러한 연구에서 새로운 신경의 항우울제 특성을 가진 약물 화합물 차동 영향을 미칠 수 정신병 무질서에 연결 된 두뇌 지구에서 유전자와 예측에 관한 식. 우리의 연구의 한 가지 한계는 LCM에 대 한 슬라이드 준비 프로세스의 여러 단계 중 RNA 무결성 있습니다 될 손상입니다. 이 프로토콜 RNA 저하의 위험을 완화 하는 데 필요한 단계를 설명 합니다. 또 다른 한계 통계 계산을 위해 사용 되는 상대적으로 작은 샘플 크기입니다. 미래에 연구, 샘플 크기를 늘리면 개별 동물 중에서 유전자와 미르 식 유사의 효과 완화 해야 합니다.
LCM의 혜택은 인간의 질환과 질병 조직20,21,,2223의 동물 모델을 사용 하 여 변환 게놈 연구에서 실현 된다. 특정 세포 인구를 잡으려고 능력 없이 다른 뇌 영역의 transcriptional 프로필 많은 종류의 세포는 알 수 없는 및 undecipherable 믹스 것입니다. LCM 메서드를 사용 하 여 뇌 손상 연구에서 주도하 고 있다 현재 노력 두뇌 지역 특정 생체 윤곽을 그리 다 하 고 어떻게 그들이 TBI의 생체 순환 연관 이해 하.

포유류 두뇌는 너무나 복잡 하 고 셀 유형1의 수천 수백와 함께 이종. 실제로, 인간 연구를 담당, 등의 지역에서 구조 그리고 백색과 회색 문제에 기능적인 차이 고 분기 transcriptional 프로필2에 반영 됩니다. 두뇌가 유전자 표현 데이터를 해석 하는 주요 장애물이 되었습니다와 뇌 손상의 필드. 전 임상 연구에서이 모호성 이후 수백 뇌 부상3에 대 한 치료의 실패 한 임상 시험을 주도하 고 있다.
레이저 캡처 기정 (LCM) 메서드를 사용 하 여 외상 성 뇌 손상 (TBI)를 공부 하는 우리-유전자는 쥐 두뇌4, 해 마, 학습 및 메모리5필수적인 뇌 영역에 초점을 맞추고 dysregulation를 유도. 레이저 캡처 모두 죽어가 고 살아남는 신경 세포에 유전자 발현을 분석 하는 기능 TBI6후 결과 (신경 생존) 결정 유전자 발현에서 stochasticity의 역할의 이해를 제공 합니다. LCM 기술은 또한 젊고 노화 생쥐7 또는 쥐8비교할 때 hippocampal 신경에 TBI의 효과 탐험 하는 데 유용 입증 했습니다.
최근 연구에서 우리는 쥐와 인간의 TBI 환자 TBI comorbidities; 고 집행 기능 (즉, 담당9)와 관련 된 분야에 초점을 맞춘 TBI에 의해 부정적인 영향을 쥐 두뇌의 다른 지역 검사 이러한 comorbidities 우울증(예: 핵 accumbens10) 등 circadian 리듬 장애 (suprachiasmatic 핵11). 이전 연구, Huusko 및 Pitkanen12 , Drexel 외. 13 시상과 시상 하 부에 유전자 발현 검사 LCM을 사용. 우리의 학문이 이전 관측을 근간 하 고 4 개의 다른 뇌 영역을 포함. TBI 후 유도 지역별 분자 변화 연구, 식별 하 고 LCM 시스템을 사용 하 여이 영역에서 셀 형식을 취득 전문 지식을 얻을 하는 데 필요한 했다. UV-절단 및 적외선 (IR) 레이저 원하는 뇌 영역의 정확한 서 하실 수 있습니다. 여기, 우리가 어떻게 식별 하 고 차동 실험 유체 타악기 뇌 부상 방법에 의해 영향을 받는 캡처 4 쥐 뇌 영역 레이저 쥐 뇌 아틀라스14, stereotaxic 좌표에 의해 유도이 LCM 시스템 사용 설명 4.

