Name: 에는 대장균-감염 살 균 소의 합성 기반 셀 무료 식 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: 배우세요 대장균 세포 밖 전사-번역 시스템을 이용한 박테리오파지 합성 방법을. 이 기술은 합성생물학에서 분자 자기조립 메커니즘을 연구하고 생물학적 시스템을 재구성하는 데 활용됩니다.

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이 자료는 해군 연구 사무실 보너스 번호 N00014-13-1-0074 (V.N.)를 지 원하는 작업을 기반으로, 인간 프론티어 과학 프로그램 부여 번호 RGP0037/2015 (V.N.), 그리고 한국군 과학 재단 부여 2014400 (V.N.).

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</ol>

저자 선언 다음 경쟁 금융 interest(s): Noireaux 실험실 MYcroarray, MYtxtl 셀 무료 단백질 식 키트의 대리점에서에서 연구 자금을 받습니다.

첸, 그 외 에 기술에 따라 SPMC에 대 한 14 , superinfection 적절 한 조건을 결정할 때 중요 한 단계에 도달입니다. 가장 가깝게 superinfection 견딜 호스트 스트레인의 능력을 제어 하는 매개 변수 자주 감염 살 균 소의 초기 농도 이다. 호스트 세포는 살 균 소의 아주 작은 금액을 초기 감염 전에 대 수 성장 단계에 있어야 합니다. 결국, 페이지 또한 로그 성장을 도달 하 고 목표 살 균 소 숫자 빠르게 셀 카운트, 각 호스트 셀에 페이지의 여러 복사본에 대 한 허용을 능가 하는. 이렇게 하면 어디 그것은 세포의 용 해를 받게 될 것 이다 준 안정 상태로 셀. 이 상태에 도달 하지 경우 셀 연계, confluent 세포를 받아야 하 고 그들의 바이러스 부하를 풀어 것입니다. Superinfection 위의 초기 바이러스 농도 사용 하 여 연결할 수 없습니다, 후속 시도 하기 전에 10의 요인에 의해 감염의 초기 다양성을 낮은. 수확을 하기...

