회절 분석 라이브의 푸리에 기반 꼬마 선 충

이 푸리에 기반 회절 분석의 전반적인 목표는 예쁜꼬마선충이 3차원 공간에서 자유롭게 이동할 때 예쁜꼬마선충의 움직임을 실시간으로 특성화하는 것입니다. 이 방법은 다양한 밀도의 용액 또는 운동 돌연변이에 대한 종의 반응을 설명함으로써 신경 생물학 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 방법은 미세한 종의 푸리에 분석을 위한 기준선 역할을 합니다.

그것은 모든 미세한 종이 고유한 푸리에 스펙트럼을 가질 것이라는 장점이 있습니다. 이 방법은 예쁜꼬마선충의 운동에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 미생물에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 레이저 빔 아래의 큐벳에서 선충을 찾는 것이 어려울 수 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

우리는 시시간 회절 신호 자체, 즉 잡음이 있는 신호에서 수영 행동에 대해 배우려고 시도하면서 이 방법에 대한 아이디어를 처음 갖게 되었습니다. 시작하려면 광학 작업대의 왼쪽 후면 모서리 근처에 헬륨 네온 레이저를 고정하고 전원에 연결합니다. 레이저와 시료 위치 사이에 중성 밀도 필터를 배치하여 레이저 빔이 시료에 도달하기 전에 필터를 통과하도록 합니다.

두 개의 전면 알루미늄 스티어링 미러를 사용하여 중성 밀도 필터 다음에 첫 번째 미러를 고정하여 잠망경을 만듭니다. 그런 다음 첫 번째 미러에서 약 10cm 아래에 두 번째 미러를 고정하여 레이저 빔을 조종할 수 있는 공간을 확보합니다. 미러 사이에 큐벳을 삽입하고 레이저 빔이 큐벳을 통해 수직으로 이동하도록 레이저 빔과 큐벳을 정렬합니다.

다음으로, 센서가 미러를 향하도록 두 번째 미러 바로 맞은편에 포토 다이오드를 고정합니다. 그런 다음 물을 채운 큐벳을 스탠드에 놓습니다. 스탠드의 높이와 미러 1 및 2의 각도를 조정하여 레이저 빔이 큐벳을 통해 이동하고 포토 다이오드에 직접 향하지 않도록 합니다.

레버를 사용하여 스탠드가 큐벳의 평평한 표면을 형성하는지 확인합니다. 스탠드가 수평이 아니면 수평이 될 때까지 적절하게 조정하십시오. 마지막으로 제공된 USB 케이블을 사용하여 포토 다이오드를 디지털 오실로스코프에 연결하고 컴퓨터에 연결합니다.

오실로스코프 소프트웨어를 로드하고 s를 설정하십시오.amp웜의 휴지통 주기를 충분히 해결하기 위해 속도를 8Hz 이상으로 설정합니다. 얇고 납작한 백금 와이어 픽을 사용하여 4개의 성체 선충을 새로운 NGM 한천으로 채워진 페트리 플레이트로 옮깁니다. 다음으로, 포장에서 일회용 플라스틱 큐벳을 제거하고 융기된 면의 큐벳만 만지도록 주의하십시오.

그런 다음 마이크로피펫을 사용하여 큐벳에 증류수가 약 80% 채워질 때까지 증류수를 큐벳에 피펫으로 넣습니다. 예쁜꼬마선충이 들어있는 페트리 접시를 해부 스코프 아래에 놓습니다. 그런 다음 플래티넘 픽을 사용하여 페트리 접시에서 성숙한 예쁜꼬마선충 하나를 제거하고 픽을 큐벳에 담그십시오.

필요한 경우 선충을 제거하기 위해 곡괭이를 원을 그리며 움직입니다. 선충을 부드럽게 다루고 큐벳을 흔들지 마십시오. 큐벳을 흔들면 벌레가 반응하지 않을 수 있습니다.

큐벳에 거품이 생기는 것을 방지하려면 큐벳 상단에서 약간 움찔할 때까지 큐벳에 증류수를 채웁니다. 그런 다음 캡에 물을 채우고 빠르게 캡을 큐벳에 끼웁니다. 렌즈 용지를 사용하여 큐벳에 쏟아졌을 수 있는 물방울을 제거합니다.

