Name: 마우스 Preimplantation 배아에서 줄기 세포 라인의 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: 배우세요 마우스 배반포 단계 배아에서 다능성 줄기 세포 라인을 유도하고 배양하는 효율적인 프로토콜을. 이 방법은 전통적인 방식보다 높은 유도 효율을 제공하여 재생의학 연구에 활용됩니다.

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피더 세포 배양, 동물 보호에 대 한 룸 Estabulari 드 라 UAB와 비디오를 기록 하기 위한 Domènec 마틴 그의 기술 지원에 감사 Jonatan 루카스 하 고. 이 작품 정부의 드 Economia y Competitividad AGL2014-52408-R 및 Generalitat 드에 의해 지원 되었습니다 카탈루냐 2014 SGR-524. MVC는 PIF UAB 장학금의 수혜자.

동물 및 Universitat Autònoma de 바르셀로나의 인간의 연구 윤리 위원회 및 Departament d 아래 섹션에서 설명 하는 동물의 사용 승인 되었습니다 &#39; 농업, Ramaderia, 낚시 나 Generalitat 드 Catalunya (프로토콜 #8741)의 Alimentació.
 1. 피더 셀 비활성화 및 스토리지 참고: 인간의 포 피 섬유 아 세포 (HFF-1) 이전 90% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 10% 디 메 틸 sulfoxide (구성 된 냉동 솔루션의 1 mL에 냉동 DMSO) 사용까지 액체 질소에 저장.
<ol><li>37 ° C 물 욕조에 유리병을 immersing 하 여 HFF-1 (1 mL)의 극저온 유리병을 녹여.</li>
	<li>미리 데워 진된 Dulbecco에 극저온 유리병의 해 동된 내용을 추가 &#39; s 수정이 글 &#39; s 매체 (DMEM) 10% 보충 FBS를 1:10 희석.</li>
	<li>T75 플라스 크에 희석된 세포 (10 mL) 씨 하 고 37 ° C, 5% CO 2 문화.</li>
	<li>다음날, DMSO 잔재를 제거 하는 매체를 변경 합니다. 매체를 제거 하 고 10% 보충 미리 따뜻하게 DMEM의 10 mL를 추가할 FBS.</li>
	<li>는 HFFs 문화 고 문화 confluent 단계를 도달할 때까지 모든 48 h 매체를 변경 합니다. 약 7 ~ 10 일 걸릴 수 있습니다.</li>
	<li>비활성화 솔루션을 준비, 미토마이신 C DMEM 10% 보충에 희석 FBS 10 µ g/mL의 최종 농도에. 37 ° C, 5% CO 2 3 h에 대 한 비활성화 솔루션 셀을 품 어.</li>
	<li>비활성화 솔루션을 제거 하 고 몇 번이 고 2 mL의 행 크 스 균형 소금 솔루션 (HBSS) 미토마이신 C 잔해 제거와 셀 린스.</li>
	<li>사 세포를 분리, 미리 데워 진된 트립 신-EDTA 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 37 ° C, 5% CO 2 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>관찰 들은 분리 되도록 거꾸로 현미경 세포 (0.3 수 가늠 구멍 또는 나 10 배 목표). 없는 경우, 37 ° C, 5% CO 2에서 몇 분 더 그들을 품 어. 다시 거꾸로 현미경 세포 검사.</li>
	<li>셀 덩어리를 분리 하기 위해 파스퇴르 피 펫과 솔루션을 플라스틱.</li>
	<li>DMEM 10 %FBS resuspend 보충의 4 mL를 추가 하 여 효소 솔루션을 무력화.</li>
	<li>세포 현 탁 액의 약 수를 받아 고 HBSS에 1: 100 희석. 셀의 수를 확인 하려면 로드 희석의 10 µ L를 Neubauer &#39; s 챔버. 거꾸로 현미경 (20 x 목표와 0.45 나) 챔버의 큰 사각형 중 하나에 있는 셀.
	<li>4 큰 사각형의 총에서 계산 반복 <ol>. N으로 세포 (N)의 총 수를 계산 셀의 평균 수 = 총 볼륨 희석 x 10 4 x x 계산.</li>
	</ol></li> <li>원심 200 x g. 삭제에서 5 분에 대 한 샘플의 나머지는 상쾌한 고 mL 당 10 6 세포의 농도에 솔루션을 동결와 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>약 10 6 셀 (1 mL) 각 극저온 튜브에서 정지 수. 냉동 컨테이너에 극저온 튜브를 놓고-80에서 동결 ° c.</li>
	<li>다음 날, 액체 질소에 극저온 튜브 저장.</li>
</ol> 2. 피더 세포 배양 <ol><li>파생 프로세스를 시작 하기 전에 1-4 일 재개 1 x 10 6을 포함 하는 극저온 유리병 비활성화 HFF-1 셀 37에서 물 욕조에 ° c.</li>
	<li>확인에 해 동된 HFF-1의 1:6 희석 사전 예 열 10 %FBS 37에 온도 유지 보완 DMEM ° c.</li>
	<li>돼지 피부에서 미리 데워 0.2% 젤라틴의 500 µ L 4-잘 접시의 모든 잘을 10 분 동안 37 ° C에서 접시를 유지</li>
	<li>우물에서 젤라틴의 500 µ L을 제거 하 고 HFFs 희석의 500 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 우물의 바닥에 HFFs의 균일 분배를 보장 하기 위해 접시 바위. 원형 움직임을 피하, 그렇지 않으면 셀 우물의 센터에 집중 합니다.</li>
	<li>접시 적어도 24 h에 각 잘 사 HFFs의 단층을 37 ° C, 5% CO 2를 품 어.</li>
	<li>다음날, 거꾸로 현미경 (10 X 목표와 0.3 나) 세포를 관찰 하 고 그들이 부착 되 고 균질 분산을 확인. DMSO 잔재를 제거 하는 매체를 변경 합니다. 매체를 제거 하 고 추가 10% 보충 미리 따뜻하게 DMEM의 500 µ L FBS.</li>
</ol> 3. 배아 수집 및 문화 <ol><li>4 일전 배아 컬렉션 관리 5 IU 임신 암 말의 &#39; s 6-12 주 오래 된 여성 쥐에 복 주사에 의해 혈 청 생식 샘 자극 호르몬. 
	참고: 다른 마우스 긴장에서 여성 사용할 수 있습니다 129S2 또는 B6CFAF1 긴장, 여성 사용 했습니다. 그럼에도 불구 하 고 때 매체 (예: CBA), 비-허용 긴장에서 여성 협력 한다으로 보충 2i 단계 4.2에서에서 설명 했 듯이.</li>
