Vivo에서 복합 이미징 및 마우스 레이저 유도 안 Neovascularization 모델의 분석

여기, 선물이 쥐에서 안 neovascularization 레이저 유도의 형태학 변화의 후속에서 경도 vivo에서 화상의 유용성.

신생혈관 돌기는 널리 퍼진 몇 가지 안구 병리학의 특징적인 특징입니다. 가장 두드러진 것은 삼출성 연령 관련 황반변성 또는 짧게 인한 습성 AMD, 증식성 당뇨병성 망막병증 및 미숙아 망막병증입니다. 이러한 질환은 전 세계적으로 법적 실명 사례 대부분을 차지하며 유리체 출혈 및 신생혈관 녹내장과 같은 추가적인 안구 합병증과 관련이 있습니다.

그러나 유병률에도 불구하고 안구 신생혈관 질환에 대한 치료 옵션은 제한적입니다. AMD 및 증식성 당뇨병성 망막병증과 관련된 신생혈관형성에 대한 현재 치료 표준은 혈관신생 및 신생혈관형성의 중요한 매개체인 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)에 대항하는 인간화 항체의 유리체강내 주사입니다. 그러나 질병의 진행을 멈추고 기능적 시력을 개선하는 효능에도 불구하고 유리체강내 주사는 비용이 많이 들고 위험이 없는 것과는 거리가 멉니다.

합병증으로는 감염, 안구내염, 망막 박리, 안구 출혈 등이 있습니다. 따라서 효과적이고 안전하며 비용이 적게 드는 새로운 치료법의 개발이 시급합니다. 신생혈관 질환에 대한 약물 개발을 진전시키기 위해서는 소동물 모델이 매우 중요합니다.

이러한 모델은 재현 가능해야 하고, 판독 및 종말점을 설정 및 검증해야 하며, 이상적으로는 양성 대조군 역할을 하기 위해 임상적으로 관련된 참조 화합물을 사용해야 합니다. 이 프로토콜에서는 CNV에 기여하는 병태생리학적 메커니즘 연구와 새로운 항신생혈관제 개발 모두에 가장 일반적으로 사용되는 모델 중 하나인 마우스 맥락막 신생혈관 형성 또는 CNV 모델을 제시합니다. CNV 모델에서 Bruch의 멤브레인은 아르곤 레이저를 사용하여 파열됩니다.

따라서 맥락막에서 비롯된 신생혈관 과정이 시작됩니다. 스펙트럼 도메인 광간섭 단층촬영(SD-OCT)과 플루오레세인 혈관 조영술에 의한 종단 생체 내 이미징을 사용하면 CNV의 증식 및 퇴행을 추적할 수 있습니다. 따라서 새로운 제약 개입의 효능과 시간 경과를 평가합니다.

또한 최근 이미지 처리의 발전으로 망막 두께 측정을 위한 자동 분할이 가능해졌으며, 부종의 존재를 평가하기 위해 연구자 편향이 없는 방법론을 제공할 수 있게 되었습니다. 여기에서는 마우스 CNV 모델에서 망막층의 자동 분할을 위한 Leica Microsystems의 새로운 InVivoVue Diver 소프트웨어의 유용성에 대해 설명합니다. 마지막으로, 망막 전체 마운트의 조직학적 분석이 이 모델에서 종적 in vivo 이미징을 어떻게 보완할 수 있는지에 대해 논의할 것입니다.

동공 확장을 위해 트로피카마이드 한 방울을 각 눈에 한 방울 떨어뜨립니다. 그 후, 동물을 설치류 정렬 단계에 부드럽게 놓습니다. 마우스는 눈이 노출되도록 조정되고 코 홀더와 등에 부드럽게 놓인 실험실 테이프 조각을 사용하여 고정됩니다.

다음으로, 윤활제 한 방울을 눈에 바르고 수분을 공급하고 여분의 액체는 여과지 면봉을 사용하여 조심스럽게 제거합니다. 마지막으로, 스테이지는 기준선 OCT 이미징을 위해 OCT 장치 앞에 정렬됩니다. In vivo spectral-domain Optical Coherence Tomography 이미징은 망막 이상이 없는지 확인하기 위해 레이저 적용 전에 베이스라인에서 수행됩니다.

홀더에서 마우스를 부드럽게 제거합니다. Viscotears 젤 한 방울을 커버 슬립에 떨어뜨려 각막을 닦습니다. 시신경 머리가 중앙에 오도록 마우스를 향하게 하고 레이저 빔을 망막 색소 상피에 초점을 맞춥니다.