지난 10 년간, 셀 무료 식 기술 긴급 종합 연구 분야 관련 합성 및 양적 생물학에서 주소 새로운 응용 프로그램을 설계 되었습니다. 원래 독립적인 생명체의 단백질을 표현 하는 데 사용, 새로운 셀 무료 TXTL 시스템 모두 기초 및 응용 과학1,2, 상당히이 기술의 범위 확대에 대 한 개발 되었습니다. TXTL 플랫폼의 새로운 세대는 사용자 친화적인, 수 있도록 설계 되었습니다 더 효율적 (도달 배치 모드3에서 단백질 합성의 2 mg/mL), 더 전사4의 수준에서 다양 하 고 게로 이렇게 모듈형 쉽게 통합 자연 소설 또는 기존 생물 학적 시스템5,6의 기능을 확장 하는 합성 함수. 특히, TXTL 시스템 셀 무료 되 규제 요소 등 작은 유전자 회로7,,89, 유전 프로그램의 신속한 프로토 타입에 대 한 편리한 디자인-빌드-테스트를 줄여 몇 일을 주기. 놀랍게도, 새로운 TXTL 시스템은 또한 큰 DNA coliphages10,11, 강한 활성 게놈의 재구성을 지원 하기 위해 충분 한 성과 보여주는 완벽 한 종합 프로그램을 처리할 수 DNA는 생활 엔티티 인코딩됩니다.
TXTL 시스템 전통적인 생체 외에서 건설적인 생 화 확 적인 분석 실험에 비해 많은 기술적인 장점을 제시. 셀-무료 TXTL 살아있는 세포의 복잡 한 세포질 반대로 감소 하 고 오픈 환경에서 최종 제품에 유전자 발현의 과정을 연결합니다. TXTL DNA를 사용 하 여, 현대 DNA 조립 기술,는 저렴 하 고 빠른 까다로운 단백질 정화 단계를 요구 하지 않는 뿐만 아니라 생화학 시스템에 생체 외에서재구성. 셀-무료 식 대부분의 생 화 확 적인 반응, 따라서12분자 상호 작용 깊은 해 부를 수 있도록 구성 요소에 대 한 직접 액세스를 제공 합니다. TXTL 반응에서 거의 불가능 한 살아있는 세포에 자유로이 생화학 및 생물 설정을 변경할 수 하나. 이러한 장점과 최근 개선을 감안할 때, TXTL 기술 합성 및 양적 생물학에 대 한 대체 플랫폼으로 더 많은 인기 되고있다. TXTL를 사용 하 여 연구 커뮤니티는 빠르게 성장 하는 동안 TXTL 바이오에 표준 기술 되 고, 그것은 TXTL 반응의와 실행에 관련 된 적절 한 전략을 개발할 수 있도록 같은 플랫폼을 사용 하는 방법을 이해 필수적입니다는 결과의 해석입니다.
이 문서에서는, 우리 모든 대장균 TXTL 시스템을 사용 하 여 그들의 게놈11, MS2 같은 살 균 소를 한 냄비 반응에서 합성 하는 방법을 설명 (RNA, 3.4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5.4 kb), 및 T7 (dsDNA, 40 kb). 우리는 페이지의 금액 반응 (마그네슘과 칼륨 농도)의 생 화 확 적인 설정의 일부에 관하여 변화를 합성 하는 방법을 보여줍니다. 말뚝의 범위 8000 농도 통해 에뮬레이션 분자 크롤 링, 여러 자릿수로 이상 살 균 소 합성에 극적인 효과가. 동시에 전사, 번역의 과정을 정리 하 고 자기 조립, 생물학 및 물리학에 관련 된 기본적인 질문을 해결 하기 위한 흥미롭습니다 단일 테스트 튜브 반응에서 이러한 큰 생화학 시스템의 실현 10 (유전자 규칙, 자기 조립), 뿐만 아니라 새로운 nanostructures13구축 페이지 기능을 재사용 하는 등 응용 프로그램 개발에. TXTL에는 실용적, 뿐만 아니라 우리 패 분석 실험에 의해 살 균 소 증폭, 게놈 추출 및 정화, 살 균 소 정량화 방법 제공합니다. 이 원고에 표시 메서드에 대장균 추출 기반 셀 자유로운 시스템을 사용 하 고 살 균 소에 관심이 연구원에 적합 합니다.
이 작품에서 제시 하는 프로토콜은 다음과 같이 요약 될 수 있다: 1) 살 균 소 확대 (주 1: 접종 준비 세포, 주 2: 플 라크, 여러 살 균 소 성장, 고 농도, 및 3 일: 살 균 소의 정화), 2) 더블-좌초 게놈 DNA 추출 (페 놀/클로 프롬 추출), 3) 셀 무료 살 균 소 반응과 titer 실험 (주 1: 호스트 셀 접시 고 한 천 배지, 주 2: 셀 무료 반응 하 고 호스트 세포 사전 문화, 그리고 하루 3: 호스트 셀 문화 및 살 균 소 titer).

<table><tbody><tr><td>초원심분리 튜브</td><td>Beckman Coulter</td><td>344057</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>그라디언트 메이커</td><td>BioComp 그라디언트 마스터</td><td>항문 Biochem 참조.1985년 7월; 148(1):254-9.</td><td></td></tr><tr><td>주사기 및 블런트 캐뉼라</td><td>Monoject</td><td>8881513918 및 888202017</td><td></td></tr><tr><td>와이드 보어 피펫 팁</td><td>Fischerbrand</td><td>02-707-134</td><td></td></tr><tr><td>플라크 카운터</td><td>New Brunswik Scientific</td><td>Colony Counter Model C-110</td><td></td></tr><tr><td>Culture tubes</td><td>Fischerbrand</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>Cell-free system</td><td>Mycroarray Inc</td><td>Mytxtl</td><td></td></tr><tr><td>BioComp Gradient Master</td><td>BioComp Instruments</td><td>모델 105ME</td><td></td></tr><tr><td>LB 한천 플레이트 레시피</td><td></td><td></td><td>25 g/L Luria-Bertani 배지(LB Broth, Miller - Fisher BioReagents, 제품 번호 BP1426) 및 15 g/L Bacto-Agar 고체(Brenton, Dickenson and Company - 제품 번호 214010).</td></tr></tbody></table>

