Name: Laminin 521 매트릭스를 이용한 인간 유래 다 능성 줄기 세포의 통합 된 자유 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: 배우세요 비통합 Sendai 바이러스 벡터와 Laminin 521 매트릭스를 이용한 인간 유래 다능성 줄기세포 유도법을. 이 방법은 질병 모델링과 약물 스크리닝에 활용됩니다.

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환자 물질의 수집 및 hiPS 세포의 유도는 2012 년 3 월 28 일 스톡홀름 윤리 검토위원회 (Statics Review Board)에서 승인합니다. 등록 번호 : 2012 / 208-31 / 3. 달리 명시되지 않는 한 세포 배양 단계는 바이오 안전성 캐비닛에서 수행되어야합니다. 세포 작업시 항상 멸균 취급 기술을 연습하십시오. 시작하기 전에 미디어, 플레이트 및 시약이 실온에 도달하도록하십시오. 고습도에서 37 ° C, 5 % CO 2 에서 세포를 배양하십시오. 1. 피부 생검에서 인간 섬유 아세포의 분리 <ol><li> 배양 배지, 소화 효소, 접시 코팅 및 해부 도구. <ol><li> Fibroblast 배지 준비 : Iscoove 수정 된 둘 베코 배지 (IMDM) 44.5 mL, 태아 소 혈청 (FBS) 5 mL 및 페니실린 / 스트렙토 마이신 (PEST) 500 μL ( 표 1 참조)를 4 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 1 mg / mL의 작업 농도에서 소화 효소를 준비하십시오 : wei4ml의 디스 페아 제 및 콜라게나 제 I 형 파우더를 별도의 15-mL 튜브에 분주하고 4 mL의 DMEM / F12 + 1 % PEST에 용해시켰다. 0.22 μm 여과기를 통과시켜 효소 용액을 소독합니다. 매번 신선한 효소 용액을 준비하십시오. </li><li> 인산염 완충 식염수 (DPBS) 0.1 % 젤라틴 1 ML로 해부 당 6 잘 조직 배양 플레이트 (또는 35 mm 조직 문화 요리)에 하나 잘 코트. 실온에서 30 분 동안 품어 낸다. </li><li> 해부를 위해 생검 당 1 세트의 외과 용 가위 및 집게를 고압 멸균합니다. </li></ol></li><li> 생검 처리 참고 : 생검 후 가능한 한 빨리 생체 조직을 처리하십시오. 4 ° C에서 48 시간 동안 PBS + 1 % PEST에 보관하십시오. 생검은 크기가 2 - 4 mm이고 윤리적 허용 기준에 따라야합니다. <ol><li> 35 mm 접시에 생검을 옮깁니다. 생검을 새로운 35 mm 접시로 옮기고 30 초 동안 70 % 에탄올 2 mL에 생검을 잠수시킵니다. </li><li> 생검을 세 번째 위치로 옮깁니다.35 mm 접시와 멸균 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 1 % 해소 보충 1 ML로 씻으십시오. </li><li> 생검을 네 번째 35 mm 접시에 옮기고 새로 준비한 0.1 % 디스 페스 용액 1 mL를 넣으십시오. </li><li> 외과 용 가위 및 집게를 사용하여 접시에서 1 - 2 mm 3 조각으로 피부 생검을 잘라 낸 다음 dispase 용액을 포함한 생검 조각을 15 mL 튜브에 옮깁니다. 추가 2 mL의 디스펜서를 첨가한다. </li><li> 35 mm 접시를 1 mL 디스펜스 용액으로 헹구고 15 mL 튜브로 옮긴다. </li><li> 밤새 4 ° C에서 생검을 품어. </li><li> 37 ℃에서 4 시간 동안 튜브에 0.1 % 콜라게나 아제 I 4 mL를 넣고 부화시킨다. </li><li> 3 분 동안 300xg의 소화 세포를 원심 분리하고 상층 액을 흡인하고 섬유 아세포 2mL에 다이제스트를 resuspend. </li><li> 6 잘 조직 문화 플레이트에서 젤라틴 솔루션을 제거합니다. 나머지 조각을 포함하여 세포 현탁액을 6 잘 조직 배양 플레이트 (또는 35mm 조직 배양 접시)를 DPBS 중의 0.1 % 젤라틴으로 미리 코팅 하였다. </li><li> 3 일마다 매체를 교체하십시오. </li></ol></li><li> 인간 섬유 아세포의 팽창 참고 : 80 % 합류 ( 그림 2B ) 때 섬유 아 세포는 T25 (25cm 2 ) 조직 배양 플라스크에 passaged 준비가되었습니다. 섬유 아세포는 일반적으로 7 일 이내에 80 %의 confluency에 도달합니다. 그러나 필요한 시간은 크게 다를 수 있지만 4 주를 넘지 않아야합니다. <ol><li> 매체를 기음과 2.5 ML의 DPBS로 한 번 씻으십시오. </li><li> DPBS를 제거하고 Trypsin-EDTA (0.05 %) 1 mL를 첨가하고 37 ° C에서 5 분간 또는 세포가 둥근 모서리를 표시 할 때까지 배양하여 분리를 시작하십시오. </li><li> 필요한 경우 세포의 적절한 분리를 보장 세포 씻어 섬유 아세포 2 ML을 추가합니다. 3 분 동안 300 XG에서 15 ML 튜브와 원심 분리기에 세포 솔루션을 전송합니다. </li><li> 상청액을 버리고 세포 펠렛을 5 mL의 섬유 아세포 배지 및 플레이트 섬유 아세포에코팅 된 세포 조직 배양 T25 플라스크. 이 단계 후에 섬유 아 세포를 확장하면 위에 설명한대로 해리하고 종자 12 X 10 3 셀 / cm 2 . </li><li> 일단 융합 세포가 냉동 준비가되면 재 프로그램을 위해 팽창 시키거나 플레이트하십시오. 