<table><tbody><tr><td>Arcturus 레이저 캡처 미세해부 시스템</td><td>응용 바이오시스템 (Life Technologies)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 6000 Pico Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus PEN Membrane Glass Slides&nbsp;</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>LCM0522</td><td></td></tr><tr><td>Capsure LCM caps</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>LCM0211/LCM0214</td><td></td></tr><tr><td>크레실 바이올렛 아세테이</td>트 <td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>크실렌 (조직학적 등급)</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 200 증거 (조직학적 등급)</td><td>UTMB Pharmacy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous Micro- Kit</td><td>Life Technologies (Ambion)</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>Taqman 유전자 발현 프라이머/프로브</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>Taqman microRNA Expression Primer/Probes</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>A25576</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 96 System</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

외상 성 부상에 의해 영향을 하는 뇌 영역의 정위 적 아틀라스 유도 레이저 캡처 기정

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

관심의 특정 뇌 영역을 분리 하는 능력은 그들의 공간 분포를 보존 하지 않는 조직 분열 기법에서에 장애가 될 수 있습니다. 과정 자체 개별 셀에 식 패턴을 변경할 수 있기 때문에 이러한 기술 또한 잠재적으로 유전자 표정 분석을 왜곡. 여기는 수정된 Nissl (cresyl 바이올렛) 얼룩 프로토콜 및 쥐 뇌 아틀라스의 지도 사용 하 여 외상 성 뇌 손상 (TBI)에 의해 영향을 하는 특정 뇌 영역을 선택적으로 수집 하는 레이저 캡처 기정 (LCM) 방법에 설명 합니다. LCM 뇌 영역 그들의 기본 위치와 신분의 각 특정 지역에 대 한 해부학 적 랜드마크를 사용 하는 기능에 액세스할 수 있습니다. 이 위해, LCM 이전 TBI에 두뇌 지역 특정 유전자 발현 검사에 사용 되었습니다. 이 의정서는 같은 동물 내에서 뚜렷한 뇌 영역에 유전자와 예측에 관한 식에서 TBI 유도 변경의 시험을 허용 한다. 이 프로토콜의 원칙 개정 고 다른 질병 및 동물 모델에서 게놈 식 조사 연구의 넓은 범위에 적용 될 수 있습니다.

