Name: 식물 발기인 분석: 식별 및 일반적인 콩에서 루트 결 절 특정 발기인의 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 학습하세요 Phaseolus vulgaris에서 Agrobacterium rhizogenes를 이용한 뿌리 결절 특정 발기인 분석 방법을. 이 프로토콜은 유전자 발현 패턴 연구와 식물 생명공학 연구에 활용됩니다.

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이 작품 전자 일반 드 Asuntos 델에 의해 부분적으로 지원 되었다 개인 Académico, DGAPA/PAPIIT-UNAM (no를 부여 합니다. M.L 하 M.에 IA205117 IN219916 A)와 Consejo 나시오날 드 많은 y Tecnològia (CONACYT 보조금 번호 240614 메이저 리그에).

1. 식별, 격리 및 피 Vulgaris 닌 발기인의 복제
<ol>
	<li>관심사의 유전자의 발기인 순서를 식별 합니다. 일부의 게놈 데이터베이스와 분석 도구 Phytozome, 합 식물, NCBI, 등 A 콩과 발기인 P. vulgaris 닌 (PvNIN; 식물에 사용할 수 있는 Phvul.009G115800)는이 연구20에 사용 되었다.</li>
	<li>디자인 oligos 게이트웨이 또는 벡터 시스템에 따라 복제 하는 전통적인 제한 효소 사용 (그림 1A). 참고: 표준 (25-35 bp), desalted 뇌관 작업 괜 찮 아 요. 발기인과 유전자 사이의 측면 역 올리고 시퀀스는 좋습니다.</li>
	<li>갓 격리 P. vulgaris 에서 PvNIN 발기인 지역 (또는 관심사의 유전자의 발기인 지구)를 증폭 발기인 특정 올리고 세트를 사용 하 여 게놈 DNA. 높은 중 합 효소를 사용 하 여 다음 PCR 조건: 95 ° C 5 분; 30 사이클 (95 ° C 30에 대 한 s, 55 ° C 30 초, 1 분에 72 ° C); 그리고 5 분 동안 72 ° C입니다.</li>
	<li>7 x 10 cm 젤 트레이에 60 V 1 %agarose 젤에 증폭된 한 파편을 실행 하 고 해당 amplicon elute (700 bp, 그림 1B) 및 제조업체의 지침에 따라 pENTR/D-이동 벡터에 클론.</li>
	<li>2 µ L 유능한 대장균 으로 반응의 변환 lysogeny 형제 (파운드) 50mg/L 대 (Kan50)와 보완에 제조업체의 지침과 변환 혼합물의 플레이트 150 µ L를 사용 하 여 셀. 밤새 37 ° C에서 도금된 세포 성장.</li>
	<li>선택 3-6 식민지 문화 그들 파운드 매체 포함 하는 Kan50에서에서 하룻밤. 플라스 미드의 선택 방법을 사용 하 여 DNA를 분리 하 고 벡터 특정 M13 oligos를 사용 하 여 PCR에 의해 플라스 미드 분석. PCR, 플라스 미드, oligos의 오후 0 3의 사용 100 ng에 대 한 10 X PCR 버퍼, 0.5 U Taq DNA 중 합 효소, 그리고 dNTPs 10 m m.</li>
	<li>사용 하는 PCR 증폭 다음과; 3 분;에 대 한 95 ° C 30 사이클 (95 ° C 30에 대 한 s, 58 ° C 30에 대 한 s, 75 72 ° C s); 그리고 7 분에 대 한 72 ° C 1 %agarose 젤에 PCR 제품을 시각화. 올바른 삽입 324 bp 밴드 (그림 1C) 밴드 1024 혈압과 삽입 지 없이 벡터에 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>LR 반응 항목 벡터 (pENTR/D-이동-PvNIN)와 대상 벡터 pBGWFS7.021 제조업체의 지침에 따라 상업 효소 혼합을 사용 하 여 수행 합니다.</li>
	<li>유능한 대장균 으로 LR 반응의 2 µ L 변환 파운드 100 mg/L spectinomycin (Spe100)의 보충에 제조업체의 지침과 접시 150 µ L의 변환에 설명 된 대로 표준 기술을 사용 하 여 셀. 밤새 37 ° C에서 도금된 세포 성장.</li>
	<li>5 식민지 약을 선택 하 고 Spe100를 포함 하는 파운드 매체에 하룻밤 문화. 선택 방법을 사용 하 여 DNA 플라스 미드를 분리 하 고 발기인 특정 oligos를 사용 하 여 PCR에 의해 플라스 미드 분석.</li>
	<li>1.3 단계에서 PCR 상태를 사용 합니다. 증폭을 확인 하는 1 %agarose 젤에 PCR 제품을 시각화 합니다. Amplicons는 700 혈압.</li>
	<li>긍정적인 플라스 미드 pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP (그림 1D) 삽입의 진위를 확인 하기 위해 발기인 특정 oligos와 시퀀스.</li>
