Name: 회절 분석 라이브의 푸리에 기반 꼬마 선 충 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 학습하세요 C. elegans의 실시간 운동을 특성화하는 푸리에 기반 회절 분석 방법을 통해 야생형과 롤러 표현형을 구분하는 기술을. 이 방법은 신경생물학 연구에 활용됩니다.

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우리는이 프로젝트와 함께 그의 계산 공헌에 대 한 후안 바스 케 즈 감사합니다. 우리는 바사 대학 학부 연구 여름 연구소 (URSI), 루시 Maynard 연어 연구 기금과 NSF 상 제 1058385의 지원에 대 한 감사.

1. 선 충 C. 성장 및 유지 보수 <ol><li>준비 선 충 문화 요리.
	<ol><li>Agar 솔루션 페 트리 접시를 두고 공고히 하 고, 그 후에 OP50의 대장균 문화 씨앗 스트레인 9 , 10.</li>
	</ol></li> <li>신선한 한 가득 접시는 대장균 패치를 여러 성인 벌레를 이동 하 여 각 접시에 성인 선 충의 시작 인구를 준비. 인큐베이터에 20 ° C에서 선 충 문화 유지. 
	참고: 선 충 류 종자는 꼬마 선 충 게놈 센터에서 얻어질 수 있다. 이 연구, 야생 타입, N2, 스트레인 및는 OH7547 (otls199 [고양이-2::GFP + rgel-1 (F25B3.3):: dsRed + rol-6(su1006)]) 스트레인, 롤러 형 전시, 활용 했다.</li>
	<li>전파 미래 문화에 대 한 웜.
	C. 선 충 및 사용 되지 않는 서식 지 온도 제어 인큐베이터에서 배양 접시를 포함 하는 <ol><li>제거는 페 트리 접시. 해 현미경의 단계에 그들을 배치.</li>
		<li>분 젠 버너를 점화 하 고 붉은 빛나는 때까지 불꽃으로 금속을 배치 하 여 백 금 선 충 선택 소독. 실내 온도에 냉각을 선택 하실 수 있습니다. 선택을 설정 하지 않거나 오염 물질 접촉 선택 하자.</li>
		<li>부드럽게 박테리아의 원의 가장자리에 선택의 팁을 터치합니다. 이 물질은 끈 적 및 개별 성인 nematodes을 쉽게 선택 하 게 됩니다.</li>
		<li>페 트리 접시를 한 가득 선 충 류 성장 매체 (NGM)에 최대 4 벗 nematodes을 전송 하 고 20 ° c.에 품 어 벌레는 알을 4 일에서 성숙 합니다.</li>
		<li>인큐베이터 4 성인 nematodes을 이동한 후 나머지 nematodes 돌아갑니다.</li>
	</ol></li></ol> 2. 광 설치 ( 그림 1) <ol><li>보안 헬륨-네온 레이저 광학 작업 대의 백-왼쪽 모서리와 전원에 연결. 
	참고: 레이저 &#39; s 빔 오버 샘플링에 대 한 요구 사항을 충족 해야 합니다. C. 선 충 약 1 m m 긴, 따라서 레이저 빔 회절 패턴은 어려운 찾을 수 있도록 선 충 류에 입사 하지만 5mm 보다 더 큰 하는 동안 2 m m 보다 큰 직경 있어야 한다.</li>
	<li>헬륨-네온 레이저와 샘플 사이 중립 밀도 필터는 레이저 빔 필터를 통해 샘플을 도달 하기 전에 여행 장소.</li>
	<li>사용 하 여 두 개의 전면 알루미늄 스티어링 거울, 중립 밀도 필터 후 첫 번째 미러를 보호 한 잠 망 경 구축. 두 번째 거울 레이저 빔을 조정 하 여 거울 사이 멧 삽입 공간을 제공 하는 첫 번째 미러 아래 약 10 ㎝를 확보. 레이저 빔은 베트를 통해 수직으로 이동 레이저 빔과 멧 맞춥니다. 
	참고: diffracting 유기 체에서 거리는 포토 다이오드를 유기 체 멀리 분야 회절을 달성 하기 위해 자체 보다 훨씬 더 큰 해야 합니다. 이 실험에서 광다이오드는 베트에서 거리는 20 cm.</li>
	<li>거울을 직면 하 고 그것의 센서와 두 번째 미러 맞은편 포토 다이오드 보호. 
	참고: 베트는 선 충 류를 포함 하는 화학 클램프를 사용 하 여 두 개의 거울 사이 놓일 것 이다. 4과 5을 참조 하십시오.</li>
	<li>는 스탠드에 물 가득 베트를 놓습니다. 스탠드의 높이 조정 합니다. 레이저 빔 베트 근처 하지만 광다이오드에 직접 목적을 통해 여행 높이 1 미러와 미러 2의 각도 조정.</li>
	<li>수준을 사용 하 여 보장 스탠드 형태는 멧에 대 한 수준별된 표면. 필요한 경우 추가 거울 조정.</li>
	<li>디지털 오실로스코프에와 함께 제공 된 USB 케이블을 사용 하 여 디지털 오실로스코프에는 포토 다이오드를 연결 합니다. 디지털 오실로스코프 컴퓨터에 연결을 기록 하 고 데이터를 저장 하는 데 사용 합니다.</li>
</ol> 3. 오실로스코프 설정 <ol><li>벌레의 탈 곡 주기를 충분히 해결 하기 위해 적어도 8 hz 샘플 속도 설정 하는 컴퓨터에 오실로스코프에 대 한 소프트웨어를 사용 하 여. 
	참고: 샘플 속도 이어야 한다 두 배 이상 많은 종의 예상된 탈 곡 주파수의 Nyquist 정리 11 충족 되도록.</li>
</ol> 4. 벌레와 베트 데이터 수집 준비 <ol><li>신선한 NGM 10 천 가득 페 트리 접시는 얇은, 평평 하 게 백 금 철사 선택 (섹션 1.3 참조)를 사용 하 여 4 개의 성인 nematodes 전송.</li>
	<li>하나 일회용 플라스틱 베트 등이 양쪽에 베트를 터치만 주의 되 고 그것의 패키지에서 제거.</li>
	<li>는 멧은 약 80%까지는 베트에 증류수를 플라스틱을 micropipette 가득 사용 증류수. 
	참고: 때 중요 하다 사용 증 류 물 또는 이온된 버퍼 M9 10 또는 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 같은 선 충, 처리 미생물 죽이 화합물을 포함 하는 수돗물으로.</li>
	<li>C. 선 충 해 범위에서 사용할 수를 포함 하는 페 트리 접시를 놓고.</li>
	<li>플래티넘 선택 사용 하 여, 페 트리 접시에서 한 성숙한 C. 선 충을 제거 하 고 선택 경우는 선 충 류를 꺼내 려 하는 데 필요한 원에 선택 이동 베트에 잠수함.</li>