모든 재 프로그램이 시작되기 전에 섬유 아세포의 두 라운드를 동결하십시오 (동결 절차는 다음 섹션 참조). 재 프로그래밍 효율은 일반적으로 낮은 통과 섬유 아세포의 경우보다 높으며, 2-4의 세포가 최적이다. 그러나,이 프로토콜을 사용하여 10 번까지 섬유 아세포의 성공적인 재 프로그램 화가 수행되었다. </li></ol></li><li> 섬유 아세포의 동결 및 해동 <ol><li> 신선한 fibroblast 냉동 매체를 준비하십시오 : 90 % FBS + 10 % dimethylsulfoxide (DMSO). 4 ° C에서 유지하십시오 ( 표 1 ). 일단 합류되면 T25 조직 배양 플라스크를 3 개의 냉동 보관실로 동결시킬 수 있습니다. 냉동 약병 당 섬유 아세포 냉동 매체 500 μL를 준비합니다. </li><li> 세포를 동결시키기 위해 c단계 1.3에서 설명한대로 혈구 계수계를 사용하여 세포 수를 계산하고 3 x 105 세포의 일부를 15 mL 튜브로 옮긴다. 300xg에서 3 분간 튜브를 회전시킵니다. 뜨는을 대기음. </li><li> 4 ˚C의 섬유 아세포 동결 배지 500 μL에 세포 펠렛을 Resuspend하고 cryovials로 전송하십시오. 냉동 용기에 유리 병을 넣고 장기 보관을 위해 액체 질소로 옮기기 전에 24 시간 동안 -80 ° C에서 배양하십시오. </li><li> 세포를 해동 시키려면 37 ° C의 물에 냉동고의 바닥 부분을 담그십시오. 액화되면 세포 현탁액을 15 mL 튜브에 옮기고 5 mL의 섬유 아세포 배지를 첨가하십시오. 세포를 300xg에서 3 분간 스핀. </li><li> 뜨는을 제거하고 fibroblast 매체 5 ML에서 세포 펠렛을 resuspend. 비 코팅 T25 조직 배양 플라스크에 세포를 옮기고 37 ° C에 품어 라. </li></ol></li></ol> 2. 섬유 아세포의 SeV 벡터 재 프로그램 <ol><li> 벡터 분취 량의 준비 </strong&gt; 주의 : 바이오 안전성 레벨 2의 밀폐하에있는 SeV를 다루십시오. 제조업체의 프로토콜 및 현지 지침 17을 참조하십시오. 바이러스 역가는 배치마다 다릅니다. <ol><li> aliquots을 준비하기 전에 제조 업체의 프로토콜 ( 예 : CytoTune 2.0)에 따라 5 X 10 4 세포에 필요한 벡터의 양을 계산합니다. 바이러스 역가는 일반적으로 8 x 107 ~ 1.5 x 108 입니다. 벡터 5 : 5 : 3 (KOS MOI = 5, hc-myc MOI = 5 및 hKlf4 = MOI 3) 벡터를 분해하고 결합하십시오. 오토 클레이브 1.5 ML 튜브에 5 X 10 4 세포의 재 프로그램을 위해 계산 된 금액. 재 프로그램을 위해 바이러스 부피를 섬유 아세포 배지로 희석하여 최종 부피 250 μL로 만듭니다. 참고 : 각 유리 병은 5 x 10 4 섬유 아세포가있는 24- 웰 조직 배양 플레이트의 한 개의 웰을 다시 프로그래밍 할 때 유효합니다. 바이러스 분주를 -80 ° C에 보관하십시오. </li></ol></li><li> SeV 벡터 전달 <ol><li> 흡인 세포 cu배지를 가하고 1 mL의 DPBS로 씻는다. DPBS를 대기음으로하고 트립신 - EDTA (0.05 %) 1 ML을 추가합니다. 37 ℃에서 5 분간 또는 세포가 분리 될 때까지 인큐베이션한다. </li><li> fibroblast 매체 2 ML을 추가하고 세포를 resuspend하고 15 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. 3 분 동안 300 XG를 원심 분리하십시오. </li><li> 뜨는을 기음과 fibrosblast 매체 2 ML에 펠렛을 resuspend. </li><li> hemocytometer를 사용하여 섬유 아 세포를 계수하고 24 - 웰 조직 배양 판의 하나의 우물에 5 x 10 4 개의 세포를 시드하십시오. 하룻밤 37 ° C에서 세포를 품어. </li><li> 세포 배양 배지를 대기음으로하여 SeV 용액 250 μL를 첨가하고 37 ° C에서 밤새 배양하십시오. </li><li> 매일 매체를 신선한 섬유 아세포로 바꿉니다. LN - 521 코팅 플레이트로 passaged하기 전에 transduced 세포가 7 일 동안 성장할 수 있습니다. 통과하기 하루 전 LN-521 판을 준비하십시오. 코팅 절차는 2.3.1을 참조하십시오. </li></ol></li><li> 형질 도입 된 섬유 아세포의 재조합 <ol><li> LN-521 코팅 된 접시 : DPBS에서 LN-521을 최종 농도 0.63 μg / cm 2로 희석하십시오. 60mm 조직 배양 접시 당 LN - 521 솔루션 2 ML 피펫. parafilm을 사용하여 60mm 조직 배양 접시를 밀봉하십시오. 4 ° C에서 밤새 품어 둡니다. </li><li> 보다 쉬운 취급을위한 Essential 8 medium (E8) 분취 량을 준비하십시오 : E8 배지 48.5 mL, E8 보충액 1 mL 및 PEST 500 μL ( 표 1 ). </li><li> 형질 도입 7 일 후, 세포를 LN-521로 코팅 된 60mm 조직 배양 접시에 옮긴다. Trypsin-EDTA (0.05 %) 250 μL를 첨가하고 37 ° C에서 5 분간 또는 세포가 분리 될 때까지 배양하십시오. 300 x g에서 3 분간 섬유 아세포 배지 2 mL와 원심 분리 세포를 첨가한다. </li><li> 뜨는을 대기음. hemocytometer에서 fibroblast 매체와 카운트 셀 2 ML의 Resuspend 펠렛. 