Laminin 521 매트릭스를 이용한 인간 유래 다 능성 줄기 세포의 통합 된 자유 유도

이 프로토콜의 전반적인 목표는 균질한 인간 유도 만능 줄기세포를 유도하는 것입니다. 이 방법은 질병 모델링, 약물 스크리닝을 포함한 다양한 목적으로 인간 유도 만능 줄기 세포를 추출하거나 전임상 세포 치료 시험을 위한 세포를 유도하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜의 장점은 견고하고 사용자 친화적이고 Xeno-free이며 화학적으로 완전히 정의된 배양 시스템에서 유지되는 균질한 세포를 생성한다는 것입니다.

인간 iPS 세포는 기증자 조직의 유전적 배경을 재현하고 잠재적으로 모든 질병 관련 세포 유형으로 분화될 수 있기 때문에 논문 모델링을 위한 훌륭한 도구를 제공합니다. 생검 해부와 군체 채취는 복잡한 절차입니다. 숙련된 손으로 수행하는 것을 보면 절차를 이해하는 데 도움이 되고 반복하기가 더 쉬워집니다.

오늘 카롤린스카 연구소(Karolinska Institutet)의 iPS 핵심 시설(iPS Core Facility)에서 근무하는 고도로 숙련된 두 명의 실험실 기술자인 해리엇 론홀름(Harriet RonnHolm)과 켈리 데이(Kelly Day)가 이 절차를 시연할 예정입니다. 피부 생검 샘플은 섭씨 4도에서 최대 48시간 동안 PBS와 1%페니실린 스트렙토마이신에 보관할 수 있지만 얻은 후 가능한 한 빨리 처리해야 합니다. 생검을 35mm 접시에 옮깁니다.

피부 생검을 35mm 접시에 70% 에탄올 2ml를 넣고 30초 동안 담급니다. 1%페니실린 스트렙토마이신이 보충된 멸균 Hank's Balanced Salt Solution 1ml를 새 35mm 접시에 넣고 생검 결과를 새 접시에 옮깁니다. 생검을 갓 준비한 0.1% 디스페이아제 용액 1ml로 채워진 35mm 접시 4개에 옮깁니다.

멸균 수술용 메스와 겸자를 사용하여 피부 생검을 1-2입방밀리미터 조각으로 자릅니다. dispase 용액이 포함된 생검 조각을 15ml 튜브로 옮기고 2ml의 dispase를 추가합니다. 35mm 접시를 1ml의 디스패스 용액으로 헹구고 헹궈진 용액을 15ml 튜브로 옮깁니다.

밤새 섭씨 4도에서 생검을 배양합니다. 다음 날 아침, 생검 조각이 있는 튜브에 0.1% 콜라겐 분해효소 I 4ml를 넣고 섭씨 37도에서 4시간 동안 배양합니다. 세포를 파종하기 30분 전에 6웰 조직 배양 플레이트에 DPBS의 0.1% 젤라틴 1밀리리터를 코팅합니다.

실온에서 30분 동안 배양합니다. 콜라겐분해효소로 4시간 배양한 후, 소화된 세포를 실온에서 3분간 300배의 g으로 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 섬유아세포 배지 2ml에 분해물을 재현탁합니다.

이전에 준비된 6웰 조직 배양 플레이트에서 젤라틴 용액을 제거합니다. 남아 있는 조직 조각을 포함한 세포 현탁액을 6-well 플레이트로 옮깁니다. 섭씨 37도에서 세포를 배양하고 습도가 높은 5% 이산화탄소에서 배양합니다.

섬유아세포는 80%가 융합될 때 T25 조직 배양 플라스크로 통과할 준비가 되어 있습니다. 2-4 계면의 섬유아세포는 재프로그래밍에 최적인데, 이는 일반적으로 낮은 계대 섬유아세포에 대해 재프로그래밍 효율이 더 높기 때문입니다. 플라스크에서 세포 배양 배지를 흡인하고 1ml의 DPBS로 세포를 세척합니다.

DPBS를 흡인하고 0.5%Trypsin EDTA 1ml를 추가합니다. 섭씨 37도에서 5분 동안 또는 세포가 분리될 때까지 배양합니다. 2ml의 섬유아세포 배지를 추가하고, 세포를 재현탁시키고, 세포 현탁액을 15ml 튜브로 옮깁니다.

실온에서 300 회 g의 원심 분리기. 상층액을 흡인하고 펠릿을 2ml의 섬유아세포 배지에 재현탁합니다. 혈구계를 사용하여 섬유아세포를 계수한 후, 24웰 조직 배양 플레이트의 한 웰에 있는 4번째 세포까지 5배를 10배로 파종합니다.

섭씨 37도에서 하룻밤 동안 세포를 배양합니다. 다음 날에는 센다이 바이러스가 취급되기 때문에 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 지정된 BSL-2 실험실에서 절차를 계속합니다. 세포 배양 배지를 흡인하고 센다이 바이러스 용액 250마이크로리터를 첨가합니다.

