Name: 수동 선명도 삭제 마우스 난소의 혈관 구조의 3 차원 재구성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: 배우세요 수동 CLARITY 기법을 이용하여 마우스 난소의 혈관 구조와 모낭 내 모세혈관 분포를 3차원으로 재구성하는 방법을. 이 기술은 생식 생물학 및 혈관 생물학 연구에 필수적인 난소 기능 이해를 돕습니다.

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이 연구는 초나라에 대 한 중국 특별 기금에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (YF No. 2014T70392), 국립 자연 과학 재단의 중국 YF (No. 81673766), 새로운 교사를 못쓰게 기금, 복 단 대학의 Zuoxue 재단 및 개발 상하이 최대 분야 통합 의학 (20150407)의 프로젝트.

동물 주제와 관련 된 모든 절차에서 상해 의학 대학, 복 단 대학 (승인 번호 20160225-013) 동물 윤리 위원회의 지침에 따 랐 다.
1입니다. 투명 마우스 난소의 준비
<ol><li>
솔루션의 준비
	<ol>
<li>준비 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 솔루션 (1 M, pH 7.6) 0.1% 트라이 톤 X-100 (PBST). 10 x PBS 재고 솔루션 1 L을 혼합 87 g의 NaCl, NaH2포4 · 3.1 g 2 H2O, 그리고 나2HPO4 ·12H2오의 28.7 g dH2O L 1과 볶음 ~ 2 h. pH 7.4에 조정 1 N NaOH를 추가 하 고 상 온에서 저장. 1/10이 10 배 재고 솔루션을 희석 0.1% 이며 dH2O를 사용 하 여 PBS에 트라이 톤 X-100.</li>
		<li>Mixings 4% (wt/vol) paraformaldehyde (PFA) 솔루션, 4% (wt/vol) 아크릴, 0.05% (wt/vol) bisacrylamide, 및 0.25% (wt/vol) VA-044 초기자 두 번 증 류 물 얼음에 의해 히드로 솔루션 (pH 7.5)를 준비 합니다.</li>
		<li>4% (wt/vol) 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 이중 증 류 물에서 포함 된 200 m m 나트륨 붕 산 염 버퍼를 혼합 하 여 개간 솔루션 (pH 8.5)를 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transcardial 관류와 난소 준비
	<ol>
<li>모든 절차 동안 얼음에 모든 솔루션을 유지.</li>
		<li>성인 여성 와일드 타입 C57BL/6 마우스 pentobarbital (0.35 mg/kg) 솔루션의 복 주사와 anesthetize 발가락-핀치 응답 보여줍니다, 일단 마우스 제대로 마 취.</li>
		<li>사지와 마우스를 해결 하기 위해 사용 스티커 테이프 플랫 폼 보드에 밖으로 뻗어.</li>
		<li>가 위로 가슴, 피부, 뼈를 통해 칼 프로세스에 절 개를 마음에 노출.</li>
		<li>동물의 오른쪽 아 트리 움로 절 개 하 고 perfuse 10 mL/min에서 얼음 1 x PBS의 20 mL와 좌 심 실.</li>
		<li>20 mL 이상 10 mL/min에서 히드로 솔루션으로 동물 perfuse</li>
		<li>가 위, 전체 enterocoelia를 노출, medioventral 라인을 따라 복 부에 피부 incise 고 내장을 제거 합니다. 난소 뿐만 아니라 자 궁 난소 형태학의 무결성을 유지 하기 위해 수집 합니다.</li>
		<li>현미경으로 난소 주위 지방 조직을 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
기체 제거
	<ol>
<li>3 일 동안 고정을 위한 4 ° C에서 10 mL 히드로 솔루션에 난소를 놓습니다.</li>
		<li>5 mL 관으로 난소를 전송 하 고 히드로 솔루션 튜브를 입력 합니다. 튜브 위에 parafilm 스트레칭 하 고 튜브의 목 parafilm 포장. 주의:는 parafilm와 히드로 솔루션 사이 아무 거품 인지 확인 합니다.</li>
