에는 대장균-감염 살 균 소의 합성 기반 셀 무료 식 시스템

이 실험의 전반적인 목표는 모든 E.coli 무세포 전사 번역 시스템을 사용하여 박테리오파지가 게놈에서 합성되는 방법을 설명하는 것입니다. 이 방법은 살아있는 시스템의 분자 자기 조립 메커니즘을 밝히는 것과 같은 합성 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 플랫폼의 다양성입니다.

많은 생물학적 시스템을 완전히 요약하고 실험 분석을 위해 미세 조정할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 파지 플라크를 준비하는 것으로 이 절차를 시작합니다. 멸균 파스퇴르 피펫의 끝 부분을 사용하여 단일 플라크를 코어로 제거하고 제거합니다.

희석된 세포에 플라크를 불어 넣습니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 완전 감염을 검사하려면 500마이크로리터 샘플을 1.5ml 튜브에 넣고 10마이크로리터의 클로로포름을 추가합니다.

즉시 혼합물을 고속으로 와류로 회전시키고 용액이 정화되는지 관찰하면 파지 감염을 나타냅니다. 세포가 완전히 감염되면 2시간 더 배양합니다. 다음으로, 8, 000 번 g 및 섭씨 4도에서 세포를 원심 분리하기 전에 DNase를 첨가합니다.

상등액을 버리고 펠릿을 10X Tris 염화마그네슘 10ml에 다시 현탁시킵니다. 500마이크로리터의 클로로포름을 첨가하고 고속으로 와류를 일으켜 세포를 용해시킵니다. 12, 000 시간 g에 분리기에 의하여 4 섭씨 온도에 10 분 동안 명백하게 하십시오.

그런 다음 상등액을 15ml 원추형 튜브에 넣고 섭씨 4도에서 보관하십시오. 4개의 초원심분리 튜브에 2.5ml의 45% 자당을 피펫팅하여 5-45% 자당 그래디언트 4개를 준비합니다. 약 2.6ml의 5% 자당으로 층을 덮고 액체가 튜브 가장자리에서 2mm에 도달하면 멈춥니다.

기울기 형성 기기를 사용하여 기울기 형성 기기를 사용하여 86도 및 23RPM에서 43초 동안 기울기를 혼합합니다. 1ml 피펫을 사용하여 팁을 액체 표면과 접촉시키고 급격한 피펫팅을 통해 혼합되지 않도록 주의하면서 자당 구배 상단에 부피를 매우 천천히 분배하여 풀링된 파지 현탁액 500마이크로리터를 추가합니다. 70, 000 번 g에서 섭씨 4도에서 20 분 동안 원심 분리기.

끝이 파지 띠의 맨 위 가장자리 중앙에 올 때까지 뭉툭한 캐뉼라를 용액에 담그십시오. 파지 밴드의 대부분이 제거될 때까지 주사기 플런저를 당겨 밴드를 제거합니다. 그런 다음 부유 파지가 있는 자당 부피를 3개 또는 4개의 초원심분리 튜브에 추가합니다.

튜브 상단에서 3mm에서 4mm 사이로 튜브를 차가운 1XTM으로 채웁니다. 튜브를 파라핀 필름으로 덮고 뒤집어 섞습니다. 튜브를 울트라 원심 분리기에 다시 넣고 섭씨 4도에서 1 시간 동안 145, 000 회 g를 소비합니다.

상층액을 빠르게 붓고 일회용 물티슈에 거꾸로 물기를 뺍니다. 모든 펠릿에 걸쳐 200-400마이크로리터의 차가운 1XTM을 나누고 섭씨 4도에서 밤새 다시 매달립니다. 흔들 필요가 없습니다.

역가를 만들기 전날, 10ml의 LB 성장 배지에서 E.coli 숙주 세포 배양을 준비하고 250RPM 및 섭씨 37도로 설정된 진탕 인큐베이터에서 밤새 배양물을 방치합니다. 다음으로, 5.25ml의 top agar, 220μl의 희석된 파지 샘플, 50μl의 숙주 박테리아 세포를 14ml의 배양 튜브에 피펫팅하여 마스터 믹스를 준비합니다. 배양 튜브와 와류를 고속으로 캡을 씌웁니다.

섭씨 37도의 인큐베이터에서 두 개의 배양 플레이트를 회수합니다. 그런 다음 마스터 믹스 2.5ml를 첫 번째 플레이트의 중앙에 천천히 추가합니다. 접시를 손으로 부드럽게 돌려 마스터 믹스가 전체 배양 접시에 걸쳐 있도록 고르게 분포시킵니다.

상단 한천이 굳을 때까지 20분 동안 기다립니다. 섭씨 37도에서 4-7시간 동안 플레이트를 배양합니다. 플라크를 계수하고 각 반응 샘플에 대한 파지 농도를 측정합니다.