	<li>후 48 h, 복 주입, 인간 융 생식 샘 자극 호르몬의 5 IU를 관리 하 고 남성, 적어도 8 주 오래 된, 1:1 비율로 여성 친구. 다음 날은 남성에서 여성을 분리.</li>
	<li>배아 컬렉션, 전날 35 m m 세포 배양 4 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 보충 KSOMaag 매체의 여러 40 µ L 방울과 페 트리 접시를 준비 하 고 완벽 하 게 커버를 미네랄 오일 접시를 채우십시오. Equilibrate 매체를 37 ° C, 5% CO 2 접시를 품 어.</li>
	<li>배아 조작 펫을 준비 하 긴 밀고 유리 분 젠 버너를 사용 하 여 파스퇴르 피 펫의 얇은 부분을 열. 일단 부드러운, 불꽃에서 그것을 철회 하 고 떨어져 두 끝을 당겨. 원하는 길이에 그것을 휴식. 끝에 내경 100-150 µ m 이어야 한다.</li>
	<li>경부 전위 45-48 h 게시물-coitum (컴퓨터)에 의해 여성 쥐를 안락사.</li>
	<li>절단 곡선 부드럽게 날카로운가 위 피부 및 똑 바른 날카로운가 위 복 하 여 복 부 구멍을 노출 하는 쥐를 해 부. 집게와 함께 한 자 궁을 잡아, 바로 날카로운가 위를 사용 하 여 수 란 관을 잘라 고에 Hepes 버퍼 CZB 매체 (HCZB) 13 37 ° C. 반복 다른 수 란 관을 제거 하는 과정.</li>
	<li>1 mL 주사기 oviducts 로드 HCZB 플러시 시계 집게 2 셀 배아를 수집 하 여 장소에서 개최. 
	참고: 준비 물 내리는 바늘 걸릴 30 G 피하 주사, 결국, 잘라내어 거칠 돌에 무뚝뚝한 끝을.</li>
	<li>입 피 펫 장치를 사용 하 여, 배아를 선택, HCZB에 그들을 씻어 및 blastocyst 단계까지 37 ° C, 5% CO 2 이전 준비 배아 문화 접시에 그들을 문화. 50 배아까지 각 40 µ L 드롭에서 경작 될 수 있습니다. 배아 개발은 stereomicroscope 아래 모든 24 시간 모니터링. 
	참고: 또는, 배아 수집할 수 있습니다 체 외에서 배아 문화 단축 blastocyst 단계에서. 이 경우에, 3.5-4.5 시공 하루에 암컷을 안락사, 자 궁 해 부. HCZB와 플러시.</li>
</ol> 4. 줄기 세포 파생 <ol>배아 시드, 당일 <li>파생 판의 준비 <ol><li>100 µ M 2 β mercaptoethanol, 1과 DMEM 매체를 보완 하 여 파생 매체 준비 비-필수 아미노산 x 혈 청 교체, 및 10의 20 3 U/mL LIF.</li>
		<li>원하는 경우 또한 MEK 억제제 PD0325901의 1 개의 µ M와 3 추가 GSK3 억제제 2i 매체를 CHIR99021의 µ M.</li>
		<li>걸릴에서 사 HFFs (단계 2.6)의 단층와 함께 4-잘 접시는 인큐베이터입니다. 매체를 제거 하 고 각 음을 미리 데워 파생 매체의 800 µ L를 추가 합니다. 인큐베이터에 접시를 반환.</li>
	</ol></li> <li>Zona pellucida 제거 및 배아 시드 <ol><li>35 m m 세포 배양 신랄 한 Tyrode의 3 개의 30 µ L 방울과 페 트리 접시를 준비 &#39; 파생 매체의 s 솔루션 14 및 3 개의 30 µ L. 미네랄 오일 방울을 커버 하 고 37에서 요리를 계속 ° c.</li>
		<li>는 인큐베이터에서 배아 문화 접시를 가져가 라. 하나, 산 성 Tyrode에 문화 상품에서 전송 된 blastocysts &#39; s 솔루션 드롭 배아 조작 피 펫을 사용 하 여. 만약에 가능 하다 면, 유도 과정을 시작 하려면만 확장 된 blastocysts 선택.</li>
		<li>는 Zona pellucida 소화는 stereomicroscope에서 모니터링합니다. 최대한 빨리 zona pellucida 사라집니다, 파생 매체 드롭 산 성 Tyrode에 밖으로 세척 하기 위하여는 blastocyst 전송 &#39; s 솔루션.</li>
		<li>각 우물에는 인큐베이터와 씨 한 zona 무료 blastocyst 급지대에서 4-잘 파생 판 셀 걸릴.</li>
		<li>인큐베이터와 37 ° C, 5% CO 2 문화 4-잘 파생 판 돌아갑니다.</li>
	</ol></li> <li>모니터링 줄기 세포 성장 및 매체 변경 <ol><li>문화는 거꾸로 한 현미경 (20 X 목표와 0.45 나) 아래 모든 24 시간 모니터링. 부 어 굴절 세포 파생물을 둘러싼 또는 심지어 추진 피더 세포 옆으로 등 줄기 세포 분화의 흔적 인지 주의 하는 것이 중요 하다.</li>
		<li>다른 매일 문화 매체를 변경 합니다. 인큐베이터에서 4-잘 접시를가지고, 각 우물에서 매체를 제거 하 고 사용 하는 경우 미리 따뜻하게 파생 매체 LIF와 2i, 보충의 800 µ L를 추가 합니다. 문화 outgrowths (6-8 일)을 관찰 하는 때까지 유지.</li>
	</ol></li></ol> 5. 줄기 세포 배양 및 유지 보수 <ol><li>준비 Kolle 같은 핸들 및 줄기 세포 조작 펫. 따라 단계 내경 250-300 µ m. 끝으로 줄기 세포 조작 펫을 준비 하는 3.4 Kolle 같은 핸들을 준비 하 당겨진된 파스퇴르 피 펫의 다른 부분을 사용 합니다. 열 및 후크를 얻기까지 모양.</li>
	<li>는 인큐베이터에서 4-잘 문화 접시 고 아래는 stereomicroscope 파생물을 찾습니다. 핸들을 사용 하 여 차별화 된 세포와 지류 파생물을 둘러싸고 멀리 밀어. 
	참고: 파생물의 최종 분화를 피하기 위해, 그것은 파생물의 가장자리에서 모든 분화 된 세포를 제거 하는 것이 중요.</li>
	<li>줄기 세포 조작 피 펫으로 파생물을 발음 하 고 50 µ L 트립 신-EDTA 드롭에서 새로운 접시에 놓습니다.</li>
	<li>메스를 사용 하 여 기계적으로 그리고 효소 그것을 세분화 하기 위해 여러 부분에서 가지를 잘라.</li>
	<li>바로, 트립 신 행동을 무력화 파생 매체의 신선한 드롭으로 파생물 조각을 전송.</li>
	<li>지류의 단층으로 새로운 4-잘 접시에 파생물 조각 전송합니다. 잘 당 최대 10 조각을 전송 하 고 37 ° C, 5% CO 2 파생 매체와 문화.</li>
	<li>는 MESC 라인 설립을 고려 하기 전에 적어도 6 주 동안 줄기 세포와 같은 문화를 유지 합니다. 모든 다른 하루와 서브 컬쳐 매체를 변경 그들 일주일에 한 번.</li>
</ol>