접시를 섭씨 37도에서 배양합니다. 군체를 채취하기 하루 전에 LN-521 코팅된 24웰 조직 배양 플레이트를 준비합니다. 250마이크로리터의 LN-521 용액을 24웰 플레이트의 한 웰에 피펫팅합니다.

파라필름을 사용하여 플레이트를 밀봉하고 밤새 섭씨 4도에서 배양합니다. 다음 날, 24웰 플레이트의 한 웰에서 LN-521 용액을 흡입하고 웰에 500마이크로리터의 E8을 추가합니다. 헤어네트와 절차용 마스크의 사용은 실체 현미경으로 군체를 선택하는 동안 권장됩니다.

군체는 직경이 1mm 이상의 크기에 도달하고 날카로운 모서리를 나타내며 균질한 단층으로 자랄 때 선택할 준비가 된 것입니다. 흐릿한 경계와 크고 조밀하지 않은 이질적인 세포 덩어리가 있는 군체를 선택하지 마십시오. 메스로 각 군체를 격자 모양의 패턴으로 더 작은 조각으로 자릅니다.

200마이크로리터 피펫을 사용하여 접시에서 세포 시트를 기계적으로 긁어낸 다음 시트를 LN-521로 미리 코팅된 24웰 조직 배양 플레이트의 웰로 옮깁니다. 콜로니 선택은 이 프로토콜의 성공에 매우 중요합니다. 몇 개의 추가 군체를 선택하면 충분한 수의 부착을 보장할 수 있습니다.

48시간 동안 E8 배지를 변경하지 않고 세포가 부착되도록 합니다. 효소를 통해 군체가 5mm 이상의 크기에 도달했을 때 세포를 배양합니다. 세포에서 세포 배양 배지를 흡인하고 250마이크로리터의 DPBS로 세척합니다.

DPBS를 흡입하고 250마이크로리터의 해리 시약을 추가합니다. 섭씨 37도에서 3분 동안 배양합니다. 세포가 둥글어지기 시작하는 것을 관찰하십시오.

해리 시약으로 세포를 헹구어 플레이트에서 세포를 분리합니다. 500마이크로리터의 E8 배지를 15ml 튜브에 넣고 세포와 해리 시약을 튜브로 옮깁니다. 300회 g에서 3분간 원심분리기

15 밀리리터 튜브에서 상등액을 흡인하고 500 마이크로리터의 E8 배지에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 혈구계를 사용하여 세포를 2.5 - 5 곱 10 배 시드 500 마이크로 리터의 실온 E8 배지를 포함하는 이전에 준비된 다른 LN-521 사전 코팅 웰에 4 번째 세포를 시드합니다. ROCK 억제제를 최종 농도 10마이크로몰에 추가합니다.

세포를 섭씨 37도에서 배양합니다. 이 프로토콜을 사용하면 인간 유도 만능 줄기세포 군락이 형질도입 후 약 12일째에 형질도입된 섬유아세포에서 나옵니다. 군체는 형질도입 후 약 3-4주에 채취할 준비가 되었습니다.

선호되는 특징으로는 편평한 소형 세포 덩어리, 균질한 단층으로 성장, 날카로운 모서리 등이 있습니다. 이러한 명시야 이미지는 매우 이질적인 세포주와 비교하여 초기 계대, 균질, 완전히 재프로그래밍된 인간 iPS 세포주를 보여줍니다. 센다이 바이러스 벡터의 손실은 3번 통로의 인간 iPS 세포와 대조적으로 12번 통로의 인간 iPS 세포에서 센다이 바이러스 벡터 특이적 마커가 없는 것으로 확인되었습니다.

다능성 마커 OCT4, SSEA-4 및 NANOG에 대한 유래 세포의 면역세포화학 염색은 균질하게 긍정적인 결과를 산출했습니다.내인성 만능 유전자의 mRNA 발현은 역전사효소 PCR에 의해 나타났습니다. 다능성 인자를 발현하지 않는 부분적으로 재프로그래밍된 세포를 포함하는 세포 배양은 폐기되었습니다.

인간 iPS 세포의 분화 가능성은 배아체의 형성에 의해 평가되었습니다. 배아체 분화 21일 후 Real-time PCR은 내배엽, 중배엽 및 외배엽 특이적 마커의 mRNA 발현을 검출하여 유래한 인간 iPS 세포가 3개의 생식층으로 분화할 수 있음을 확인했습니다. 이 기술을 마스터하면 약 16주간의 기간 동안 약 22시간의 실습 시간으로 수행할 수 있습니다.

유래된 인간 유도 만능 줄기 세포는 성인 인체의 모든 세포 유형으로 분화되어 연구 분야와 관련된 모든 질문에 답할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후 피부 생검에서 유도 만능 줄기 세포를 추출하는 데 필요한 단계를 수행하는 방법을 잘 이해하셨기를 바랍니다.