수동 선명도 삭제 마우스 난소의 혈관 구조의 3 차원 재구성

이 프로토콜의 전반적인 목표는 마우스 난소 난포 내 모세혈관 분포의 완전한 3차원 뷰를 제공하고 그들 간의 관계를 보여주는 것입니다. 난소는 생식 및 내분비학에서 필수적인 기관입니다. 각기 다른 발달 단계의 난포와 체세포의 수를 측정하십시오.

또한 다른 장기들과 달리, 난소는 기능 단위의 반복적인 분지 구조를 보이지 않습니다. 성인 여성의 경우, 국소 혈관계와 신경계가 매 월경 주기마다 큰 변화를 겪을 수 있습니다. 난소에 투명화 기법을 적용하면 난소 내 세포들과 난포들의 전체적인 분포 및 상호 연결성을 확인할 수 있습니다.

이 측정법의 가장 핵심적인 특징은 난소에 미치는 영향이 최소화되면서도 다양한 마커들을 명확히 구분해낼 수 있다는 점입니다. 현미경 이미지의 재구성을 통해 우리는 난소의 지도를 제공하였습니다. 혈관, 신경세포 및 난포의 세부 사항들을 명확하게 관찰할 수 있습니다.

이미지 분석을 위해, 난소와 구조물 간의 관계를 평가하고자 Imaris의 일부 옵션을 사용하였습니다. 논문의 지침에 따라 관류액을 준비하고 얼음 위에 보관하십시오. 마우스를 마취하고 발가락 꼬집기 반응이 없는지 확인하십시오.

에탄올을 분무하고 우심방에 절개를 가한 다음, 즉시 좌심실에 20ml의 ice cold PBS를 분당 10ml의 속도로 관류하여 혈액을 씻어냅니다. 그런 다음 동일한 속도로 차가운 Hydrogel Solution을 사용하여 동물을 관류합니다. 난소 형태의 무결성을 유지하기 위해 자궁과 함께 난소를 수집합니다.

분리된 난소를 차가운 하이드로젤 용액(Hydrogel Solution)으로 옮깁니다. 실체 현미경 하에서 난소 주변의 지방 조직을 제거합니다. 조직 고정 결과를 개선하기 위해 난소낭(ovarian bursa)을 제거하는 것을 권장합니다.

난소를 하이드로젤 용액(Hydrogel Solution)에 3일 동안 보관하십시오. 3일 후, 난소를 유리 튜브로 옮기고 튜브에 신선한 하이드로젤 용액을 채웁니다. 튜브 윗부분을 파라필름으로 팽팽하게 덮은 다음, 튜브 목 부분에 파라필름을 한 번 더 감으십시오.

파라필름과 하이드로겔 용액(Hydrogel Solution) 사이에 기포가 없는지 확인하십시오. 젤이 형성될 때까지 37°C의 진탕 배양기에 유리 튜브를 넣고 2시간 동안 배양합니다. 여과지를 사용하여 난소 주변의 과잉 젤을 조심스럽게 제거하십시오.

난소를 15ml 튜브에 넣고 10ml의 투명화 용액으로 튜브를 채웁니다. 튜브를 37°C의 진탕 배양기에 넣고 최소 두 달 동안 보관합니다. 처음 3일 동안은 매일 투명화 용액을 교체하고, 이후에는 난소가 투명해질 때까지 매주 교체합니다.

모든 면역염색 과정은 37°C의 쉐이커 위에서 수행합니다. 먼저, 난소를 PBST로 24시간 동안 세척합니다. 둘째, PBST로 희석한 1차 항체에 난소를 2일 동안 배양합니다.

셋째, PBST 버퍼로 1차 항체를 세척하여 제거합니다. 넷째, PBST에 희석한 원하는 2차 항체와 함께 난소를 2일 동안 배양합니다. 다섯째, PBST로 2차 항체를 세척하여 제거합니다.

여섯째, RI 균질화를 위해 난소를 굴절률 매칭 용액으로 옮깁니다. 시각적 투명도를 확인하고, 난소가 완전히 투명해지면 이미징이 가능합니다. 먼저, 깨끗한 유리 바닥 접시를 준비합니다.

퍼티 실린더를 만들어 말굽 모양으로 성형합니다. 유리 슬라이드 위에 퍼티의 바깥쪽 가장자리를 단단히 눌러 밀폐된 공간을 만듭니다. 퍼티의 높이는 난소보다 약간 높아야 합니다.