사전 코팅 판에서 LN - 521 솔루션을 대기음과 LN - 521 precoated 60mm 요리에 섬유 아세포 매체의 5ml에 4 X 10 4 셀을 시드. Rho 키나아제 억제제 Y-27632를 첨가하십시오(ROCKi)를 5 μM의 최종 농도로 첨가 하였다. 37 ° C에서 밤새 품어 둡니다. </li><li> 중요하게, 다음날, 매체를 E8 매체로 변경하십시오. 매일 E8 매체를 교체하십시오. hiPS 세포 콜로니가 2 ~ 3 주 이내에 나옵니다. </li></ol></li></ol> 3. 콜로니 선택 및 hiPS 세포의 확대 참고 : 다음 단계는 스테레오 현미경으로 바이오 안전성 캐비닛 외부에서 수행됩니다. 헤어넷과 절차 마스크를 사용하는 것이 좋습니다. 세포 배양 물을 오염시키지 않도록 조심스럽게 작업하십시오. <ol><li> 피킹하기 전날 LN-521 코팅 조직 배양 24- 웰 플레이트를 준비하십시오. DPBS 0.63 μg / cm 2 에서 LN-521 희석. 250 - LN - 521 솔루션의 피펫 24 잘 조직 문화 플레이트 중 하나에 잘. parafilm을 사용하여 플레이트를 밀봉하십시오. 4 ° C에서 밤새 품어 둡니다. 참고 : 식민지는 직경이 1mm를 초과하면 집어 낼 준비가됩니다. 식민지는 날카로운 모서리를 나타내고 균질 한 mon으로 자라야한다.olayers ( 그림 2D ). </li><li> LN - 521 솔루션을 대기음하고 24 잘 조직 문화 플레이트 중 하나에 E8 500 μL를 추가합니다. </li><li> stereomicroscope 아래 패턴과 같은 격자에 메스와 작은 조각으로 식민지를 잘라. 기계적으로 접시에서 세포 시트를 긁어 준비 잘 ( 그림 2D -2E ) 200 μL 피펫을 사용하여 시트를 전송할 수 있습니다. 콜로니를 별도의 우물로 선택하십시오. </li><li> 48 시간 동안 배지를 바꾸지 않고 세포가 부착되도록하십시오. 그 후, 매일 E8 배지로 교환하십시오. </li><li> 콜로니의 크기가 5 mm를 초과하면 LN-521 코팅 판의 새 우물에 단일 세포로서 효소 적으로 세포를 통과시킵니다. </li><li> 세포에서 세포 배양 매체를 대기음과 DPBS 250 μL로 씻으십시오. </li><li> DPBS를 기음. 해리 시약 250 μL를 추가하고 37에서 3 분 품어 ° C. </li><li> 세포가 반올림되기 시작했는지 관찰하십시오. 떼다세포를 해리 시약으로 몇 번 헹구어 플레이트에서 제거한다. </li><li> 15 ML 튜브에 E8 매체 500 μL를 추가합니다. 해리 시약의 세포를 튜브에 옮기고 300 x g에서 3 분간 원심 분리한다. </li><li> LN - 521 precoated 우물에서 LN - 521 솔루션을 대기음과 500 μL 실내 온도 E8 매체를 추가합니다. </li><li> 뜨는을 대기음과 E8 매체 500 μL에있는 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> hemocytometer를 사용하여 세포를 계산하고 준비 LN - 521 precoated 잘 (1.25 X 10 4 - 2.5 X 10 4 셀 / cm 2 )에서 2.5 X 10 4 - 5 X 10 4 세포를 시드. 세포 배양 양식은 의도 한 목적에 맞게 쉽게 확대 할 수 있습니다. </li><li> ROCKi를 10 μM의 최종 농도에 첨가하십시오. 37 ° C에서 세포를 품어. </li><li> 매일 E8 매체를 교체하십시오. 세포는 보통 4-6 일 후에 통과 할 준비가됩니다. 상기에서 기술 한 바와 같이 단일 세포로서 효소 적으로 세포를 통과 시키며, 약 90 % 융합. 참고 : 재 프로그램 벡터는 hiPS 세포 확장 도중 점진적으로 희석되고 통과 12 후에는 검출되지 않습니다. 공평하게 재 프로그램 된 세포는 일반적으로 6 ~ 10 번 통로에서 증식을 멈추거나 특징적인 다 능성 줄기 세포 형태를 잃습니다 ( 그림 3B ). </li><li> hiPS 세포의 동결 및 해동 <ol><li> 세포를 동결하려면, 위에서 설명한대로 효소로 단일 세포로 세포를 해리하고, hemocytometer에서 세포를 계산하고 E8 매체의 1 ML을 포함하는 15 ML 튜브에 2.5 X 10 5 세포를 전송합니다. 3 분 동안 300 XG에서 원심 분리하십시오. 뜨는을 대기음. </li><li> 4 μC PSC cryomedium 250 μL에 Resuspend 세포 펠렛과 cryovial로 전송합니다. 냉동 보관 용기에 유리 병을 놓고 장기 보관을 위해 액체 질소로 옮기기 전에 24 시간 동안 -80 ° C에서 배양하십시오. </li><li> 세포를 녹이기 위해서는 미리 코팅 한 24- 웰 조직 배양의 LN-521 웰을 준비하십시오플레이트를 LN-521 용액을 흡입하고 250 ㎕의 E8 배지를 첨가함으로써 배양 하였다. 작은 고드름이 남아있을 때까지 37 ° C의 물에서 냉동 보관함의 바닥 부분을 잠급니다. </li><li> cryovial에 E8 매체 250 μL를 추가하고 세포 현탁액을 15 ML 튜브에 전송하고 E8 매체 1 ML을 추가합니다. 세포를 300xg에서 3 분간 스핀. </li><li> 뜨는을 제거하고 상온 E8 매체 250 μL의 세포 펠렛을 resuspend. 준비된 우물에 세포 현탁액을 전송하고 1 % 세포 생존 보충 또는 10 μm의 록키를 추가합니다. 37에서 조직 문화 플레이트를 품어 ° C. </li></ol></li></ol>