	<li>베트에서 형성 하는 거품을 방지 하기 위해 물으로 베트 채우기 때까지 그것은 약간에 베트 bulges &#39; s 가기. 채우기는 베트 &#39; 다음에 물으로 완전히 s 모자는 베트에 신속 하 게 모자를 쓰고.</li>
	<li>광학 청소 헝겊을 사용 하 여 고 종이 어떤 작은 잔여 방울 청소를 청소 광학 쏟 았 있을 수 있습니다 물방울 제거.</li>
</ol> 5. 회절 패턴 강도 변화의 실시간 데이터 수집 <ol><li>에 헬륨-네온 레이저와 붉은 광선을 생산 하 고 있습니다. 주파수/색상 설정을 조정. 센서 설정. 
	주의: 632에서 낮은 에너지 빔 사용 nm, C. 선 충으로 방지 고주파 (파란) 빛 12.</li>
	<li>는 베트에 벌레를 찾습니다. 선 충 류는 베트의 부분 중앙에 약까지 베트 기울기 부드럽게 그것의 등이 양쪽에 베트를 들고. 
	참고: 동요 하거나 심하게는 베트를 기울이기는 베트의 벽과 충돌 웜을 발생 합니다. 이 선 충 류를 손상 수 있습니다.
	<li>장소 광학 시스템에 대기에 베트 레이저 내 벌레를 중심으로 <ol>&#39; s 빔 미러 2 미러 1에서 반영. 길 잃은 빛을 제거 하십시오.</li>
	</ol></li> <li>레이저 빔에 벌레 센터.
	<ol><li>광다이오드의 위치와 회절 패턴의 중앙 최대 일치 하지 않는 회절 패턴에는 포토 다이오드를 배치.</li>
		<li>는 광다이오드의 포화를 방지 하기 위해 중립 밀도 필터를 조정 합니다. 중립 밀도 필터 휠을 돌려 빛의 강도 조절.
		<li>중립 밀도 필터는 포토 다이오드에서 출력 전압을 증가 하는 회전 <ol>. 
			참고: 전압 출력 디지털 포토 다이오드를 위한 소프트웨어를 사용 하 여 관찰 됩니다. 포토 다이오드의 전압 변경 되지 않는 경우 포화입니다. 이 경우, 돌려 중립 밀도 필터는 전압 감소 최소 읽기에 병합 하지 않고. 전압 신호는 광다이오드의 채도 나타내는 피크 리딩에서 평평 하지 않습니다 확인 합니다. 채도 관찰 되는 경우 중립 밀도 필터 바퀴를 회전 하 여 빛의 강도 감소.</li>
		</ol></li> <li>이동 회절 패턴 벌레를 모니터링 하는 동안 오실로스코프를 제어 하는 소프트웨어에 있는 시작 버튼을 클릭 하 여 표시, 수집 데이터는 포토 다이오드를 일단 &#39; s 운동. 벌레 레이저 빔와 diffrac는 이동 될 때까지 측정을 계속합니다기 패턴 사라집니다, 일반적으로 약 20 소요 s.
		오실로스코프에 대 한 소프트웨어에 있는 중지 버튼을 클릭 하 여 <ol><li>중지 데이터 수집 프로세스. 각 시도 저장 &#39; s 데이터.csv 또는.txt 형식.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>각 표현 형에 대 한 데이터 세트를 적어도 50가 수집 될 때까지 단계 5.2 5.3를 반복. 재판 당 8 ~ 10 동물을 사용 하 여.</li>
	<li>는 베트 경우 그것은, 벌레 및 반복 단계 4의 dispose 긁힌. 경우 웜 전송에서 해 이다, 그것의 처분 하 고 동일한 cuvette을 사용 하 여 4 단계를 반복 하기 전에 증류수와 cuvette 린스.</li>
	<li>반복 단계 5는 OH7547를 사용 하 여 &#34; 롤러 &#34; 데이터를 웜 변형 표시를 주의 하는 스트레인.</li>
</ol> 6. 푸리에 스펙트럼 데이터 <ol><li>이산 푸리에 변환 3을 수행할 수 있는 데이터 분석 프로그램으로 수집한 데이터 가져오기.</li>
	<li>수행 푸리에 변환 소프트웨어의 고속 푸리에 변환 (FFT) 옵션을 사용 하 여 각 데이터 집합에.</li>
	<li>N2 야생 타입에 대 한 각 진폭 벌레에 대 한 FFT 결과에서 주파수를 평균.</li>
	<li>반복 단계 6.3는 OH7547에서 Fft를 사용 하 여 &#34; 롤러 &#34; 웜.</li>
</ol> 7. 푸리에 스펙트럼의 모델링 <ol><li>프로그램은 선 충 류의 이진 모델 운동 (보충 자료에 포함 된 프로그램을 참조). 
	참고:이 모델에서 처음 웜 모션의 두드러진 특성을 표시 하는 거친 근사치입니다. 결과 실제 웜 비교 모델 세련 된 될 수 있습니다. 웜 도형은 근사 현미경 이미지 13를 사용 하 여입니다.
	<li>만들기 순차적 프레임 두 개 이상 벌레 사이클 ( 그림 2a)을 통해 이동 하는 이진 모델의 <ol>. 보충 자료;에서 동영상 보기 C 웜 비디오 (CWorm.avi) 및 W 웜 비디오 (WWorm.avi).</li>
	</ol></li> <li>순차적 회절 패턴을 생산. 보충 자료에 동영상을 참조 하십시오. C 웜 회절 비디오 (CWormDiff.avi)와 W 웜 (WWormDiff.avi) 있습니다.
	벌레 이미지의 <ol><li>푸리에 변환 각 이진 프레임. 큰 패딩 웜 주위 프레임의 더 나은 회절 이미지의 해상도 됩니다. 
		참고: 각 푸리에 변환된 프레임의 절대값은 해당 회절 패턴 ( 그림 2b)에 비례.</li>
		<li>눈금에 회절 패턴의 농도 매핑하여 회절 패턴의 명암을 조정. 
		참고: 카메라와 눈 비 선형 가늠 자에 작동 하는 경향이. 로그 눈금은 어떻게 회절 패턴은 일반적으로 인간의 눈으로 인식 시뮬레이션할 수 있습니다.</li>
	</ol></li> <li>모델된 회절 신호를 추출.
	<ol><li>회절 패턴에 광다이오드의 위치에 해당 하는 중앙 위치를 선택.</li>
		<li>는 광다이오드의 크기 시뮬레이션 광다이오드의 위치를 둘러싼 인접 행렬 요소를 추가 합니다. 광다이오드의 크기는 일반적으로 모델링 된 회절 패턴의 0.1%.</li>
		<li>기록과 음모는 회절의 크기의 순서 신호. 신호는 합리적인 물리적으로 확인 (즉, 정기적인 탈 곡의 경우는 포토 다이오드에서 신호 해야 정기 뿐만).</li>
	</ol></li> <li>푸리에 7.3에서 얻은 회절 신호 변환 및 실험 데이터와 결과 비교.</li>
	<li>다양 한 웜 변종에 대 한 반복 및 비교.</li>
</ol>