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<li>Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+stem+cell+states%3A+naive+to+primed+pluripotency+in+rodents+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 155-169 (2016).</li>
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<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

MESC 선 파생 많은 실험실에서 일상적으로 사용 하는 잘 알려진 절차는, 비록 그 효율 항상 pluripotency 유지 보수를 방해할 수 있는 여러 요인으로 인해 예상 대로 높은 것은 아닙니다. 현재 문서에서 우리가 쇼, 단계적으로, 간단 하 고 신뢰할 수 있는 프로토콜을 사용 하 여 높은 효율성과 mESC 라인을 설정 하는 방법. 이러한 효율성은 문학에서 보고 된 것과 유사한.
최대 효율을 보장 하기 위해, 그것은 매일 셀을 제어 하는 것이 중요 또는 매일, 시간 이후 포인트 표시는 그냥 설명. 세포 죽음과 감 별 법이 추진 하 고 이후 식민지의 전면에 자라 난을 피하기 위해 필수적 이다. 그것은 또한 그들의 subculture 동안 식민지의 트립 신-EDTA에 노출 가능한 한 많이 감소 하는 것이 중요 때문에이 또한 세포 생존 능력을 줄일 수 있습니다.
또 다른 중요 요인은 피더 세포의 소스와 그들의 문화 이다. 여러 연구...