		<li>유해를 하이드로 겔 수 있도록 3 h의 최대 37 ° C에서 인큐베이터에서 통에 튜브를 놓습니다.</li>
		<li>주걱을 사용 하 여 젤에서 난소를 제거 하 고 조심 스럽게 티슈 페이퍼에 의해 난소 주위에서 초과 젤을 제거. 4 번 1 x PBS 가진 난소를 씻어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
수동 청소
	<ol>
<li>청소 솔루션의 10 mL에 난소 잠수함 개간 과정을 시작 하는 37 ° C에서 80 rpm에서 부드럽게 흔들어.</li>
		<li>첫 주에 3 일 마다 솔루션을 변경 합니다. 일단 난소까지 주 분명해 1 주일 후 청소 솔루션을 새로 고칩니다. 일반적으로이 프로세스는 약 2-3 주 걸립니다. 참고: 난소 또는 immunostained를 직접 수 저장할 수 있습니다 나트륨 아 지 드 (0.02%)에 PBS에 4 ° C에서 immunostaining 전에 몇 주 동안.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. Immunostaining
<ol><li>통에 37 ° C에서 1 일에 PBST에 두 번 난소를 씻어.</li>
	<li>37 ° c.에 2-3 일에 1 차 항 체/PBST 솔루션 (표 1)에 통에 난소를 품 어 에 여기에 제시, 기본 항 체 혈소판 내 피 성장 세포 접착 분자 1 (CD31) 했다 일과 티로신 hydroxylase 각각 1시 10분, PBST에 1시 50분에 희석. 주의: 두 개 이상의 종류 1 차적인 항 체의 사용 하는 경우 다른 동물 소스 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>하루에 4 통에 37 ° C에서 PBST 버퍼 기본 항 체를 씻어.</li>
	<li>하루 5-6 통에 37 ° C에 PBST에서 원하는 보조 항 체와 난소를 품 어. 여기에 제시 된 작품에 2 차 항 체 티로신 hydroxylase와 알 렉 사 가루 594 CD31 PBST에 1시 50분에 희석에 대 한 알 렉 사 가루 488을 했다.</li>
	<li>통에 7 일에 37 ° C에서 PBST 버퍼와 2 차 항 체를 씻어.</li>
	<li>주 8에 굴절률 균질에 대 한 굴절률 매칭 솔루션으로 조직의 전송. 눈금선의 시각적 선명도 눈금선을 볼 수 있는지 여부를 확인 하 여 확인 하는 종이에 조직을 넣어. 일단 조직을 완전히 명확히 있다, 몇 군데 될 수 있습니다.</li>
	<li>단지 주변을 수 퍼 실린더 조직, 그리고 말굽 모양으로 모양을 만들고 밀폐 공간을 만들기 위하여 유리 슬라이드에 밀접 하 게 외부 릿지를 누릅니다. 퍼 티의 높이 난소 보다 조금 키가 있어야 합니다.</li>
	<li>명확히 난소 신중 하 게 퍼 티의 중심에 놓고 굴절률 일치 하는 솔루션을 추가 합니다. 유리 하단 접시 퍼 티에 단단히 넣고 퍼 티를 사용 하 여 요리를 해결.</li>
</ol>3. confocal 현미경 검사 법
<ol><li>Confocal 현미경 이미징, "Ni-E" 패널에서 선택 (이 경우 물 침수 25 X 렌즈, 1.1-나, 2 mm-WD)에 렌즈 (이 경우 2.0 m m)에 적절 한 작업 거리.</li>
	<li>
"수집" 패널에서 채널 수를 선택 합니다. 여기에, 3 개의 채널을 사용 합니다.
	<ol>
<li>첫째, 사용 하 여 "눈 포트" 탭 및 XY 컨트롤러 조이스틱 현미경 접 안 렌즈를 통해 확인 하 여 조직 필드의 중심을 이동.</li>
		<li>셔터 라이트를 끈 후 조정 "레이저 파워", "HV (이득)", "라이브" 탭을 클릭 하 고 "오프셋 ' 각 별도로 채널. 높은 레이저 전원 및 HV 높은 신호를 발생할 수 있습니다 그리고 더 높은 오프셋 배경 잡음을 줄일 수 있습니다.</li>
		<li>적절 한 "스캔 크기"와 "수"를 선택 합니다. 사용 하 여 1024 x 1024 µ m2 의 스캔 크기와 4 ~ 8의 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
설정 패널에서 조직의 깊이 정의 하기 위한 이미지 품질 "Z 강도 보정", 후 (조직 중심)에서 난소의 최상위 계층에 렌즈를 찾아서 최상위 계층에 대 한 인수를 조정 후, 클릭 "더하기" 버튼을 상위 계층을 정의 합니다.