<ol><li>Magnes, J., et al. <a target="_blank" href="http://file.scirp.org/Html/6-1850026_21423.htm">Analysis of Freely Swimming C. elegans Using Laser Diffraction.</a> Open J. Biophys. 2, 101-107 (2012).</li>
<li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Eells, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Locomotion+Study+of+Freely+Swimming+Micro-organisms+Using+Laser+Diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction.</a> J. Vis. Exp. (68), (2012).</li>
<li>James, J. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJames%2C+JF+%22A+Student%27s+Guide+to+Fourier+Transforms+with+Applications+in+Physics+and+Engineering%22">A Student's Guide to Fourier Transforms with Applications in Physics and Engineering</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. (1995).</li>
<li>Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensation+and+mechanical+load+modulate+the+locomotory+gait+of+swimming+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans.</a> J. Exp. Biol. 210, (2007).</li>
<li>Martin-Garcia, J. M., Conrad, C. E., Coe, J., Roy-Chowdhury, S., Fromme, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+femtosecond+crystallography%3A+A+revolution+in+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Serial femtosecond crystallography: A revolution in structural biology.</a> Arch. Biochem. Biophys. 602, 32-47 (2016).</li>
<li>Thibault, P., Rankenburg, I. C. <a target="_blank" href="http://aapt.scitation.org/doi/10.1119/1.2750378">Optical diffraction microscopy in a teaching laboratory.</a> Amer. J. Phys. 75 (9), 827-832 (2007).</li>
<li>Miao, J., Ishikawa, T., Anderson, E. H., Hodgson, K. O. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/233743787_Phase_retrieval_of_diffraction_patterns_from_noncrystalline_samples_using_the_oversampling_method">Phase retrieval of diffraction patterns from non crystalline samples using the oversampling method.</a> Phys. Rev. B. 67, 174104(2003).</li>
<li>Zhang, Y. P., Zhang, J. Q., Xu, W. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0030402613003215">Method for eliminating zero-order diffraction in lensless Fourier transform digital holography.</a> Optik - International Journal for Light and Electron Optics. 124 (21), 4873-4875 (2013).</li>
<li>Brody, A. H., Chou, E., Gray, J. M., Pokrywka, N. J., Raley-Susman, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mancozeb-induced+behavioral+deficits+precede+structural+neural+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroToxicology%22%5BJournal%5D)">Mancozeb-induced behavioral deficits precede structural neural degeneration.</a> NeuroToxicology. 34, 74-81 (2013).</li>
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<li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+molecular+solution+for+ultraviolet+light+detection+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biol. 6 (8), e198(2008).</li>
<li>Bilbao, A., Wajnryb, E., Vanapalli, S. A., Blawzdziewicz, J. <a target="_blank" href="https://arxiv.org/pdf/1306.4423.pdf">Nematode Locomotion in Confined and Unconfined Fluids.</a> Phys. Fluids. 25, 081902(2013).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

