Vivo에서 복합 이미징 및 마우스 레이저 유도 안 Neovascularization 모델의 분석

신생혈관 형성 과정은 여러 흔한 안과 질환의 특징적인 모습입니다. 가장 대표적인 예로 삼출성 연령 관련 황반변성(또는 줄여서 습성 AMD), 증식성 당뇨망막병증, 미숙아 망막병증 등이 있습니다. 이러한 질환들은 전 세계적으로 법적 실명의 대부분을 차지하며, 유리체 출혈 및 신생혈관성 녹내장과 같은 추가적인 안과적 합병증과 연관되어 있습니다.

하지만 이러한 질환들이 매우 흔함에도 불구하고, 안구 신생혈관 질환에 대한 치료 옵션은 제한적입니다. AMD 및 증식성 당뇨망막병증과 관련된 신생혈관 형성에 대한 현재의 표준 치료법은 혈관 신생 및 신생혈관 형성의 핵심 매개체인 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor) 또는 VEGF를 표적으로 하는 인간화 항체의 유리체 내 주사입니다. 그러나 질병의 진행을 억제하고 기능적 시력을 개선하는 효능에도 불구하고, 유리체 내 주사는 비용이 많이 들며 위험성이 완전히 없지는 않습니다.

합병증으로는 감염, 내안구염, 망막 박리 및 안구 출혈 등이 포함될 수 있습니다. 따라서 효능이 뛰어나고 안전하며 비용 효율적인 새로운 치료 옵션의 개발이 시급합니다. 신생혈관 질환의 약물 개발을 진전시키기 위해서는 소동물 모델이 매우 중요합니다.

이러한 모델은 재현 가능해야 하며, 확립되고 검증된 판독값 및 종말점을 가져야 하고, 이상적으로는 양성 대조군 역할을 할 임상적으로 관련 있는 참조 화합물을 사용해야 합니다. 본 프로토콜에서는 CNV의 병태생리학적 기전 연구와 새로운 항신생혈관 제제 개발 모두에 가장 흔히 사용되는 모델 중 하나인 마우스 맥락막 신생혈관, 즉 CNV 모델을 제시하겠습니다. CNV 모델에서는 아르곤 레이저를 사용하여 브루크막(Bruch's membrane)을 파열시킵니다.

이를 통해 맥락막에서 기원하는 신생혈관 형성 과정이 시작됩니다. 분광 영역 광간섭 단층촬영(SD-OCT)을 이용한 종단적 생체 내 영상 촬영과 형광안저혈관조영술을 활용하면 CNV의 증식과 퇴행 과정을 추적할 수 있습니다. 이를 통해 새로운 약물 중재법의 효능과 시간적 경과를 평가할 수 있습니다.

최근의 영상 처리 기술의 발전은 망막 두께 측정을 위한 자동 분할을 가능하게 하여, 연구자의 편향 없이 부종의 존재 여부를 평가할 수 있는 방법론을 제공합니다. 본 논문에서는 마우스 CNV 모델에서 망막 층의 자동 분할을 위한 Leica Microsystems의 새로운 InVivoVue Diver 소프트웨어의 유용성에 대해 논의하겠습니다. 마지막으로, 망막 전체 마운트의 조직학적 분석이 이 모델에서 종단적 생체 내 영상 촬영을 어떻게 보완할 수 있는지 논의하겠습니다.

동공 확장을 위해 각 눈에 트로피카미드 한 방울을 점안합니다. 그 후, 동물을 설치류 정렬 스테이지에 조심스럽게 배치합니다. 눈이 노출되도록 마우스를 조정한 뒤, 코 홀더와 등 위에 조심스럽게 붙인 실험용 테이프를 사용하여 고정합니다.

다음으로, 보습을 위해 안구에 윤활제를 한 방울 도포하고, 거름종이 면봉을 사용하여 과잉 액체를 조심스럽게 제거합니다. 마지막으로, 기저선 OCT 영상을 촬영하기 위해 스테이지를 OCT 장치 앞에 맞춥니다. 레이저 조사 전, 망막에 이상이 없는지 확인하기 위해 기저선에서 in vivo spectral-domain 광간섭 단층 촬영 영상을 획득합니다.

홀더에서 마우스를 조심스럽게 꺼냅니다. 각막을 평평하게 하기 위해 커버 슬립 위에 Viscotears Gel 한 방울을 떨어뜨립니다. 시신경 유두가 중심에 오도록 마우스의 방향을 잡고, 레이저 빔을 망막 색소 상피에 맞춥니다.

