식물 발기인 분석: 식별 및 일반적인 콩에서 루트 결 절 특정 발기인의 특성

털이 많은 뿌리는 리포터 구조로 Phaseolus에서 변형된 뿌리를 얻는 데 사용됩니다. 생성된 형질전환 뿌리는 리포터 유전자의 발현을 검사하는 데 사용됩니다. 프로모터 발현 연구는 유전자의 시공간 발현 패턴을 이해하는 데 중요합니다.

오늘 우리는 털뿌리 유도 방법론을 시연하고 Phaseolus의 뿌리 결절 공생 조건에서 형질전환 털뿌리의 프로모터 발현 패턴을 연구할 것입니다. Estrada-Navarrete와 동료들은 이전에 Phaseolus에서 Agrobacterium rhizogenes 유도 털 뿌리 시스템을 확립했습니다. 현재 방법은 털이 많은 뿌리 유도 기간을 가속화하여 시스템의 다양성을 향상시키는 데 도움이 될 것입니다.

제 동료인 Manoj-Kumar Arthikala와 제 연구실의 학부생인 Alma Leticia와 Brenda Mariana가 절차를 시연할 것입니다. 먼저 Phytozome의 Phaseolus vulgaris 게놈 데이터베이스에서 NIN 유전자 염기서열을 검색하고 ATG에 필요한 염기서열 길이를 선택합니다. 적절한 프로모터 염기서열 분석에 따라 올리고뉴클레오티드를 설계합니다.

갓 준비된 Phaseolus 게놈 DNA는 프로모터 염기서열을 PCR로 증폭하는 주형 역할을 합니다. 이전에 설계된 올리고뉴클레오티드와 함께 high-fidelity Taq 중합효소 및 표준 PCR 성분과 함께 PCR 마스터 믹스를 준비합니다. 마스터 믹스를 2 mL PCR 튜브에 분주하고 thermocycler에서 적절한 프로그램을 사용하여 promoter fragment 증폭을 수행합니다.

PCR 산물을 1.2% 아가로스 겔에서 전기영동으로 분리합니다. UV 투과 조명 하에서 700 염기쌍으로 증폭된 NIN 단편을 시각화합니다. 표준 지침에 따라 단편을 절제, 용리 및 Gateway entry vector pENTR/D-TOPO 벡터로 복제합니다.

2마이크로리터의 반응 혼합물을 섭씨 42도에서 50초 동안 수용성 대장균 세포로 형질전환하고, 카나마이신 리터당 50mg이 보충된 LB에 형질전환된 대장균을 플레이트화합니다. 도금된 세포를 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 성장시킵니다. M13 올리고뉴클레오티드를 사용하여 무작위로 선택된 E.coli 콜로니에서 분리된 플라스미드에 대한 PCR 반응을 수행합니다.

1024 염기쌍의 단편은 양성 클론을 나타내야 합니다. positive entry clone과 destination binary vector 사이의 LR 반응을 수행합니다. 2마이크로리터의 반응 혼합물을 대장균으로 변형시키고 섭씨 37도에서 리터당 100mg의 스펙티노마이신에서 콜로니를 선택합니다.

NIN 특이적 올리고뉴클레오티드로 플라스미드를 증폭합니다. 양성 클론은 700 염기쌍에서 증폭되어야 합니다. 클론 조각의 순서를 정하고 정확성을 확인합니다.

NIN 프로모터 구조체를 전기 적질성 K599 Agrobacterium rhizogenes 세포로 동원합니다. 그리고 다시 한 번, 프로모터 특이적 올리고뉴클레오티드로 클론을 확인합니다. 유황은 Phaseolus vulgaris 씨앗을 살균하고 섭씨 28도의 어둠 속에서 이틀 동안 멸균된 젖은 여과지에서 발아합니다.

150마이크로리터의 Agrobacterium rhizogenes 세포를 NIN 구조로 펴고 스펙티노마이신 선택을 통해 LB 플레이트에 벡터를 제어합니다. 섭씨 28도에서 하룻밤 사이에 문화를 성장시킵니다. Phaseolus 묘목의 코팅을 벗기고 플레이트에서 구부러진 200마이크로리터 팁으로 Agrobacterium rhizogenes 세포를 긁어냅니다.

그리고 1mL의 멸균 증류수와 함께 Eppendorf Tube에 재현탁합니다. Agrobacterium rhizogenes 세포를 3mL 주사기에 모으고 Phaseolus 묘목을 이전에 준비된 튜브 설정에 놓습니다. 발아 된 씨앗의 hypocotyls를 바늘 끝으로 약간 찌르고 동시에 Agrobacterium rhizogenes 세포를 주입합니다.

바늘이 hypocotyl을 통과하지 않도록 주의해야 합니다. 주입 된 묘목을 섭씨 28 도의 성장 챔버에서 16 시간 빛 및 8 시간의 어두운 광주기로 유지하십시오. 상처 입은 hypocotyls의 굳은살은 5-7일 이내에 볼 수 있어야 합니다.

2주 후, 털이 많은 뿌리 아래 2cm 아래의 줄기를 잘라 1차 뿌리를 제거하고 멸균 질석이 들어있는 화분에 이식합니다. 동시에 식물에 1ml의 Rhizobium tropici를 접종하여 결절을 유도합니다. Rhizobium 배양액을 OD 600에서 6으로 희석

섭씨 28도, 빛 16시간, 어두운 광주기 8시간의 성장실에서 식물을 유지하고 B 및 D 용액으로 관개합니다. NIN promoter의 시공간 발현 패턴을 연구하기 위해 서로 다른 시점에서 샘플링을 수행합니다. 뿌리를 손상시키지 않고 식물을 꺼내고 질석 얼룩없이 뿌리를 씻으십시오.

NIN 및 대조 식물에서 뿌리를 무작위로 선택하고 GUS assay buffer의 샘플을 섭씨 37도에서 어두운 곳에서 16시간 동안 배양하여 GUS 조직화학적 염색을 진행합니다. 입체 현미경 및 복합 현미경으로 GUS 염색 뿌리를 관찰합니다. 이 그림은 1차 뿌리에서 Rhizobium-induced NIN promoter 발현을 보여줍니다.

NIN 프로모터 발현은 Rhizobium에 감염된 뿌리 유모 세포에서도 볼 수 있습니다. 또한, GUS 발현은 치근 결절 발달의 여러 단계에서 문서화될 수 있습니다. 벡터 대조근에서 GUS 발현이 관찰되지 않았습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 promoter constructs를 설계하고 Phaseolus의 형질전환 털뿌리에서 promoter 발현 패턴을 연구하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 시스템은 Phaseolus 및 다른 진쌍식물의 다른 공생 및 병원체 상호 작용 하에서 프로모터 발현 패턴을 연구하기 위해 더욱 확장될 수 있습니다.