배아 줄기 세포 (ESC)는 만능 세포 자체 갱신 또는 특정 조건1에서 차별화 수 유지 preimplantation 배아에서 파생 된. 이러한 속성을 바탕으로, ESC 재생 의학, 질병 모델링 및 조직 공학 연구2에 대 한 유용한 도구가 되고있다.
ESC는 preimplantation 마우스 배아, 발생 하는 낮은 성공3,4마우스 ESC (mESC) 라인에서에서 처음으로 파생 되었다. 년, 파생 효율 낮은 pluripotency 시험관을 유지의 어려움 때문에 남아 있었다. 게다가 피더 세포5, 파생 효율성을 높여주는 존재 식민지 첨부 하 고 karyotypic 안정성6, 프로토콜 이어질 pluripotency 유지 보수 개선의 몇 가지 수정을 강화 합니다. 가장 중요 한 추가 백혈병 금지 요인 (LIF)의 mESC 문화 매체7,8, 129S2 허용 배경9 에서 배아의 사용 그리고 보충 매체와 mESC의 문화 정의 혈 청, 잠재적인 차별화 요인10의 무료. 더 최근에, 강력한 증거는 보이지 mESC 배양 (2i 라고도 함)에 신호 통로의 2 개의 작은 분자 변조기의 칵테일의 pluripotency를 유지 하기 위해 최고의. 칵테일 2i MEK 억제제 물질 활성화 한 단백질 키 니 아 제 (MAPK) 통로 억제 함으로써 차별화 신호를 감소, PD0325901 및 GSK3β 억제 물 CHIR99021, 낮은 농도에서 세포 생존을 향상의 조합 구성 Wnt 통로11활성화 하 여
현재 문서에서 우리는 효율적으로 mESC 라인 마우스 blastocysts에서 파생 하는 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 파생 매체 LIF와 혈 청 교체12보충에 피더 세포에 관대 한 긴장에서 배아를 배양 표준 절차를 따릅니다. 이 프로토콜, mESC 라인 효율성 2i 매체에서 그에 해당 된 파생 수 있습니다. 도 불구 하 고, 2i는 문제를 방지 하려면 가능한 pluripotency 유지 관리 또는 작업 비 관대 한 긴장을 할 때 추가할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1 mL 스라이통</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>309628</tr><tr><td>2-&beta;-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>4-well plate</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Acidic Tyrode's solution&nbsp;</td><td>집에서 만든</td><td></td><td>Nagy et al, 2003의 레시피를 참조하십시오. 단기 보관(최대 1개월)의 경우 4&ordm;C로 유지하고 장기 보관의 경우 -20&ordm;C로 유지합니다. 용액의 효율이 감소하면 HCl 1M의 작은 방울의 첨가물로 산성화해야 합니다.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488</td><td>분자 프로브 - Invitrogen</td><td>A-21200</td><td>1:500 희석. Oct4, Tuj1, &alpha;SMA 및 AFP 마우스 항체에 대한 2차 항체.&nbsp;</td></tr><tr><td>CHIR990212</td><td>축삭 메드켐&nbsp;</td><td>1386</td><td>1mM 원액을 얻기 위해 분말 1mg당 2.15ml DMSO로 재구성합니다. 원하는 부피로 분취하고 -20&ordm;C에서 보관하십시오.동결 및 해동 주기를 피하십시오.&nbsp;</td></tr><tr><td>CryoTube</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>3754518</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>41640</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>BioWest</td><td>L0107</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>BioWest</td><td>S1810</td><td>사용 전에 56°C에서 30분 동안 가열하여 비활성화합니다. 분취 및 -20°C에서 보관; C</td></tr><tr><td>플러싱 바늘</td><td>BD&nbsp;</td><td>304000</td><td>바늘 끝을 자르고</td></tr><tr><td>돼지 껍질에서 연마석 젤라틴</td>의 뭉툭한 끝으로 갈아서 <td>Fluka</td><td>48724</td><td>증류된 물에 0,2%로 희석하고 오토클레이브합니다. 각 희석액은 한 달 동안 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>염소 항 토끼 IgG, Alexa Fluor 594</td><td>분자 프로브 - Invitrogen</td><td>A-11037</td><td>1:500 희석. Sox2 토끼 항체에 대한 2차 항체.&nbsp;</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>BioWest</td><td>L0611</td><td></td></tr><tr><td>Hepes-buffered CZB&nbsp;</td><td>집에서 만든</td><td></td><td>See composition in Chatot et al, 1989</td></tr><tr><td>Human chorionic gonadotropin</td><td>Divasa-Farmavic</td><td>Veterin-Corion 3000 UI</td><td>50 IU / ml에서 NaCl 0.9 %로 희석. 1 ml에 Aliquot 및 -20&ordm에서 보관; C는 최대 2개월 동안 사용할 수 있습니다. 한 번 해동하면 다시 얼지 마십시오.&nbsp;</td></tr><tr><td>인간 포피 섬유아세포</td><td>ATCC</td><td>ATCCSCRC-1041</td><td>장기 보관을 위해서는 액체 질소에 보관하는 것이 좋습니다.</td></tr><tr><td>KnockOut 세럼 교체용</td><td>생명 기술</td><td>&nbsp; 10828-028</td><td>감광성. 10ml와 같은 소량으로 분주하고 -20°C에 보관하는 것이 좋습니다. C(만료 날짜 확인). 동결 및 해동 주기를 피하십시오.&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>KSOMaag Evolve</td><td>Zenith Biotech</td><td>ZEKS-050</td><td>보충제에는 4mg/ml BSA가 함유되어 있습니다. 37&ordm에서 평형; C 및 5% CO2는 사용 하루 전.</td></tr><tr><td>백혈병 억제 인자</td><td>Merk Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>생쥐&nbsp;</td><td>Charles River/Harlan</td><td></td><td>mESC 유도 측면에서 허용 균주(예: 129S2 또는 C57BL)의 마우스를 사용하는 것이 좋습니다. 그러나 근친 교배 균주는 배아를 생산하는 데 덜 효율적입니다. 따라서 하이브리드 활력을 활용하기 위해 129S2 x C57BL 또는 B6CBAF1와 같은 하이브리드 변형을 사용하는 것이 좋습니다.</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>Embryo 테스트 완료. 감광성.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Serva</td><td>2980501</td><td>0.5 mg/ml에 MilliQ 물로 분말을 재구성하십시오. 4&ordm에 저장하십시오; C는 빛으로부터 보호됩니다. 주의, 그것은 유해하고 암을 일으키는 것으로 의심됩니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>마우스 항 튜불린 &베타; III (Tuj1)</td> <td>Biolegend</td><td>MMS-435P</td><td>1:500 희석</td></tr><tr><td>마우스 단클론 항 알파, SMA</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td>1:200 희석</td></tr><tr><td>마우스 단클론 항 AFP</td><td>R & D 시스템</td><td>MAB1368</td><td>1:50 희석</td></tr><tr><td>마우스 단클론 안티 Oct3/4&nbsp;</td><td>산타 크루즈</td><td>Sc-5279</td><td>1:50 희석</td></tr><tr><td>비필수 아미노산</td><td>생명 기술</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Axon Medchem&nbsp;</td><td>1408</td><td>1mM 원액을 얻기 위해 분말 1mg당 2.08ml DMSO로 재구성합니다. 원하는 부피로 부분 표본을 만들고 -20°C에서 보관하십시오. 동결 및 해동 주기를 피하십시오.</td></tr><tr><td>페트리 접시 (35mm)</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 (60mm)</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>임산부의 혈청 성선 자극 호르몬</td><td>Foligon</td><td>Foligon-1000 UI</td><td>는 50 IU / ml에서 NaCl 0.9 %로 희석합니다. 1 ml에 그것을 분취하고 -20 &ordm에서 보관하십시오. C는 최대 2개월 동안 사용할 수 있습니다. 한 번 해동하면 다시 얼지 마십시오.&nbsp;</td></tr><tr><td>Rabbit policlonal anti-Sox2</td><td>Merck Millipore</td><td>AB5603</td><td>1:200 희석</td></tr><tr><td>T75 falcon</td><td>Thermo Scientific</td><td>130190</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 10x</td><td>BioWest</td><td>X0930</td><td>HBSS에서 1:10을 희석하여 1x 용액 얻기</td></tr></tbody></table>