그림 1 에서 제시 하는 회로도 특정 뇌 영역 및 잠재적인 다운스트림 분석 응용 프로그램의 인도 아틀라스 LCM의 전체 워크플로 보여 줍니다. 이 연구는 TBI 이상 comorbidities의 개발 하 고 관련 4 개의 두뇌 영역에 초점을 맞춘: FrA, AcbC, SCN, 그리고 Hp. 특정 뇌 영역의 한계 LCM에는 해 부 위치 그림 2 (A, D, G, J)에서 볼 수 있듯이 정의 된 경계의 부족에 의해 가려진 자주는 이다. 단면 안내 및 특정 지역의 캡처 레이저 뇌 아틀라스의 사용 대상 이외의 뇌 영역 샘플 오염의 가능성을 감소 시킨다. 주의 단면 중 고 Nissl 염색 후 조직 랜드마크를 따라 때 LCM 기술은 세포, 핵, 또는 지역15의 개별 인구를 인수 하는 높게 일관 된 수단을 제공할 수 있습니다. 이러한 연구의 장기 목표 유전자와 microRNAs 대리,으로 잠재적으로 사용할 수 있는 비-침략 적 생체 두뇌 지역 특정 상해의 식별 하는. 이 바이오 마커 개발 파이프라인의 첫 단계 실험 TBI 후 조직의 특정 transcriptional 변화의 특성 이다. 이러한 데이터는 biofluids 순환에서 부상 유발 변경 다음 상관 수 있습니다.
제시 절차 통해 양적 실시간 PCR (RT-정량) 전에 총 LCM RNA의 반전 녹음 방송 RNA 분석을 허용 하기 위하여 RNA 저하의 위험을 줄이기 위해 최적화 되었다. (를 포함 하 여 크고 작은 RNA 종) 총 RNA 격리 된 개별 뇌 영역에서 레이저 캡처 했다 조직에 열 기반 격리 방법을 사용 하 여 했다. 격리 절차 후 RNA 무결성, 품질 및 수량 평가, RNA 샘플 짧게 70 ° C에서 변성 되었고 RNA 분석기에서 실행. 질적 측정 포함 18 및 28s rRNA 밴드 (그림 3), 전반적인 저하의 대표 될 수 있는의 피크 진폭을 분석 하 고 번호를 사용 하는 "RNA 무결성" (린). 경우 주의 RNase 무료 기술을 사용 하 여, RNA 격리 LCM 샘플에서 일반적으로 6-8에서 신장에 결과. 더 낮은 린 RNA 품질을 암시 할 수 있다 하 고 잠재적으로 유전자와 예측에 관한 식 분석의 정확성을 줄일 수 있습니다. 반대로, 높은 린 RNA 분석에서 생성 된 결과의 타당성에 신뢰를 높일 수 있습니다.
실시간 정량 Pcr 뇌관/프로브 세트를 사용 하 여 개별 유전자와 microRNAs (그림 4)에 대 한 수행 했습니다. 약 1 ng 총 RNA의 cDNA에 리버스 변하게 되었고 미리 증폭 정량 제조 업체의 프로토콜에 따라 수행 하기 전에. 상해 관련 유전자 연구에서 평가 포함 BCL2 연결 X, Apoptosis 레 귤 레이 터 (Bax), B-세포 CLL/림프 종 2 (Bcl-2), Caspase 3, Apoptosis-Related 시스테인 Peptidase (Casp3) 두뇌 파생 된 Neurotrophic 요인 (Bdnf), 그리고 캠프 응답 요소 단백질 1을 묶는 (Creb). 미르-15b 개별 죽어가는 신경 세포에 실험 TBI 후 변경할 표시 되었습니다 때문에 선정 되었다. 그것은 또한 있다 실험적으로 유효성을 검사 하 고 bioinformatically 유전자 대상 프로 생존 기능 (게시 되지 않은 데이터)를 예측 했다. 정규화 된 배-변경 비율 TBI 동물 및 내 인 성 유전자 (Gapdh) 또는 작은 RNA (U6), 정규화 순진한 컨트롤에서 유전자와 예측에 관한 식 레벨을 각각 비교 하는 ΔΔCt 방법에 의해 계산 되었다. 1 위의 배 변경 해당 유전자 또는 예측에 관한, 전반적인 upregulation 나타내고 반대로, 겹 변경 1 나타냅니다는 downregulation 보다 낮은. 통계 분석이 보여주었다 중대 한 변화 TBI와 순진한 제어 (p ≤ 0.05) 유전자 발현에 뇌 영역을 의존 했다. 미르-15b 식에 중요 한 변경 TBI와 순진한 제어 감지 했다 하지만 뇌 영역 종속 패션에 높고 낮은 식으로 동향. 이러한 데이터는 추가 최적화는 예측에 관한 식에서 변화를 평가 하는 데 필요한 것이 좋습니다. 그것은 또한 가능한 샘플 크기는 너무 작아서 식에서 고유의 가변성 때문에 통계적 의미를 얻을 수입니다. 미래 연구는 그 유전자를 위해 운영 하는 가짜 동물 포함 됩니다 그리고 예측에 관한 식 변화는 TBI 하 고 수술 준비 때문.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig1.jpg"> 
