Name: Vivo에서 복합 이미징 및 마우스 레이저 유도 안 Neovascularization 모델의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 학습하세요 마우스 레이저 유도 맥락막 신생혈관화 모델에서 SD-OCT와 형광안저촬영을 활용한 생체 내 복합 이미징 방법을. 이 기술은 망막 병리 진행을 추적하고 항혈관신생 치료제 효능을 평가하는 데 활용됩니다.

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저자 우수한 기술과 videographic 지원 율리야 Naumchuk (Loyola 대학 시카고)와 아 그네 Žiniauskaitė (Experimentica 주식 회사)를 감사 하 고 싶습니다. Kaja 박사 연구 프로그램 박사 존 P.와 써 리 E. Mulcahy 부여 교수 Loyola 대학 시카고에 안과에 의해 지원 됩니다.

모든 동물 ARVO 문을 따라 동물에 대 한 사용의 안과 및 비전 연구 및 동물 실험에 대 한 EC 지침 86/609/EEC 승인 및 핀란드의 동물 실험 보드에 의해 모니터링 프로토콜을 사용 하 여 치료를 받았다.
1. 레이저 유도 마우스 CNV 모델 5
<ol><li>거시적 어떤 이상에 대 한 동물의 눈을 검사 합니다.</li>
	<li>마우스 무게.</li>
	<li>계산 하 고 동물, 예를 들면 medetomidine (1 mg/kg), 케 타 민 (75 mg/kg), 그리고 1:1.5:2.5, 또는 마 취 제 (40-75 mg/kg)의 비율 (0.9 %NaCl 용액) 증류수의 혼합물의 무게에 따라 사용, 마 취약의 적절 한 금액을 준비 xylazine (5 mg/kg), 그리고 1:2.; 5: 1의 비율로 증류수 (0.9 %NaCl 용액) 20 g 마우스에 대 한 혼합물의 0.1 mL를 주사.</li>
	<li>Intraperitoneally 마 취 제를 주사.</li>
	<li>동물 마 취 때까지 감 금 소 및 대기에 다시 마우스를 놓습니다. 마우스는 제대로 페달 반사의 부족에 의해 anesthetized 확인 합니다.</li>
	<li>레이저 안전 개인 보호 장비를 사용 하 여를 확인 합니다.</li>
	<li>슬릿 램프와 532 nm 다이오드 레이저를 켭니다.</li>
	<li>감 금 소 및 난방 패드에 장소에서 마우스를 제거 합니다.</li>
	<li>동 공 팽창에 대 한 Tropicamide의 한 방울을 적용 합니다. 전체 (3 mm) 동 공 팽창에 대 한 3-5 분을 기다립니다.</li>
	<li>슬릿 램프의 단계에 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>Applanate 각 막에 coverslip에 opthalmic 액체 젤의 한 방울을 배치 합니다.</li>
	<li>마우스 눈을 센터에 시 신경 머리의 방향을 정하십시오.</li>
	<li>100 레이저 전원 설정 mW, 100 ms, 기간 및 50 μ m 스팟 사이즈.</li>
	<li>망막 안료 상피 (RPE)에 레이저 빔을 초점.</li>
	<li>각각 4, 8, 및 12 시 시 신경 주위에 위치에 이상적으로 망막 혈관을 피하 여 레이저 촬영 한 눈에 확인 합니다. 모든 레이저 망막 출혈의 부재에 대 한 촬영 후 눈의 저를 검사 합니다. Contralateral 눈 비에서 컨트롤 역할을 합니다.</li>
	<li>다시가 열 패드에 coverslip 및 장소 마우스를 삭제 합니다.</li>
	<li>두 눈에 한 방울 못 젤 방울을 적용 합니다.</li>
</ol>2. SD-10 월 6,7
<ol><li>설치류 맞춤 단계에 마우스를 놓고 머리를 고정 합니다.</li>
	<li>Vivo에서 이미징 X 및 Y 단계 컨트롤러를 사용 하 여 SD 10 월 시스템 (예를 들어, Bioptigen/Leica Envisu R2200) 얼굴 눈의 렌즈를 맞춥니다.</li>
	<li>Bruch의 막의 휴식을 확인 하기 위해 SD 10 월 검사: 일단 SD-10 월 전체 눈 검사, 수동으로 이동할 참조 라인 lasered 사이트. Bruch의 막의 나누기에서 영역 ( 그림 1참조)에 명확 하 게 볼 수 있어야 합니다.</li>
</ol>3. fluorescein 제품은 7,,89
<ol><li>홀더, 마우스를 제거 하 고 (예를 들어, 하이델베르크 Spectralis HRA2) FA 시스템에 그것을 배치.</li>
	<li>레이저에 초점 적외선 반사율 모드를 사용 하 여 보기 창 중간에 시 신경의 머리와 눈의 저 분야를 구울.</li>
	<li>피하 또는 intraperitoneally 5 %fluorescein 나트륨 소금 20 g 마우스에 대 한 0.1 mL를 주사.</li>
	<li>안 수준에 초점을.</li>
	<li>안 초점 수준에서 이미지를 가져가 라.</li>
	<li>다시 망막 수준에 집중 하 고 이미지를 가져가 라.</li>
	<li>30 s 및 반복 단계 3.4-3.6 기다립니다.</li>
	<li>소유자에서 마우스를 제거 하 고 난방 패드에 그것을 배치.</li>
	<li>Α2-medetomidine, atipamezole (0.5 mg/kg, i.p.), 또는 마 취에서 동물 복구에 대 한 대기에 대 한 적으로 마 취를 반대로.</li>
	<li>반복 에서 vivo SD 10 월 및 FA 이미징 마 취 동물에 후속 일 5, 10, 14에.</li>
</ol>4. CNV 등급
<ol><li>학년 10 월 이미지와 다음 날 0 lasering 직후 찍은 안 FA 이미지에서 Bruch의 막의 손상: 0-Bruch의 멤브레인은 손상 되지 1-Bruch의 막의 성공적인 손상</li>
	<li>학년 누설 fluorescein 신호 다음으로 망막 FA 이미지의 일련에서의 역학을 비교 하 여 관찰 했다에서 관광 명소에서 CNV의 존재: 0-망막의 정상적인 외관 누설의 0.5-희미 한 얼룩 1.0-새 CNV 영역 참고: 사용 하 여 OCT 영상 CNV의 또는 의심 FA에서 추가 확인 10 월 이미지에 intraretinal 액체의 존재 CNV 등급 좋을 곳.</li>
</ol>5. 망막 두께 측정
<ol><li>자동된 분할 소프트웨어를 사용 하 여 망막 두께 측정. RPE (건강 측정 사이트), 또는 RPE 손상 (레이저 사이트)의 사이트에 연결 하는 가상 선 신경 섬유 층에서 모든 층의 간격으로 총 망막 두께 간주 됩니다 확인 하십시오 ( 그림 7참조).</li>
</ol>