	<li>그러나 A. rhizogenes 긴장 K599 (, A. rhizogenes 의 다른 변종 사용할 수 있습니다)에 플라스 미드를 변환. 다음 설정으로 1mm 베트에 electroporate 및 electrocompetent 세포의 50 µ L를 플라스 미드 준비의 2 µ L를 추가: 1.8 kV, 25 µ F, 및 200 Ω.</li>
	<li>셀에 복구 ~ SOC 매체의 500 µ L 2 h. 접시 파운드 Spe100에 28 ° C에서 흔들어와 28 ° C에서 2 일 동안 성장.</li>
	<li>1.7 단계에서 언급 한 대로 식민지 심사를 수행 하 고 단계 1.3에서 PCR 조건을 사용 하 여. 긍정적인 복제품에서 글리세롤 주식을 확인 하 고-80 ° C에 저장</li>
	<li>A. rhizogenes 문화 은닉 부정적인 컨트롤로 빈 pBGWFS7.0 벡터를 사용 합니다.</li>
</ol>
2. A. Rhizogenes 는 일반 콩의 털이 뿌리 변형
<ol>
	<li>콩 (P. vulgaris cv. 흑인 Jamapa) 씨앗 (약 20)을 살 균 하십시오 1 분 96% 에탄올의 50 ml에서 및 에탄올; 삭제 층 류 두건에 지속적인 혼합과 10 분 동안 20% 표 백제 (염소) 50 mL를 추가 합니다. 표 백제를 제거 하 고 3 번 초과 살 균 물에 씻어. 참고: 다른 P. vulgaris cultivars 털이 루트 유도 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>브 로튼 적신 멸 균 필터 종이에 소독된 씨앗을 발 아 &#38; Dilworth (B &#38; D) 솔루션22 (표 1) 28 ° c.에 어둠 속에서 2 일 동안</li>
	<li>변환 하기 전에 하루 준비 다음.
	<ol>
		<li>A. rhizogenes 문화 (준비 단계 1.13 1.14) 이진 벡터 은닉의 150 µ L을 고체 파운드 Spe100에 streak 하룻밤 28 ° C에서 성장 하 고.</li>
		<li>B 15 mL 튜브를 채우기 &#38; D 솔루션 및 바꾸기 두 배 층이 된 알루미늄 호 일 나사 모자. B의 10 mL를 포함 하는 22 cm 유리 튜브에 이것을 조립 &#38; D 솔루션 (그림 2C) 및 고압 그것.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>변화의 날, 층 류 두건에 다음 메 마른 재료 조립: 2.2 단계에서 씨앗, 단계 2.3.1, 2.3.2 단계에서 튜브, 살 균 두 배 증류수 (10 mL), 펫 및 피 펫 팁, 살 균 겸 문화 접시를 출 아 했다 그리고 3 mL 주사기입니다.</li>
	<li>구부러진된 200 µ L 팁을 사용 하 여 microcentrifuge 튜브로 접시에서 A. rhizogenes 세포를 긁어와 이중 살 균 물의 1 mL에서 resuspend. 마찬가지로, 벡터 제어 셀 별도로 준비 합니다.
	<ol>
		<li>Resuspend을 부드럽게 세포를 혼합. 와 동 하지 마십시오.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>단계의 2.3.2 살 균 피 펫 팁을 사용 하 여 튜브의 알루미늄 호 일에 3mm 구멍을 확인 합니다.</li>
	<li>주사기와 2.5 단계에서 세포 (발기인 또는 벡터 제어)를 수집 하 고 약간 찌르는 바늘 팁 (그림 2G) 세균된 씨의 hypocotyls. 참고: 바늘 침투 (4-6 시간) 혈관 조직 다는 것을 확인 하 고 작은 주사 (~ 5 µ L)는 hypocotyl 주위에 다른 위치에서 상처에 셀의 삭제.</li>
	<li>신중 하 게 B를 포함 하는 15 mL 튜브의 3 m m 구멍에 삽입 된 묘 목의 뿌리를 삽입 &#38; D 솔루션. 유리 튜브 22 mL에 전체 설치를 반환 하 고 습도 유지 하기 위해 그들을 봉인.</li>
	<li>16 h 빛: 8 28 ° C 유지 성장 챔버에 튜브를 품 어 h 어두운 photoperiod. 참고: 3-4 일 후 부 화, 식물 성장 22 mL 유리 튜브의 가장자리에.</li></ol>이 단계에서 모자를 제거 하 고 그림2에서와 같이 줄기 주위 parafilm으로 가장자리를 밀봉 합니다.
	<li>5-7 일, 부상 사이트에서 굳은 살을 관찰 하 고 찾아 ~ 2 cm 털 뿌리 변환 후 10-12 일. 참고: 그것은 B를 유지 하는 것이 중요 &#38; 플라스틱 및 유리 튜브에 끊임없이 D 솔루션.</li>
	<li>2 주 후, 털 뿌리 아래 2 cm 줄기를 절단 하 여 기본 루트를 제거 하 고 살 균 질 석 포함 하는 남 비로 기본 뿌리를 이식 합니다. 성장 챔버 (16 빛: 8 시 28 ° C에서 어두운)에 식물을 유지 하 고 B와 관개 &#38; D 솔루션.</li>