에는 대장균-감염 살 균 소의 합성 기반 셀 무료 식 시스템

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

셀 무료 전사-번역 (TXTL) 시스템, 더 큰 다양성 및 모듈화, 테스트 튜브 반응에서 기초 및 응용 과학을 수행 하기 위해 새로운 기능을 제공 하기 위해 설계 된의 새로운 세대. 지난 10 년간, TXTL 셀 무료 소설 종합 연구 분야 관련된 양적 및 합성 생물학의 광범위 한 범위에 대 한 강력한 기술 되고있다. 새로운 TXTL 플랫폼은 생성 하 고 합성 또는 자연 유전자 회로 실행을 통해 생화학 시스템 심문 특히 유용 합니다. 생체 외에서 TXTL 입증 정리로 빠르게 프로토 타입 규제 요소와 뿐만 아니라 생물 네트워크에 편리한 메커니즘 생활 시스템에서 발견 하는 자기 조립 분자. 이 문서에서 설명 하는 어떻게 전염 성 살 균 소, 등 MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA), 그리고 T7 (dsDNA), 전적으로 모든 대장균, 셀 프리 TXTL 시스템을 사용 하 여 한 냄비 반응에 그들의 게놈에서 합성 됩니다. 3 coliphages의 합성 상 패 분석 결과 사용 하 여 정량 이다. 우리는 합성된 살 균 소의 수확량 반응의 생 화 확 적인 설정에 따라 결정 하는 방법을 보여줍니다. 던지다 8000의 제어 집중을 통해 에뮬레이션 분자 크롤 링, magnitudes의 명령에 의해 합성된 페이지의 금액에 영향을 줍니다. 우리는 또한는 페이지를 증폭 하는 방법 및 그들의 게놈을 정화 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜 및이 작품에서 제시 하는 결과 집합이 셀 무료 합성 생물학 및 생명 공학에 종합 연구 참여에 대 한 관심의 이어야 한다.

우리는 4 개의 대표적인 결과 보여줍니다. 그림 1에서는 셀 무료 TXTL 시스템 및 살 균 소 DNA 주식 생활 오염 되지 되도록 부정적인 컨트롤 집합 소개 대장균 세포. 우리 셀 무료 TXTL 시스템은 그대로 대장균 의 무료 확인 모두 비 인 큐베이 팅 및 incubated 반응 솔루션 genomic DNA (그림 1A 와 그림 1B)의 무효를 도금 하 여 오염 셀. 경우 셀 무료 TXTL 시스템 대장균 세포 오염 되었다, 성장 접시에 관찰 될 것 이다. 또한, 우리 확인 셀 무료 반응 그리고 그러므로 어떤 가능한 오염 물질 셀, 살 균 소의 합성에 대 한 책임 도금 살 균 소 게놈 (<strong c...

셀 무료 녹음 방송 번역 플랫폼의 새로운 세대 생화학 시스템에 생체 외에서 유전자 회로 실행을 통해 구성 설계 되었습니다. 이 문서에서는, 우리는 모든 대장균 세포 무료 TXTL 시스템을 사용 하 여 그들의 게놈에서 살 균 소 MS2, ΦΧ174, T7, 등는 합성 하는 방법을 설명 합니다.