시신경 주위의 4시, 8시, 12시 방향에서 망막 혈관을 피하여 세 번의 레이저 조사를 수행합니다. 모든 레이저 조사가 끝난 후 안구의 견고함을 확인하여 망막 출혈이 없는지 점검합니다. 이전과 마찬가지로 마우스를 홀더에 정렬시키고, 플루오레세인 혈관 조영술과 OCT 영상을 촬영하여 브루크막(Bruch's membrane)의 손상 여부를 확인합니다.

형광 안저 혈관 조영술을 위해, 먼저 적외선 반사 모드를 사용하여 레이저 조사 부위에 초점을 맞춥니다. 이 모드를 통해 레이저가 투여된 위치를 시각화할 수 있습니다. 마우스의 눈 위치를 변경하지 않은 상태에서, 마우스 체중 20g당 약 0.1mL의 5% fluorescein sodium salt를 조심스럽게 주입합니다. 약 30초 간격으로 맥락막 수준과 망막 수준에서 형광 안저 혈관 조영 이미지를 촬영하기 시작합니다.

이전과 동일하게 OCT 촬영을 위해 안구를 정렬하고 촬영을 시작합니다. 이 시퀀스에서 보여주는 것과 같이 SD-OCT 신호를 평균화하면 상세한 망막 형태를 더 잘 시각화하는 데 도움이 됩니다. SD-OCT 촬영이 완료되면 홀더에서 마우스를 조심스럽게 제거하십시오.

양쪽 눈에 윤활제를 도포합니다. 이때 medetomidine의 alpha-2 길항제인 atipamezole을 피하 주사하여 마취를 역전시키거나, 동물이 마취에서 회복될 때까지 기다릴 수 있습니다. 마취된 동물을 대상으로 5일, 10일 및 14일째 추적 관찰일에 in vivo SD-OCT 및 FA 영상 촬영을 반복합니다.

망막 두께 측정을 위해 InVivoVue Diver 소프트웨어의 자동 분할 기능을 사용하십시오. 건강한 망막의 경우, 총 망막 두께는 신경 섬유층부터 망막 색소 상피(RPE)까지 모든 층의 두께로 간주됩니다. 이 예시에서 볼 수 있듯이, 건강한 망막에서는 자동 분할 기능을 통해 개별 망막 층을 정확하게 검출할 수 있습니다.

CNV가 존재하는 부위에서는 각 CNV 병변 부위에 대해 망막 두께를 개별적으로 수동 측정해야 한다는 점에 유의하십시오. 측정은 신경섬유층부터 RPE 층을 통과하는 가상선까지 수행합니다. 이 시퀀스는 CNV 병변이 있는 부위에서 수동 두께 측정을 수행하는 작업 흐름을 보여줍니다.

이미지의 상단에는 신경섬유층이, 하단에는 맥락막이 위치합니다. 마우스나 터치패드를 사용하여 신경섬유층과 맥락막의 경계를 수동으로 지정하면, 소프트웨어가 이 좌표를 기반으로 전체 망막 두께를 자동으로 계산합니다. 이 그림은 맥락막 수준에서 20초 간격으로 촬영한 연속 영상을 보여줍니다.

이미지 1은 적외선 반사 모드로 획득되었습니다. 그 외의 이미지들은 복강 내로 플루오레세인을 주입한 후 획득되었습니다. 이미지 1의 흰색 화살표는 레이저 조사 부위를 가리키며, 이 부위들은 이미지 18의 흰색 화살표로 강조된 바와 같이 이후 시점에서 플루오레세인 누출을 보입니다.

이 이미지는 망막 수준에서 획득한 FA 연속 영상을 보여줍니다. 이미지 18의 흰색 화살표는 레이저 조사 부위를 가리키며, 이는 이미지 18에서 원으로 표시된 다른 두 부위보다 형광색소 누출이 더 빠르게 나타남을 보여줍니다. 이 요약 그림은 SD-OCT 영상의 시간 경과를 나타냅니다.

기초 단계, 레이저 조사 직후, 그리고 5일, 10일, 14일째의 추적 관찰 시점에 측정합니다. 요약하자면, SD-OCT 및 FA 영상을 이용한 CNV 병변의 종단적 생체 내 영상 촬영 프로토콜을 통해 CNV 병리학적 상태와 망막 부종의 존재 여부를 빠르고 다각적이며 신뢰성 있게 분류할 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사합니다.