비활성 데이터의 뻗 기를 포함 하 여 인공 낮은 주파수 결과 평균 것입니다 이후 결과 왜곡 됩니다. 광다이오드를 흠뻑 젖 게 하는 것은 편평한 봉우리 또는 원시 데이터에서 "차단" 봉우리 인식할 수 있습니다. 피크 농도 의해 각 원시 데이터 세트를 나누어 회계 변동 레이저 강도에 대 한 도움이 됩니다.
피크 주파수는 전체의 지표로 thrashing 주파수; 그러나, 복잡 한 모션 비트 주파수 간섭 회절 패턴에서 원인과 신중 하 게 검사 해야 합니다.
이 메서드는 다른 선 충의 운동을 조사를 사용할 수 있습니다. 환경 다른 매체를 변경할 수 있습니다. 파장은 또한 변경할 수 있습니다. 전자기 스펙트럼의 보이는 범위에서 일 하는 것은 쉽고 안전한입니다.
더 세련 된 모델 회절 스펙트럼을 미래에 더 현실적으로 시뮬레이션할 것 이다. 미래 모델 방향, 주파수 위치 하지만 상대 피크 높이는 영향을 미치지 것을 바꿀 수 있는 벌레를 포함할 수 있습니다. 보다 현실적인 모델 실험 데이터에서 봉우리를 넓힐 것이 탈 곡 주파수의 확률 분포에 대 한 수 있습니다. 주파수에서 확산 탈 곡 주파수 변화에 대 한 계정을 것입니다.
현재 웜 형태는 원유, 특히 머리와 꼬리, 지역에서 현재 모델에서 보다 더 테이퍼 되어야. 그것은 때문에 그것은 다른 돌연변이에 운동의 복잡성에 대 한 단서를 줄 수 있는 신호의 시계열의 상세한 분석을 실시 재미 있을 수 있습니다.
그것은 동시에 여러 선 충을 특성화로이 기술을 확대의 실용성을 고려 가치가 있다입니다. 이 방법은 전통적인 현미경을 사용 하 여 기존 방법에 보완적인 방법으로 이해 되어야 한다. 이 메서드는 벌레 초점 평면에서 이동 수 있습니다 데이터 수집 동안 현미경을 요구 하지 않기에 이점이 있다. 평균된 주파수 스펙트럼 웜 모션에서 명확한 차이 보여 고 널리 주파수 봉우리에 의해 양이 정해질 수는 웜 운동 측정에서 소설 방법입니다. 회절 서명의 데이터 분석 추가 개발 되며 잘하면 여러 돌연변이 개인의 자동된 식별 과정으로 이어질 것입니다.

이 메서드는 선 충 C. 두 종자를 사용 하 여 매우 다른 locomotory 패턴의 운동의 실험과 모델 주파수 스펙트럼을 비교 합니다. 결과는 주파수 스펙트럼 분명 현미경 이미지 분석에 대 한 필요 하지 않습니다 있도록 물 열에는 선 충 류 수영으로 시간 변화에 따라 보여 줍니다. 이 방법은 양적 실시간 분석 가능 하며 전통적인 현미경으로 얻은 이미지/동영상 무료 정보를 제공 합니다. 프라운호퍼 회절, 멀리 분야 회절 라고도 라이브 회절 데이터1,2를 얻기 위한 기초를 제공 합니다. 회절 패턴에서 모든 단일 지점에서 빛의 강도도 랑에 선 충3의 개요 모든 지점에서 빛의 결과 이다. 결과적으로, 시간 동안 수집 된 빛의 강도 선 충 류의는 운동에 대 한 정보를 포함 합니다. 시간에 따른 회절 신호 분석 전통적인 비디오 분석을 보완 하는 운동에 관련 된 모든 주파수를 분석 하는 이후 해당 돌연변이의 특성 모션을 식별할 수 있습니다. 이 경우에, "롤러"의 운동 및 야생 형식 C. 선 충 의 특성 차이 선 충 류의 두 개의 다른 긴장의 주파수 스펙트럼을 비교 하 여 확인 됩니다.
일부 이전 특성 주파수 분석 주파수2,4수영 같은 회절 신호를 사용 하 여 확인 되었습니다. 더 중요 한 것은,이 방법으로 데이터 수집 되는 컴퓨터 화면에 실시간으로에서 운동 관찰 하 전통적인 현미경 검사 법을 보완 한 방법으로 사용할 수 있습니다. 명백한 locomotory 본을 가진 벌레의 주파수 스펙트럼은 푸리에 변환 회절 신호는 신호를 고려 하 여 측정할 수 수 있습니다.
이 작품에서 푸리에 기반 회절의 여러 자연 생물학과 물리학의 분야를 포함 한다. 샘플링에 의해 회절 오래 생물학5 와 다른 분야에 크리스탈 구조를 조사 하기 위해 사용 되었습니다. 그러나이 실험에서,6,7 오버 샘플링 멀리 분야 회절 패턴을 있도록 만듭니다 유기 체는 레이저 빔에 중심 이다. 오버 샘플링 렌즈-덜 이미징8 단계 검색 알고리즘 원래 개체의 이미지를 재구성 하는와 함께에서 일반적으로 사용 됩니다. 단계 검색 때 scatterers의 경우는 선 충 류와 함께 달성 하기 어렵습니다. 일시적인 회절 서명 웜 모션의 핵심 주파수를 평가 하기 위해 충분 하다. 이 방법은 계산 부담 덜 며 운동을 계량 하는 광학 방법 제공 합니다. 이 기술은 쉽게 동작을 변경 하는 환경 조건이 나 돌연변이의 분석에 대 한 적응 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>조정 가능한 헬륨-네온 레이저</td><td>연구 전기 광학</td><td>30602</td><td>543nm와 633nm 사이에서 4개의 파장을 선택할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>2 전면 알루미늄 미러</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-F01</td><td></td></tr><tr><td>포토다이오드: SI 증폭 검출기</td><td>Thorlabs</td><td>PDA 100A</td><td></td></tr><tr><td>석영 큐벳</td><td>Starna Cells</td><td>21/G/5</td><td>플라스틱 셀도 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>MatLab (Software)</td><td>MathWorks</td><td>R2016b (9.1.0.441655)</td><td>fft 명령을 사용하여 회절</td></tr><tr><td>시뮬레이션 Excel</td><td>Microsoft</td><td>14.7.1</td> 그림 4Caenorhabditis elegans Roller University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC)Strain: OH7547 Genotype: otIs199의 <td>데이터 분석에 사용됩니다</td></tr><tr><td></td><td></td><td>.</td><td>https://cbs.umn.edu/cgc/home</td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans Wild Type</td><td>University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC)</td><td>Strain:N2 유전자형: C. elegans wild isolate</td><td>https://cbs.umn.edu/cgc/home</td></tr></tbody></table>