<ol><li>Dobi, E. T., Puliafito, C. A., Destro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+experimental+choroidal+neovascularization+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ophthalmol.+Chic.+Ill+1960%22%5BJournal%5D)">A new model of experimental choroidal neovascularization in the rat.</a> Arch. Ophthalmol. Chic. Ill 1960. 107, 264-269 (1989).</li>
<li>Tobe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+neovascularization+in+mice+with+overexpression+of+vascular+endothelial+growth+factor+in+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Evolution of neovascularization in mice with overexpression of vascular endothelial growth factor in photoreceptors.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 180-188 (1998).</li>
<li>Seo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+inhibition+of+retinal+and+choroidal+neovascularization+by+oral+administration+of+a+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Dramatic inhibition of retinal and choroidal neovascularization by oral administration of a kinase inhibitor.</a> Am. J. Pathol. 154, 1743-1753 (1999).</li>
<li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+choroidal+and+retinal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Animal models of choroidal and retinal neovascularization.</a> Prog. Retin. Eye Res. 29, 500-519 (2010).</li>
<li>Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mouse+Model+for+Laser-induced+Choroidal+Neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization.</a> J Vis Exp. (106), e53502(2015).</li>
<li>Giani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+evaluation+of+laser-induced+choroidal+neovascularization+using+spectral-domain+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">In vivo evaluation of laser-induced choroidal neovascularization using spectral-domain optical coherence tomography.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 3880-3887 (2011).</li>
<li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+an+Image-Guided+Laser-Induced+Choroidal+Neovascularization+Model+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice.</a> PloS One. 10, e0132643(2015).</li>
<li>Sheets, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotectin+D1+attenuates+laser-induced+choroidal+neovascularization+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Neuroprotectin D1 attenuates laser-induced choroidal neovascularization in mouse.</a> Mol. Vis. 16, 320-329 (2010).</li>
<li>Hoerster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+and+ex-vivo+characterization+of+laser-induced+choroidal+neovascularization+variability+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol.+Albrecht+Von+Graefes+Arch.+Klin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">In-vivo and ex-vivo characterization of laser-induced choroidal neovascularization variability in mice.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. Albrecht Von Graefes Arch. Klin. Exp. Ophthalmol. 250, 1579-1586 (2012).</li>
<li>Sulaiman, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Optical+Coherence+Tomography+Quantification+Method+for+Choroidal+Neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ocul.+Pharmacol.+Ther.+Off.+J.+Assoc.+Ocul.+Pharmacol.+Ther.+Off.+J.+Assoc.+Ocul.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A Simple Optical Coherence Tomography Quantification Method for Choroidal Neovascularization.</a> J. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. 31, 447-454 (2015).</li>
</ol>