마우스 preimplantation 배아에서 줄기 세포 라인의

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

마우스 배아 줄기 세포 (mESC) 파생은 만능 세포는 preimplantation 배아에서 설립 하는 과정입니다. 이 라인 자동 갱신 또는 특정 조건 하에서 분화 하는 능력을 유지 합니다. 이러한 속성으로 인해 mESC은 재생 의학, 질병 모델링 및 조직 공학 연구에 유용한 도구입니다. 이 문서는 피더 세포 백혈병 금지 요인으로 보충 하는 정의 된 매체에에 허용 마우스 긴장에서 blastocysts 경작 여 mESC 라인 높은 파생 효율성 (60-80%)을 얻기 위해 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜 파생 매체 (2i 매체)에 두 개의 작은 분자 억제제의 칵테일의 간단한 추가 의해 효율적으로 mESC 라인 비 허용 마우스 긴장에서 파생에 적용할 수 있습니다. 자세한 절차 준비 및 피더 세포, 수집 및 마우스 배아, 그리고 파생의 문화와 mESC 라인의 문화 문화에 제공 됩니다. 이 프로토콜 특수 장비가 필요 하지 않습니다 하 고 기본적인 포유류 세포 문화 전문 지식 가진 어떤 실험실에서 실시 될 수 있습니다.

이 프로토콜에 따라 이상 파생물 형성의 95% 달성 되어야 문화 (그림 1A)의 첫 번째 주 후. 6 구절 후 mESC 라인의 설립의 60-80% 평균 성공 실험적인 복제 사이 변수 이다. 2i 추가 크게 개선 되지 않습니다 결과 허용 마우스 변종, 129S2 배경 등을 작업할 때 하지만 작업 비 관대 한 긴장을 할 때 필요 합니다.
마우스 ESC 식민지 평면 모양으로 일반 형태를 제시 해야 하 고 치료 (그림 1B-C) 없이 교양 때 가장자리를 정의 또는 2i와 교양 (그림 1D). 식민지 제시 주변 차별화 표시 되어야 합니다 (그림 1...

