Name: 생물 발광 시스템 비-침략 적 비보에 의해 Murine 호스트에서 Enterohemorrhagic 대장균 식민지의 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: 학습하세요 생체 발광 이미징을 이용하여 마우스에서 출혈성 대장균(EHEC) 식민지를 비침략적으로 검출하는 방법을. 이 기술은 살아있는 동물에서 실시간으로 세균 식민지를 모니터링하여 병원성 연구에 활용됩니다.

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우리는 인정 하는 치 정 첸에서 학과의 의료 연구, 치 매 의료 센터 (타이난, 대만), 감염 및 국립 쳉 쿵 대학 실험실 동물 센터에서 지원에 마우스에 도움. 이 작품은 과학의 성직자에 의해 지원 하 고 기술 (대부분) CC를 (가장 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006-011, and106-2321-B-006-005)를 부여 합니다.

주의: EHEC O157:H7는 biosafety 수준 2 (BSL-2) 병원 체 질병 통제 및 예방 (CDC) biosafety 지시 (https://www.cdc.gov/)를 위한 센터에 따르면. 따라서, 모든 실험 절차 관련 된 EHEC BSL-2 시설에서 수행 되어야 합니다. 실험을 수행 하는 동안 실험실 코트와 장갑 착용. 인증된 biosafety 내각 (BSC)에서 작동 합니다. 70% 에탄올과 실험 절차 전후 실험 벤치를 소독. 모든 악기 또는 장비 연락처 (또는 잠재적으로 연락처) EHEC 70% 에탄올 이나 표 백제로 소독 되어야 한다. 신중 하 게 오염 된 (또는 잠재적으로 오염 된) 폐기물은 밀봉 하 고 압력가 이어야 한다. 필요한 경우 마스크, 눈 보호, 이중 장갑 또는 죄수 복을 착용. 6 주 된 C57BL/6 여성 마우스 구입 하 고 실험실 동물 센터의 국립 쳉 쿵 대학 (NCKU)에서 유지 했다. 동물 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회 NCKU (승인 번호 104-039)에 의해 승인 되었다.
1. Bioluciferase 표시 된 EHEC 박테리아 생성
<ol><li>믹스 50 ng deoxyribonucleic 산 (DNA), 1 μ 각 10 μ M의 앞으로 반전 뇌관, 2 μ 2.5 m m deoxynucleotides (dNTPs), 2 μ 버퍼, 0.2 μ DNA 중 합 효소, 및 살 균 이중 증 류 물 (ddH2O) 증폭 20 μ의 최종 볼륨을 x 10에 반대로 대 카세트, nptII 유전자24 DNA 템플렛 pBSL18024, 국가 유관 프로젝트 (NBRP)에서 구입 하는 것입니다. PCR 조건 표 1 에 나열 되 고 뇌관 순서는 표 2에서 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>PCR 제품 상업적 복제 벡터 키트 다음을 위하여 프로토콜 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>NsiI 와 SmaI 에 의해 클로닝 벡터에서 nptII 유전자 단편을 삭제할 및 pAKlux29 대 내성 플라스 미드를 만드는 NsiI ScaI 에 의해 소화 되어, pBBR1MCS4로 복제 pWF27813.</li>
	<li>LuxCDABE 오 페론 luciferase 플라스 미드9, pAKlux2, SpeI-HF 와 ScaI 및 복제에 의해 표현에서 삭제할 SpeI HF 와 SmaI 소화 대를 생성 하는 pWF278 저항 및 luciferase 플라스 미드, pWF27913를 표현. 참고: 플라스 미드 추출 및 삭제 조각 purifications, 상업 플라스 미드 추출 및 젤 추출 키트를 각각 사용 합니다. 효소 소화에 대 한 100 ng DNA, 1 μ 10 x 버퍼, 각 선택 된 제한 효소, 그리고 살 균 ddH2O 10 μ의 총 볼륨의 1 μ를 혼합 하 고 2.5-3 h 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>2500 V 4 ms와 electroporation에 의해 대장균 O157:H7 EDL933 유능한 세포에 pWF279 플라스 미드를 변환.</li>