저자 Symantas Ragauskas 박사는 직원 (연구원) 및 제공 계약 연구 서비스 채용이 문서에서 사용 되는 전 임상 CNV 모델 Experimentica 회사의 주주.
저자에 바 Kielczewski는이 문서에 사용 되는 SD 10 월 시스템을 생산 하는 Leica 마이크로 시스템즈의 직원 (연구 응용 프로그램 엔지니어, 10 월).
저자 조셉 밴스는 직원 (나 10 월 판매 감독)이이 문서에 사용 되는 SD 10 월 시스템을 생산 하는 Leica 마이크로 시스템즈의. 요셉 밴스 대통령 그리고 Spective, LLC의 전무 이사 이기도합니다.
저자 사이먼 Kaja, 박사 컨설턴트 최고 과학 책임자와 Experimentica 주식 회사, 한 전 임상 계약 연구 조직 제공 계약 연구 서비스, 포함이이 문서에서 사용 되는 전 임상 CNV 모델의 주주입니다. 사이먼 Kaja, 박사 CEO의 K & P 과학, LLC는, 컨설팅 회사, 생명 과학 이며 또한 박사 존 P. 및 Loyola 대학 시카고, Stritch 학부의 안과 써 E. Mulcahy 부여 교수로. 이 계약의 용어를 검토 하 고 상충 방침에 따라 Loyola 대학 시카고에 의해 승인 되었습니다.
저자 Giedrius Kalesnykas 박사는 직원 (CEO) 및 제공 계약 연구 서비스 채용이 문서에서 사용 되는 전 임상 CNV 모델 Experimentica 회사의 주주.

복합 영상 CNV 병리학 평가 위한 귀중 한 도구를 제공합니다. 여기 우리는 FA, 구성 된 이미징 프로토콜 제시 SD-10 월, 그리고 CNV 병 리의 재현, 빠르고 신뢰할 수 있는 평가 대 한 자동 세분화. Bruch의 막 레이저 관리가 확인 후의 휴식. 또한,이 단계에서 SD OCT를 사용 하 여도 해석 결과의 혼동 수 있습니다 가능한 intraretinal 및 subretinal 출혈의 즉각적인 시각화 허용. 망막 누수 FA 이미지에서 fluorescein 신호에 따라 등급이 있었다. SD-10 월의 사용 CNV 병 리에 대 한 더 자세한 설명을 제공합니다. 또한, 후속 기간에 걸쳐 다양 한 시간 지점에서 경도 SD 10 월 분석 FA 혼자 의존 하는 경우에 애매 하 게 남아 있을 것입니다 병리학 시간적 차이 강조 했다.
총 망막 두께 자동된 조각화를 사용 하 여 측정 했다. CNV 유도 되었다 사이트에서 망막 두께 측정 수동으로 했다. 안 flatmount의 조직학 평가...