새로운 1.5ml 튜브에 1XTM 버퍼를 사용하여 파지 스톡의 일부를 400마이크로리터로 희석합니다. 희석액에 동일한 부피의 Tris phenol chloroform을 첨가하십시오. 혼합물을 실험실 로커에 올려 또는 손으로 5분 동안 부드럽게 흔듭니다.

그런 다음 생성된 에멀젼을 17, 000회 g의 탁상용 원심분리기에서 5-10분 동안 원심분리합니다. 상부 수성상을 새 튜브로 제거하고 계기 경계를 방해하지 않도록 주의하십시오. 이 단계를 두 번 더 반복하여 총 3번의 페놀 추출을 수행합니다.

수성상을 새 튜브로 옮기고 동일한 부피의 클로로포름을 첨가합니다. 수성 DNA 샘플을 깨끗한 튜브로 옮기기 전에 흔들고 원심분리합니다. 다음으로, 3 몰 아세트산 나트륨 0.4 부피와 95 % 에탄올 3 부피를 추가합니다.

튜브를 섭씨 영하 20도의 냉동고에 넣어 밤새 강유시킵니다. 17, 000 시간 g의 원심 분리기를 10-15 분 동안 벤치 탑 원심 분리기에서 원심 분리기. 디캔팅 또는 피펫팅을 통해 상층액을 제거하고 폐기합니다.

그런 다음 500마이크로리터의 70% 에탄올을 넣고 펠릿이 튜브 바닥에서 떠오를 때까지 튜브를 부드럽게 흔듭니다. 원심 분리 후 에탄올을 제거하고 버리고 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오. 에탄올을 첨가하고 이전과 같이 원심 분리한 후 에탄올을 두 번 제거하고 버리고 펠릿을 방해하지 않도록 다시 한 번 주의하십시오.

펠릿을 벤치탑에서 30-60분 동안 자연 건조합니다. 건조되면 펠릿에 이중 증류수 50마이크로리터를 넣고 실온에서 1시간 동안 배양하거나 섭씨 4도에서 밤새 배양하여 다시 현탁합니다. 280나노미터에서 흡수 측정을 사용하여 DNA 농도를 측정합니다.

cell-free 반응을 수행하려면 표시된 양의 미처리 추출물(최종 반응 부피의 33%)을 마이크로 원심분리 튜브에 분취합니다. 텍스트 프로토콜에 나열된 대로 마스터 믹스를 준비합니다. 각 성분의 적절한 부피를 미처리 추출물에 첨가합니다.

마지막 성분을 첨가한 후 와류로 반응을 균질화합니다. 그런 다음 마스터 믹스를 n개의 마이크로 원심분리기 튜브로 나눕니다. 다음으로, 변수 구성 요소의 표시된 볼륨을 마스터 믹스 어레이에 추가합니다.

와류가 발생하기 전에 원하는 최종 반응 부피에 도달하기 위해 각 반응에 물을 추가합니다. 그런 다음 마이크로 원심분리기 튜브를 섭씨 29도에서 최소 8시간 동안 또는 밤새 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 파지 역가를 위한 세포를 준비한 후, 이 비디오의 앞부분에서 설명한 대로 최종 cell-free 반응 LB 용액을 적정합니다.

다음은 phi X 174 파지를 합성하는 cell-free 반응의 대표적인 결과입니다. 이 파지 플라크는 적절한 희석으로 역가된 성공적인 파지 반응을 보여주며, 이는 셀 수 있는 플라크의 수로 분명합니다. 그러나 반응의 파지 수율에 비해 희석 계수가 너무 낮을 경우 성공적인 반응이 제대로 나타나지 않을 수 있습니다.

이 판에는 셀 수 없이 많은 명판이 있습니다. 여기에 표시된 것은 배양 플레이트 온도의 불충분한 사전 평형으로 인해 파지 플라크가 불균일하게 분포된 플레이트입니다. 파지 역가를 수행하는 동안 배양 플레이트는 플레이트의 오른쪽 하단 부분에서 반응을 응고시켰습니다.

분자 밀집 조건은 phi X 174에 대한 파지 합성에 강력한 영향을 미치며, 특히 PEG 농도가 부피 기준으로 4%에서 2%로 떨어질 때 T7에 대한 파지 수율 T7.In 3배 떨어집니다. 일단 마스터하면 파지 정제 및 DNA 추출이 제대로 수행되면 2일 이내에 완료할 수 있습니다. cell-free 반응은 문제가 없을 때 몇 시간 밖에 걸리지 않습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 파지를 성장시키고, DNA를 추출 및 정제하고, 그 결과를 사용하여 무세포 반응 시스템을 사용하여 완전히 감염성 파지를 재구성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 페놀로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 실험실 가운, 보안경 및 장갑과 같은 예방 조치를 착용해야 합니다. 페놀이 열린 용기에 대한 모든 작업은 흄 후드에서 수행해야 합니다.