	<li>1 시간 동안 37 ° C에서 1 mL Luria Bertani (파운드) 매체에 변형 된 박테리아 세포를 품 어.</li>
	<li>16-18 h 37 ° C에서 대의 50 µ g/mL으로 보충 한 파운드 천 배지에 박테리아 접시</li>
	<li>vivo에서 이미징 기계 다음 날 여 접시의 발광 신호를 확인 하십시오. 접시에서 단일 식민지를 선택 하 고 3 mL 파운드 16-18 h 37 ° C에서 50 µ g/mL 대 보충에 문화.</li>
	<li>Diluting 하 여 세균성 주식 매체를 준비 살 균 ddH2O 30% 글리세롤 솔루션 100% 글리세롤.</li>
	<li>대 방지 고정 나사 모자 cryovial에 세균성 주식으로-80 ° c.에서 박테리아 문화 및 30% 글리세롤 용액의 1:1 비율로 luciferase 플라스 미드를 은닉 하는 대장균 O157:H7 EDL933 박테리아 글리세롤의 최종 농도 15%입니다.</li>
</ol>2. 발광 EHEC 박테리아 준비 구두 접종에 대 한
참고: EHEC 준비 및 마우스 구강에 대 한 실험 절차의 타임 라인 순서도 그림 1 실험 준비에 도움을 제공.
<ol><li>은닉 luciferase 플라스 미드-80 ° C 주식에서 50 µ g/mL 대와 파운드 한 천 배지 위에 행진 대장균 O157:H7 EDL933 박테리아. 16-18 h 37 ° c.에 대 한 박테리아를 성장</li>
	<li>16-18 h 220 rpm에서 37 ° C 배양 기에서 50 µ g/mL 대와 3 mL 파운드 매체에 문화와 하룻밤 플레이트에서 단일 식민지를 선택 하십시오.</li>
	<li>Subculture 박테리아 (1: 100 희석) 대 (50 µ g/mL)으로 200 rpm에서 37 ° C 배양 기에서 2.5-3 h에 대 한 파운드 국물 포함. (예를 들어, 추가 2 mL 하룻밤 배양 보충 대 (50 µ g/mL)와 200 mL 파운드 매체에 박테리아).</li>
	<li>2.5-3 h에 대 한 박테리아를 품 어 및 600에서 광학 밀도 값 측정 값까지 nm (OD600) 0.9 ~ 1 사이입니다. 세균성 세포 수는 약 108 콜로 니 형성 단위 (CFU)의 밀도 / mL.</li>
	<li>8000 x g 30 분, 4 ° c.에서 다시 교양된 박테리아 원심</li>
	<li>박테리아의 펠 릿을 교 반 하지 않고는 상쾌한을 삭제 하 고 부드러운 동요에 의해 100 mL 0.9% 메 마른 정상적인 염 분으로 펠 릿을 세척.</li>
	<li>한 번 2.5-2.6 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>세척 후 원심 8000 x g 30 분, 4 ° C에서 세균성 문화 하 고는 상쾌한 부드럽게 삭제.</li>
	<li>응축은 펠 릿에 100 0.9% 살 균 일반 식 염 수와 함께. 예를 들어, 200 mL 박테리아 centrifuged는 펠 릿을 중단 2 mL 정상적인 염 분을 추가 합니다.</li>
	<li>10 직렬 희석25통해 집중된 박테리아를 도금 하 여 박테리아 CFU (그것은 약 109 CFU/100 μ 응축 후에 있어야 정상적인 염 분)을 확인 합니다.</li>
</ol>3. 마우스 EHEC의 구강
<ol><li>24 h에 대 한 스 물 (5 g/L)와 6 주 된 여성 C57BL/6 쥐를 취급 합니다.</li>
	<li>24 시간 후 gavage 전에 또 다른 24 h에 대 한 일반 식 수로 전환. 24 h에 대 한 일반 물으로 치료 후 쥐 EHEC의 구강에 대 한 준비가.입니다.</li>
	<li>플런저에 다시 당겨 100 μ EHEC 박테리아로 주사기를 채우십시오. 아무 공기 방울이 주사기에는 확인 하십시오. 손가락으로 주사기를 스냅 하 여 거품을 제거 합니다.</li>
	<li>동물을 부드럽게 들어올리고 주의 케이지 위에 그것을 배치 합니다.</li>
	<li>꼬리, 신중 하 게 마우스 잡고 고 동물 케이지의 상단을 그립 하 고 멀리 이동 하려고.</li>