3. 발기인 분석: 닌 발기인 식 일반 콩의 Rhizobial 혹
<ol>
	<li>뿌리 혹의 유도, 접종 Rhizobium tropici 또는 Rhizobium etli (일반 콩에 호환 되)는 PY 매체 (0.5 g 펩, 0.3 g 효 모 추출 물) 700 mM CaCl2 와 20 mg mL− 1 를 가진 보충의 100 ml nalidixic 산입니다. 300 rpm에서 떨고와 30 ° C 24 h에서 품 어. 참고: 어떤 특정 항생제 유전자 변형 Rhizobium경우 사용 될 수 있습니다.</li>
	<li>실 온에서 2800 x g에서 3 분 동안 원심 분리기에 셀 작은 고 10mm MgSO410 mL에 resuspend. 10mm MgSO4로 희석 하 여 세600 0.6 셀의 OD를 조정 합니다.</li>
	<li>문화 (3.2 단계에서 준비) 식물 (모두 발기인 및 벡터 제어) 털이 뿌리에 결 절 성장 유도 하 당 1-2 mL 접종 B 식물을 관개 &#38; D 솔루션 nodulation 홍보 제한 질소 (2mm 알 것3).</li>
	<li>실험 필요에 따라서 다른 시간 지점에서 털이 뿌리를 수집 합니다. 3-5 일 사이 감염 스레드 공부에 대 한 수집 샘플 게시물 접종 (dpi). 참고: 원시 결 절 및 젊은 혹 수 수에서 공부 6-9 dpi와 10-12 일 dpi, 각각. 마지막으로, 성숙 하 고 기능적인 혹 14-21 dpi, 및 senesced 혹에서 공부 될 수 있다 &#62; 28 dpi.</li>
	<li>거 스 (GFP) 리포터 유전자의 활동에 대 한 루트/작은 혹을 처리 합니다. 제퍼슨23에 의해 설명 하는 프로토콜에 따라 GUS 활동 분석. GFP 형광 현미경으로 관찰 합니다. GFP 형광 블루 아르곤 이온 레이저 자극 (488 nm), 510에서 540 내보낸된 형광을 수집 nm.</li>
</ol>

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<li>Estrada-Navarrete, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+rhizogenes-transformation+of+the+Phaseolus+spp.%3A+a+tool+for+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium rhizogenes-transformation of the Phaseolus spp.: a tool for functional genomics.</a> Mol Plant Microbe Interact. 19 (12), 1385-1393 (2006).</li>
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저자는 공개 없다.

유전자의 기능 분석, 동안 유전자 식 패턴의 연구 vivo에서유전자의 공간과 일시적인 규칙 이해에 중요 한 역할을 하고있다. 진 식 패턴을 공부 하는 잘 알려진 방법 관심, 유전자 프로모터 영역을 복제 하는 것입니다 형광 표식 유전자 (GFP, RFP, 등) 등 β-glucuronidase 리포터 유전자를 업스트림. 여기, 우리는 루트 결 절 공생 (RNS) 특정 유전자의, RNS 동안 P. vulgaris spatio 시간적 식 패턴을 공부 하 닌 발기인 영역을 선택 했습니다. 선택한 발기인 순서 GFP::GUS 기자 발기인 식 벡터에 게이트웨이 메서드를 사용 하 여 업스트림 복제 되어 있다.
우리 털이 루트 시스템의 공생 특정 promotor의 식을 묘사 했다 P. vulgaris. 털이 루트 시스템은 유전자의 기능적 특성에 대 한 널리 이용 되는, 포함 한 RNAi 중재 아래, 소성 제정 유전자의, 발기인 식 ...