또한 렌즈 용지를 사용하여 남아 있는 작은 물방울을 제거하십시오. 헬륨 네온 레이저를 켜고 빨간색 빔을 생성하도록 주파수 설정을 조정합니다. 그런 다음 센서를 켭니다.

큐벳의 융기된 면을 잡고 선충이 큐벳의 대략 중앙에 올 때까지 부드럽게 기울입니다. 그런 다음 큐벳을 광학 시스템의 스탠드에 놓고 미러 1에서 미러 2로 이동하는 레이저 빔 내에서 웜을 중앙에 놓습니다. 다음으로, 포토 다이오드의 위치와 회절 패턴의 중심 최대값이 일치하지 않도록 회절 패턴에 포토 다이오드를 배치합니다.

그런 다음 포토 다이오드에서 눈에 띄는 전압 출력이 있도록 neutral density filters를 회전합니다. 포토 다이오드가 포화되는 것을 방지하기 위해 중성 밀도 필터를 사용하여 빛을 제한하십시오. 평평한 선은 과포화 또는 강도 부족을 나타냅니다.

움직이는 회절 패턴이 보이면 소프트웨어의 시작 버튼을 클릭하여 포토 다이오드로 데이터를 수집하고 웜의 움직임을 모니터링하면서 오실로스코프를 제어합니다. 웜이 레이저 빔에서 벗어나고 회절 패턴이 사라질 때까지 측정을 계속합니다. 큐벳이 긁힌 경우 큐벳과 벌레를 처분하고 다시 시작하십시오.

약 20초 후 오실로스코프용 소프트웨어에서 중지 버튼을 클릭하여 데이터 수집 프로세스를 중지합니다. 각 평가판의 데이터를 쉼표로 구분된 값 또는 텍스트 형식으로 저장합니다. 각 표현형에 대해 최소 50개의 데이터 세트를 수집하고 시험당 8-10마리의 동물을 사용합니다.

모델링된 순차적 웜 이동과 해당 회절 패턴의 예가 여기에 나와 있습니다. 모델링된 회절 패턴은 실험 패턴과 질적으로 유사하며 시뮬레이션이 선충을 성공적으로 모델링했음을 나타냅니다. 또한, 롤러(roller)와 야생형 예쁜꼬마선충(wild type c elegans)의 시간적 회절 특징을 정량적으로 보여줄 수 있습니다.

여기에서 볼 수 있듯이 각 선충은 서로 다른 속도와 진폭으로 몸부림칩니다. 평균 디지털 푸리에 변환을 통해 선충은 회절 주파수 스펙트럼의 진폭으로 식별할 수 있습니다. 야생형 웜 스펙트럼은 롤러 모션 스펙트럼보다 낮은 주파수에 의해 지배됩니다.

다음은 두 개의 반대되는 바다 움직임으로 생각할 수 있는 w 진동의 예입니다. 대조적으로, 롤러는 대부분 한쪽에 c를 형성하고 다음과 같이 나타납니다. 주파수를 검사할 때 w 운동은 더 복잡하여 c 운동보다 더 많은 2차 저주파를 나타냅니다.

일단 마스터되면 기술이 제대로 수행되면 약 2분 안에 하나의 데이터 세트를 수집할 수 있습니다. 일련의 데이터 세트에 대한 광학 장치를 설정하는 데 약 20-30분이 걸립니다. 이 절차를 시도하는 동안 예쁜꼬마선충의 운동성을 보존하기 위해 예쁜꼬마선충을 조심스럽게 다루는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 트랙터 재구성 및 비선형 해석과 같은 다른 방법을 적용하여 예쁜꼬마선충 운동에 대해 자세히 알아볼 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 신경생물학 연구자들이 예쁜꼬마선충의 운동 돌연변이를 보다 깊이 연구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청하고 나면 살아있는 선충에 대한 회절 패턴을 생성하는 방법과 이를 분석하는 방법을 꽤 잘 이해하게 될 것입니다.

레이저로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 절차를 수행하는 동안 레이저가 눈높이에서 이동하지 않도록 하는 등의 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.