	<li>부드럽게 마우스의 머리를 이동 하지 않도록 엄지와 함께 동물의 앞면과 뒷면 목의 느슨한 피부를 파악 하 여 마우스를 제 지 하십시오.</li>
	<li>Gavage 바늘을 삽입 하 고 마우스의 머리는 고정 하 고 수직을 확인 하는 수직 위치에 마우스를 잡아.</li>
	<li>입의 지붕에 따라 마우스 입에 gavage 바늘을 삽입 하 고 식도 및 위를 향해 아래로 이동.</li>
	<li>삽입 된 바늘 절반 또는 2/3 길이 마우스에 때 주사 약 109 CFU 셀을 포함 하는 100 μ EHEC 박테리아.</li>
</ol>4입니다. 시각화
<ol><li>구강, 후 1, 2 일에 발광 신호를 감지 합니다.</li>
	<li>동물의 발광 신호를 검사 하기 전에 2.5% isoflurane 1.5 L/min 산소의 약 실에 그들을 둬서 그들을 anesthetize.</li>
	<li>모든 마우스 의식 및 중지 이동 될 때까지 2-5 분을 기다립니다. 동물 생물 발광의 비보에 탐지에 대 한 준비가 되었습니다.</li>
	<li>검색 및 이미지 동물의 발광 신호는 vivo에서 이미징 시스템. 소프트웨어 작업에 대 한 "데이터 수집" 섹션 5를 참조 하십시오. 이미징 프로세스 동안 모든 동물 2.5% isoflurane 1.5 L/min 산소의 지속적인된 공급을 받고 있다.<ol>
<li>파일을 클릭 > 라이브, 그리고 수동으로 마우스에 집중.</li>
		<li>노출 시간 및 레이저 강도 선택 합니다.</li>
		<li>클릭 취득 > 캡처.</li>
	</ol>
</li>
	<li>쥐 자 궁 경부 전위에 의해 안락사는 ex vivo 영상, 감염 된 쥐의 전체 내장 제거 및. Vivo에서 이미징 시스템 내장 9 cm 배양 접시와 이미지에 배치 합니다. 설정 되는 vivo에서 이미징 보기의 필드 A/b.로 설정 되어 제외 하 고 동일 자세한 내용은 "데이터 수집" 섹션 5를 참조 하십시오. 참고: 자 궁 경부 전위에 대 한 방법: 동물 케이지 그립을 한 손으로 꼬리를 파악 하 여 케이지 위에 마우스를 억제. 두개골의 기지에서 마커 펜 또는 엄지 및 목의 뒤에 대 한 다른 한편의 첫 번째 손가락을 놓습니다. 빨리 머리를 억제 하는 동안 손 또는 개체와 함께 앞으로 밀어 하 고 꼬리를 잡고 손으로 뒤로 당겨. 밀접 하 게 호흡 검거, 및 아무 심장 박동 확인 확인.</li>
</ol>5. 데이터 수집
참고: 데이터 수집에 사용 되는 소프트웨어는 재료의 테이블에에서 나열 됩니다.
<ol><li>이미지 수집을 위한 소프트웨어 (그림 2)의 수집 컨트롤 패널을 엽니다.</li>
	<li>선택 "발광" "사진,"와 "오버레이 합니다."</li>
	<li>"자동"으로 노출 시간 설정 "매체"로 Binning 설정</li>
	<li>Ƒ/중지 1로 발광 하 고 8에 대 한 설정 사진. Ƒ/중지 컨트롤 CCD 검출기는 빛의 양을 받았다.</li>
	<li>보기의 이미지를 얻으려고 관심 분야에 따라 필드를 설정 합니다. 옵션 "D"는 5 6 주 된 쥐를 적합 하 고 한 번에 모든 이미지 수 있습니다. "C"는 한 필드에서 3 6 주 된 쥐 이미지 수 있습니다.</li>
	<li>마우스/샘플 영상에 대 한 준비가 되 면, 일단 이미지 수집을 위한 "취득"을 클릭 합니다.</li>
	<li>이미지 데이터 획득을 엽니다.</li>
	<li>도구 팔레트 패널 (그림 3)을 엽니다.</li>
	<li>ROI 도구를 선택 합니다. 이미지 (그림 4) 발광 영역 범위 원을 (가장 왼쪽 중 하나)이 좋습니다.</li>
	<li>"측정 ROIs" (연필 아이콘) 측정 표면 발광 강도 (그림 3)를 클릭 합니다. 패널의 ROI 측정 및 정량화 값 표시 (그림 5).</li>
	<li>사용 하 여 구성 측정 ROI 측정 패널의 왼쪽에 선택 값/필요한 정보 (그림 6), 그렇지 않으면 "수출"이 데이터 테이블 내보내고.csv 파일 (그림 5)으로 저장을 클릭 합니다.</li>
	<li>.Csv 파일에서 발광 강도 정량화로 열 "총 속 (p/s)"의 값을 사용 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