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<li>Schlaeger, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+non-integrating+reprogramming+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">A comparison of non-integrating reprogramming methods.</a> Nat Biotech. 33 (1), 58-63 (2015).</li>
<li>Nichole Wetton, C. C., Zarrabi MacArthur, A. ryan, Lakshmipathy, U. ma Ideal Xeno-Free Culture Conditions For Human Fibroblasts That Facilitate Efficient Reprogramming. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf</a> (2016).</li>
<li>Trokovic, R., Weltner, J., Noisa, P., Raivio, T., Otonkoski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+negative+effect+of+donor+age+and+time+in+culture+on+the+reprogramming+efficiency+into+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Combined negative effect of donor age and time in culture on the reprogramming efficiency into induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res. 15 (1), 254-262 (2015).</li>
</ol>

저자는보고 할 이해 관계가 없습니다.

이 프로토콜의 예상 결과는 여러 clonally derived hiPS 세포 라인의 성공적인 생성입니다. 중요하게, 여기에 기술 된 확립 된 hiPS 세포의 유지 및 확대를위한 방법은 신뢰성이 있고 줄기 세포 배양의 경험이 거의없이 수행 될 수있다. LN-521 매트릭스와 함께 ROCKi와 함께 효소 단클론 항체는 식민지 기반의 구강이 10 , 19 , 20을 자극 할 수있는 유도 이질성을 피하면서 핵형 적으로 정상, 다 능성 및 쉽게 분화 할 수있는 것으로 세포를 유지하는 것으로 알려져있다. LN-521에서 배양 된 hiPS 세포는 ROCKi 10을 첨가하지 않고 단일 세포로 계대 할 수 있지만, ROCKi를 첨가하면 경험이 적은 핸들러가 쉽게 프로토콜을 수행 할 수 있으며 hiPS 세포 유도에 필요한 시간이 단축됩니...

다카하시 (Takahashi) 등에 의한 hiPS 세포주의 일차 유도 이후, 1 , 2 , hiPS 세포는 질병 모델링, 약물 발견 및 재생 의학 3 에서 세포 치료법을 생성하기위한 원료 물질로서 유용한 도구를 제공합니다. hiPS 세포 배양은 오랫동안 섬유 모세포 피더 세포 4 , 5 또는 Matrigel 6 및 태아 소 혈청 (FBS)을 함유하는 배지 배합물과 함께 공 배양에 의존 해왔다. 일괄 배치 (batch-to-batch) 편차는 이러한 배양 조건의 정의되지 않은 특성의 공통적 인 결과이며 예측할 수없는 변형을 가져 오며 이는 이러한 프로토콜의 신뢰성을 저해하는 주요 원인입니다. Essential 8 (E8) 8 및 정의 된 세포 배양 기질, 예를 들어 LN-521 9 와 같은 한정 배지의 개발은재현성있는 프로토콜을 확립하고 homogenous hiPS cell 7 , 8 , 9 , 10 의 강력한 생성 및 유지를 돕습니다. 통합 자유 재 프로그래밍 기술의 개발은 도약을 가져 왔습니다. 원래 재 프로그램은 레트로 바이러스 벡터에 의존하여 무작위로 게놈에 통합되어 게놈 무결성에 파괴적인 영향을 미쳤습니다. 리 프로그래밍 방법의 발전에는 RNA 기반 벡터의 개발이 포함됩니다. RNA 벡터는 게놈 재조합을 통한 의도하지 않은 통합이 가능하지 않기 때문에 DNA 기반 재 프로그램 방법보다 이점이 있습니다 12 . SeV 벡터는 DNA- 상 11 없이 단일 가닥 RNA를 통해 외인성 인자를 과도하게 높게 발현한다. SeV에 의해 전달 된 재 프로그래밍 벡터세포 배양 전반에 걸쳐 희석되고 궁극적으로 배양 물로부터 흘려 발판 인쇄 방법으로 재 프로그램 할 수 있습니다. 그 후, pluripotency의 유지는 pluripotency 유전자 2 의 내인성 발현에 의존합니다. 선구적인 hiPS 세포 기반 치료법이 임상 시험으로 옮기기 시작함에 따라 표준화 된 배치, 재현성 및 안전성에 대한 요구가 13을 해결하는 데 필수적인 문제입니다. 그러므로 동물 기원의 제품은 피해야한다. 예를 들어, 이종 생산물의 사용은 비인간 병원균 오염의 위험과 관련되어있다. 또한, 동물 유래 배양 성분의 존재 하에서 배양 된 세포는 비인간 실리아 산을 세포막 내로 도입시켜 유도 된 세포를 면역 원성으로 만드는 위험이있다. 따라서 이종 제품을 제거해야 할 필요성은 앞으로의 임상 적 진료에 필수적입니다. 이 프로토콜은 xe를 적용합니다.세포를 임상 순응에 더 가깝게 이동시키는 hiPS 세포의 유지에 자유롭고 정의 된 배양. 이 프로토콜은 섬유 아세포에서 표준화 된 hiPS 세포를 생성하는 일관되고 재현성 있고 사용하기 쉬운 방법을 설명합니다. 또한 기존의 hiPS 세포를 유지 관리 할 수있는 친숙한 배양 시스템을 제공합니다. 이 프로토콜은 Karolinska Institutet의 스웨덴 국가 인체 iPS 코어 시설에서 300 줄 이상의 hiPS 세포주를 추출하는데 사용되어 왔으며이 중 일부 줄은 이미 15 , 16 에 기술되어있다.