난소를 조심스럽게 중앙으로 이동시킨 후 마운팅 용액을 첨가합니다. 퍼티 위에 디시를 누르고, 두 개의 퍼티 조각을 사용하여 고정합니다. 난소를 촬영할 준비가 되면, 16X 렌즈가 장착된 Nikon 공초점 현미경을 선택하여 촬영할 수 있습니다.

공초점 현미경으로 이미징하려면, 먼저 Ni-E 패널에서 렌즈를 선택하십시오. 획득(acquisition) 패널에서 채널 수를 선택합니다. 먼저, Eye Port 탭과 XY 컨트롤러 조이스틱을 사용하여 현미경 접안렌즈로 확인하며 조직을 시야 중심부로 이동시킵니다.

둘째로, 셔터 라이트를 끈 후, 라이브(live) 탭을 클릭하여 각 채널의 레이저 출력, HV 및 오프셋을 조정합니다. Z Intensity Correction 패널에서 최상층의 획득 설정을 조정하려면 플러스(+) 버튼을 클릭하여 상단을 정의하고, 렌즈를 아래로 이동시켜 조직 바닥면에 적절한 HV와 레이저 출력을 설정한 후 최하층 정보를 추가합니다. 그 다음 To ND를 클릭하여 설정값을 패널 및 획득 설정과 동기화합니다. 그리고 획득(acquisition) 설정에서 먼저 스캐닝 단계 수를 설정합니다.

Z 탭과 대형 이미지 탭을 클릭하십시오. 둘째, 대형 이미지 스캔 창으로 이동하여 조직의 경계에 따라 시야의 크기를 정의하십시오. 셋째, ND 획득 화면으로 돌아가 스캔 시야의 크기를 입력하고 10%에서 50% 사이의 중첩 범위를 선택하십시오. 그런 다음 Z 보정 실행을 클릭하고 이미징 프로세스가 완료될 때까지 기다리십시오.

먼저 imagic을 사용하여 원본 NIS 파일을 엽니다. image 버튼을 클릭하고 색상 및 디스플레이 채널을 선택한 다음, file을 클릭하여 image sequences를 선택하고 각각 tiff 파일로 저장합니다. 그 다음, Imaris를 사용하여 tiff 파일 중 하나를 엽니다.

편집 버튼을 클릭하고 채널 추가를 선택하여 나머지를 추가하십시오. 이름과 색상은 디스플레이 조정에서 변경할 수 있습니다. 조직의 두께 또한 이미지 속성에서 수정해야 합니다.

셋째, 편집 버튼을 클릭하고 Crop 3D를 선택하여 불필요한 부분을 잘라냅니다. 먼저, 필라멘트 버튼을 클릭하고 다음을 누릅니다. 슬라이스 패널로 이동하여 추적 용기와 거리를 설정한 후, 다시 Surpass로 돌아와 정적 수치를 입력하고 다음을 클릭합니다.

둘째로, 시작점과 설정점 임계값을 조정합니다. 카메라 패널에서 선택 도구를 선택한 후, Shift 키를 누른 상태에서 지점을 클릭하여 불필요한 부분을 제거합니다. 셋째로, 가장 높은 임계값을 선택하고 다음을 클릭합니다.

검출 지점을 선택하지 말고 다음으로 진행하십시오. 초과 부분의 일부는 편집 패널에서 제거할 수 있습니다. 색상은 색상을 클릭하여 편집할 수 있습니다.

CD31 면역염색 후 난소 혈관의 3D 구조를 조사하였습니다. 3D 구조는 다른 단면들을 통과하는 슬라이스 형태로 관찰하거나, 볼륨 렌더링을 통해 전체 모습으로 관찰할 수 있습니다. 성체 마우스의 여포 혈관에 대해 CD31 염색을 수행하였습니다.

필라멘트를 이용한 모세혈관의 재구성을 통해, 개별 난포와 그에 해당하는 모세혈관 사이의 관계를 보여줄 수 있었습니다. 여성의 난소는 항상 활성화되어 있으며 가변적입니다. 하지만 전통적인 조직학적 분석의 한계로 인해, 이토록 복잡한 구성 요소들 간의 관계를 설명하는 것은 매우 어렵습니다.

새롭게 개발된 방법인 passive clarity는 광학적 장애물을 극복하고, 전체 조직의 무결성을 유지하며, 기능적 단서를 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다.