회절 분석 라이브의 푸리에 기반 꼬마 선 충

Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans

이 원고 시간적 멀리 분야 회절 서명을 사용 하 여 선 충을 분류 하는 방법을 설명 합니다. 단일 선 충 C. 광학 멧 내부 물 열에서 일시 중단 됩니다. 632 nm 연속파 HeNe 레이저는 전면 표면 거울을 사용 하 여 베트를 통해 이동 합니다. 20-30 cm 이상 빛은 베트 통과 후 여행 상당한 거리 유용한 멀리 필드 (프라운호퍼) 회절 패턴을 보장 합니다. 레이저 빔을 내는 선 충 류로 실시간으로에서 회절 패턴 변화 아무것도. 광다이오드는 회절 패턴에 오프 센터를 배치 됩니다. 전압 신호는 포토 다이오드를 실시간으로 관찰 하 고 디지털 오실로스코프를 사용 하 여 기록. 이 프로세스는 139 야생 유형 및 108 "롤러" C. 선 충에 대 한 반복 됩니다. 야생 타입 웜 솔루션에서 급속 한 진동 패턴을 전시 한다. "롤러" 벌레 표 피 부드러운 운동 방해의 핵심 구성 요소에는 돌연변이 있다. 채도 비활성의 무료 하지 않은 시간 간격 삭제 됩니다. 그것은 그것의 최대 상대 농도 비교 하 여 각 평균 분할 하입니다. 각 벌레에 대 한 신호는 푸리에 변환 각 벌레에 대 한 주파수 패턴 나온다. 벌레의 각 유형에 대 한 신호 평균 이다. 야생 유형 및 "롤러" C. 선 충 에 대 한 평균된 푸리에 스펙트럼 분명히 다른 고 공개 두 다른 웜 변종의 동적 벌레 모양 푸리에 분석을 사용 하 여 구분할 수 있습니다. 각 웜 스트레인의 푸리에 스펙트럼 locomotory 순간에 해당 하는 두 개의 다른 이진 웜 도형을 사용 하 여 대략적인 모델 일치. 실제 모델된 벌레에 대 한 평균된 주파수 분배의 봉투 모델에는 데이터와 일치 하는지를 확인 합니다. 이 방법은 모든 미생물의 독특한 푸리에 스펙트럼 있을 것입니다 많은 미세한 종에 대 한 푸리에 분석을 위한 기준으로 사용할 수 있습니다.