이 문서는 효율적으로 파생 하 고 만능 마우스 배아 줄기 세포 라인 blastocyst 단계에서 문화 프로토콜을 설명 합니다.

마우스 Preimplantation 배아에서 줄기 세포 라인의

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

줄기세포는 장기적인 자기 재생 능력과 특정 조건에서 세 가지 배엽으로부터 분화된 세포를 생성할 수 있는 능력을 특징으로 하는 다능성 및 특수 세포입니다. 이러한 특성 덕분에 줄기세포는 재생 의학, 질병 모델링 및 동물 공학 분야에서 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 수년 동안 연구 목적으로 사용되는 배아줄기세포주는 주로 생쥐 배아에서 유도되었으나, 일반적으로 달성된 유도 효율은 낮았습니다.이 영상에서는 2i와 같은 신호 전달 경로 조절제를 사용했을 때 얻어지는 효율에 비견될 만큼 상당히 높은 유도 효율을 제공하는 표준 조건을 이용하여 마우스 배아줄기세포주를 유도하는 간단한 프로토콜을 소개합니다. 본 프로토콜에서는 ESC 유도 및 배양을 위한 공급세포(feeder cells)로 인간 포피 섬유아세포를 사용합니다. ESC 유도 과정을 시작하기 전에 공급세포를 불활성화하는 과정이 필요합니다.먼저, 액체 질소에 보관된 인간 포피 섬유아세포(human foreskin fibroblasts)가 들어있는 냉동 보관용 튜브를 꺼내, 37 °C의 항온수조에 담가 해동합니다. 해동 후, 소태아혈청(fetal bovine serum)이 첨가된 DMEM으로 내용물을 희석합니다. 희석액을 Falcon 플라스크에 접종하고, 세포가 합류(confluence) 단계에 도달할 때까지 배양합니다. 다음으로, 섬유아세포를 불활성화하기 위해 소태아혈청이 첨가된 DMEM에 mitomycin C를 희석하고, 이 불활성화 용액에서 세포를 3시간 동안 배양합니다.그 후, 불활성화 용액을 제거하고 Hanks'Balanced Salt Solution으로 세포를 세 번 헹구어 mitomycin C 잔여물을 제거합니다. 불활성화된 feeder 세포를 분리하기 위해 trypsin-EDTA 용액 1 mL를 첨가하고 세포를 5분 동안 배양합니다. 그 다음, 도립 현미경으로 세포를 관찰하여 배양 플라스크에서 세포가 잘 분리되었는지 확인합니다.그런 다음, 파스퇴르 피펫으로 세포를 피펫팅하여 세포 덩어리를 분리하고, 태아 송아지 혈청이 보충된 DMEM 4mL를 첨가하여 효소 용액을 중화합니다. 소량의 aliquot을 취해 식염수에 희석하고, Neubauer 챔버를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 이와 동시에 나머지 샘플을 원심 분리합니다.상층액을 제거하고, 펠렛을 동결 용액에 희석하여 최종 농도를 1,000,000 cells/mL가 되게 합니다. 현탁액을 동결 보존 튜브에 나누어 담습니다. 마지막으로, 동결 보존 튜브를 동결 용기에 넣어 -80 °C에 보관합니다. 다음 날, 액체 질소에 저장합니다.유도 과정을 시작하기 1~4일 전에, 액체 질소에 보관된 비활성화된 공급 세포(feeder cells) 크라이오튜브를 꺼내 37 °C 항온수조에서 해동합니다. 그다지, 태아 송아지 혈청이 첨가되어 미리 데워둔 DMEM에 세포를 희석하고, 부드럽게 파이펫팅하여 균일한 혼합물이 되도록 합니다. 4-웰 플레이트의 각 웰에 미리 데워둔 젤라틴 용액 500 µL를 넣고 37 °C에서 10분 동안 유지합니다. 그 직후, 각 웰에서 젤라틴을 제거합니다.각 웰에 희석된 피더 세포(feeder cells) 500 µL를 추가하고, 플레이트를 부드럽게 흔들어 피더 세포가 웰 바닥에 균일하게 분포되도록 합니다. 세포가 웰 중앙에 집중될 수 있으므로 원형으로 움직이는 것은 피하십시오. 그 다음, 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건의 인큐베이터에 넣고 최소 24시간 동안 배양합니다.다음 날, 도립 현미경으로 세포를 관찰하여 세포가 부착되어 있고 고르게 분포되었는지 확인합니다. 마지막으로, DMSO 잔여물을 제거하기 위해 공급층 세포(feeder cells)의 배지를 태아 송아지 혈청이 첨가되어 미리 가온된 DMEM으로 교체합니다. 배아 수집 전, 48시간 간격으로 5 IU의 임신마 혈청 성선 자극 호르몬(PMSG)과 인간 성선 자극 호르몬(hCG)을 복강 내 주사하여 마우스 암컷의 과배란을 유도합니다.암컷을 수컷과 교배시킨 후 24시간 뒤에 분리합니다. 2세포기 배아를 수집하기 위해, 교배 후 48시간 뒤에 암컷을 안락사시키고, 암컷 생쥐를 해부하여 수란관과 자궁각의 짧은 부분을 적출하여 HEPES 완충 CZB 배지가 담긴 디쉬에 넣습니다. 그 다음, 실체 현미경 하에서 HEPES 완충 CZB 배지로 수란관을 하나씩 세척하여 배아를 수집합니다.2세포기 배아를 전날 미네랄 오일로 덮인 배아 배양액 몇 방울을 떨어뜨려 준비한 배양 접시에 옮깁니다. 배아가 포배기 단계에 도달할 때까지 인큐베이터에서 배양합니다. 24시간마다 배아의 발달 상태를 관찰합니다.배아는 체외 배양 시작 후 48시간 뒤에 배반포 단계에 도달할 것으로 예상됩니다. 가능하다면, 유도 과정을 시작하기 위해 확장 배반포만을 선택하십시오. 