<table><tbody><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>171105-041</td><td>생검 분해</td></tr><tr><td>콜라겐분해</td>효소 <td>시그마</td><td>C0130</td><td>생검 분해</td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>시그마</td><td>G1393</td><td>섬유아세포 매트릭스</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life Technologies</td><td>21980002-032</td><td>섬유아세포 매체</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td>섬유아세포 매체</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td>항생제</td></tr><tr><td>필수 8 배지</td><td>ThermFisher Scientific</td><td>A1517001</td><td>iPS 세포 배양 배지</td></tr><tr><td>LN-521</td><td>Biolamina</td><td>LN521-03</td><td>iPS 세포 배양 매트릭스</td></tr><tr><td>TrypLE select 1X</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12563011</td><td>해리 시약</td></tr><tr><td>Rho-kinase 억제제 Y27632</td><td>Millipore</td><td>SCM075</td><td>Rho-kinase inhibitor (ROCKi)</td></tr><tr><td>CytoTune &ndash; iPS 2.0 재프로그래밍 키트</td><td>Life Technologies</td><td>A1377801</td><td>센다이 바이러스 재프로그래밍 벡터</td></tr><tr><td>35 mm 조직 배양 접시</td><td>Sarstedt</td><td>83.3900.300</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>60 mm 조직 배양 접시</td><td>Sarstedt</td><td>83.3901.300</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>24 웰 조직 배양 플레이트</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922.300</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>T25 조직 배양 플라스크</td><td>VWR</td><td>734-2311</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>15 mL 튜브</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>Centrifuge 튜브</td></tr><tr><td>1.5 mL 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>0030123.301</td><td>1.5 mL 튜브</td></tr><tr><td>CoolCell cell LX</td><td>Biocision</td><td>BCS-405</td><td>냉동 용기</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ml</td><td>섬유아세포 동결</td></tr><tr><td>극저온 1.8 mL</td><td>VWR</td><td>479-6847</td><td>극저온 PSC</td></tr><tr><td>냉동 보존 키트</td><td>Gibco</td><td>A2644601</td><td>PSC CryomediumRevitaCell 보충제</td></tr><tr><td>트립신-EDTA (0.05%)</td><td>ThermoFisherScientific</td><td></td><td>25300054 섬유아세포 해리 효소</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>31331-028</td><td>소화 효소 희석제</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td>PBS</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFIsher Scientific</td><td>14025-050</td><td>생검 준비</td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Sigma</td><td>BRAND, 718920</td><td>세포 계수</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>291-1213</td><td>보관용 밀봉 플레이트</td></tr></tbody></table>

laminin 521 매트릭스를 이용한 인간 유래 다 능성 줄기 세포의 통합 된 자유 유도

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Xeno-free 및 완전 정의 된 조건은 균질 한 사람 유도 pluripotent stem (hiPS) 세포의 강력하고 재현성있는 생성을위한 핵심 매개 변수입니다. 피더 세포 또는 정의되지 않은 매트릭스상의 hiPS 세포의 유지는 배치 차이, 병원성 오염 및 면역 원성의 위험에 취약하다. 제노 프리 및 정의 된 배지 배합물과 조합하여 정의 된 재조합 인간 라미닌 521 (LN-521) 매트릭스를 사용하면 변이가 감소하고 hiPS 세포의 일관된 생성이 가능해진다. 센다이 바이러스 (SeV) 벡터는 비 통합 RNA 기반 시스템이므로 벡터 통합 벡터가 가질 수있는 게놈 무결성에 대한 파괴적인 효과와 관련된 우려를 회피 할 수 있습니다. 또한, 이들 벡터는 진피 섬유 아세포의 재 프로그래밍에서 비교적 높은 효율을 입증 하였다. 또한, 세포의 효소 단일 세포 passaging은 줄기 세포의 실질적인 사전 경험없이 hiPS 세포의 균질 유지를 용이하게합니다문화. 여기서는 재현성과 사용 용이성에 중점을두고 광범위하게 시험하고 개발 한 프로토콜을 기술하여 섬유 아세포에서 정의되고 이종없는 인간 hiPS 세포를 생성하는 강력하고 실질적인 방법을 제공합니다.