그것은 알려졌다 EHEC luciferase 플라스 미드와 변환 호스트 또는 유전자 식 vivo에서8,,1112에 그것의 지역화를 검사 활용 되었습니다. 여기 시연 murine 모델 또한 murine 호스트8에서 EHEC 식민지 시기와 지역화를 검색 하기 위해 보고 되었다. 그럼에도 불구 하 고, 우리는 intragastrically 마우스 EHEC 접종을 관리 하는 방법과 구강에 대 한 발광 박테리아를 신중 하 게 준비 하는 방법의 세부 프로토콜을 제공 합니다. 특히,는 마우스 구강 EHEC (단계 3.7)의에 대 한 마우스 헤드의 위치 때 중요 gavage 바늘 삽입 됩니다. 위치 수직 하지 않으면 그것은 바늘을 통과 하기 어려울 것입니다 그리고 그것은 아마도 마우스를 다칠 수 있습니다. 3.8 단계에...

EHEC O157:H7 설사1, HS2에서3, 오염 된 물 이나 음식을 통해도 급성 신부전4 원인 병원 체 이다. EHEC 병원 성 enterobacterium 이며 인간1의 위장을 colonizes. EHEC 먼저 호스트 창 자 상피 준수 때 그들은 유형 III 분 비 시스템 (T3SS) 분자 주사기는 연결을 유도 하 고 적용을 이후에 병 변 (A/E) effacing 역할을 통해 호스트 세포에 주입 식민 요인 접착 (식민)5. 이 유전자는 A/E 병 변 형성에 관여 enterocyte 항목 (리) pathogenicity 섬5의 소재 시로 인코딩됩니다.
생물 발광은 빛 생산 화학 반응, 어떤 luciferase catalyzes 보이는 빛6를 생성 하는 기판 소. 이 효소 과정은 종종 산소 또는 아데노신 3 인산 염 (ATP)6의 존재를 필요로 한다. 생물 발광 영상 (BLI) 연구원 시각화 및 호스트 병원 체 상호 작용의 양자화에에서 있습니다 라이브 동물7. 씨 수 있습니다 그들은 이주와 다른 조직7; 침략 발광 박테리아에 따라 살아있는 동물에서 세균 감염 사이클 특성을 이 감염의 동적 진행을 보여준다. 또한, 동물에서 세균 부하는 관련이 발광 신호8; 따라서, 그것은 간단 하 고 직접적인 방법으로 실험 동물의 병 적인 상태를 추정 하는 편리한 표시기입니다.
여기에 사용 되는 플라스 미드 포함 luciferase 오 페론, luxCDABE, 박테리아 자체 luciferase 기판7,9인코딩하는 Photorhabdus luminescens 에서. 이 luciferase 표현 플라스 미드 박테리아로 변형 하 여 살아있는 동물에서 이러한 발광 박테리아를 관찰 하 여 식민과 감염 프로세스를 모니터링할 수 있습니다. 전반적으로, 씨 및 생물 발광 표시 된 박테리아 세균 숫자 및 위치, 항생제/치료 치료와 감염/식민지6, 에 세균성 유전자 발현 세균 생존 능력을 감시 하는 연구자 수 7. 수많은 병원 성 박테리아는 감염에서 감염 주기 및/또는 유전자 표현 검토 하 luxCDABE 오 페론 표현 보고 되었습니다. Uropathogenic 대장균10, EHEC8,11,,1213, enteropathogenic를 포함 하 여 이러한 박테리아 대장균 (EPEC)8, Citrobacter rodentium14,15, 살 모 넬 라 typhimurium16, Listeria monocytogenes17, Yersinia enterocolitica18,19, 비 브리 오 cholerae20, 문서화 되었습니다.
몇 가지 실험 모델 EHEC 식민 생체 외에서 그리고 vivo에서21,,2223의 연구를 촉진 하기 위해 개발 되었습니다. 그러나, 공부 하기는 EHEC 식민 vivo에서, 적당 한 동물 모델의 부족 및 따라서 내용의 결과 소수 있다. EHEC 식민 메커니즘에는 vivo에서의 연구를 촉진 하기 위하여 관찰 하 고 계량 비-침략 적 방법에서 살아있는 동물에서 EHEC 식민 동물 모델을 구축 하는 귀중 한입니다.
이 원고는 EHEC 식민 생활 호스트에 시간이 지남에 따라 모니터 발광 표현 시스템을 사용 하는 마우스-EHEC 식민 모델을 설명 합니다. 마우스는 intragastrically 생물 발광 표시 EHEC로 접종 하 고 발광 신호는 비-침략 적 vivo에서 이미징 시스템13와 쥐에서 발견 되. 마우스 감염 생물 발광 표시 EHEC 2 일 게시 감염 후 2 일 게시 감염 호스트 창에 그 박테리아 식민지는 제안 후 그들의 내장에서 중요 한 발광 신호를 보여주었다. 이미지 데이터 비보 전 이 식민은 맹 쥐의 콜론에서 구체적으로 보여주었다. 이 마우스 EHEC 모델을 사용 하 여 발광 EHEC 식민 검출 될 수 있다 살아있는 호스트에는 vivo에서 이미징 시스템에서 더 이해를 증진 수 있습니다 장의 박테리아 식민지의 상세한 메커니즘을 연구 하 여 EHEC 유도 생리와 병리학 변화입니다.