배아 파종 당일에 줄기세포 유도를 위한 배지를 준비하십시오.2-beta-mercaptoethanol, 비필수 아미노산 및 KnockOut 혈청 대체제가 첨가된 DMEM에 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor, LIF)를 추가합니다. 필요에 따라 MAPK 억제제와 GSK-3 억제제를 추가하여 2i 배지를 조제합니다. 배양기에서 feeder 세포 단층이 형성된 4-well 플레이트를 꺼냅니다.배지를 제거하고, 새로 준비한 유도 배지 800 µL를 첨가합니다. 배아포를 피더 세포에 파종하기 전에 투명대를 제거해야 합니다. 이를 위해 배양 플레이트에서 배아 하나를 산성 Tyrode 용액 방울로 옮겨 투명대가 소화될 때까지 유지합니다.실체 현미경의 초점과 대비를 조절하여 투명대가 완전히 제거되었는지 확인하십시오. 그런 다음, 투명대가 제거된 배아를 여러 방울의 유도 배지로 헹구고 피더 세포 단층 위에 파종하십시오. 나머지 배아들에 대해 이 과정을 반복하십시오.플레이트를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 배양하십시오. 24시간마다 도립 현미경으로 배양 상태를 관찰하여 성장을 평가하고, 증식 부위 주변에 굴절률이 높은 부푼 세포가 나타나거나 피더 세포를 밀어내는 것과 같은 초기 분화 징후가 있는지 확인하십시오. 배양액은 격일로 교체하십시오.이를 위해, 인큐베이터에서 4웰 플레이트를 꺼내어 각 웰의 배지를 제거하고, LIF 및 (사용하는 경우) 2i가 보충된 예열된 유도 배지 800 µL를 추가합니다. 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣고, 아웃그로스(outgrowth)가 관찰될 때까지 배양을 유지합니다. 포배 seeding 후 6~8일이 지나면 아웃그로스가 관찰되어야 하며, 이때 계대 배양을 수행해야 합니다.이 절차를 위해서는 컬(cull) 형태의 핸들과 줄기세포 조작용 피펫이 필요합니다. 이를 제작하려면, 팁이 긴 파스퇴르 피펫을 준비하여 분젠 버너를 이용해 가느다란 부분을 가열합니다. 피펫이 부드러워지면 불꽃에서 떼어낸 뒤, 두 끝을 양옆으로 잡아당겨 분리될 때까지 늘려줍니다.더 굵은 부분을 줄기세포 조작 피펫으로 사용하십시오. 더 가는 부분의 끝을 가열하여 갈고리 모양이 될 때까지 성형함으로써 cull 형태의 핸들을 준비합니다. 자라난 세포(outgrowth)를 계대 배양하려면, 실체 현미경 하에서 해당 위치를 찾으십시오.핸들을 사용하여 돌출부 주변의 분화된 세포들을 밀어냅니다. 추후의 분화를 방지하기 위해 돌출부 가장자리에서 분화된 세포를 제거할 때 철저하게 수행하는 것이 중요합니다. 줄기세포 조작 피펫을 사용하여 돌출부를 흡입한 후, 미리 데워둔 trypsin-EDTA 용액 한 방울에 넣습니다.메스를 사용하여 증식물을 여러 조각으로 절단하여 기계적 및 효소적으로 분리합니다. 증식물 파편을 회수하여 미리 데워둔 유도 배지 한 방울에 넣어 트립신의 작용을 중화시킵니다. 마지막으로, 증식물 파편을 피더 세포 단층이 있는 4-웰 플레이트에 접종하고 37 °C, 5% carbon dioxide 조건의 유도 배지에서 배양합니다.ESC 라인이 확립된 것으로 간주되기 전까지 줄기세포 유사 배양물은 최소 6주 동안 유지되어야 합니다. 이 기간 동안 이틀마다 배지를 교체하고 일주일에 한 번씩 계대 배양하는 것이 필요합니다. 계대 횟수가 증가함에 따라 콜로니의 형태는 점차 돔 모양에서 더 길고 납작한 형태로 변화합니다.6회 계대 배양 후, 마우스 ESC 라인은 Oct 4 및 Sox 2와 같은 다능성 마커를 지속적으로 발현합니다. 또한, feeder cell 없이 10% fetal bovine serum이 첨가된 DMEM에서 배양하여 ESC의 인비트로(in vitro) 분화를 유도하면, 세 가지 배엽을 대표하는 분화 마커를 면역형광법으로 검출할 수 있습니다. 여기서는 외배엽 마커로서 anti-tubulin beta-3 단백질을, 중배엽 마커로서 alpha-smooth muscle actin을, 그리고 내배엽 마커로서 alpha-fetoprotein의 검출 방법을 보여줍니다.이 간단한 절차를 따르면 60%에서 78% 사이의 효율로 생쥐 배반포에서 배아줄기세포를 유도할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 여기에 제공된 타이밍은 예시일 뿐이므로 매일 또는 이틀에 한 번씩 세포를 관리하는 것이 중요합니다. 배아줄기세포 콜로니가 과성장하면 세포 축적으로 인해 색이 더 어두워지며 더 쉽게 분화되는 경향이 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면 표준 조건을 이용한 생쥐 배아줄기세포 유도 및 배양에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 프로토콜 세부 마우스 배아의 줄기 세포 (ESC)와 lethally 조사받는 마우스에 그들의 이후의 주입에서 transplantable 조혈 줄기 세포의 유도. 간단히, ESC는 다음 retroviral HoxB4 및 OP9 stromal 세포와 조혈 크린 시토킨 공동 양식에 감염된 embryoid 단체로 구별됩니다.