그림 1 에 표시 된 광학 실험 설정 초점 평면에 연결 되 고 없이 미생물의 연구에 대 한 수 있습니다. 포토 다이오드에서 탈 곡 신호 데이터 수집 컴퓨터 화면에 실시간으로에서 관찰할 수 있습니다. 특이 한 패턴 표시 됩니다 즉시 자세히 비디오 분석 하지 않고.
예제 모델된 순차적 웜 움직임과 해당 회절 패턴은 그림 2에 나와 있습니다. 모델링 된 회절 패턴을 질적 실험 패턴1 을 닮은 고 시뮬레이션 성공적으로 선 충 류 모델 초기 표시.
C. 선 충 여기 공부 두 가지 유형의 샘플 시간적 회절 서명 그림 3에 표시 됩니다. 그것은 각 선 충 류 다른 속도 진폭에 몸부림 품질로 볼 수 있습니다. 차이의 일부 이전 게시1에서 완료 했다 피팅 곡선을 통해 측정할 수 있습니다. 그러나 이산 푸리에 변환,, 포함 된 주파수에 관한 자세한 내용은 밝히지:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56154/56154eq1.jpg">(1)
변수 n 과 개별 주파수 가변 k. N의 총 수는 Fk 는 디지털 푸리에 변환 (FT) 및 fn 은 이산 시간 시간에 따라 원시 회절 신호 데이터 요소입니다. 평균 디지털 푸리에 변환의 회절 주파수 스펙트럼 (그림 4)의 진폭에 의해 식별 선 충 류 있습니다. 야생 타입 스펙트럼 롤러 모션 스펙트럼 보다 더 낮은 주파수에 의해 지배 된다.
롤러 선 충 C. 노트 대 야생 타입에 근접 하는 모델 야생 타입 롤러 진동 C 모양 ( 대략 유사한 한쪽을 선호 하는 경향이 있다 하는 동안 wavelike (W 또는 S 모양) 모션 (그림 2a)의 때리는 경향이 그림 5). 이 다른 스펙트럼에 대 한 몇 가지 설명을 제공합니다. 주로 롤러는 W 발진 C 움직임 반대 2로 생각 될 수 있다 하는 동안 1 개의 측에 C를 형성 합니다. 이러한 이유로 W 움직임은 더 복잡 한 C 모션 보다 더 많은 보조 낮은 주파수를 공개. 이 결과 전산 모델에서 확인 된다. W 모양을 C 모양 (그림 6) 보다 훨씬 높은 주파수 밀도 있다. 이것은 그림 4 동안 완전히 개별 롤러 주파수 더 클러스터 되어 있는 FFT에서 확인 된다. 롤러의 통계는 비뚤어진 롤러 야생 타입 운동으로 일시적으로 되돌릴 수 있기 때문 이다.
롤러 타입의 부드러운된 파워 스펙트럼 C. 선 충 은 광범위 한 피크 ~1.5 Hz, 수영 야생 타입 C. 선 충 복합 스펙트럼 (~1.0 Hz와 1.75 Hz에서 포함 한 봉우리)를 전시 하는 동안입니다. 포토 다이오드 (PD)는 유한 크기 여러 행렬 요소를 확산. 개별 매트릭스 요소 또는 회절 패턴에 포인트 다 강도 마다 다르므로 건설적인 그리고 파괴적인 방해; 그럼에도 불구 하 고, 주파수는 고 농도 다 같습니다 모든 매트릭스 요소, 그림 7에서 볼 수 있듯이. 시간 미분 식 1을 고려 하면 주파수 변동 위상 매트릭스에 하지만 원래 개체의 변동에만 의존 하지 않는 볼 수 있습니다.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56154/56154eq2.jpg">(2)
PD는 여러 매트릭스 요소 확산, 피크 위치 일관 된 주파수 프로필에 평균. 일부 유사 예상 될 수 있다 고 벌레의 방향에 대 한 단서를 줄 수 있다. 주파수 분배 웜 변화의 걸음 걸이로 변경 됩니다. 현재 모델만 피크 위치 보다는 상대적인 피크 높이의 평가 대 한 허용 하는 간단한 모델이 이다. 다른 locomotory 패턴 다른 피크 위치에 평균 것입니다.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig1.jpg"> 
그림 1입니다. 실험적인 체제. 중립 밀도 필터를 통해 저전력 레이저 빔 여행은 미러 M1 M2, 미러와 포토 다이오드 쪽으로 여행에 벌레를 포함 하는 멧을 통해 아래로 반영 됩니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig2.jpg"> 
그림 2입니다. 순차적 웜 형태와 해당 회절 패턴. (한) 일부 모델된 W 모양 선 충 및 (b) 해당 순차적 회절 패턴의 순차적 바이너리 이미지를 선택 합니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig3.jpg"> 
그림 3입니다. 실험 샘플 회절 서명. (한) OH7547 "롤러" (b) N2 야생 타입 선 충 C. 회절 패턴. 에 하나의 포토 다이오드를 사용 하 여 회절 서명 수집 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig4.jpg"> 
그림 4입니다. 실험 평균 롤러 및 야생 유형 프라운호퍼 회절 시리즈의 파워 스펙트럼. 스펙트럼 주파수 시계열의 평균된 푸리에 변환에서 현재 녹화 광다이오드와 함께. 가우스 필터 표준 편차의 3 표준 편차에서 잘린 0.075 Hz 부드럽게 사용 됩니다. Note (~1.0 및 1에서 봉우리를 포함 한 복합 마무리 야생 유형 스펙트럼에 비해 매끄러운된 롤러 스펙트럼에서 ~1.5 Hz에서 광범위 한 스펙트럼 피크.75 Hz)입니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig5.jpg"> 
그림 5입니다. 회절 대형 그림. 회절 패턴은 infinitesimally 작은 직선 (왼쪽)으로 각 선 세그먼트의 생각에 의해 모델링 될 수 있습니다. (오른쪽)이이 라인을도 랑 모양 선 충 류는 C에 의해 생성 된 멀리 분야 회절 패턴의 건설을 보여 줍니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig6.jpg"> 
그림 6입니다. 롤러 및 야생 유형 프라운호퍼 회절 시리즈의 파워 스펙트럼 시뮬레이션. (a) C 모양 및 (b) W 모양 웜 광다이오드와 200 (세로) 및 175 (수평) 매트릭스 요소에 중심으로. W 모양 더 복잡 한 운동으로 인해 주파수의 더 높은 조밀도 보여준다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig7.jpg"> 
그림 7입니다. 롤러 및 다른 포토 다이오드 위치에서 야생 유형 프라운호퍼 회절 시리즈의 파워 스펙트럼 시뮬레이션. (한) W 모양 웜 그리고 광다이오드의 다양 한 위치를 시뮬레이션 하는 다양 한 위치에서 단일 매트릭스 요소 (b) C 모양 웜. 다양 한 위치;에 대 한 피크 높이 다 그러나, 피크 위치 특정 도형에 그대로 유지. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 원고 멀리 분야 회절 서명을 사용 하 여 다른 선 충을 구별 하는 방법을 설명 합니다. 우리는 평균 주파수 연속파 레이저를 사용 하 여 단일 위치에서 임시 프라운호퍼 회절 서명 연관 하 여 139 야생 유형 및 108 "롤러" C. 선 충 의 운동을 비교 합니다.

This manuscript describes how to classify nematodes using temporal far-field diffraction signatures. A single C. elegans is suspended in a water column ...