발기인은 관심사의 유전자의 표현 규제 이해에 중요 한 역할을 하는 중요 한 분자 생물학적 도구. 프로모터는 상류에 있는 DNA 순서는 번역의 개시 코 돈 유전자의 순서 그리고 그들이 유전자;의 중앙 규제 정보 따라서, 그들의 올바른 주석 및 특성화는 유전자 기능을 이해 하는 중요 한. 식 패턴에 따라 공장 발기인 구성, 조직, 또는 개발 단계 관련 및 유도할 수 있는1으로 분류 됩니다. Transcriptomic 기술, 컴퓨터 모델링, 개선 및 다양 한 식물 종에 대 한 게놈 시퀀스의 수를 증가의 가용성 발기인 시퀀스2의 대규모 예측을 촉진 했습니다.
다른 한편으로, 그것은 또한 발기인 평가 도구와, 효율적으로, 신속 하 고 재현할 수 있는 유전자 변환 기술을 확립에 중요 한. 다른 모델 식물 달리 일반적인 콩 콩과 식물 (P. vulgaris) 유전자의 기능 특성의 안정적인 유전자 변환에 대 한 sp. Phaseolus 완강히 특성상 주로 장애가. 일시적인 변환 시스템 빠른 유전자 기능 분석 연구3에 대 한 대체 역할을 합니다. 콩과 공생 연구, 콩과 식물 호스트 공장 및 rhizobial 박테리아 사이의 상호 작용 발기인 연구 및 결 절 특정 유전자의 기능 분석에 대 한 가장 온순한 모델 시스템 중 하나입니다. 지금까지,이 공생에 관련 된 여러 가지 콩과 발기인 되었습니다 특징, 즉, 개자리속 truncatula PT44, SWEET115, 로터스 나무 키 클 롭 스, UBQ6, VAG17, 글리신 최대 PT5 8, Exo70J9, P. vulgaris RbohB10,11,12, TRE113, PI3K14, 토르15, 등. Cis 요소 직접 영향을 미치는 유전자 규칙. 녹음 방송 요인 ENBP1A의 초기 nodulin VfENOD12, Cis 규제 지역 (bp −692)에 한다이 얼 faba16의 결 절 primordia에서 취재 원 유전자의 표현을 용이 하 게 한다. Cis 규제 지역의 교체 (−48 bp −161) 결 절 특정 발기인의 leghemoglobin GLB3는 분리와 발기인 δ-p35S 및 δ-pNOS, 결 절 특이성의 손실 귀착되 었 다 잘리고 발기인 활동17 감소 .
이전 보고서 표시 녹음 방송 요인 닌 루트 머리 세포에 rhizobial 감염의 개시에 필요한 고도 결 절 organogenesis L. 나무18에 대 한 필수적 이다. 현재 연구에서 우리는 식별, 격리, 복제 및 일반적인 콩 털이 뿌리에 결 절 특정 발기인의 특성에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 위해 우리 P. vulgaris 의 rhizobial 공생 전용 닌 발기인을 선택 하 고 공상 기자 거 스 enhanced::GFP transcriptional 퓨전에 복제. 또한,이 프로토콜 P. vulgaris A. rhizogenes 유도 털 뿌리를 사용 하 여 유전자 변환의 신속 하 고 다양 한 시스템을 설명 합니다. 이 시스템은 변환 후 2 주 미만에 털이 뿌리를 생성합니다. 마지막으로, 우리는 거 스 얼룩에 의해 식민지 rhizobia 루트 혹에서 닌 발기인의 spatiotemporal 식 평가.
여기에 설명 된 절차는 콩과 식물 식물의 nodulation 및 mycorrhization11 의 연구 뿐만 아니라 뿌리19에서 발기인 식 패턴의 연구에 대 한 유용할 수 있습니다. 또한,이 프로토콜은 비 전문 실험실에서 사용 하기 쉬운입니다.