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

본 실험의 전반적인 목표는 전 공정이 E.coli 무세포 전사-번역 시스템을 이용하여 박테리오파지가 게놈으로부터 어떻게 합성되는지 기술하는 것입니다. 이 방법은 생체 시스템 내의 분자 자기 조립 메커니즘을 규명하는 것과 같이 합성 생물학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 플랫폼의 다재다능함에 있습니다.많은 생물학적 시스템은 실험적 분석을 위해 완전히 재현하고 미세하게 조정할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 파지 플라크(phage plaque)를 준비하여 이 절차를 시작하십시오. 멸균된 파스퇴르 피펫(Pasteur pipette) 끝을 사용하여 단일 플라크를 코어링하여 제거합니다.플라크를 희석된 세포 속으로 불어 넣습니다. 그런 다음 37 °C에서 2시간 동안 배양합니다. 완전 감염 여부를 테스트하려면, 500 µL 샘플을 1.5 mL 튜브에 취하고 10 µL의 클로로포름을 첨가합니다.혼합물을 즉시 고속으로 볼텍싱하고, 용액이 투명해지는지 관찰하십시오. 이는 파지 감염을 나타냅니다. 세포가 완전히 감염되면 2시간 동안 더 배양하십시오. 다음으로 DNase를 첨가한 후, 8,000 ×g 및 4 °C에서 세포를 원심분리하십시오.상청액을 버린 후, 펠릿을 10 mL의 1X Tris magnesium chloride에 재현탁합니다. 500 µL의 클로로포름을 첨가하고 고속으로 볼텍싱하여 세포를 용해합니다. 4°C에서 12,000 ×g로 10분간 원심분리하여 상층액을 맑게 합니다.그런 다음 상층액을 15 mL 원추형 튜브에 옮겨 담고 4 °C에서 보관하십시오. 4개의 초원심분리 튜브에 45% sucrose 2.5 mL를 피펫팅하여 5~45% sucrose 기울기를 4개 준비하십시오. 그 위에 5% sucrose 약 2.6 mL를 층별로 쌓으며, 액체가 튜브 가장자리에서 2 mm 지점에 도달하면 멈추십시오.농도 기울기 형성 기구를 사용하여 86도 각도로 23 RPM에서 43초 동안 튜브를 회전시켜 기울기를 혼합합니다. 1 mL 피펫을 사용하여, 팁을 액체 표면에 접촉시킨 후 매우 천천히 sucrose 기울기 상단에 500 µL의 통합 파지 현탁액을 분주하며, 이때 급격한 피펫팅으로 인해 혼합되지 않도록 주의합니다. 4°C에서 70,000 ×g로 20분 동안 원심분리합니다.뭉뚝한 캐뉼라를 용액에 담가 팁이 파지 밴드의 최상단 가장자리 중앙에 위치하도록 합니다. 시

synthesis-infectious-bacteriophages-an-e-coli-based-cell-free

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

계절 hypoxic 피요르드의 수직 깊이 연속으로부터 격리 환경 게놈 DNA와 fosmid 라이브러리의 구축이 설명되어 있습니다. 그 결과 클론 라이브러리는 384 잘 접시에 들어서 자동 식민지 따기 시스템의 응용 프로그램에서 스트림 시퀀싱 및 기능 검사를 위해 보관됩니다.

대형 삽입 환경 게놈 라이브러리 제작

이 문서는 박테리오파지 람다의 감염의 휘황 라벨이 지정된 버전을 준비하기위한 절차를...

에 셀 운명을 따라<em&gt; E. 대장균</em&gt; 파지 람다에 의해 감염 후

Source: Rustad, M., et al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the synthesis of bacteriophages using a cell-free transcription–translation (TXTL) system. A master mix is prepared using a bacterial crude extract, an energy mix, an amino acid mix, an inhibitor for a DNA-degrading enzyme, and bacteriophage DNA, then incubated. The in vitro molecular machinery enables viral protein expression and DNA...