	<ol>
<li>렌즈를 이동 하 고 적절 한 HV 및 조직의 하단에 대 한 레이저 전원 설정 Z 강도 보정 테이블에 낮은 레이어 정보 추가. "하 차" "ND 수집" 패널 설정을 동기화 하려면 클릭 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
"ND 수집" 패널, 스캔 수 단계 첫 번째 집합. 그런 다음, "Z"와 "큰 이미지" 탭 체크.
	<ol>
<li>접 안경 통해 조직 시각화의 도움으로 조직의 경계에 따라 필드의 크기를 정의 하려면 "스캔 큰 이미지" 창으로 이동 합니다. 다시 검색 영역 ("필드")의 크기를 입력 하 고 10%와 15% 사이 오버랩 선택 "ND 수집" 패널으로 이동.</li>
		<li>"실행 Z 수정" 하지 "실행" 지금", 자동으로 각 계층에 대 한 적절 한 HV, 레이저 파워와 오프셋을 설정 하 고 이미지 처리를 위해 대기를 클릭 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 개별 낭과 그들의 Vasculatures의 3D 재구성
<ol><li>첫째, ImageJ5 를 사용 하 여 원래 NIS 파일을 엽니다. "이미지" 버튼을 클릭 하 고 "색상" 및 "분할 채널"을 선택 합니다. 다음, "파일"을 클릭 하 고 별도로 "다른 이름으로 저장"에서 "이미지 시퀀스" 옵션을 사용 하 여 tiff 파일 시리즈로 채널을 저장.</li>
	<li>Imaris를 사용 하 여 tiff 파일 시리즈 중 하나를 엽니다. "편집" 버튼을 클릭 하 고 "채널 추가"를 선택 추가 채널의 나머지를. 이름 및 색상 채널의 "디스플레이 조정" 탭에서 변경할 수 있습니다. 직물의 두께 "편집" 드롭 다운 목록에서 "이미지 속성" 패널에서 수정 해야 합니다.</li>
	<li>3D 자르기 최종 이미지의 과잉 부분 제거, 대 한 "편집" 버튼을 클릭 하 고 "3D 자르기"를 선택 합니다. 테두리를 끌어 필드의 크기를 조정할 수 있습니다.</li>
	<li>
Surpass 패널에 필 라 멘 트 알고리즘으로 선박 신호를 재구성 하 새로운 필 라 멘 트를 생성 하 고 클릭 합니다 "필" 버튼을 클릭 합니다.
	<ol>
<li>가장 크고 가장 얇은 직경을 정의 하기 위해 "슬라이스" 패널에가 고 추적 선박을 찾을. 거리 선박의 최대 너비에 두 포인트를 선택 하 여 "측정" 패널에 자동으로 표시 됩니다.</li>
		<li>"Surpass" 패널에 돌아가 측정된 폭을 입력을 클릭 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>시작 및 씨앗 포인트 임계값을 조정 합니다. "카메라" 패널에서 "선택"을 선택 합니다. 자동으로 생산된 분야의 일부는 제거 될 필요가, shift 하 고 지점에 클릭 하십시오. "이동"을 선택 하 고 마우스를 이동, 구조는 모든 올바른 포인트 유지 되 고 다음을 클릭 합니다 회전할 수 있습니다.</li>
	<li>로컬 대비를 위한 높은 임계값을 선택 하 고을 클릭 합니다. "쪽이 검출"를 선택한 혈관 실린더의 재건을 마무리 계속 하지 마십시오. 색상은 "색상" 탭을 클릭 하 여 편집할 수 있습니다. 통계 데이터는 복원 된 필 라 멘 트의 "통계" 패널에서 추출할 수 있습니다. "편집" 패널에서 초과 부분을 제거할 수 있습니다. 참고: 다른 알고리즘은 총 낭 또는 소 낭 모양 벽의 볼륨을 측정 하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에 제시 된 작품에는 oocytes 두 이차 항 체의 autofluorescence에 의해 표를 했다. 많은 양의 데이터 때문에 워크스테이션 서버 데이터 분석을 위해 사용 되었다.</li>
</ol>5. 통계 분석
참고: 이미지 분석 데이터는 ± 표준 오류를 의미 하는 대로 표시 됩니다.
<ol><li>독립 표본 t-검정를 사용 하 여 모 공 사이의 비교를 수행 하 고 피어슨의 상관 관계 테스트를 사용 하 여 상관 관계 계수 follicular 벽 및 모 세관 길이 비교. P의 값을 설정 < 0.05 통계적 의미에 대 한 제한.</li>
</ol>