<table><tbody><tr><td>Primers for qRT-PCR assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pNIN Forward</td><td>CACC ATA GCT, CCC CAA AAT GGT, AAT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pNIN Reverse</td><td>CAT CTT CCT TCC ACT, AAC TAA C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M13 Forward</td><td>GTA AAA CGA CGG CCA G</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M13 Reverse</td><td>CAG GAA ACA GCT ATG AC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pENTR/D-TOPO 클로닝 키트</td><td>Invitrogen</td><td>K243520</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II 효소 믹스&nbsp;</td><td>인비트로젠</td><td>11791100</td><td></td></tr><tr><td>pBGWFS7.0&nbsp;</td><td>식물 시스템 생물학</td><td>https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/</td><td></td></tr> <tr><td>Platinum Taq DNA Polymerase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10966018</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Plant Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>69104</td><td></td></tr><tr><td>PureLink 퀵 젤 추출 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Pfx DNA Polymerase</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>11708013</tr><tr><td>인증 분자 생물학 Agarose</td><td>Bio-Rad</td><td>1613102</td><td></td></tr><tr><td>One Shot TOP10 화학적 유능 대장</td>균 <td>Invitrogen</td><td>C404006</td><td></td></tr><tr><td>Nacl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7293-250G</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625-250G</td><td></td></tr><tr><td>세균 한천</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5306-1KG</td><td></td></tr><tr><td>카나마이신 설페이</td><td>트 Sigma-Aldrich</td><td>60615-25G</td><td></td></tr><tr><td>스펙티노마이신 설페이</td><td>트 Sigma-Aldrich</td><td>PHR1441</td><td></td></tr><tr><td>에틸 알코올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>세균 펩톤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0556</td><td></td></tr><tr><td>염화</td><td>칼슘시그마 알드리치</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>날리 딕 산</td><td>시그마 알드리치</td><td>N8878</td><td></td></tr><tr><td>황산 마그네슘</td><td>시그마 알드리치</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>겔 로딩 용액</td><td>시그마 알드리치</td><td>G7654</td><td></td></tr><tr><td>< 강한> 이름 < / 강한></td> <td>< 강한> 회사 < / 강한><</td> <td>강한>카탈로그 번호 </td><td>코멘트</td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Veriti Thermal Cycler</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sigma Sigma</td><td>1-14K</td><td></td></tr><tr><td>Gel 문서화 장치</td><td>Carestream</td><td>Gel Logic 212 PRO</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator - 115VAC</td><td>Thermo scientific</td><td>EW-51708-70</td><td></td></tr><tr><td>식물 생장</td><td>챔버 MRC</td><td>PGI-550RH</td><td></td></tr><tr><td>Horizantal laminarair flow cabinate</td><td>Lumistell</td><td>LH-120</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Leica</td><td>DM4500 B</td><td></td></tr><tr><td>Petridish</td><td>sym laboratorios</td><td>90X15</td><td></td></tr><tr><td>메스 블레이드</td><td>Fisher scientific</td><td>53223</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Fisher scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>22mL 유리관</td><td>Thomas Scientific</td><td>45048-16150</td><td></td></tr></tbody></table>

식물 발기인 분석: 식별 및 일반적인 콩에서 루트 결 절 특정 발기인의 특성

Plant Promoter Analysis: Identification and Characterization of Root Nodule Specific Promoter in the Common Bean

업스트림 시퀀스 시퀀스를 코딩 하는 유전자의 발기인 시퀀스도 불린다. 발기인의 식 패턴을 공부 하는 것은 유전자 규정과 spatiotemporal 식 패턴 대상 유전자의 이해에 매우 중요 한입니다. 다른 한편으로, 그것은 또한 발기인 평가 도구와, 효율적으로, 신속 하 고 재현할 수 있는 유전자 변환 기술을 확립에 중요 한. 이 연구에서 우리는 유전자 변형 털 뿌리에 Phaseolus vulgaris 의 rhizobial 공생 특정 결 절 개시 (NIN) 발기인의 spatiotemporal 식 패턴 조사. 식물 게놈 데이터베이스와 식별, 분석 도구를 사용 하 여 격리, 그리고 복제 공상 기자 transcriptional 퓨전에 P. vulgaris 닌 발기인 β-glucuronidase (거 스) 거 스 enhanced::GFP. 또한,이 프로토콜 P. vulgaris Agrobacterium rhizogenes 유도 털 뿌리를 사용 하 여 유전자 변환의 신속 하 고 다양 한 시스템을 설명 합니다. 이 시스템은 변환 후 10 ~ 12 일에 ≥2 cm 털 뿌리를 생성합니다. 다음으로, 우리 Rhizobium 접종 후 접종의 정기적으로 털 뿌리에 닌 발기인의 spatiotemporal 식 평가. GUS 활동에 의해 묘사 된 우리의 결과 표시 닌 발기인 nodulation의 과정에서 활동적 이었다. 함께, 현재 프로토콜 식별, 격리, 복제, 그리고 일반적인 콩 털이 뿌리에서 식물 발기인을 특성화 하는 방법을 보여 줍니다. 또한,이 프로토콜은 비 전문 실험실에서 사용 하기 쉬운입니다.