생검에서 hiPS 세포로 생체 검사부터 확립 된 hiPS 세포에 이르는 전체 과정은 재 프로그램 벡터가 없으며 특성화를 위해 준비되며 약 16 주 소요됩니다 ( 그림 1 ). 보다 자세한 타임 라인은 그림 2A에 명시되어 있습니다. 섬유 아세포 배양을 확립하고 확장시키기 위해서는 약 4 주가 소요됩니다. 첫 번째 hiPS 세포 콜로니는 센다이 벡터 형질 도입 후 약 3 주 후에 나타났다. 콜로니는 첫 번째 통로에서 기계적으로 골라내어 효소 적으로 단일 세포로 퍼지게된다. 인간 섬유 아세포 배양 물의 확립 <p class="jove_content" f...

인간 유래 다 능성 줄기 (hiPS) 세포의 강력한 유도는 피부 섬유 아세포의 비 통합 적 센다이 바이러스 (SeV) 벡터 매개 재 프로그램 화를 사용하여 달성되었다. 재조합 인간 라미닌 521 (LN-521) 매트릭스 및 필수 E8 (E8) 배지를 사용하여 제노 프리 및 화학적으로 한정된 배양 조건을 사용하여 hiPS 세포 유지 및 클론 확장을 수행 하였다.