최초의 성공적인 시도가 설치류에 인간의 CNV의 병 리를 모방 긴 에반스 쥐1크립 톤 레이저와 거의 3 년 전을 시연 했다. 그 후, 크립 톤 레이저는 가장 인기 있는 마우스 스트레인, C57BL/6J2,,34에 Bruch의 멤브레인을 끊는 데 사용 됩니다. CNV 유도 FA와 조직학 얼룩 확인 했습니다. 10 월, 같은 비 침범 성 이미징 modalities의 급속 한 발전 설치류 전 임상 모델 분야의 성장을 육성 시켰다. 크게 여러 시간 시점에 같은 눈에 망막의 형태학 상 변화를 모니터링 하는 기능, 동물 사용의 감소에 기여 하 고 실험 연구에서 효율을 증가. CNV 변의 조직학 평가 오히려 간단 하며 레이저 관리, 이미지 수집 및 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 지역/볼륨 추정의 사이트 주위 비정상적인 혈관 성장의 라벨. 대조적으로, vivo에서 화상 진 찰 양식 CNV 병리학과 그 해석의 더 복잡 한 분석을 소개합니다.
여기 우리는 간단 하 고 비교적 빠른 방법을 제시 학년 유도, 진행, CNV의 회귀를 FA, SD-10 월를 사용 하 여 및 마우스에 자동된 분할 방법 레이저 유도 CNV 모델.

<table><tbody><tr><td>메데토미딘 (상업명 Domitor)</td><td>Orion</td><td>Vnr 01 56 02</td><td>마취</td></tr><tr><td>케타민</td><td>Intervet</td><td>Vnr 51 14 85</td><td>마취</td></tr><tr><td>0,9% NaCl</td><td>B Braun</td><td>357 0340</td><td>마취</td></tr><tr><td>자일라진 (상업명 Rompun vet)</td><td>바이엘</td><td>vnr 14 89 99</td><td>마취</td></tr><tr><td>트로피카미드</td><td>Santen</td><td>Vnr 04 12 36</td><td>Mydriatic </td></tr><tr><td>에이전트 Viscotears</td><td>Alcon</td><td>Vnr 44 54 81</td><td>윤활제</td></tr><tr><td>Systane</td><td>Alcon</td><td>&nbsp;-</td><td>윤활제</td></tr><tr><td>5% 플루오레세인 나트륨 염</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6377-100G</td><td>형광제</td></tr><tr><td>Atipamezole (상품명 Antisedan)</td><td>Orion</td><td>Vnr 47 19 53</td><td>마취</td></tr></tbody></table>

vivo에서 복합 이미징 및 마우스 레이저 유도 안 neovascularization 모델의 분석

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

레이저 유도 안 neovascularization (CNV) 나이 관련 황 반 변성 (AMD)의 습식 모방을 잘 설립 모델입니다. 이 프로토콜에서 우리는 신생 프로세스, 하지만 오히려 multimodal 경도 에서에서 얻을 수 있는 강력한 정보에 초점을 방 아 쇠를 단순히 병 변 레이저 유도 생성의 기술적 고려 사항 통해 독자를 안내 하고자 vivo에서 후속 기간에 걸쳐 이미징.
레이저 유도 마우스 CNV 모델 다이오드 레이저 관리에 의해 생성 되었습니다. 이미징 기술은 복합 vivo에서 CNV 유도, 진행 및 회귀를 모니터링 하는 데 사용 되었다. 첫 번째, 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 (SD-10 월) 확인 Bruch의 막의 휴식 lasering 즉시 수행 했다. 후속 vivo에서 이미징 fluorescein angiography (FA)를 사용 하 여 직렬 이미지 안 수준에서 인수에서 Bruch의 막의 성공적인 손상 확인. CNV 확산 및 회귀는 lasering 후 5, 10, 및 14 일에의 경도 후속 SD 10 월 및 FA를 사용 하 여 수행 되었다. 간단 하 고 신뢰할 수 있는 FA 이미지에서 새 CNV leasions의 등급 표시 됩니다. CNV 사이트에서 망막 두께의 측정에 대 한 수동 구경 응용 프로그램과 결합 하는 총 망막 두께의 측정에 대 한 자동화 된 세분화 종의 존재의 중 정한 평가 하실 수 있습니다. 마지막으로, CNV의 조직학 확인 isolectin GS-IB4 안 flatmounts에 얼룩을 사용 하 여 수행 됩니다. 얼룩이 지는 thresholded, 그리고 isolectin-긍정적인 지역 ImageJ로 계산 됩니다.
이 프로토콜은 특히 복합, 빨리, 수 CNV 병리학의 높은 처리량 같은 심사를 요구 하는 치료제 연구 및 CNV 병리학과 망막 부 종의 신뢰할 수 있는 분류에 유용 합니다. 또한, 높은 해상도 SD 10 월 subretinal 또는 intraretinal 액체의 축적 등 다른 병 적인 특징의 녹음 수 있습니다. 그러나,이 메서드는 수동으로 수행 하는 SD 10 월 이미지, CNV 볼륨 분석을 자동화 하는 가능성을 제공 하지 않습니다.