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<li>Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-mount+approach+for+accurate+quantitative+and+spatial+assessment+of+fetal+oocyte+dynamics+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice.</a> Biol Reprod. 93 (113), (2015).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

현재 연구에서 선물이 3D 이미징 모세 혈관과 개별 성장 낭 사이의 관계를 평가 하기 위해. 우리의 이전 작품에서는 동일한 프로토콜 9를 사용 하 여, 우리는 큰 맥 관 구조, 모 공, 그대로 마우스 난소에서 난 포의 위치 사이 상호 작용의 역할을 공부 했습니다. 수동 선명도 접근 수 마이크로 및 매크로 vasculatures, folliculogenesis, corpora lutea의 다른 발달 단계에서 난소 아키텍처를 재구성으로 낭도 간의 상호 관계를 공부 하 고 있었습니다.
데이터를 얻기 위해 3D 이미지 그대로 직물의, 개간 과정은 중요 한 첫걸음 이다. 두 가지 주요 전략-탈수 방법 및 수동 선명도10같은 친수성의 시 약-기반 방법. 탈수 방법 종종 형광 신호 감소 이어질 종종 독성 유기 솔루션 폐기물 생산 때문에 우리는 다양 한 조직 유형으로 사용 하기 위해 수동 선명도 방법의 몇 가...

여 포는 난소의 기본적인 구조상과 기능 단위 이며 그 개발 높은 난소 내에서 맥 관 구조에 관련 된. 혈관 영양과 모 낭에 호르몬을 공급 하 고 따라서 성장과 낭1의 성숙에 중요 한 역할.
선택적 혈관 마커, 유전자 변형 마우스 모델 및 제약 개발을 포함 하 여 기술의 조합 난소 혈관 네트워크, 신생, 혈관의 기능에 대 한 우리의 지식을 증가합니다 folliculogenesis입니다. 난소는 그것 folliculogenesis와 배 란 기간 동안 다양 한 조직 및 혈관 네트워크를 개장 하기 때문에 활성 장기로 알려져 있다. 혈관의 구조와 크기에 이러한 활성 개장 하는 것은 개발 및 낭의 생물 학적 기능을 위한 필요 이다.
난소 및 혈관의 immunolabeling를 사용 하 여 전통적인 조직학 및 histomorphometric 메서드는 2 차원 (2D) 이미지2. 3 차원 (3D) 재구성 기술 개발 조직 조각의 2D 이미지 3 차원 구조를 만들기 위해 중첩 수 있습니다 하지만이 방법은 여전히 몇 가지 한계가-조직의 단면 마이크로 구조의 일부를 파괴할 수는 조직, 자주 그리고 상당한 노동은 조각에서 얻은 이미지에서 3 차원 개조를 제작에 관련 된. Confocal 현미경 검사 법으로 전체 조직의 3D 영상 많은, 이러한 한계를 극복할 수 있지만 이러한 방법은 배아 난소3신생의 평가에 제한 됩니다. 전체 조직의 선명도4 같은 방법의 선택을 취소를 사용 하 여 산 후 및 성인 난소에 이러한 문제를 해결할 수 있도록 시각화 된 볼륨을 증가 시킬 수 있습니다 그리고 이러한 방법을 모든 구조적 변형 없이 난소의 광학 정리 제공. 그대로 난소의 3D 아키텍처의 이미징이이 작품에 사용 된 Imaris 소프트웨어 패키지 같은 이미지 분석 소프트웨어에 대 한 정확한 이미지 데이터베이스를 제공 합니다.
성인 기에 걸쳐 난소의 개장 동적 생리 체계의 일부 이며 이것은 난소 신생의 규칙에 대 한 조사에 대 한 우수한 모델. 또한, polycystic 난소 증후군이 나 난소 암 등 여성 생식의 pathologic 상태에서 난소 혈관의 역할을 평가 전체 난소 조직 영상 통해 공부 될 수 있다. 수동 선명도 방법의 개발 및 고급 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 혈관과 모 낭 등 난소의 구조 간의 관계에 자세한 공간 정보 제공.