<table><tbody><tr><td>셰이커 인큐베이터</td><td>YIH DER</td><td>LM-570R</td><td>박테리아 인큐베이션&nbsp;</td></tr><tr><td>안와 진탕 인큐베이터</td><td>FIRSTEK</td><td>S300</td><td>박테리아 인큐베이션&nbsp;</td></tr><tr><td>pBSL180</td><td></td><td></td><td>nptII 유전자</td></tr><tr><td>pAKlux2</td><td></td><td></td><td>luxCDABE 오페론</td></tr><tr><td>T& 복제 키트</td><td>Yeastern Biotech</td><td>FYC001-20P</td><td>TA 복제에 사용&nbsp;</td></tr><tr><td>Nsi I</td><td>NEB</td><td>R0127S</td><td>플라스미드 클로닝에 사용&nbsp;</td></tr><tr><td>Sca I</td><td>NEB</td><td>R0122S</td><td>플라스미드 클로닝에 사용&nbsp;</td></tr><tr><td>Spe I-HF</td><td>NEB</td><td>R0133S</td><td>플라스미드 클로닝에 사용&nbsp;</td></tr><tr><td>Sma 나는&nbsp;</td><td>플라</td><td>스미드 클로닝에 NEB</td> <td>R0141S</td> 사용&nbsp;</tr><tr><td>플라스미드 클로닝에 T4</td> <td>리가제</td><td>NEB</td><td>M0202S</td> 사용&nbsp;</tr><tr><td>Ex</td><td>Taq TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>PCR 증폭 사용</td></tr><tr><td>10X Ex Taq 버퍼</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>PCR 증폭</td></tr><tr><td>dNTP 혼합물 사용&nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>는 PCR 증폭</td></tr><tr><td>PCR 기계에</td><td>사용됩니다. Biosystem을 적용했습니다.</td><td>2720 써멀 사이클러&nbsp;</td><td>&nbsp; PCR 증폭용</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>SIGMA</td><td>G5516-1L</td><td>박테리아 스타킹 용액</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434-5KG-R</td><td>LB 매체 제조용 화학품, 10g/L</td></tr><tr><td>트립톤</td><td>CONDA pronadisa</td><td>Cat 1612.00</td><td>LB 배지 제조용 화학품, 10g/L</td></tr><tr><td>효모 추출물 분말</td><td>Affymetrix</td><td>23547-1 KG</td><td>LB 배지 제조용 화학품, 5g/L</td></tr><tr><td>Agar</td><td>CONDA pronadisa</td><td>Cat 1802.00</td><td>LB 한천 카나마이신을 만들기 위한 화학물질</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>K4000-5G</td><td>항생제, 셀렉시톤</td></tr><tr><td>스트렙토마이신에 사용&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S6501-100G</td><td>항생제, 쥐의 미생물군 제거</td></tr><tr><td>EDL933 유능한 세포</td><td>집에서 만든</td><td></td><td>방법은 보충 문서에 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>MicroPulser</td><td></td><td>for electroporation</td></tr><tr><td>Electroporation Cuvettes</td><td>Gene Pulser/MicroPulser</td><td>1652086</td><td>for electroporation</td></tr><tr><td>고속 원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti, J-26S XP</td><td>use for centrifuging bacteria&nbsp;</td></tr><tr><td>고정 각도 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>JA25.5</td>는 <td>박테리아를 원심분리하는 데 사용됩니다&nbsp;</td></tr><tr><td>고정 각도 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>JLA10.5</td>는 <td>박테리아를 원심분리하는 데 사용됩니다&nbsp;</td></tr><tr><td>원심분리기 병</td><td>Beckman Coulter</td><td>REF357003</td><td>박테리아 원심분리에 사용&nbsp;</td></tr><tr><td>원심분리기 병</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>3141-0500</td><td>세균 원심분리에 사용&nbsp;</td></tr><tr><td>Eppendorf BioPhotometer Plus&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>AG 22331 함부르크</td>는 박테리아 C57BL/6 마우스<td>의 OD600 값을 측정하기 위한</td></tr> 것입니다<tr><td>&nbsp;</td><td>NCKU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>실험실 코트의 실험실 동물 센터,</td><td>개인 보호용 장갑</td><td></td><td></td>&nbsp;</tr><tr><td>이소플루란&nbsp;</td><td>파니온 & BF 생명 공학 Inc.</td><td>G-8669</td><td>마우스 마취용, 제약 등급</td></tr><tr><td>1ml 주사기&nbsp;</td><td></td><td></td><td>마우스의 구강 간을 위한 사용</td></tr><tr><td>재사용 가능한 22 G 볼 팁 먹이 바늘</td><td></td> <td>& 파이; 0.9 mm X L 50 mm</td><td>마우스 구강 위장에 사용</td></tr><tr><td>&nbsp; 가위&nbsp;</td><td></td><td></td><td>생쥐 실험에 사용</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS 200 이미징 시스템</td><td>Perkin Elmer</td><td>IVIS 스펙트럼</td><td>생물 발광 이미지 캡처에 사용&nbsp;</td></tr><tr>이미지 <td>데이터를 정량화하는 데</td> 사용되는 <td>Living Image Software</td><td>Perkin Elmer</td><td>버전 4.1</td></tr></tbody></table>