Laminin 521 매트릭스를 이용한 인간 유래 다 능성 줄기 세포의 통합 된 자유 유도

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 균질한 인간 유도만능줄기세포를 유도하는 것입니다. 이 방법은 질병 모델링, 약물 스크리닝 또는 전임상 세포 치료 시험을 위한 세포 유도를 포함한 다양한 목적으로 인간 유도만능줄기세포를 유도하는 데 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜의 장점은 견고하며, 사용자 친화적이고 Xenofree이며 완전히 화학적으로 정의된 배양 시스템에서 유지되는 균질한 세포를 생성한다는 점입니다.인간 iPS 세포는 공여자 조직의 유전적 배경을 재현하며 질병 관련 모든 세포 유형으로 분화될 가능성이 있으므로, 질병 모델링을 위한 우수한 도구가 됩니다. 생검 조직의 절개와 콜로니 피킹은 정교한 과정입니다. 숙련된 전문가가 이를 수행하는 과정을 지켜보는 것은 절차를 이해하고 이를 더 쉽게 재현하는 데 도움이 됩니다.오늘 이 절차를 시연할 분들은 Karolinska Institutet의 iPS Core Facility 소속의 숙련된 실험실 기술자인 Harriet RonnHolm과 Kelly Day입니다. 피부 생검 샘플은 1% penicillin streptomycin이 포함된 PBS에서 4°C로 최대 48시간 동안 보관할 수 있으나, 채취 후 가능한 한 빠르게 처리해야 합니다. 생검 조직을 35 mm 디쉬로 옮깁니다.피부 생검 조직을 70% ethanol 2 mL가 담긴 35 mm 디시에 30초 동안 담급니다. 1% penicillin streptomycin이 첨가된 멸균 Hank's Balanced Salt Solution 1 mL를 새로운 35 mm 디시에 넣고, 생검 조직을 새 디시로 옮깁니다. 생검 조직을 갓 조제한 0.1% dispase 용액 1 mL가 채워진 35 mm 디시로 옮깁니다.멸균된 외과용 메스와 핀셋을 사용하여 피부 생검 조직을 1~2$\text{mm}^3$ 크기의 조각으로 자릅니다. dispase 용액과 함께 생검 조각들을 15$\text{mL}$ 튜브로 옮기고 dispase 2$\text{mL}$를 추가로 넣습니다. 35$\text{mm}$ 디쉬를 dispase 용액 1$\text{mL}$로 헹구고, 헹군 용액을 15$\text{mL}$ 튜브로 옮깁니다.생검 조직을 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 생검 조직 조각이 들어있는 튜브에 0.1% collagenase I 4 mL를 첨가하고 37°C에서 4시간 동안 배양합니다. 세포를 분주하기 30분 전에, 6-well 조직 배양 플레이트의 한 well에 DPBS 내 0.1% gelatin 1 mL를 코팅합니다.실온에서 30분 동안 배양합니다. 콜라게나아제(collagenase)와 함께 4시간 동안 배양한 후, 소화된 세포를 실온에서 300 ×g로 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡입하여 제거하고 소화물을 2 mL의 섬유아세포 배지에 다시 현탁합니다.이전에 준비한 6-well 조직 배양 플레이트에서 젤라틴 용액을 제거합니다. 남아 있는 조직 조각을 포함한 세포 현탁액을 6-well 플레이트로 옮깁니다. 세포를 37 °C, 5% CO2 및 고습도 조건에서 배양합니다.섬유아세포(Fibroblasts)가 80% 밀도로 도달하면 T25 조직 배양 플라스크로 계대 배양할 준비가 된 것입니다. 계대 배양 횟수가 2~4회인 섬유아세포가 리프로그래밍에 최적이며, 이는 일반적으로 계대 횟수가 낮은 섬유아세포의 리프로그래밍 효율이 더 높기 때문입니다. 플라스크에서 세포 배양액을 흡입하여 제거하고 1 mL의 DPBS로 세포를 세척합니다.DPBS를 흡입하여 제거하고 0.5% Trypsin EDTA 1 mL를 첨가합니다. 37 °C에서 5분 동안 또는 세포가 떨어져 나올 때까지 배양합니다. 섬유아세포 배지 2 mL를 첨가하여 세포를 재부유시킨 후, 세포 현탁액을 15 mL 튜브로 옮깁니다.상온에서 300 ×g로 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡입하여 제거하고 펠릿을 2 mL의 섬유아세포 배지에 재현탁합니다. 혈구계수기로 섬유아세포 수를 측정한 후, 24-웰 조직 배양 플레이트의 한 웰에 5 × 10⁴개의 세포를 접종합니다.세포를 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, Sendai virus를 다루게 되므로 적절한 개인 보호 장구를 착용한 상태로 지정된 BSL-2 실험실에서 절차를 계속 진행합니다. 세포 배양액을 흡입하여 제거하고 250 µL의 Sendai virus 용액을 첨가합니다.플레이트를 37°C에서 배양합니다. 콜로니를 픽킹하기 하루 전, LN-521로 코팅된 24-웰 조직 배양 플레이트를 준비합니다. 24-웰 플레이트의 한 웰에 LN-521 용액 250 µL를 피펫팅합니다.파라필름을 사용하여 플레이트를 밀봉하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 24-웰 플레이트의 한 웰에서 LN-521 용액을 흡입하여 제거하고 해당 웰에 E8 500 µL를 추가합니다. 실체 현미경 하에서 콜로니를 피킹하는 동안 헤어넷과 절차용 마스크 착용을 권장합니다.콜로니의 직경이 1mm 이상이 되고, 가장자리가 뚜렷하며, 균일한 단일층으로 성장했을 때 콜로니를 수확할 준비가 된 것입니다. 경계가 모호하거나 세포 덩어리가 크고 불균일하며 응집되지 않은 콜로니는 선택하지 마십시오. 메스를 사용하여 각 콜로니를 격자 모양으로 작게 절단하십시오.200 µL 피펫을 사용하여 디쉬에서 세포 시트를 기계적으로 긁어낸 다음, 미리 LN-521로 코팅한 24-웰 조직 배양 플레이트의 웰로 시트를 옮깁니다. 이 프로토콜의 성공을 위해서는 콜로니 선택이 매우 중요합니다. 몇 개의 콜로니를 추가로 선택하면 충분한 수의 세포가 부착되는 것을 보장할 수 있습니다.E8 배지를 교체하지 않고 48시간 동안 세포를 부착시킵니다. 콜로니 크기가 5mm 이상이 되면 세포를 효소적으로 계대 배양합니다. 세포 배양 배지를 흡입하여 제거하고 250 µL의 DPBS로 세척합니다.DPBS를 흡입하여 제거하고 250 µL의 해리 시약을 첨가합니다. 37 °C에서 3분 동안 배양합니다. 세포가 둥글게 변하기 시작하는 것을 확인합니다.해리 시약을 이용하여 세포를 헹구어 플레이트에서 분리합니다. 15 milliliter 튜브에 E8 배지 500 microliters를 넣고, 세포와 해리 시약을 튜브로 옮깁니다. 300 times g에서 3분 동안 원심분리합니다.15 milliliter 튜브에서 상층액을 흡입하여 제거하고, 세포 펠렛을 500 microliters의 E8 배지로 재부유합니다. 혈구계수기로 세포 수를 측정한 후, 실온의 E8 배지 500 microliters가 들어 있는 미리 준비된 LN-521 사전 코팅 웰에 2.5~5 × 10⁴ 개의 세포를 접종합니다. ROCK 억제제를 최종 농도 10 micromolar가 되도록 첨가합니다.세포를 37°C에서 배양합니다. 본 프로토콜을 사용하면, 형질전환된 섬유아세포로부터 형질전환 후 약 12일째에 인간 유도만능줄기세포 콜로니가 나타납니다. 콜로니는 형질전환 후 약 3~4주 후에 피킹할 수 있는 상태가 됩니다.선호되는 특징으로는 평탄하고 조밀한 세포 덩어리, 균질한 단층 성장, 그리고 뚜렷한 가장자리가 있습니다. 이 명시야 이미지들은 고도로 이질적인 세포주와 비교하여, 초기 계대의 균질하고 완전히 재프로그래밍된 인간 iPS 세포주를 보여줍니다. Sendai 바이러스 벡터의 소실은 계대 3의 인간 iPS 세포와 대조적으로, 계대 12의 인간 iPS 세포에서 Sendai 바이러스 벡터 특이적 마커가 검출되지 않음을 통해 확인되었습니다.유도된 세포를 대상으로 다능성 마커인 OCT4, SSEA-4 및 NANOG에 대해 면역세포화학 염색을 수행한 결과, 균질하게 양성인 결과가 나타났습니다. 내인성 다능성 유전자의 mRNA 발현은 역전사 PCR을 통해 확인되었습니다. 다능성 인자를 발현하지 않는 부분적으로 재프로그래밍된 세포가 포함된 세포 배양물은 폐기되었습니다.인간 iPS 세포의 분화 잠재력은 배아체(embryoid bodies) 형성을 통해 평가되었습니다. 배아체 분화 21일 후 실시간 PCR을 통해 내배엽, 중배엽 및 외배엽 특이적 마커의 mRNA 발현을 검출하였으며, 이를 통해 유도된 인간 iPS 세포가 세 가지 배엽으로 분화할 수 있음을 확인하였습니다. 이 기술에 숙달되면 약 16주의 기간 동안 약 22시간의 직접 작업 시간으로 수행할 수 있습니다.유도된 인간 유도만능줄기세포는 연구 분야와 관련된 모든 질문에 답하기 위해 성인 인체의 모든 세포 유형으로 분화될 수 있습니다. 이 영상을 시청하신 후, 피부 생검으로부터 유도만능줄기세포를 유도하는 데 필요한 단계들을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하시길 바랍니다.