<table><tbody><tr><td>아크릴아미드</td><td>Vetec</td><td>v900845</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845</td></tr><tr><td>Alexa Flour 488 (희석 1:50)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A11039</td><td>https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039</td></tr><tr><td>Alexa Flour 594 (희석 1:50)</td><td>Life Technologies</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 비사크릴아미드</td><td>Amresco</td><td>172</td><td>http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx</td></tr><tr><td>검은 벽 유리 바닥 접시 (Willco-Dish)</td> <td>Ted Pella</td><td>14032</td><td>http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall</td></tr><tr><td>붕산</td><td>Sinopharm 화학 시약</td><td>10004818 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818</td><td></td></tr><tr><td>인산수소 나트륨 (Na2HPO4 12H2O)</td><td>Sinopharm 화학 시약</td><td>10020318</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318</td></tr><tr><td>FocusClear</td><td>Celexplorer</td><td>FC-102</td><td>http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td>http://www.parafilm.com/products</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sinopharm Chemical 시약</td><td></td><td>80096618</td></tr><tr><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618 PECAM1/CD31, 혈소판-내피 세포 접착 분자 1 (희석 1:10)</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td></td></tr><tr><td>http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html 광개시제 VA044</td><td>Wako</td><td>va-044/225-02111</td><td></td></tr><tr><td>http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm 아지드화나트륨</td> 시<td>그마</td><td>S2002</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>시노팜 화학 시약</td><td>10019318</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318</td></tr><tr><td>인산이수소나트륨(NaH2PO4 2H2O)</td><td>Sinopharm 화학 시약</td><td>20040718</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718</td></tr><tr><td>나트륨 도데 실 설페이트</td><td>Sinopharm 화학 시약</td><td>30166428</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428</td></tr><tr><td>수산화 나트륨 (NaOH)</td> <td>Sinopharm 화학 시약</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718 Triton X-100</td><td>Sinopharm 화학 시약</td><td>30188928</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928</td></tr><tr><td>티로신 하이드록실라제 (TH, 희석 1:50)</td><td>Abcam</td><td>ab76442</td><td>http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html</td></tr></tbody></table>

수동 선명도 삭제 마우스 난소의 혈관 구조의 3 차원 재구성

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

난소는 여성의 생식 시스템의 주요 기관 이다 하 고 여성 gametes의 생산에 대 한 복잡 한 구조 관계와 3 차원 (3D) 맥 관 구조 아키텍처의 내 분 비 시스템을 제어 하기 위한 필수적 이다는 난소는 잘 기술 된다. 3D 연결과 그대로 난소에 혈관의 아키텍처를 시각화 하기 위해 첫 번째 중요 한 단계는 광학 투명 난소를 만드는 것입니다. 피하 조직의 수축, 우리가 사용 하는 하이드로 겔 고정 기반 수동 선명도 (아크릴 때 교배 고정 취소 지질 교환 이미징 / Immunostaining/에서 제자리 교 잡-호환 조직 히드로) 메서드는 그대로 난소를 프로토콜 . Immunostaining, 고급 multiphoton confocal 현미경 검사 법, 그리고 3D 이미지 복원 다음 난소 혈관 및 소 낭 모양 모 세관의 시각화를 위해 사용 되었다. 이 방식을 사용 하 여, 우리는 상당한 긍정적인 상관 관계 보였다 (P < 0.01) follicular 벽의 볼륨과 follicular 모 세관의 길이 사이.

우리는 수동 난소 follicular와 혈관 구조를 보존 하 고 혈관과 모 낭의 레이블이 표시에서 높은 형광 신호를 취득 하는 동안 지우기에 대 한 신속 하 고 간단한 방법으로 수동 선명도 메서드를 적응. Follicular 맥 관 구조의 3D 아키텍처 CD31, 내 피 세포6표식에 대 한 immunostaining에 의해 결정 되었다. 필 라 멘 트 알고리즘을 사용 하 여 및 follicular 모 세관 및 기본 및 보조 모 공 (그림 1) 사이의 상호 관계를 보여주었다 CD31 성인 쥐의 난소에 얼룩 추적 했다.
티로신 hydroxylase immunostained oocytes granulosa와 thecal 층을 감지 하 고 낭7...

여기 우리는 그대로 마우스 난소에서 수동 선명도 난소 맥 관 구조 및 follicular 모세 혈관의 시각화를 위한 3D 재구성 방법의 적응을 제시.