생물 발광 시스템 비-침략 적 비보에 의해 murine 호스트에서 enterohemorrhagic 대장균 식민지의 검출

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. 대장균 (EHEC) O157:H7는 foodborne 병원 체는 causesdiarrhea, 출혈 성 대 장 염 (HS), 그리고 hemolytic 신부전 증후군 (HUS), 인간의 창 자 장관에 식민지. EHEC 식민 vivo에서 의 상세한 메커니즘 연구를 모니터링 하 고 계량 EHEC 식민 동물 모델에 필수적 이다. 여기 모니터링 하 고 계량 EHEC 식민지 생활 호스트에서 EHEC에 발광 표현 플라스 미드를 변형 하 여 마우스 EHEC 식민 모델을 설명 합니다. 동물 생물 발광 표시 EHEC로 주사는 비-침략 적 vivo에서 이미징 시스템으로 탐지 하 여 쥐에서 강렬한 발광 신호를 보여줍니다. 후 1, 2 일 게시 감염, 발광 신호 수 여전히 감지할 수 감염 된 동물에서 EHEC 호스트에 적어도 2 일 동안 식민지 건의 하. 우리는 또한 이러한 발광 EHEC ex vivo 이미지에서 맹에 콜론, 특히 마우스 소장을 찾아 보여줍니다. 이 마우스 EHEC 식민 모델 EHEC 식민 메커니즘의 현재 정보를 도구 될 수 있습니다.

우리는 생물 발광 표시 EHEC 관리 (~ 109 세균성 세포) 구강에 의해 6 주 오래 된 여성 C57BL/6 마우스. 1 시간 이내 쥐 EHEC의 구두 접종 후 동물 vivo에서 이미징 시스템 그림 7과 같이 발광 신호 위해 시험 되었다. 결과 생물 발광 표시 EHEC와 gavage 쥐에서 강한 발광 신호를 보여주었다. 우리는 2 일 게시물 감염에 신호를 검사합니다. 그림 8A같이 쥐 2 일 EHEC는 2 일에 의해 호스트에 식민지 제안 감염 게시 후에 강렬한 발광 신호를 보여 야생-타입 EHEC EDL933 생물 발광 표시와 주사. 우리는 또한 intragastrically 생물 발광 표시 된 EDL933ΔrfaD (ΔrfaD) 쥐 (그림 8A) 감염. 이...

Enterohemorrhagic 생물 발광 표시 된 박테리아를 사용 하 여 대장균 (EHEC) 식민지에 대 한 마우스 모델의 자세한 프로토콜 제공 됩니다. 비-침략 적 vivo에서 이미징 시스템 라이브 동물에 의해 이러한 발광 박테리아의 탐지 EHEC 식민의 우리의 현재 이해를 미리 수 있습니다.