그림 1입니다. 다운스트림 게놈 분석에 대 한 아틀라스 기반 LCM의 워크플로. (A-F) 다운스트림 정량 분석에서 동물 준비 절차: (A) 성인, 남성 Sprague Dawley 쥐 (나이 및 무게 300 g ~ 6 주) 취, 유체 타악기 TBI, 대상이 고 부상 후 24 h를 고통 없이 안락사. (B) 직렬 섹션 (30 µ m) 신선한 냉동된 두뇌의 기반으로하 Paxinos와 왓슨의 쥐 두뇌 아틀라스에서 특정 뇌 영역 (FrA, AcbC, Hp, SCN)의 좌표. (C) 섹션은 고정, Nissl 스테인드 (1 %Cresyl 바이올렛), 탈수, 건조 공기. (D). LCM에 LCM 시스템 뇌 영역을 식별. (E) LCM 매크로 모자는 RNase 무료 0.5 mL 튜브 세포 세포의 용 해 버퍼의 100 μ에 전송 하 고 RNA 격리 다운스트림 게놈 분석까지-80 ° C에 저장. RNA 다음 TBI 후 또는 관심 (F)의 두뇌 지구 사이 분자 별로의 차동 식 검사 유전자 또는 예측에 관한 실시간 정량 분석을 위한 역 복사할 수 있습니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig2.jpg"> 
그림 2입니다. LCM TBI의 영향을 받는 뇌 영역. 조직 단면도의 수집 동측 측에서 IR와 UV 부상 사이트의 대표 이미지 레이저 LCM 시스템에 (A-나). 조직은 cryostat (30 µ m)에 구분 되었고 펜 막 슬라이드에 수집. 섹션 다음 고정, Nissl-물 들일 cresyl 바이올렛 (1%), 그리고 해부학 적 랜드마크 Paxinos와 왓슨의 The 쥐 뇌 아틀라스에서 참조에 따라 특정 뇌 영역을 식별 하는 탈수. (A-C) 정면 연결 피 질 (GrDG)가 뇌의과 립 층의 완전히 형성된 뿔 옆에 있는 해 마 (Hp)의 CA1, CA2, CA3 피라미드 계층의 구성 요소 (FrA) (D-F) 의 영역. (G-나) 핵 accumbens 공동의 영역(AcbC) 다시 인접 하 고 rostral 전방 commissure (aca). (J-K) 핵 Suprachiasmatic (SCN) rostral supraoptic chiasm (그리고). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig3.jpg"> 
그림 3입니다. RNA 품질의 대표 검사. 대표 electropherograms와 LCM에서 파생 하는 RNA의 관련된 젤 이미지 수집 조직 (A-D). Electropherograms 및 관련된 젤 이미지 그대로 RNA 18s와 28s rRNA 봉우리와 젤 밴드의 모습에 따라 표시 됩니다. 이 RNA는 모든 게놈을 포함 하 여 다운스트림 응용 프로그램 및 proteomic 분석에 적합 합니다. (A) 전 협회 피 (FrA) RNA 6.1 린입니다. (B) 년 해 마 (Hp) RNA 4.4 린입니다. (C) 핵 accumbens 코어 (AcbC) RNA. 7.3 린입니다. (D) Suprachiasmatic 핵 (SCN) RNA 린 7.6입니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig4.jpg"> 
그림 4입니다. 두뇌 지역 특정 유전자와 예측에 관한 식을 통해 RT-정량의 다운스트림 분석. 관심 (Bax, Bcl-2, Bdnf, Casp3, Creb)의 유전자와 관심 (미르-15b)의 예측에 관한 개별 실시간 정량 TBI 후 레이저 캡처 두뇌 지역에서 수행 되었다 (Hp와 AcbC n = 5, FrA n = 4) 손상 되지 않은 순진한 동물에 비해 (n = 4). Hp, AcbC, FCx. 데이터 정규화 된 배 변경 비율 순진한 제어 뇌 영역에 비해 서 제시는 TBI 병 인에 관련 된 유전자의 분석 수행 했다 (웰 치의 보정 ± SEM;와 짝이 없는 t 테스트 * p ≤ 0.05) (A). 서로 다른 뇌 영역에 미르-15b의 차동 식 순진한 제어 (± SEM)에 비해 표준화 된 배 변경으로 제공 됩니다 (B). SCN에서 데이터 (n = 2) 포함 되지 않습니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