거품 또는 subretinal lasering 직후 출혈은 항상 보이지 않는다입니다. 따라서, SD-10 월은 특히 Bruch의 막의 손상을 확인 하는 것이 중요. 그림 1 레이저 관리 후 다른 시간 지점에서 10 월 이미징의 예를 보여 줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56173/56173fig1.jpg"> 그림 1 : 눈 저 (VIP 이미지)의 10 월 엔 얼굴 보기 흰색, 녹색, 빨간색 동그라미에 설명 된 세 가지에서 영역을 보여줍니다. 10 월 B-스캔 이미지 찍은 사전 lasering (초기), lasering Bruch의 막의 휴식을...

여기, 선물이 쥐에서 안 neovascularization 레이저 유도의 형태학 변화의 후속에서 경도 vivo에서 화상의 유용성.

Vivo에서 복합 이미징 및 마우스 레이저 유도 안 Neovascularization 모델의 분석

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

신생혈관 형성 과정은 여러 흔한 안과 질환의 특징적인 모습입니다. 가장 대표적인 예로 삼출성 연령 관련 황반변성(또는 줄여서 습성 AMD), 증식성 당뇨망막병증, 미숙아 망막병증 등이 있습니다. 이러한 질환들은 전 세계적으로 법적 실명의 대부분을 차지하며, 유리체 출혈 및 신생혈관성 녹내장과 같은 추가적인 안과적 합병증과 연관되어 있습니다.하지만 이러한 질환들이 매우 흔함에도 불구하고, 안구 신생혈관 질환에 대한 치료 옵션은 제한적입니다. AMD 및 증식성 당뇨망막병증과 관련된 신생혈관 형성에 대한 현재의 표준 치료법은 혈관 신생 및 신생혈관 형성의 핵심 매개체인 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor) 또는 VEGF를 표적으로 하는 인간화 항체의 유리체 내 주사입니다. 그러나 질병의 진행을 억제하고 기능적 시력을 개선하는 효능에도 불구하고, 유리체 내 주사는 비용이 많이 들며 위험성이 완전히 없지는 않습니다.합병증으로는 감염, 내안구염, 망막 박리 및 안구 출혈 등이 포함될 수 있습니다. 따라서 효능이 뛰어나고 안전하며 비용 효율적인 새로운 치료 옵션의 개발이 시급합니다. 신생혈관 질환의 약물 개발을 진전시키기 위해서는 소동물 모델이 매우 중요합니다.이러한 모델은 재현 가능해야 하며, 확립되고 검증된 판독값 및 종말점을 가져야 하고, 이상적으로는 양성 대조군 역할을 할 임상적으로 관련 있는 참조 화합물을 사용해야 합니다. 본 프로토콜에서는 CNV의 병태생리학적 기전 연구와 새로운 항신생혈관 제제 개발 모두에 가장 흔히 사용되는 모델 중 하나인 마우스 맥락막 신생혈관, 즉 CNV 모델을 제시하겠습니다. CNV 모델에서는 아르곤 레이저를 사용하여 브루크막(Bruch's membrane)을 파열시킵니다.이를 통해 맥락막에서 기원하는 신생혈관 형성 과정이 시작됩니다. 분광 영역 광간섭 단층촬영(SD-OCT)을 이용한 종단적 생체 내 영상 촬영과 형광안저혈관조영술을 활용하면 CNV의 증식과 퇴행 과정을 추적할 수 있습니다. 이를 통해 새로운 약물 중재법의 효능과 시간적 경과를 평가할 수 있습니다.최근의 영상 처리 기술의 발전은 망막 두께 측정을 위한 자동 분할을 가능하게 하여, 연구자의 편향 없이 부종의 존재 여부를 평가할 수 있는 방법론을 제공합니다. 본 논문에서는 마우스 CNV 모델에서 망막 층의 자동 분할을 위한 Leica Microsystems의 새로운 InVivoVue Diver 소프트웨어의 유용성에 대해 논의하겠습니다. 마지막으로, 망막 전체 마운트의 조직학적 분석이 이 모델에서 종단적 생체 내 영상 촬영을 어떻게 보완할 수 있는지 논의하겠습니다.동공 확장을 위해 각 눈에 트로피카미드 한 방울을 점안합니다. 그 후, 동물을 설치류 정렬 스테이지에 조심스럽게 배치합니다. 눈이 노출되도록 마우스를 조정한 뒤, 코 홀더와 등 위에 조심스럽게 붙인 실험용 테이프를 사용하여 고정합니다.다음으로, 보습을 위해 안구에 윤활제를 한 방울 도포하고, 거름종이 면봉을 사용하여 과잉 액체를 조심스럽게 제거합니다. 