integration-free-derivation-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 인간의 연결을 progenitors 및 신경 수리 개발 CNS에의 연결을 세포 유형의 대형 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 neuroblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

우리는 함께 retroviral Oct3 / 4, Sox2, Klf4과 c-myc (OSKM)를 인코딩 벡터, 라이브 염색법에 의해 정확하게 다시 프로그램 hiPSC의 신분을 이용하여 인간의 유도된 pluripotent 줄기 세포 (hiPSC) Tra-로 인간의 체세포의 효율적인 언어학 재활을위한 프로토콜을 제시 1-81 항체.

인간 유도 Pluripotent 줄기 세포의 선택 및 분리 식민지는 성인 섬유아 세포에서 다시 프로그램

여기에서는 해리된 단일 세포의 비집락형 단층(NCM) 성장을 기반으로 하는 인간 만능 줄기 세포(hPSC) 배양 프로토콜을 제시합니다. Rho 관련 키나아제 억제제 또는 라미닌 동형(laminin isoform 521, LN-521)을 활용하는 이 새로운 방법은 다량의 동질적인 hPSC 생산, 유전자 조작 및 약물 발견에 적합합니다.

인간 다 능성에 대한 대안 문화는 전지 생산, 유지 보수 및 유전 분석을 줄기

우리는 렌티바이러스 기반의 재프로그래밍 및 특성화된 무인자 인간 유도 만능 줄기세포를 유도하고 추정되는 임상 등급 조건으로 전환하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

의 유도 및 특성 형질 전환 유전자가없는 인간 유도 다 능성 정의 임상 수준의 조건으로 세포주 및 변환 줄기

유도 만능 줄기 세포의 생성은자가 이식의 유도에 대한 매혹적인 전망을 제공합니다. 그러나, 만능 상태와 힘든 다시 차별화를 통해 진행은 여전히​​ 임상 번역을 방해한다. 여기에서 우리는 성인 인간 섬유 아세포의 유도와 유도 된 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환과 신경 계통에 후속 차별화를 설명합니다.

성인 인간 섬유 아세포의 유도 및 확장 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환

이 원고는 뽑은 모발에서 인간 각질세포를 유도 및 유지하고 우발적 벡터에 의한 통합이 없는 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)를 후속 생성하기 위한 단계별 절차를 제공합니다.

헤어 유래 각질 세포를 사용하여 통합없는 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 프로토콜은 인간 성인 말초 혈액 세포에서 통합이 없는 iPSC를 효율적으로 생성하기 위한 자세한 방법을 설명합니다. 재프로그래밍 인자를 발현하기 위해 KLF4, MYC, BCL-XL 또는 OCT4 및 SOX2와 같은 4개의 oriP/EBNA 기반 에피솜 벡터를 사용하여 1mL의 말초 혈액에서 수천 개의 iPSC 콜로니를 얻을 수 있습니다.

에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

여기에 제시된 방법은 다 능성 줄기 세포로부터 인간 간세포 - 유사 세포를 생성하기 위해 확장 및 우수 제조 기준 (GMP) 레디 분화 시스템을 설명한다. 이것은 기초 및 응용 연구 인간 간 인간 간세포 - 유사 세포를 생성하기위한 비용 효과적이고 표준화 된 시스템으로서 작용한다.

정의 및 간세포와 같은 세포의 확장 성 생성 인간 다 능성 줄기 세포에서

세포 재프로그래밍은 다능성 세포 상태를 조절하고 유지하는 주요 유전자의 도입을 요구합니다. 기술된 프로토콜은 바이러스/통합 방법 없이 인간 진피 섬유아세포로부터 유도된 만능 줄기 세포(iPSCs) 콜로니의 형성을 가능하게 하지만, 세포 방어 메커니즘을 감소시키는 면역 회피 인자와 결합된 비변형 RNA(NM-RNAs)를 사용한다.

비통합 방법을 사용하여 복부 피부에서 성인 인간 진피 섬유 아세포의 분리 및 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 프로토콜의 목표는 다양한 세포외 기질(ECM) 코팅 조건을 비교하여 차등 코팅이 유도만능줄기세포(iPSC)의 성장 속도에 어떤 영향을 미치는지 평가하는 것입니다. 특히, 우리는 iPSC 배양의 최적 성장을 얻기위한 조건을 설정하는 것을 목표로합니다.

자동 이미징 시스템을 사용한 iPSC의 합류점 측정.

이 문서의 목표는 만능 줄기 세포로부터 인간 간 선구분화를 유도하는 표준화된 접근법을 제공하는 것입니다. 즉시 사용 가능한 미디어 제형이 있는 이 절차의 개발은 사용자에게 생체 의학 연구 및 번역을 위한 인간 간 세포를 생성하는 촉진 시스템을 제공합니다.

정의된 분화 시스템을 사용하여 만능 줄기 세포에서 간 선조 사양

배우세요 비통합 Sendai 바이러스 벡터와 Laminin 521 매트릭스를 이용한 인간 유래 다능성 줄기세포 유도법을. 이 방법은 질병 모델링과 약물 스크리닝에 활용됩니다.

Laminin 521 매트릭스를 이용한 인간 유래 다 능성 줄기 세포의 통합 된 자유 유도

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