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 마우스 난소 난포 내 모세혈관 분포의 완전한 3차원 뷰를 제공하고 그들 간의 관계를 보여주는 것입니다. 난소는 생식 및 내분비학에서 필수적인 기관입니다. 각기 다른 발달 단계의 난포와 체세포의 수를 측정하십시오.또한 다른 장기들과 달리, 난소는 기능 단위의 반복적인 분지 구조를 보이지 않습니다. 성인 여성의 경우, 국소 혈관계와 신경계가 매 월경 주기마다 큰 변화를 겪을 수 있습니다. 난소에 투명화 기법을 적용하면 난소 내 세포들과 난포들의 전체적인 분포 및 상호 연결성을 확인할 수 있습니다.이 측정법의 가장 핵심적인 특징은 난소에 미치는 영향이 최소화되면서도 다양한 마커들을 명확히 구분해낼 수 있다는 점입니다. 현미경 이미지의 재구성을 통해 우리는 난소의 지도를 제공하였습니다. 혈관, 신경세포 및 난포의 세부 사항들을 명확하게 관찰할 수 있습니다.이미지 분석을 위해, 난소와 구조물 간의 관계를 평가하고자 Imaris의 일부 옵션을 사용하였습니다. 논문의 지침에 따라 관류액을 준비하고 얼음 위에 보관하십시오. 마우스를 마취하고 발가락 꼬집기 반응이 없는지 확인하십시오.에탄올을 분무하고 우심방에 절개를 가한 다음, 즉시 좌심실에 20ml의 ice cold PBS를 분당 10ml의 속도로 관류하여 혈액을 씻어냅니다. 그런 다음 동일한 속도로 차가운 Hydrogel Solution을 사용하여 동물을 관류합니다. 난소 형태의 무결성을 유지하기 위해 자궁과 함께 난소를 수집합니다.분리된 난소를 차가운 하이드로젤 용액(Hydrogel Solution)으로 옮깁니다. 실체 현미경 하에서 난소 주변의 지방 조직을 제거합니다. 조직 고정 결과를 개선하기 위해 난소낭(ovarian bursa)을 제거하는 것을 권장합니다.난소를 하이드로젤 용액(Hydrogel Solution)에 3일 동안 보관하십시오. 3일 후, 난소를 유리 튜브로 옮기고 튜브에 신선한 하이드로젤 용액을 채웁니다. 튜브 윗부분을 파라필름으로 팽팽하게 덮은 다음, 튜브 목 부분에 파라필름을 한 번 더 감으십시오.파라필름과 하이드로겔 용액(Hydrogel Solution) 사이에 기포가 없는지 확인하십시오. 젤이 형성될 때까지 37°C의 진탕 배양기에 유리 튜브를 넣고 2시간 동안 배양합니다. 여과지를 사용하여 난소 주변의 과잉 젤을 조심스럽게 제거하십시오.난소를 15ml 튜브에 넣고 10ml의 투명화 용액으로 튜브를 채웁니다. 튜브를 37°C의 진탕 배양기에 넣고 최소 두 달 동안 보관합니다. 처음 3일 동안은 매일 투명화 용액을 교체하고, 이후에는 난소가 투명해질 때까지 매주 교체합니다.모든 면역염색 과정은 37°C의 쉐이커 위에서 수행합니다. 먼저, 난소를 PBST로 24시간 동안 세척합니다. 둘째, PBST로 희석한 1차 항체에 난소를 2일 동안 배양합니다.셋째, PBST 버퍼로 1차 항체를 세척하여 제거합니다. 넷째, PBST에 희석한 원하는 2차 항체와 함께 난소를 2일 동안 배양합니다. 다섯째, PBST로 2차 항체를 세척하여 제거합니다.여섯째, RI 균질화를 위해 난소를 굴절률 매칭 용액으로 옮깁니다. 시각적 투명도를 확인하고, 난소가 완전히 투명해지면 이미징이 가능합니다. 먼저, 깨끗한 유리 바닥 접시를 준비합니다.퍼티 실린더를 만들어 말굽 모양으로 성형합니다. 유리 슬라이드 위에 퍼티의 바깥쪽 가장자리를 단단히 눌러 밀폐된 공간을 만듭니다. 퍼티의 높이는 난소보다 약간 높아야 합니다.난소를 조심스럽게 중앙으로 이동시킨 후 마운팅 용액을 첨가합니다. 