Bacteriophage Synthesis Using a Cell-Free Transcription-Translation System

Source: Rustad, M. et al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the amplification and recovery of infectious bacteriophages from E. coli cultures. It outlines the steps for plaque isolation, phage replication, controlled lysis, and purification.

Amplification and Recovery of Infectious Bacteriophages

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp.(2018)This video demonstrates preparation of a bacteriophage lysate containing transducing particles. A donor strain is infected, plaques form, and the soft agar overlay is processed with chloroform to yield a clarified lysate for downstream analysis.

Preparation of Bacteriophage Lysate for Generalized Transduction

이 5 일간의 프로토콜은 모든 단계, 장비 및 기반의 효율적인 내생 대장균 처음부터 TX-TL의 무 세포 발현 시스템을 구축 및 실행에 필요한 추가 소프트웨어를 설명합니다. 시약, 프로토콜은 8 셋업 시간 이하의 반응, 수집, 및 프로세스 데이터를 걸린다.

구현을위한 프로토콜 대장균을 바탕으로 TX-TL의 무 세포 발현 시스템

여기, 선물이 곤충 세포 및 잠재 단백질 식 시스템 단백질 결정 화에 대 한 분 비 하는 식물 단백질의 대량 생산에 활용에 대 한 프로토콜. 잠재 식 벡터 GP67 또는 곤충 hemolin 신호 펩 티 드 식물 곤충 세포에서 단백질 분 비 식에 대 한 수정 되었습니다.

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이 프로토콜은 RNA 및 단백질 생산 합성 세포의 상향식 준비를 위한 방법, 물질, 장비 및 단계를 설명합니다. 합성 세포의 내부 수성 구획은 지질 이중층(즉, 안정한 리포솜) 내에 캡슐화된 S30 세균 용해물을 함유하고, 수중 오일 에멀젼 전달 방법을 사용하였다.

세포가 없는 세균 추출물, 리포좀 및 에멀젼 전달을 사용하여 합성 세포를 생산하는 단백질 을 준비합니다.

박테리아를 감염시키는 바이러스인 박테리오파지(파지)는 장내 마이크로바이옴의 필수 구성 요소입니다. 이러한 공생 생물이 박테리아 적합성과 개체군 역학을 주도하지만 장내 항상성과 질병에 미치는 영향에 대해서는 거의 알려져 있지 않습니다. 이 프로토콜은 마우스 모델 내에서 분리된 T4 파지를 연구하며, 다른 파지-박테리아 쌍에 적응할 수 있습니다.

쥐 장에서 T4 박테리오파지와 대장균 상호작용: 생체 내 숙주-박테리오파지 역학 연구를 위한 프로토타입 모델

이 프로토콜은 합성 세포를 구성하는 데 사용되는 CFPS(Cell-Free Protein Synthesis) 시스템을 설명합니다. 다양한 마이크로 컴파트먼트에서 대표적인 결과를 제공하는 주요 단계를 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 합성 세포 커뮤니티의 다양한 실험실에 대한 모범 사례를 수립하여 합성 세포 개발의 진전을 촉진하는 것을 목표로 합니다.

합성 세포 구축을 위한 Cell-Free 단백질 합성 시스템

이 프로토콜은 양이온성 펩타이드 Mel4와 펩타이드 모방 RK758의 항균 활성과 세포독성을 생성하고 평가하는 방법을 설명합니다. 화학 합성, 재조합 발현, 표준화된 기능 분석법을 통합함으로써, 펩타이드 및 소분자 모방체의 생산 및 시험을 위한 효율적인 워크플로우를 제공합니다.

항균 펩타이드 및 그 모방체의 생산 및 시험

배우세요 대장균 세포 밖 전사-번역 시스템을 이용한 박테리오파지 합성 방법을. 이 기술은 합성생물학에서 분자 자기조립 메커니즘을 연구하고 생물학적 시스템을 재구성하는 데 활용됩니다.

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