우리는 유전자와 예측에 관한 분석에 대 한 서로 다른 뇌 영역에서 뚜렷한 세포 인구의 샘플을 얻기 위해 레이저 캡처 서의 사용을 설명 합니다. 이 기술은 쥐 두뇌의 특정 지역에서 외상 성 뇌 손상의 차동 효과의 연구를 수 있습니다.

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

이 레이저 캡처 미세해부 프로토콜의 전반적인 목표는 분자 분석을 위해 외상성 뇌 손상의 영향을 받은 특정 뇌 영역에서 세포를 수집하는 것입니다. 저는 헬렌 헬미치 박사입니다. 텍사스 대학교 의과대학의 인간 병태생리학 및 중개 의학 프로그램의 학생인 제 대학원 조교인 Harris Weisz는 뇌 손상 연구에서 레이저 캡처 현미해부 방법을 어떻게 사용하는지 시연할 예정입니다.이 방법은 실행 기능을 제어하는 전두엽 피질(frontal cortex)과 같은 개별 뇌 영역에서 TBI로 인한 변화의 메커니즘과 결과를 설명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그리고 메모리 의존 과정에 중요한 해마. 이 기술의 주요 장점은 동일한 뇌의 여러 개별 뇌 영역 또는 개별 세포 유형에 대한 질병 과정의 영향을 연구할 수 있다는 것입니다.전사 분석을 포함하는 LCM 절차 전에 RNace 제거 세제로 모든 표면을 청소하여 오염 및 RNA 분해 위험을 완화하십시오. 저장소에서 뇌 조직을 회수합니다. 그리고 섭씨 영하 20도까지 냉각된 시로스타트에 넣으십시오.뇌가 약 10분 동안 저온 유지 챔버의 온도와 평형을 이루도록 합니다. 뇌를 배쪽이 위로 향하게 하여 저온 유지 장치 단계 위에 있는 거즈 시트에 놓습니다. 깨끗한 RNA를 사용하여 면도날을 사용하여 소뇌 바로 앞쪽에 있는 뒤쪽 부분과 시신경 바로 앞쪽 부분을 잘라냅니다.소량의 최적 절단 온도 매체를 두 개의 개별 크라이오 몰드에 넣습니다. 전두엽 연관 피질과 측좌핵 코어를 포함하는 뇌를 하나의 극저온 주형 내부가 아래로 향하게 놓습니다. 조직을 덮을 수 있을 만큼 충분한 OCT 배지를 추가합니다.해마와 시교차상핵(suprachiasmatic nucleus)을 포함하는 뇌 조직 조각으로 이 단계를 반복합니다. OCT 배지를 저온 유지 장치에서 약 20분 동안 완전히 동결시킵니다. 조직과 OCT 배지가 완전히 얼면 마운팅 헤드에 소량의 OTC를 짜냅니다.얼어붙은 크라이오몰드를 마운팅 헤드에 누르고 OCT가 완전히 얼도록 하여 조직을 포함하는 몰드가 헤드에 단단히 부착되도록 합니다. 헤드 부착물을 섹션 마운트에 고정하고 나사를 조입니다. 조정 레버를 사용하여 저온 유지 장치 블레이드와 관련하여 절단 각도를 조정하여 섹션이 균일하게 절단되도록 합니다.단면 두께를 30미크론으로 설정합니다. 해마와 SEN을 포함하는 조직 블록을 절편화할 때, 제3심실이 뚜렷해지면 시신경이 브레그마 0.48mm에서 평평해질 때까지 절편화합니다. 그런 다음 절편된 조직 위에 실온 폴리에틸렌 나프탈레이트 멤브레인 슬라이드를 부드럽게 배치하여 이 지점에서 SEM에 대한 절편을 수집합니다.조직과 OTC가 슬라이드에 완전히 녹았는지 확인하여 슬라이드에 대한 접착력을 시각적으로 확인합니다. 조직 절편이 있는 모든 슬라이드는 염색될 때까지 저온 유지 장치에 보관하십시오. supraoptic decussation이 시작될 때 bregma 0.72mm에서 수집 절편을 중지합니다.해마 채취의 경우, 과립 세포층 치상 회랑의 뿔이 브레그마 3.00mm에서 보일 때까지 절단합니다. 해마 CA 하위 필드가 브레그마 4.78mm의 관상 절편에서 융합될 때까지 절편을 수집합니다. 이를 통해 개두술 및 부상 부위 아래의 해마를 완전히 수집할 수 있습니다.염색하기 전에 RNase 제거 세제로 화학 흄 후드에서 모든 식기와 염색 부위를 세척하십시오. 저온 유지 장치에서 측면 랙을 가져와 흄 후드에 놓습니다. 슬라이드를 30초 동안 따뜻하게 합니다.크레실 바이올렛으로 섹션을 염색하고 식염수로 투명하게 염색합니다. 스테인드 슬라이드 랙을 흄 후드의 실온에서 10분 이상 자연 건조하지 마십시오. 건조되면 즉시 LCM으로 진행하십시오.RNA 분석을 위한 LCM 절차를 시작하기 전에 RNAse 제거 세제와 100% 에탄올로 채취 영역과 장치 주변을 닦아냅니다. 현미경 베이스를 켜기 전에 적외선 레이저 생성 장치의 전원 스위치를 뒤집고 데스크탑에서 소프트웨어를 시작하기 전에 시스템이 초기화되도록 합니다. 