이 연구의 목적은 결 절-특정 P. vulgaris 닌 spatiotemporal 식 패턴을 평가 했다. 이렇게 하려면 700 bp 지역 상류 닌 유전자의 번역 개시 코 돈에의 선정 되었다 고 그림 1A에서처럼 oligos의 집합 설계 되었습니다. 높은 중 합 효소를 사용 하 여, 닌 발기인 조각 증폭 되었다, (그림 1B), 절연 그리고에 transcriptional 퓨전을 생성 하는 게이트웨이 접근 방식을 통해 대상 바이너리 벡터 pBGWFS7.0 (그림 1C)에 복제 합니다 공상 취재 원 거 스 강화 된 GFP (pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP) PBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP 벡터 구조는 일반적으로 독립적인 복제품의 수백을 생성합니다. 유전자 관련 ...

발기인 식 분석은 유전자 규정의 이해 및 대상 유전자의 spatiotemporal 식 개선에 중요 한. 여기 우리는 식별, 격리, 식물 발기인을 복제 하는 프로토콜을 제시. 또한, 우리는 일반적인 콩 털이 뿌리에 결 절 특정 발기인의 특성을 설명합니다.

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in ...

리포터 컨스트럭트가 포함된 Phaseolus의 형질전환 뿌리를 얻기 위해 모상근(Hairy roots)을 이용합니다. 생성된 형질전환 뿌리는 리포터 유전자의 발현을 조사하는 데 사용됩니다. 프로모터 발현 연구는 유전자의 시공간적 발현 패턴을 이해하는 데 매우 중요합니다.오늘은 Phaseolus에서 근절 symbiotic 조건 하의 형질전환 hairy root 내 프로모터 발현 패턴을 연구하고 hairy root 유도를 위한 방법론을 시연하겠습니다. Estrada-Navarrete와 동료들은 이전에 Phaseolus에서 Agrobacterium rhizogenes로 유도된 hairy root 시스템을 구축한 바 있습니다. 본 방법은 hairy root 유도 기간을 단축하여 시스템의 범용성을 향상시키는 데 도움이 될 것입니다.절차 시연은 제 동료인 Manoj-Kumar Arthikala와 저희 실험실의 학부생인 Alma Leticia, Brenda Mariana가 맡아 진행하겠습니다. 먼저, Phytozome의 Phaseolus vulgaris 게놈 데이터베이스에서 NIN 유전자 서열을 검색하고, ATG 상위 영역에서 필요한 길이의 서열을 선택하십시오. 적절한 프로모터 서열 분석에 따라 올리고뉴클레오타이드를 설계하십시오.신선하게 준비된 Phaseolus 게놈 DNA를 템플릿으로 하여 프로모터 서열을 PCR 증폭합니다. 고충실도(high-fidelity) Taq polymerase와 표준 PCR 성분, 그리고 이전에 설계된 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 PCR 마스터 믹스를 준비합니다. 마스터 믹스를 2 mL PCR 튜브에 분주하고, 적절한 프로그램이 설정된 써모사이클러에서 프로모터 단편 증폭을 수행합니다.1.2% 아가로스 젤에서 PCR 생성물을 전기영동으로 분리합니다. UV 트랜스일루미네이션 하에서 700 base pairs로 증폭된 NIN 단편을 시각화합니다. 표준 지침에 따라 해당 단편을 절제 및 용출하고 Gateway entry vector인 pENTR/D-TOPO 벡터로 클로닝합니다.반응 혼합물 2 µL를 42 °C에서 50초 동안 competent E.coli 세포에 형질전환시키고, 50 mg/L kanamycin이 첨가된 LB 배지에 형질전환된 E.coli를 도말합니다. 도말된 세포를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 무작위로 선택한 E.coli 콜로니에서 분리한 플라스미드를 대상으로 M13 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 PCR 반응을 수행합니다.1024 bp의 단편은 양성 클론임을 나타냅니다. 양성 엔트리 클론과 목적지 이진 벡터(destination binary vector) 간에 LR 반응을 수행하십시오. 