이 푸리에 기반 회절 분석의 전반적인 목표는 C. elegans가 3차원 공간에서 자유롭게 이동할 때의 운동성을 실시간으로 특성화하는 것입니다. 이 방법은 용액의 다양한 밀도나 운동성 돌연변이체에 대한 종의 반응을 설명함으로써 신경생물학 분야의 핵심 질문들에 답할 수 있습니다. 이 방법은 미세 생물 종의 푸리에 분석을 위한 기초 기준이 됩니다.모든 미세 생물 종이 각자 고유한 푸리에 스펙트럼을 갖는다는 장점이 있습니다. 이 방법은 C elegans의 이동 방식에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 다른 미생물에게도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사용자는 큐벳 내 레이저 빔 아래에서 선충을 찾는 것이 어려울 수 있어 고전할 수 있습니다.우리는 먼저 노이즈가 많은 신호인 시간적 회절 신호 자체로부터 수영 행동에 대해 알아내려는 시도를 통해 이 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다. 우선, 광학 작업대의 왼쪽 뒷부분 근처에 헬륨-네온 레이저를 고정하고 전원에 연결하십시오. 레이저 빔이 시료에 도달하기 전 필터를 통과하도록 레이저와 시료 위치 사이에 중성 농도 필터를 배치하십시오.두 개의 전면 알루미늄 조향 거울을 사용하여, 첫 번째 거울을 중성 밀도 필터 뒤에 고정함으로써 잠망경을 구축합니다. 그런 다음, 레이저 빔을 조향할 공간을 확보하기 위해 첫 번째 거울의 약 10 centimeters 아래에 두 번째 거울을 고정합니다. 거울 사이에 큐벳을 삽입하고, 레이저 빔이 큐벳을 수직으로 통과하도록 레이저 빔과 큐벳의 정렬을 맞춥니다.다음으로, 센서가 거울을 향하도록 두 번째 거울 바로 맞은편에 포토다이오드를 고정합니다. 그런 다음, 스탠드 위에 물이 채워진 큐벳을 놓습니다. 레이저 빔이 큐벳을 통과하여 포토다이오드 근처로 향하되, 다이오드에 직접 닿지 않도록 스탠드의 높이와 첫 번째 및 두 번째 거울의 각도를 조절합니다.레버를 사용하여 스탠드가 큐벳을 위한 수평면을 형성하도록 하십시오. 스탠드가 수평이 아닐 경우, 수평이 맞을 때까지 적절히 조정하십시오. 마지막으로, 제공된 USB 케이블을 사용하여 포토다이오드를 디지털 오실로스코프에 연결하고 이를 컴퓨터에 연결하십시오.오실로스코프 소프트웨어를 실행하고, 벌레의 트래싱(trashing) 주기를 충분히 분석할 수 있도록 샘플링 속도를 최소 8 Hz로 설정하십시오. 가늘고 납작한 백금 와이어 픽을 사용하여 성체 네마토드 4마리를 신선한 NGM 한천으로 채워진 페트리 접시로 옮깁니다. 그다음, 일회용 플라스틱 큐벳을 패키지에서 꺼내되, 큐벳의 요철이 있는 측면만 잡도록 주의하십시오.그 다음, 마이크로피펫을 사용하여 큐벳의 약 80%가 채워질 때까지 증류수를 분주합니다. C elegans가 들어 있는 페트리 접시를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 그런 다음, 백금 픽을 사용하여 페트리 접시에서 성체 C elegans 한 마리를 옮겨 큐벳 안에 넣습니다.필요한 경우, 픽(pick)을 원형으로 움직여 네마토드(nematode)를 떼어냅니다. 네마토드를 조심스럽게 다루고 큐벳을 흔들지 마십시오. 큐벳을 흔들면 벌레들이 반응하지 않을 수 있습니다.큐벳에 기포가 생기는 것을 방지하려면, 큐벳의 상단 위로 약간 넘칠 때까지 증류수를 채웁니다. 그 다음, 캡에 물을 채운 후 빠르게 큐벳에 캡을 씌웁니다. 렌즈 페이퍼를 사용하여 큐벳 외부로 흘러나온 물방울을 닦아냅니다.또한, 렌즈 페이퍼를 사용하여 남아 있는 작은 액적들을 제거하십시오. 헬륨 네온 레이저를 켜고 빨간색 빔이 생성되도록 주파수 설정을 조정하십시오. 그 다음, 센서를 켭니다.큐벳의 요철진 측면을 잡고 선충이 큐벳의 대략 중앙에 올 때까지 조심스럽게 기울입니다. 그다음, 거울 1에서 거울 2로 이동하는 레이저 빔의 중심에 선충이 오도록 큐벳을 광학 시스템의 스탠드 위에 놓습니다. 이어서, 포토다이오드의 위치와 회절 패턴의 중앙 극대가 일치하지 않도록 회절 패턴 내에 포토다이오드를 배치합니다.그런 다음, 포토다이오드에서 뚜렷한 전압 출력이 나올 때까지 중성 밀도 필터를 회전시킵니다. 포토다이오드의 포화를 방지하기 위해 중성 밀도 필터를 사용하여 빛을 제한해야 합니다. 직선으로 나타나는 것은 과포화 또는 강도 부족을 의미합니다.이동하는 회절 패턴이 보이면, 소프트웨어의 시작 버튼을 클릭하여 포토다이오드로 데이터를 수집하고, 벌레의 움직임을 모니터링하면서 오실로스코프를 제어하십시오. 벌레가 레이저 빔 밖으로 나가 회절 패턴이 사라질 때까지 측정을 계속하십시오. 만약 큐벳에 흠집이 있다면, 해당 큐벳과 벌레를 폐기하고 다시 시작하십시오.약 20초 후에 오실로스코프 소프트웨어의 정지 버튼을 클릭하여 데이터 수집 과정을 중단하십시오. 각 시험의 데이터를 쉼표로 구분된 값(CSV) 또는 텍스트 형식으로 저장하십시오. 표현형당 최소 50개의 데이터 세트를 수집하고, 시험당 8~10마리의 동물을 사용하십시오.모델링된 선충의 순차적 이동 예시와 그에 따른 회절 패턴이 여기에 제시되어 있습니다. 모델링된 회절 패턴은 실험 패턴과 정성적으로 유사하며, 이는 시뮬레이션이 선충을 성공적으로 모델링했음을 나타냅니다. 또한, roller 변이체와 야생형 c elegans의 시간적 회절 특성을 정량적으로 보여줄 수 있습니다.여기에서 볼 수 있듯이, 각 선충은 서로 다른 속도와 진폭으로 몸을 흔듭니다. 평균 디지털 푸리에 변환을 통해 회절 주파수 스펙트럼의 진폭으로 선충을 식별할 수 있습니다. 야생형 벌레의 스펙트럼은 롤러 운동 스펙트럼보다 낮은 주파수가 지배적입니다.다음은 두 개의 서로 반대되는 해류 운동으로 생각할 수 있는 w 진동의 예시입니다. 이와 대조적으로, 롤러(roller)는 주로 한쪽으로 c 형태를 형성하며 다음과 같이 나타납니다. 주파수를 분석해 보면, w 운동은 c 운동보다 더 복잡하며 더 많은 2차 저주파를 나타냅니다.숙달되면 기술을 적절히 수행했을 때 하나의 데이터 세트를 약 2분 만에 수집할 수 있습니다. 일련의 데이터 세트를 위해 광학 장치를 설정하는 데는 약 20분에서 30분이 소요됩니다. 이 절차를 시도하는 동안, C elegans의 이동 능력의 무결성을 보존하기 위해 주의 깊게 다루는 것이 중요함을 기억하십시오.이 절차에 이어, 트랙터 재구성(tractor reconstruction) 및 비선형 분석과 같은 다른 방법을 적용하여 C elegans의 운동에 대해 더 자세히 알아볼 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 신경생물학 연구자들은 C elegans의 운동성 돌연변이체를 더욱 심도 있게 연구할 수 있는 길을 열게 되었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 살아있는 선충의 회절 패턴을 생성하는 방법과 이를 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.레이저 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 절차를 수행하는 동안 레이저가 눈 높이로 지나가지 않도록 하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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자유 수영 선충류와 같은 미세한...