소프트웨어가 부팅되고 실행되면 초기화 단계가 수행되지만 소프트웨어 설정 패널을 열고 현재 단계 버튼을 누릅니다.모듈식 스테이지는 LCM 매크로 캡 및 슬라이드를 적재 및 오프로드하는 위치로 이동합니다. 최대 3개의 펜 멤브레인 슬라이드를 젖빛 가장자리가 오른쪽을 향하도록 홀더에 넣습니다. 해당 슬라이드 옆에 있는 캡 및 슬라이드 처리 영역을 선택하고 MEM 확인란을 클릭하여 멤브레인 유리 슬라이드가 로드되었음을 소프트웨어에 알립니다.그런 다음 먼저 캡처할 슬라이드를 클릭합니다. 캡 배치를 위한 조직 위치 및 방향에 대한 바둑판식 이미지를 캡처하려면 도구 모음에서 이미지를 선택하고 개요 획득을 선택합니다. 바둑판식 이미지의 영역 위에 커서를 놓고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭한 다음 Place cap at region center를 선택합니다.소프트웨어가 선택한 위치에 자동으로 캡을 놓습니다. 적외선 및 UV 레이저를 찾은 후 선택 도구 창에서 자유형 그리기 옵션을 선택합니다. 터치 스크린 스타일러스를 사용하여 관심 영역의 둘레를 그리면서 터치 스크린과 스타일러스 헤드 사이의 접촉을 잃지 않도록 합니다.시작점과 끝점을 함께 연결해야 합니다. 해마 수집을 위해 레이저는 브레그마 3.00mm에서 시작하여 CA1, CA2 및 CA3 해마 하위 필드를 캡처하고 완전히 형성된 치상회(dentate gyrus)의 과립층을 형태학적 식별의 물리적 랜드마크로 사용합니다. 채취 후 LCM 매크로 캡을 QC 위치로 이동하고 UV 절단 조직이 멤브레인에 부착되어 있는지 육안으로 확인하여 완전한 조직 부착을 검사합니다.UV 레이저는 조직 전체를 절단해야 합니다. 그렇게 하지 않으면 조직이 LCM 캡에 불완전하게 부착되는 결과를 초래할 수 있습니다. 그런 다음 각 캡을 100마이크로리터의 세포 리수스 완충액이 들어 있는 RNAse가 없는 0.5밀리리터의 얇은 벽 반응 튜브에 빠르게 넣습니다.완전한 리수스를 확인하기 위해 샘플을 잠시 소용돌이치고 다운스트림 게놈 분석을 수행할 준비가 될 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 다음은 LCM 시스템의 적외선 및 UV 레이저 기능을 사용하여 부상 부위의 외측 측에서 수집된 조직 절편의 대표적인 이미지입니다. 이것은 전두엽 연합 피질의 영역입니다.이 이미지는 수집 후 동일한 지역을 보여줍니다. 그리고 이것은 채취 후 뚜껑에 있는 조직입니다. 이 이미지는 치상회(dentate gyrus)의 중력층(granual layer)의 완전히 형성된 뿔(horns) 옆에 위치한 해마(hippocampus)의 CA1, CA2 및 CA3 파라미탈층(parameatal layer)의 구성 요소를 보여줍니다.CA2 및 CA3 영역을 수집했으며 이러한 세포 집단을 캡에서 볼 수 있습니다. 여기서, 전방(anterior commissure)에 대한 핵 accumbens core proximal adrostral의 영역이 표적으로 삼았으며, 캡에 충실하게 재현되어 있었다. 마지막으로, 시상(supraoptic chiasm)에 대한 시교차상핵(suprachiasmatic nucleus rostral)은 TBI 후 LCM에 의해 포획되었습니다.이 기술을 완전히 익히면 약 8시간 안에 하나의 뇌를 처리하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에는 조직 처리, 염색 및 LCM이 포함됩니다. 이 절차에 따라 메틸화 패턴 또는 미세닉 발현에 관한 질문에 답하기 위해 후성유전학적 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 동일한 뇌의 여러 뇌 영역에서 LCM을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Furmanski, O., et al. 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 세포의 치료적 이식을 통한 마우스 뇌 손상의 제어된 피질 충격 모델. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오에서는 외상성 뇌 손상의 마우스 모델에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 세포를 심부 피질의 회백질-백질 경계에 입위적으로 주입합니다. 이식된 세포는 조직에 통합되어 손상된 뇌의 기능 회복과 회로 복구를 촉진합니다.