Murine 배아 줄기 세포로부터 조혈 줄기 세포의 유도

자기 갱신과 신체의 모든 세포 유형으로 차별화하는 인간 배아 줄기 세포의 능력은 그들이 모두 의료 어플 리케이션을위한 개발과 질병의 근본적인 질문을 해결하기위한 연구 도구로 큰 약속을 개최하는 것이 좋습니다. 여기서 우리는 내부 세포 질량 immunosurgical 절연에 의해 배아에서 인간 배아 줄기 세포의 유도에 대한 간결한, 단계별 절차를 제공합니다.

Immunosurgery에 의해 인간 배아 줄기 세포의 유도

초기 개발 단계 동안 원시 종자 세포로 차별화하는 배아 새싹 세포의 능력은 암, 불임에 관한 우리의 가설을 해결하기 위해 완벽한 모델​​입니다. 이 프로토콜은 10.5-11.5 일 게시 coitum 마우스 배아의 개발 생식선에서 원시 종자 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다.

절연 및 마우스 배아 새싹 세포의 유도

이 비디오에서는, 우리는 마우스 blastocysts의 고립과 blastocysts에서 trophoblast의 줄기 세포의 유도를 보여줍니다. 우리는 또한 줄기 세포 속성의 유지 보수뿐만 아니라 문화에 분화의 유도에 대한 조건을 설명합니다.

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성인 마우스에서 spermatogonial 줄기 및 전구 세포 라인을 도출하고 유지하는 간단한 방법은 여기 제공됩니다. 방법은 성인 마우스 testis의 체세포 구획에서 발생하는 피더 세포를 활용합니다. 이 기술은 유전자 변형, 노크 - 아웃 등의 일반적인 마우스 변종에 적용하고, 똑 -의 생쥐.

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최근 몇 년 동안 체외 배양 방법에서 사용하는 생식 세포의 형성은 체세포 줄기 세포의 여러 가지 유형을 사용하여 증명되었습니다. 이 문서에서는 시각적으로 초기 난 모세포 - 유사 세포로 신생아 마우스 유래 줄기 세포의 분화를 발표 할 예정이다.

세균과 같은 세포로 신생아 마우스 피부 유래 줄기 세포의 분화<em&gt; 체외</em

마우스 배아 줄기 세포는 OP9-DL1 공동 배양 시스템을 사용하여 in vitro에서 T 세포로 분화할 수 있습니다. 이 절차를 성공적으로 수행하려면 시약/세포 유지 관리 및 주요 기술에 민감한 단계에 세심한 주의를 기울여야 합니다. 여기에서는 이러한 중요한 매개변수에 대해 논의하고 이 기술의 채택을 장려하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

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이 프로토콜은 마우스 착상 전 배아 계통 명세서를 연구하는 단백질 발현의 정량적 분석 시츄, 단일 셀을 수행하는 방법을 제시한다. 포배의 수집에 필요한 절차, 단백질의 면역 검출을 전체 마운트, 공 초점 현미경, 핵 세분화 및 이미지 분석에 샘플 영상은 설명한다.

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

이 문서는 반 복제 배아의 건설을 위한 정액을 대신하기 위하여 parthenogenetic haploid 배아 줄기 세포의 사용을 입증하는 것을 작정입니다.

정자의 대체로 마우스 파르테노유전학 Haploid 배아 줄기 세포의 응용 프로그램

배우세요 마우스 배반포 단계 배아에서 다능성 줄기 세포 라인을 유도하고 배양하는 효율적인 프로토콜을. 이 방법은 전통적인 방식보다 높은 유도 효율을 제공하여 재생의학 연구에 활용됩니다.

마우스 Preimplantation 배아에서 줄기 세포 라인의

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