자유롭게 미생물 수영의 양적 운동 연구는 레이저 회절을 사용하여

이 동영상은 칼슘 이미징의 개념을 소개하고 성형된 아가로스 웰에 포함된 벌레의 타임 랩스 이미징을 위한 예제 프로토콜을 포함합니다.

칼슘 이미징: 살아있는 예쁜꼬마선충의 신경 활동을 시각화하는 방법

여기에 제시된 기술은 자유롭게 단일 파장의 노출을 사용하여 미세한 종 수영의 경로를 측정한다. C. 엘레은 비용이 많이 드는 현미경에 저렴한 대안으로 그림자 영상을 보여주기 위해 사용된다. 이 기술은 방향, 속도, 가속도 및 힘을 측정하기 위하여 다양한 방향, 환경 및 종을 수용하도록 구성 될 수있다.

단일 파장 그림자 영상<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 로코 모션을 포함하여 강제 추정

동물을 움직이지 않게 하지 않고 장시간 척도에 걸쳐 행동과 신경 활동을 영상화하는 것이 행동을 이해하기 위한 전제 조건입니다. 아가로스 미세유체 챔버 이미징(AMI)은 예쁜꼬마선충의 모든 생애 단계에 대한 신경 활동과 행동을 이미지화하는 데 사용할 수 있습니다.

의 장기 칼슘 이미징을위한 아가로 오스 Microchambers<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

이 문서에서는 사용자 지정 미세 장치를 채용 하는 개별 벌레의 라이브 이미징을 설명 합니다. 장치에서 여러 벌레는 개별적으로 별도 챔버, 다양 한 생물 학적 과정의 다중화 경도 감시 허용에 국한 됩니다.

꼬마 선 충 에 경도 이미징을 위한 미세 플랫폼

우리 꼬마 선 충 의 생식. 의 3 차원 재구성 자동화 된 방법을 제시합니다 우리의 방법 수와 생식 및 분석 생식 단백질 분포 및 cytoskeletal 구조 내에서 각 핵의 위치를 결정합니다.

꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

여기에 보고된 것은 잘 제어되고 국소화되지 않은 진동을 가진 자유롭게 행동하는 예쁜꼬 마선충에서 칼슘 이미징을 위한 시스템이다. 이 시스템을 통해 연구원은 나노 규모의 변위에서 잘 제어 된 특성을 가진 비 국부적 인 진동을 불러 일으키고 진동에 대한 C. elegans 의 반응 중에 칼슘 전류를 정량화 할 수 있습니다.

잘 제어되고 국소화되지 않은 진동으로 자유롭게 행동하는 Caenorhabditis elegans의 칼슘 이미징

여기에서, 우리는 Caenorhabditis elegans embryos 를 준비하고 장착하고, 4D 현미경으로 개발을 기록하고 세포 계보를 추적하기위한 프로토콜을 제시합니다.

4D 현미경 검사: 노마르스키 현미경을 이용한 예쁜꼬마 선 충 배아 발달 풀기

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미토콘드리아 질환의 카노르하비티스 예르간 모델에서 동물 활동을 정량화하는 실험 방법의 비교 분석

이 연구는 가장 큰 Lyapunov 지수(LLE)를 측정하여 C. elegans 의 운동에 대한 연령의 영향을 조사합니다. 나이가 들수록 C. elegans 는 운동 조절이 증가하고 그에 따른 감소를 보입니다. 결과는 5일 후에 LLE가 최고조에 달하고 벌레가 나이가 들면서 감소하는 것으로 나타났습니다.

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