생물 발광 시스템 비-침략 적 비보에 의해 Murine 호스트에서 Enterohemorrhagic 대장균 식민지의 검출

이 실험의 전반적인 목표는 비침습적 생체 내 이미징 시스템을 사용하여 마우스에서 장 출혈성 대장균 집락화를 감지하는 것입니다. 이 방법은 집락화와 같은 장출혈성 대장균 병원성 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 동물을 희생하지 않고도 살아있는 동물에서 EHEC 집락화를 감지할 수 있다는 것입니다.

먼저 루시페라제 플라스미드를 보유하고 있는 대장균 O157:H7 EDL933 박테리아의 섭씨 80도 스톡을 밀리리터당 50마이크로그램의 카나마이신이 함유된 LB 한천 플레이트에 줄무늬를 만듭니다. 섭씨 37도에서 16-18시간 동안 박테리아를 성장시킵니다. 오버나이트 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 3밀리리터의 LB 배지에 밀리리터당 50마이크로그램의 카나마이신을 접종합니다.

그런 다음 섭씨 37도 및 220rpm에서 16-18시간 동안 배양합니다. 다음날, 하룻밤 배양을 1에서 100까지 희석한 2 밀리리터를 준비하고 200 밀리리터의 LB에 카나마이신을 접종합니다. 섭씨 37도 및 200rpm에서 2.5-3시간 동안 또는 600나노미터의 광학 밀도가 0.9에서 1 사이에 도달할 때까지 배양합니다.

다음으로, 재배양된 박테리아를 중력의 8000배, 섭씨 4도의 온도에서 30분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 버리고 부드러운 교반으로 100% 멸균 생리식염수 0.9ml로 세균을 세척합니다. 세척 후 박테리아 배양액을 다시 원심분리하고 상층액을 부드럽게 버립니다.

그런 다음 0.9% 멸균 생리식염수를 사용하여 펠릿을 100배 농축합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 24시간 동안 스트렙토마이신 물로 마우스를 처리한 후 주사기에 100마이크로리터의 EHEC 박테리아를 채웁니다. 동물을 부드럽게 들어 올려 조심스럽게 케이지 위에 놓습니다.

그런 다음 쥐의 꼬리를 조심스럽게 잡고 동물이 케이지 상단을 잡고 도망치려고 합니다. 엄지와 검지를 사용하여 동물의 목과 뒤쪽의 느슨한 피부를 잡고 머리가 움직이지 않도록 마우스를 부드럽게 제지합니다. 그런 다음 마우스를 수직 위치에 잡고 마우스 머리가 이 위치에서 움직이지 않는지 확인합니다.

입천장을 따라 동물의 입에 개침을 삽입하고 위를 향해 식도로 내려갑니다. 삽입된 바늘이 마우스의 절반 또는 2/3 지점에 있을 때, 약 10에서 9번째 CFU의 세포를 포함하는 100마이크로리터의 EHEC 박테리아를 주입합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 생물 발광 세포를 시각화한 후 소프트웨어의 Acquisition Control Panel을 엽니다.

발광, 사진 및 오버레이를 선택합니다. 노출 시간을 자동으로 설정합니다. 그런 다음 범주화를 중간으로 설정합니다.

F/스톱을 발광의 경우 1로 설정하고 사진의 경우 8로 설정합니다. F/stop은 CCD 검출기가 수신하는 빛의 양을 제어합니다. 마우스 샘플이 이미징할 준비가 되면 Acquire를 클릭하여 이미지 획득을 수행합니다.

획득한 이미지 데이터를 연 다음 도구 팔레트 패널을 엽니다. 원과 같은 ROI 툴을 선택하여 영상의 생물 발광 영역을 정의합니다. 다음으로, 연필 아이콘을 사용하여 ROI 측정을 클릭하여 표면 생물 발광 강도를 측정합니다.

ROI 측정 패널과 정량화 값이 나타납니다. 그런 다음 ROI 측정 패널의 왼쪽 모서리에서 측정 구성을 사용하여 필요한 값/정보를 선택합니다. 그렇지 않으면 내보내기를 클릭하여 이 데이터 테이블을 내보내고 csv 파일로 저장합니다.

마지막으로, 총 플럭스 p/s 열의 값을 csv 파일의 생물 발광 강도 정량화로 사용합니다. 이 이미지에서 입증된 바와 같이, EHEC 접종이라고 표시된 생물 발광이 있는 구강 배에 노출된 마우스에서 강력한 생물 발광 신호가 관찰되었습니다. 이 그림에서 야생형 EHEC EDL933으로 명명된 생물발광을 접종한 마우스는 감염 후 2일이 지나도 강렬한 생물 발광 신호를 보였는데, 이는 EHEC가 2일 이내에 숙주를 군집화했음을 시사합니다.

그러나 지질다당류에 결함이 있는 돌연변이 E.coli에 감염된 마우스는 생물 발광을 나타내지 않으며, 이는 박테리아의 수가 감소하거나 전혀 이 마우스에 군집화되지 않았음을 시사합니다. 생물 발광 표지된 박테리아를 국소화하기 위해 희생된 동물의 장을 생체 외에서 이미지화했습니다. 생물발광으로 표지된 EHEC에 감염된 생쥐의 장기는 맹장과 결장에서 상당한 생물발광 신호를 보였는데, 이는 이러한 장기의 집락화를 나타냅니다.

대조적으로, LPS 돌연변이에 감염된 마우스는 장 조직에서 생물 발광이 감소한 것으로 나타났으며, 이는 생체 내 이미지와 일치합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 IV 시스템을 사용하여 마우스의 EHEC 집락화를 모니터링하는 실험을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.