시신경 주위의 4시, 8시, 12시 위치에 있는 망막 혈관을 피하여 레이저 샷을 세 번 쏜다. 모든 레이저 촬영 후 눈의 탄력 상태를 검사하여 망막 출혈이 없는지 확인하십시오. 이전과 마찬가지로 마우스를 홀더에 정렬하고 플루오레세인 혈관 조영술 및 OCT 이미징을 수행하여 Bruch의 멤브레인 손상을 확인합니다.

플루오레세인 혈관 조영술의 경우, 먼저 적외선 반사 모드를 사용하여 레이저 화상 부위에 초점을 맞추고, 이를 통해 레이저가 투여된 부위를 시각화할 수 있습니다. 마우스의 눈 위치를 변경하지 않고 약 20g의 마우스 체중에 대해 0.1ml의 5%플루오레세인 나트륨 염을 조심스럽게 주입합니다. 맥락막 수준과 망막 수준에서 약 30초마다 플루오레세인 혈관 조영술 이미지를 촬영하기 시작합니다.

이전과 같이 OCT 이미징을 위해 눈을 정렬하고 이미징을 시작합니다. SD-OCT 신호의 평균을 구하면 이 시퀀스에서 볼 수 있듯이 상세한 망막 형태를 더 잘 시각화하는 데 도움이 됩니다. SD-OCT 이미징이 수행되면 홀더에서 마우스를 조심스럽게 제거합니다.

양쪽 눈에 윤활제를 바르십시오. 이 시점에서 메데토미딘, 아티파메졸에 대한 알파-2 길항제의 피하 주사로 마취를 역전시키거나 마취에서 동물이 회복될 때까지 기다릴 수 있습니다. 추적 관찰 5일, 10일, 14일에 마취된 동물에서 생체 내 SD-OCT 및 FA 이미징을 반복합니다.

망막 두께를 측정하기 위해 InVivoVue Diver 소프트웨어의 자동 세분화 기능을 사용하십시오. 건강한 망막의 경우, 총 망막 두께는 신경 섬유층에서 RPE에 이르는 모든 층의 두께로 간주됩니다. 건강한 망막에서 자동 분할은 이 예에서 볼 수 있듯이 개별 망막층을 정확하게 감지할 수 있습니다.

CNV가 존재하는 곳에서는 각 CNV 병변 부위에 대해 개별적으로 망막 두께를 수동으로 측정해야 한다는 점을 언급할 필요가 있습니다. 신경 섬유층에서 RPE 층을 통과하는 가상의 선까지. 이 시퀀스는 CNV 병변이 있는 부위에서 수동 두께 측정을 위한 작업 흐름을 보여줍니다.

신경 섬유층은 이미지의 맨 위에, 맥락막은 맨 아래에 있습니다. 마우스 또는 터치패드를 사용하여 신경 섬유층과 맥락막의 경계가 수동으로 결정되고 소프트웨어는 이러한 좌표를 기반으로 총 망막 두께를 자동으로 계산합니다. 이 그림은 맥락막 수준에서 20초마다 촬영된 연속 이미지를 보여줍니다.

이미지 1은 적외선 반사 모드에서 획득되었습니다. 다른 사람들은 복강내 플루오레세인 주사 후. 이미지 1의 흰색 화살표는 레이저 부위를 가리키며, 이는 이미지 18의 흰색 화살표로 강조 표시된 이후 시점에서 플루오레세인 누출을 보여줍니다.

이 이미지는 망막 수준에서 획득한 FA 연속 이미징을 보여줍니다. 이미지 18의 흰색 화살표는 레이저로 촬영된 부위를 가리키며, 이는 플루오레세인 누출이 이미지 18에서 원으로 표시된 다른 두 개보다 더 빠르게 나타나는 것을 보여줍니다. 이 요약 그림은 SD-OCT 이미지의 시간 경과를 보여줍니다.

기준선에서, 레이저 촬영 직후, 그리고 후속 시점은 5일, 10일, 14일째입니다. 요약하면, SD-OCT 및 FA 이미징을 사용하여 CNV 병변의 종단 생체 내 이미징을 위한 프로토콜은 CNV 병리학 및 망막 부종의 존재를 빠르고 다양하며 신뢰할 수 있는 분류를 가능하게 합니다. 관심을 가져 주셔서 감사합니다.