반응 혼합물 2 µL를 E.coli에 형질전환시키고, 37 °C에서 100 mg/L의 spectinomycin이 포함된 배지에서 콜로니를 선택하십시오.NIN 특이적 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 플라스미드를 증폭합니다. 양성 클론은 700 base pairs에서 증폭되어야 합니다. 클론 단편의 서열을 분석하여 정확성을 확인합니다.NIN 프로모터 컨스트럭트를 전기천공 가능 K599 Agrobacterium rhizogenes 세포로 이동시킵니다. 그 후, 프로모터 특이적 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 클론을 다시 한번 확인합니다. Phaseolus vulgaris 종자를 황으로 살균하고, 28 °C의 암조건에서 멸균된 젖은 여과지 위에 올려 이틀 동안 발아시킵니다.NIN 컨스트럭트와 컨트롤 벡터가 포함된 Agrobacterium rhizogenes 세포 150 µL를 스펙티노마이신 선택 배지가 포함된 LB 플레이트에 도포합니다. 28 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. Phaseolus 묘목의 외피를 제거하고, 굽은 200 µL 팁을 사용하여 플레이트에서 Agrobacterium rhizogenes 세포를 긁어냅니다.그리고 1 mL의 멸균 증류수가 들어있는 Eppendorf Tube에 다시 현탁합니다. Agrobacterium rhizogenes 세포를 3 mL 주사기에 수집하고, 미리 준비한 튜브 설정에 Phaseolus 묘를 배치합니다. 발아된 종자의 하배축을 바늘 끝으로 살짝 찌르면서 동시에 Agrobacterium rhizogenes 세포를 주입합니다.바늘이 하배축을 관통하지 않도록 주의해야 합니다. 주입된 묘목은 28 °C의 생장실에서 16시간 광조사와 8시간 암조건의 광주기 하에 유지합니다. 손상된 하배축의 캘러스는 5~7일 후에 관찰될 것입니다.2주 후, 유모근(hairy roots)에서 2cm 아래의 줄기를 절단하여 주근을 제거하고, 멸균된 버미큘라이트가 담긴 화분에 이식합니다. 동시에, 근류 형성을 유도하기 위해 1ml의 Rhizobium tropici를 식물에 접종합니다. 이때 Rhizobium 배양액을 OD 600 기준 6으로 희석하십시오.식물을 28°C, 광주기 16시간 및 암주기 8시간 조건의 성장 챔버에서 유지하고 B 및 D 용액으로 관수합니다. NIN 프로모터의 시공간적 발현 패턴을 연구하기 위해 여러 시점에서 샘플링을 수행합니다. 뿌리가 손상되지 않도록 식물을 꺼내고, 버미큘라이트 입자가 남지 않도록 뿌리를 세척합니다.NIN 및 대조군 식물에서 뿌리를 무작위로 선택하고, 샘플을 GUS 분석 버퍼에 넣고 37°C의 암조건에서 16시간 동안 배양하여 GUS 조직화학적 염색을 진행합니다. 실체 및 복합 현미경으로 GUS 염색된 뿌리를 관찰하십시오. 이 사진은 일차 뿌리에서 Rhizobium에 의해 유도된 NIN 프로모터 발현을 보여줍니다.NIN 프로모터 발현은 Rhizobium에 감염된 뿌리털 세포에서도 관찰될 수 있습니다. 또한, GUS 발현은 뿌리결절 발달의 서로 다른 단계에서 기록될 수 있습니다. 벡터 대조군 뿌리에서는 GUS 발현이 나타나지 않았습니다.이 영상을 시청한 후에는 프로모터 컨스트럭트를 설계하고 Phaseolus의 형질전환 뿌리털(hairy roots)에서 프로모터 발현 패턴을 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 시스템은 Phaseolus 내의 다른 공생 및 병원균 상호작용뿐만 아니라 다른 진정쌍떡잎식물(eudicots)의 프로모터 발현 패턴 연구로 더욱 확장될 수 있습니다.

plant-promoter-analysis-identification-characterization-root-nodule

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

털이 루트 복합 식물이 어려운 변환 종의 식물 rhizobi​​um 상호 작용과 유괴를 공부하는 데 사용할 수있는 방법을 우리가...