퍼티 위에 디시를 누르고, 두 개의 퍼티 조각을 사용하여 고정합니다. 난소를 촬영할 준비가 되면, 16X 렌즈가 장착된 Nikon 공초점 현미경을 선택하여 촬영할 수 있습니다.공초점 현미경으로 이미징하려면, 먼저 Ni-E 패널에서 렌즈를 선택하십시오. 획득(acquisition) 패널에서 채널 수를 선택합니다. 먼저, Eye Port 탭과 XY 컨트롤러 조이스틱을 사용하여 현미경 접안렌즈로 확인하며 조직을 시야 중심부로 이동시킵니다.둘째로, 셔터 라이트를 끈 후, 라이브(live) 탭을 클릭하여 각 채널의 레이저 출력, HV 및 오프셋을 조정합니다. Z Intensity Correction 패널에서 최상층의 획득 설정을 조정하려면 플러스(+) 버튼을 클릭하여 상단을 정의하고, 렌즈를 아래로 이동시켜 조직 바닥면에 적절한 HV와 레이저 출력을 설정한 후 최하층 정보를 추가합니다. 그 다음 To ND를 클릭하여 설정값을 패널 및 획득 설정과 동기화합니다. 그리고 획득(acquisition) 설정에서 먼저 스캐닝 단계 수를 설정합니다.Z 탭과 대형 이미지 탭을 클릭하십시오. 둘째, 대형 이미지 스캔 창으로 이동하여 조직의 경계에 따라 시야의 크기를 정의하십시오. 셋째, ND 획득 화면으로 돌아가 스캔 시야의 크기를 입력하고 10%에서 50% 사이의 중첩 범위를 선택하십시오. 그런 다음 Z 보정 실행을 클릭하고 이미징 프로세스가 완료될 때까지 기다리십시오.먼저 imagic을 사용하여 원본 NIS 파일을 엽니다. image 버튼을 클릭하고 색상 및 디스플레이 채널을 선택한 다음, file을 클릭하여 image sequences를 선택하고 각각 tiff 파일로 저장합니다. 그 다음, Imaris를 사용하여 tiff 파일 중 하나를 엽니다.편집 버튼을 클릭하고 채널 추가를 선택하여 나머지를 추가하십시오. 이름과 색상은 디스플레이 조정에서 변경할 수 있습니다. 조직의 두께 또한 이미지 속성에서 수정해야 합니다.셋째, 편집 버튼을 클릭하고 Crop 3D를 선택하여 불필요한 부분을 잘라냅니다. 먼저, 필라멘트 버튼을 클릭하고 다음을 누릅니다. 슬라이스 패널로 이동하여 추적 용기와 거리를 설정한 후, 다시 Surpass로 돌아와 정적 수치를 입력하고 다음을 클릭합니다.둘째로, 시작점과 설정점 임계값을 조정합니다. 카메라 패널에서 선택 도구를 선택한 후, Shift 키를 누른 상태에서 지점을 클릭하여 불필요한 부분을 제거합니다. 셋째로, 가장 높은 임계값을 선택하고 다음을 클릭합니다.검출 지점을 선택하지 말고 다음으로 진행하십시오. 초과 부분의 일부는 편집 패널에서 제거할 수 있습니다. 색상은 색상을 클릭하여 편집할 수 있습니다.CD31 면역염색 후 난소 혈관의 3D 구조를 조사하였습니다. 3D 구조는 다른 단면들을 통과하는 슬라이스 형태로 관찰하거나, 볼륨 렌더링을 통해 전체 모습으로 관찰할 수 있습니다. 성체 마우스의 여포 혈관에 대해 CD31 염색을 수행하였습니다.필라멘트를 이용한 모세혈관의 재구성을 통해, 개별 난포와 그에 해당하는 모세혈관 사이의 관계를 보여줄 수 있었습니다. 여성의 난소는 항상 활성화되어 있으며 가변적입니다. 하지만 전통적인 조직학적 분석의 한계로 인해, 이토록 복잡한 구성 요소들 간의 관계를 설명하는 것은 매우 어렵습니다.새롭게 개발된 방법인 passive clarity는 광학적 장애물을 극복하고, 전체 조직의 무결성을 유지하며, 기능적 단서를 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다.