마지막으로, 기저선 OCT 영상을 촬영하기 위해 스테이지를 OCT 장치 앞에 맞춥니다. 레이저 조사 전, 망막에 이상이 없는지 확인하기 위해 기저선에서 in vivo spectral-domain 광간섭 단층 촬영 영상을 획득합니다.홀더에서 마우스를 조심스럽게 꺼냅니다. 각막을 평평하게 하기 위해 커버 슬립 위에 Viscotears Gel 한 방울을 떨어뜨립니다. 시신경 유두가 중심에 오도록 마우스의 방향을 잡고, 레이저 빔을 망막 색소 상피에 맞춥니다.시신경 주위의 4시, 8시, 12시 방향에서 망막 혈관을 피하여 세 번의 레이저 조사를 수행합니다. 모든 레이저 조사가 끝난 후 안구의 견고함을 확인하여 망막 출혈이 없는지 점검합니다. 이전과 마찬가지로 마우스를 홀더에 정렬시키고, 플루오레세인 혈관 조영술과 OCT 영상을 촬영하여 브루크막(Bruch's membrane)의 손상 여부를 확인합니다.형광 안저 혈관 조영술을 위해, 먼저 적외선 반사 모드를 사용하여 레이저 조사 부위에 초점을 맞춥니다. 이 모드를 통해 레이저가 투여된 위치를 시각화할 수 있습니다. 마우스의 눈 위치를 변경하지 않은 상태에서, 마우스 체중 20g당 약 0.1mL의 5% fluorescein sodium salt를 조심스럽게 주입합니다. 약 30초 간격으로 맥락막 수준과 망막 수준에서 형광 안저 혈관 조영 이미지를 촬영하기 시작합니다.이전과 동일하게 OCT 촬영을 위해 안구를 정렬하고 촬영을 시작합니다. 이 시퀀스에서 보여주는 것과 같이 SD-OCT 신호를 평균화하면 상세한 망막 형태를 더 잘 시각화하는 데 도움이 됩니다. SD-OCT 촬영이 완료되면 홀더에서 마우스를 조심스럽게 제거하십시오.양쪽 눈에 윤활제를 도포합니다. 이때 medetomidine의 alpha-2 길항제인 atipamezole을 피하 주사하여 마취를 역전시키거나, 동물이 마취에서 회복될 때까지 기다릴 수 있습니다. 마취된 동물을 대상으로 5일, 10일 및 14일째 추적 관찰일에 in vivo SD-OCT 및 FA 영상 촬영을 반복합니다.망막 두께 측정을 위해 InVivoVue Diver 소프트웨어의 자동 분할 기능을 사용하십시오. 건강한 망막의 경우, 총 망막 두께는 신경 섬유층부터 망막 색소 상피(RPE)까지 모든 층의 두께로 간주됩니다. 이 예시에서 볼 수 있듯이, 건강한 망막에서는 자동 분할 기능을 통해 개별 망막 층을 정확하게 검출할 수 있습니다.CNV가 존재하는 부위에서는 각 CNV 병변 부위에 대해 망막 두께를 개별적으로 수동 측정해야 한다는 점에 유의하십시오. 측정은 신경섬유층부터 RPE 층을 통과하는 가상선까지 수행합니다. 이 시퀀스는 CNV 병변이 있는 부위에서 수동 두께 측정을 수행하는 작업 흐름을 보여줍니다.이미지의 상단에는 신경섬유층이, 하단에는 맥락막이 위치합니다. 마우스나 터치패드를 사용하여 신경섬유층과 맥락막의 경계를 수동으로 지정하면, 소프트웨어가 이 좌표를 기반으로 전체 망막 두께를 자동으로 계산합니다. 이 그림은 맥락막 수준에서 20초 간격으로 촬영한 연속 영상을 보여줍니다.이미지 1은 적외선 반사 모드로 획득되었습니다. 그 외의 이미지들은 복강 내로 플루오레세인을 주입한 후 획득되었습니다. 이미지 1의 흰색 화살표는 레이저 조사 부위를 가리키며, 이 부위들은 이미지 18의 흰색 화살표로 강조된 바와 같이 이후 시점에서 플루오레세인 누출을 보입니다.이 이미지는 망막 수준에서 획득한 FA 연속 영상을 보여줍니다. 이미지 18의 흰색 화살표는 레이저 조사 부위를 가리키며, 이는 이미지 18에서 원으로 표시된 다른 두 부위보다 형광색소 누출이 더 빠르게 나타남을 보여줍니다. 이 요약 그림은 SD-OCT 영상의 시간 경과를 나타냅니다.기초 단계, 레이저 조사 직후, 그리고 5일, 10일, 14일째의 추적 관찰 시점에 측정합니다. 요약하자면, SD-OCT 및 FA 영상을 이용한 CNV 병변의 종단적 생체 내 영상 촬영 프로토콜을 통해 CNV 병리학적 상태와 망막 부종의 존재 여부를 빠르고 다각적이며 신뢰성 있게 분류할 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사합니다.