생물 발광 시스템 비-침략 적 비보에 의해 Murine 호스트에서 Enterohemorrhagic 대장균 식민지의 검출

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

이 실험의 전반적인 목표는 비침습적 생체 내 이미징 시스템을 사용하여 마우스 내의 장출혈성 E.coli 정착을 검출하는 것입니다. 이 방법은 정착과 같이 장출혈성 E.coli 병원성 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 동물을 희생시키지 않고 살아있는 동물에서 EHEC 정착을 검출할 수 있다는 점입니다.먼저, 루시페라아제 플라스미드를 보유한 E.coli O157:H7 EDL933 박테리아의 -80 °C 보관주를 50 µg/mL의 kanamycin이 포함된 LB agar 플레이트에 스트리킹합니다. 박테리아를 37 °C에서 16~18시간 동안 배양합니다. 하룻밤 배양한 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하여 50 µg/mL의 kanamycin이 포함된 LB 배지 3 mL에 접종합니다.그런 다음, 배양물을 37 °C, 220 rpm에서 16~18시간 동안 배양합니다. 다음 날, 하룻밤 배양한 배양물을 1:100로 희석하여 2 mL를 준비하고, 이를 kanamycin이 포함된 200 mL LB 배지에 접종합니다. 배양물을 37 °C, 200 rpm에서 2.5~3시간 동안 또는 600 nm에서의 광학 밀도(OD600)가 0.9에서 1 사이가 될 때까지 배양합니다.다음으로, 재배양된 박테리아를 8000 ×g, 4 °C에서 30분 동안 원심분리합니다. 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 제거하고, 100 mL의 0.9% 멸균 생리식염수를 이용해 부드럽게 교반하여 박테리아를 세척합니다. 세척 후, 박테리아 배양액을 다시 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 제거합니다.그 다음, 0.9% 멸균 생리식염수를 사용하여 펠릿을 100배 농축합니다. 본문 프로토콜에 따라 24시간 동안 streptomycin water로 마우스를 처리한 후, 주사기에 100 µL의 EHEC 박테리아를 채웁니다. 동물을 조심스럽게 들어 올려 케이지 상단에 주의하여 놓습니다.그런 다음, 마우스의 꼬리를 조심스럽게 잡아 동물이 케이지 상단을 붙잡고 벗어나려고 시도하게 합니다. 엄지와 검지를 사용하여 동물의 목과 등 쪽의 느슨한 피부를 잡아 머리가 움직이지 않도록 부드럽게 보정합니다. 이어서 마우스를 수직 상태로 유지하고, 이 자세에서 마우스의 머리가 고정되었는지 확인합니다.가바지 바늘을 동물의 입에 삽입하여 입천장을 따라 식도를 통해 위쪽으로 밀어 넣습니다. 삽입된 바늘이 마우스의 절반 또는 3분의 2 정도 들어갔을 때, 약 10⁹ CFU의 세포를 포함하는 100 µL의 EHEC 박테리아를 주입합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 생체 발광 세포를 시각화한 후, 소프트웨어의 획득 제어 패널(Acquisition Control Panel)을 엽니다.발광(luminescent), 사진 촬영(photograph) 및 오버레이(overlay)를 선택하십시오. 노출 시간을 자동(auto)으로 설정하십시오. 그런 다음 비닝(binning)을 중간(medium)으로 설정하십시오.발광(luminescence) 측정 시에는 F-stop을 1로, 사진 촬영 시에는 8로 설정하십시오. F-stop은 CCD 검출기에 도달하는 빛의 양을 조절합니다. 마우스 샘플의 이미징 준비가 완료되면, 이미지 획득을 위해 acquire를 클릭하십시오.획득한 이미지 데이터를 연 다음 도구 팔레트 패널을 엽니다. 원형과 같은 ROI 도구를 선택하여 이미지상의 생물 발광 영역을 지정합니다. 다음으로 연필 아이콘을 사용하여 ROI 측정(measure ROI's)을 클릭해 표면 생물 발광 강도를 측정합니다.ROI 측정 패널과 정량화 값이 나타납니다. 그런 다음 ROI 측정 패널의 왼쪽 모서리에 있는 측정 구성(configure measurement)을 사용하여 필요한 값/정보를 선택하십시오. 그렇지 않으면 내보내기(Export)를 클릭하여 이 데이터 테이블을 내보내고 csv 파일로 저장하십시오.마지막으로 csv 파일 내의 총 플럭스(total flux) p/s 열의 값을 생물발광 강도 정량값으로 사용하십시오. 이 이미지에서 알 수 있듯이, 생물발광 표지된 EHEC을 경구 투여한 마우스에서 강한 생물발광 신호가 관찰되었습니다. 이 그림에서 생물발광 표지된 야생형 EHEC EDL933을 접종한 마우스는 감염 후 2일째에도 강한 생물발광 신호를 보여, EHEC이 2일 이내에 숙주에 정착했음을 시사합니다.하지만 리포다당류(lipopolysaccharides)에 결함이 있는 변이 E.coli에 감염된 마우스에서는 생물발광이 나타나지 않았으며, 이는 박테리아의 정착 수가 감소했거나 정착하지 않았음을 시사합니다. 생물발광으로 표지된 박테리아의 위치를 파악하기 위해, 희생된 동물의 장을 ex vivo로 영상화하였습니다. 생물발광 표지 EHEC에 감염된 마우스의 장기에서는 맹장과 결장에서 유의미한 생물발광 신호가 관찰되었으며, 이는 해당 장기들에 박테리아가 정착했음을 나타냅니다.이와 대조적으로, LPS 돌연변이체에 감염된 생쥐는 장 조직에서 생체 발광이 감소한 것으로 나타났으며, 이는 생체 내 이미지와 일치합니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 IV 시스템을 사용하여 생쥐의 EHEC 정착을 모니터링하는 실험 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.

detection-enterohemorrhagic-escherichia-coli-colonization-murine-host

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

생활 동물 세균성 감염의 bioluminescence 이미징을위한 방법은 설명되어 있습니다. 병원균은 살아있는 동물에 감염 광학 온 몸이 이미징을 허용 루시페라제 표현을 수정합니다. 동물 모델은 루시페라제 표현 병원균에 감염과 질병의 발생 과정은 bioluminescence 이미징에 의해 실시간으로 시각하실 수 있습니다.

마우스의 이미지 세균 감염에 루시페라제를 사용하여

발광 생물 세균 이미징<em&gt; 생체 내</em

출처: Valentine, ME, et al. 녹농균 에서 프레임 내 유전자 결실 돌연변이체의 생성 및 간단한 감염 마우스 모델에서 독성 감쇠 테스트. J. Vis. 경험. (2020년)이 비디오는 생쥐에서 독성 및 약독화된 박테리아 균주의 생체 내 거동을 시각화하고 비교하기 위해 생물 발광을 사용하는 방법을 보여줍니다. 생물발광 박테리아 현탁액의 제조와 마우스에 대한 복강내 주사에 대해 설명합니다. 독성 균주는 전신 확산을 나타내는 반면, 약독화된 균주는 국소적으로 유지되며 희미해지는 신호로 표시된 대로 점차적으로 제거됩니다.