외상성 뇌손상이 있는 마우스에 신경 세포 현탁액의 정위 이식

우리는 정량 실시간 PCR 및 / 또는 전체를 게놈 microarrays를 사용하여 후속 유전자 발현 분석을위한 부상을 쥐의 뇌의 냉동 섹션에서 hippocampal 뉴런 또는 단일 뉴런의 풍부한 인구를 얻기 위해 레이저 캡처 microdissection (LCM)를 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

외상성 뇌 손상 후 뉴런 또는 유전자 발현 분석을위한 단일 뉴런의 강화 인구의 레이저 캡처 Microdissection

레이저 nanodissection 결합 이광자 이미징은, 세포 내 해상도 중추 신경계 퇴행성 및 재생 공정을 연구하는 유용한 도구이다. 이 프로토콜은, 라벨 이미지 및 생체 내에서 소뇌 피질에서 하나의 등반 섬유를 해부하는 방법을 보여줍니다.

소뇌 축삭의 레이저 Nanosurgery<em&gt; 생체</em

급성 뇌 손상은 날짜에 더 적절한 치료가없는 심각한 부상입니다. 다 광자 현미경은 길이 방향으로 급성 뇌 손상 개발의 과정을 공부하고 설치류에 치료 적 전략을 프로빙 할 수 있습니다. 두뇌의 생체 내 두 광자 이미징 연구 급성 뇌 손상의 두 가지 모델이 프로토콜에 설명되어 있습니다.

세로 두 광자 이미징 다음 마우스의 급성 뇌 외상

외상성 뇌 손상(TBI)은 여전히 심각한 건강 문제로 남아 있습니다. 통제된 피질 충격 수술 모델을 사용하여 TBI의 영향과 가능한 치료 방법에 대한 연구를 수행할 수 있습니다.

외상성 뇌 손상에 대한 제어 피질 충격 모델

이 문서에서는 마이크로-CT 영상, 어떤 병 변 양이 정해질 수 있다와 전극 전체 뇌의 맥락에서 높은 정밀도와 위치에 대 한 작은 동물 두뇌를 준비 하는 간단한 방법을 설명 합니다.

병 변 특성화 및 작은 동물 두뇌에 전극을 위치에 대 한 마이크로-CT 기반 방법

여기에서 우리는 동일한 살아있는 동물 내의 침습적 외과 적 개입 (예를 들어, 생검) 전후 뇌 종양 세포의 고해상도 시간 경과 다광자 이미징을위한 방법을 설명합니다. 이 방법은 종양 세포의 철새, 침략적 인 행동에 대한 이러한 침습적 인 외과 적 절차의 영향을 단일 세포 수준에서 연구 할 수 있습니다.

침략적인 외과 생검에 응하여 뇌종양 세포 행동의 경도 내 활력 화상 진찰

여기에서 우리는 열린 머리 통제된 피질 충격을 통해 뮤린 외상성 뇌 손상의 유도를 위한 프로토콜을 기술합니다.

외상성 뇌 손상의 유도에 대한 제어 피질 영향의 뮤린 모델

여기에 제시된 프로토콜은 뇌 손상의 설치류 모델을 만드는 기술을 보여줍니다. 여기에 설명된 방법은 레이저 조사를 사용하고 모터 피질을 대상으로 합니다.

쥐의 모터 피질에서 레이저 유도 된 뇌 손상

레이저 미세 해부 (LMD)는 신경교종 이질성과 침략을 중재하는 통로를 밝히기 위하여 이용될 수 있는 민감하고 높게 재현가능한 기술입니다. 여기에서, 우리는 전사성 분석에 선행된 레이저 LMD를 사용하여 신경교종 조직에서 이산 지역을 격리하기 위하여 최적화된 프로토콜을 기술합니다.

종양 내 이질성, 온코스트림 및 침략의 공간 및 분자 특성화를 위한 신경교종 소구역의 레이저 캡처 미세 분해

뇌타박상을 동반한 뇌골 출혈 및 신경 염증은 심각한 2차 뇌 손상을 유발할 수 있습니다. 이 프로토콜은 쥐 제어 피질 영향(CCI) 모델을 자세히 설명하여 연구원들이 출혈, 타박상 및 외상 후 면역 반응을 연구하고 잠재적인 치료법을 탐색할 수 있도록 합니다.

외상성 출혈 타박상 및 신경염증에 대한 전임상 제어 피질 영향 모델

배우세요 외상성 뇌손상 영향을 받는 쥐 뇌 특정 영역에서 세포를 분리하는 레이저 캡처 현미절단법을 활용한 분자 분석 기술입니다. 이 방법은 전두엽과 해마 등에서 유전자 및 microRNA 발현을 정밀하게 연구할 수 있게 합니다.

외상 성 부상에 의해 영향을 하는 뇌 영역의 정위 적 아틀라스 유도 레이저 캡처 기정

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