three-dimensional-reconstruction-vascular-architecture-passive

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 연구는 가역 조직 삭제, immunostaining, 3D 렌더링 및 인간 태 반 villi 샘플 1-2 m m3의 순서에 혈관 네트워크의 분석에 대 한 프로토콜을 선물 한다.

3 차원 렌더링 및 Immunolabeled, 분석 인간 Placental Villous 혈관 네트워크를 명확히

여기, 선물이 직렬 구분 없이 교양된 난소 젊은 쥐의 모 낭을 계량 하는 프로토콜. 전체 기관 면역 형광 및 조직 삭제를 사용 하 여, 실제 단면 광 단면으로 대체 됩니다. 샘플 준비 및 시각화의이 방법은 기관 무결성을 유지 하 고 특정 셀의 자동화 된 정량화를 용이 하 게.

전체 산 면역 형광 및 교양된 마우스 난소의 여 포 정량화

난소 조직 문화 여 포 개발, 배 란, 그리고 여 포가 폐쇄 증의 모델로 사용할 수 있습니다 하 고 동적 난소 프로세스의 규제 메커니즘을 나타냅니다.

난소 조직 문화 현상을 마우스 난소에서 시각화 하

여기에서, 우리는 고정 마우스 난소 조직의 정확한 여포 계산을 위한 2개의 다른 기술을 기술하고, 비교하고, 대조합니다.

성인 마우스 난소의 정확한 여포 열거

여기에서는 전체 탑재 면역 염색, 다중 광자 현미경 검사, 3D 시각화 및 분석을 사용하여 정량적 및 정성적 분석을 위해 전체 난소를 이미징하는 데 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 독성학, 임상 진단 및 난소 기능의 게놈 분석에 적용 할 수있는 높은 처리량, 신뢰성 및 반복 가능한 처리를 수용합니다.

전체 난소 면역 형광, 클리어링 및 마우스에서 난소 예비의 정량적 3D 분석을위한 다중 광자 현미경 검사

망막 혈관 구조의 주위 세포는 형광 토마토 렉틴의 역궤도 주사 후 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β로 면역 형광 염색으로 검사했습니다. 표지된 망막은 조직 제거 방법으로 추가로 처리되었으며 컨포칼 현미경으로 망막 혈관 구조를 둘러싼 주위 세포의 3차원 보기를 시각화하기 위해 전체적으로 장착되었습니다.

Immunostaining을 통한 마우스의 망막 혈관 주위 세포의 3D 시각화 

배란 전 기간 동안 난소 혈류의 변화는 배란에 필수적입니다. 도플러 초음파 검사는 난소 혈류역학 및 관류를 평가하기 위해 인간과 대형 동물에서 사용되었습니다. 마우스의 배란 전 및 배란 전후 단계에서 난소 혈역학을 평가하기 위해 도플러 초음파를 적용하기 위한 프로토콜이 제시됩니다.

생쥐의 난소 혈관 기능의 실시간 이미징 및 정량화를 위한 도플러 초음파 검사

히 - C 방식은 염색질 상호 작용 (1) 편견, 게놈 차원의 식별이 가능합니다. 히 - C의 커플 근접 결합 및 대규모 병렬 시퀀싱합니다. 그 결과 데이터가 여러 스케일에서 게놈 구조를 연구하는 데 사용할 수 있습니다 : 초기 결과는 같은 염색체 지역, 개방적이고 닫힌 염색질의 분리 및 megabase 규모의 염색질 구조와 같은 기능을 확인.

안녕하세요 - C : Genomes의 3 차원 구조를 공부하는 방법.

그들은 pluripotency에 대한 표준 테스트를 통과 때도 생성 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 라인이 발달 가능성을 서로 다른 행을 생산하고 있습니다. 여기 가진 전체 pluripotency로 iPSC 라인을 정의 iPSCs에서 완전히 파생 쥐를 생산하기 위해 프로토콜을...

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

우리는 단일 세포의 세 차원 공 촛점 형광에서 가져 정의되지 않은 형태의 형태학의 변화를 측정하기 Imaris 신경 과학, ImarisXT 및 MATLAB을 사용하는 소프트웨어 플랫폼을 개발했습니다. 이 새로운 접근 방식은 수용체 활성화에 따라 세포 모양의 변화를 수량화하는 데 사용되므로 약물 발견을위한 가능한 추가 도구를 나타냅니다 할 수 있습니다.

3 차원 형광 이미지에서 세포 형태학의 변경 사항 단정 지을 분석 도구

배우세요 수동 CLARITY 기법을 이용하여 마우스 난소의 혈관 구조와 모낭 내 모세혈관 분포를 3차원으로 재구성하는 방법을. 이 기술은 생식 생물학 및 혈관 생물학 연구에 필수적인 난소 기능 이해를 돕습니다.

수동 선명도 삭제 마우스 난소의 혈관 구조의 3 차원 재구성

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