생물발광을 사용한 마우스의 박테리아 감염 역학 추적

출처: Kuo, C., et al. 비침습적 생체 내 생물발광 시스템에 의한 쥐 숙주에서 장출혈성 대장균 집락화 검출. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 동물 모델에서 경구 접종물로 사용하기 위해 냉동 재고에서 루시페라아제 발현 장출혈성 대장균 현탁액을 제조하는 방법을 보여줍니다. 이를 통해 생체 내 감염 연구 중 장 집락화에 대한 실시간 생물 발광 추적이 가능합니다.

생물발광 장출혈성 대장균 접종물의 제조

출처: de Vries, C. R. 외, 만성 Pseudomonas aeruginosa 상처 감염의 지연 접종 모델. J. Vis. 경험 (2020).이 영상은 생체 마우스 모델에서 박테리아 감염 진행을 모니터링하는 생물발광 영상 기법을 시연합니다. luxABCDE 리포터 시스템으로 설계된 병원성 박테리아는 감염 부위에서 빛을 방출하여 대사적으로 활발한 박테리아를 시각화할 수 있게 합니다. 쥐를 시간에 따라 영상화함으로써 연구자들은 비침습적으로 감염 역학을 추적하고 생물발광 신호 강도를 정량화할 수 있습니다.

쥐 박테리아 감염의 생물발광 영상

출처: Seman, B. G. 외 그람 음성 세균성 패혈증의 신생아 영상 모델. J. Vis. 경험 (2020)이 영상은 캡슐화된 생물발광 박테리아를 이용한 신생아 마우스 모델을 시연하여 전신 감염을 연구합니다. 신생아 새끼들은 고용량 또는 저용량 박테리아 현탁액을 주사한 후 산후 관리를 위해 어미에게 돌려보냅니다. 캡슐화된 박테리아는 조기 면역 검출을 피하고 전신적으로 퍼지며, 발광 영상을 통해 시간이 지남에 따라 시각화됩니다. 이 모델은 신생아 쥐에서 감염 진행을 비침습적으로 추적할 수 있게 합니다.

캡슐화된 생물발광 박테리아를 이용한 신생아 쥐 감염 모델링

출처: Valentine, M. E. 외, Pseudomonas aeruginosa 에서 인프레임 유전자 결실 돌연변이 생성과 감염 단순 마우스 모델에서의 병원성 감감 검사. J. Vis. Exp. (2020)이 영상은 생체 쥐 모델에서 박테리아 감염을 모니터링하기 위해 생물발광 기반 영상 기법을 시연합니다. 순차적 생물발광 및 X선 영상은 숙주 전역에 퍼진 감염을 실시간으로 시각화하고 해부학적 위치를 파악할 수 있게 합니다.

생물발광을 이용한 쥐 모델에서 박테리아 감염의 실시간 영상

출처: Luyts, N. 외. 생체발광 영상을 이용한 요로 감염 및 그 치료에 대한 종단 추적 관찰. J. Vis. 경험 (2021).이 영상은 방광에 주입된 생물발광성 대장균 을 이용해 쥐 모델에서 요로 감염을 유도하고 추적하는 과정을 시연하며, 박테리아의 부착, 침입, 세포 내 복제가 이루어집니다. 생물발광 오페론에서 방출되는 빛은 감염 진행 중 박테리아 부하를 실시간으로 측정하는 지표 역할을 합니다.

생물발광을 이용한 쥐 모델에서 요로 감염의 시각화

멀티 양상 이미징 작은 동물 모델에서 세균성 식민지 공부를위한 유용한 방법입니다. 이 프로토콜은 생물 발광과 생쥐의 감염을...

의 4D 좌석 Multimodality 이미징<em&gt; Citrobacter rodentium</em마우스에서&gt; 감염

이 원고는 생물 발광 이미징을 사용하여 세균 부하의 생체 내 분석에서 마우스의 요로 감염을 유도하기 위해 호화 요법 을 가진 비뇨기과 박테리아의 내막 투여를 설명합니다.

요로 감염의 세로 후속 및 생물 발광 이미징을 사용하여 마우스에서의 치료

조산(37주 분만)은 최적이 아닌 예방 및 치료 옵션이 있는 긴급한 글로벌 건강 문제&lt; 있습니다. 우리는 상행 질 세균 감염으로 인한 조산의 마우스 모델을 제시하고 그 결과 신생아 이환율과 사망률을 분석하는 방법을 간략하게 설명합니다.

마우스의 상승하는 질 감염, 조산 및 신생아 이환율 모델링

학습하세요 생체 발광 이미징을 이용하여 마우스에서 출혈성 대장균(EHEC) 식민지를 비침략적으로 검출하는 방법을. 이 기술은 살아있는 동물에서 실시간으로 세균 식민지를 모니터링하여 병원성 연구에 활용됩니다.

생물 발광 시스템 비-침략 적 비보에 의해 Murine 호스트에서 Enterohemorrhagic 대장균 식민지의 검출

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