의 복합 식물의 생성 Medicago truncatula 유괴의 Assays 사용

LRIS(Lateral Root Inducible System)는 측근의 동기 유도를 허용하며 Arabidopsis, thaliana 및 maize에 대해 제공됩니다.

의 측면 루트 유도 성 시스템<em&gt; 애기 장대</em&gt;과 옥수수

우리는 라이브 셀에 복잡 한 규제 및 신호 메커니즘을 연구를 많은 양의 콩 protoplasts의 준비를 위한 간단 하 고 효율적인 프로토콜을 개발.

콩 Protoplasts 및 변이 유전자 표정 분석 응용 프로그램의 격리에 대 한 간단한 방법

여기에 제시 된 프로토콜의 목표 endosphere 절연 균 mycoides 의 감자 루트 exudates에 transcriptomic 반응을 것입니다. 이 메서드는 식물-미생물 상호작용에 관련 된 중요 한 세균 유전자의 식별을 용이 하 게 하 고 원칙적으로 다른 endophytes 및 식물, 사소한 조정에 적용.

감자 루트 Exudates 균 Mycoides 의 Transcriptional 응답을 식물 세균 상호 작용:

시각화 및 루트 성장에서 제자리에 매우 도전 이다. 우리는 루트 개발 및 영양 농축에 대 한 응답에서 시간이 지남에 확산을 추적 하는 사용자 정의 rhizobox 방법을 제시. 이 메서드는 루트 소성 유기 질소 소스에 대 한 응답에서에 옥수수 genotypic 차이 분석 하는 데 사용 됩니다.

루트 성장 및 지역화 된 양분에 응답을 시각화 하는 최적화 된 Rhizobox 프로토콜

여기, 우리 감자 식물을 변환 하는 데 두 프로토콜을 제시. Agrobacterium tumefaciens 변환 Agrobacterium rhizogenes 야생 타입 촬영 자체 전파 될 수 있는 유전자 변형 털 뿌리를 생성 하는 동안 완전 한 유전자 변형 식물에 지도 한다. 우리는 다음 변환 된 뿌리에 얼룩이 지 거 스 여 발기인 활동 감지.

Agrobacterium tumefaciens 및 Agrobacterium rhizogenes-감자의 변환 중재와 거 스 얼룩에 의해 Suberin 유전자의 발기인 활동

리보솜 친화도 정제(TRAP)를 번역하면 장기와 조직의 최소한의 처리로 개발 프로그램을 해부할 수 있습니다. 이 프로토콜은 녹색 형광 단백질(GFP)으로 표적화된 세포로부터 고품질의 RNA를 산출합니다. qRT-PCR 또는 RNA-seq와 같은 다운스트림 분석 도구는 조직 및 세포 유형별 발현 프로파일을 밝힙습니다.

세포 유형 별 척도에서 애기장대 뿌리 개발을 조사하기 위해 리보솜 친화성 정제 (TRAP) 번역

이 프로토콜은 식물 뿌리에 토양 매개 미생물을 접종하는 전략에 대한 자세한 요약을 제공합니다. 진균 Verticillium longisporum 및 Verticillium dahliae에 대해 예시된 세 가지 상이한 뿌리 감염 시스템이 기술된다. 잠재적 응용 분야와 가능한 다운스트림 분석이 강조되고 각 시스템에 대한 장단점이 논의됩니다.

식물 뿌리를 토양 매개 미생물로 감염시키는 접종 전략

여기에서 우리는 형질전환 대두 털 뿌리의 고효율 생산을 위한 프로토콜을 제시합니다.

유전자 기능 분석을 위한 콩 털이 뿌리 형질전환

여기에서는 복합 식물을 생산하기 위해 Agrobacterium tumefaciens 가 매개하는 원스텝 형질전환 방법의 자세한 프로토콜을 제공합니다.

Agrobacterium rhizogenes 기반 털이 많은 뿌리 형질전환에 의한 복합 식물 생산을 위한 효율적이고 재현 가능한 방법

학습하세요 Phaseolus vulgaris에서 Agrobacterium rhizogenes를 이용한 뿌리 결절 특정 발기인 분석 방법을. 이 프로토콜은 유전자 발현 패턴 연구와 식물 생명공학 연구에 활용됩니다.

식물 발기인 분석: 식별 및 일반적인 콩에서 루트 결 절 특정 발기인의 특성

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