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Neuroscience

신경과학

생체내 bioluminescence과 자기 공명 영상에서 (I), 그리고 (ii) 해부 histological 분석 :이 문서를 사용하여 쥐 두뇌에있는 세포 이식의 multimodal 이미징을위한 이벤트를 최적화된 순서를 설명합니다. 하나의 동물에서 이러한 이미징 modalities를 결합하면 높은 해상도, 민감도와 특이성과 세포 이식 평가를하실 수 있습니다.

마우스의 중추 신경계에서 줄기 세포 주입의 Multimodal 이미징

출처: Bosco, A., et al. In vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma(신경 퇴행 중 망막 미세아교세포 활성화의 생체 내 역학: 마우스 녹내장의 컨포칼 안과 영상 및 세포 형태 측정).   J. Vis. 특급 (2015년) 이 비디오는 녹내장의 마우스 모델에서 망막 미세아교세포의 생체 내 이미징을 보여줍니다. 형광 단백질 발현 망막 미세아교세포를 가진 형질전환 마우스가 검안경 아래에 위치합니다. 적외선 조명은 시신경두(ONH)를 찾는 데 사용되며, 초점면은 망막 혈관을 랜드마크로 사용하여 설정됩니다. 그런 다음 형광 미세아교세포를 시각화하기 위해 형광 이미징을 사용합니다. 세포체가 커지고 분지 복잡성이 감소하는 것을 특징으로 하는 활성화된 미세아교세포를...

In Vivo Imaging of Retinal Microglia in a Mouse Model of Glaucoma

여기에서는 신생혈관 연령 관련 황반변성(AMD)의 혈관 특징을 재현하는 실험 모델인 마우스 레이저 유도 맥락막 신생혈관화(CNV) 프로토콜을 제시합니다. 일단 마스터하면 다양한 실험 측정을 테스트하기 위한 모델 시스템으로 CNV를 안정적이고 효과적으로 유도할 수 있습니다.

레이저에 의한 맥락막 신생 혈관에 대한 마우스 모델

이 프로토콜 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 등 어떻게 고해상도 이미징 기술을 설명 하 고 스캐닝 레이저 ophthalmoscopy에 정보를 얻기 위해 안과 이미징 플랫폼 시스템을 사용 하 여 작은 설치류에 이용 될 수 있다 망막 두께 microglial 각각 유통, 셀.

Vivo에서 스펙트럼-도메인 광학 일관성 단층 촬영 스캐닝 레이저 Ophthalmoscopy와 Cx3cr1gfp/gfp 기자 쥐의 이미징

여기에 제시 라이브 마우스 안구 표면 이미징을위한 다광 현미경 플랫폼입니다. 형광 형질 전환 마우스는 안구 표면 내의 세포 핵, 세포 막, 신경 섬유 및 모세 혈관의 시각화를 가능하게합니다. 콜라주 구조에서 파생된 비선형 제2 고조파 생성 신호는 기질 아키텍처에 대한 라벨없는 이미징을 제공합니다.

마우스 각막과 결막의 라이브 이미징을 위한 맞춤형 다광현미경 플랫폼

생체 내 이미징은 건강 및 질병 생물학 연구를위한 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 표준 2 광자 현미경으로 마우스 망막의 경공 영상을 설명합니다. 또한 망막의 여러 세포 코호트를 형광으로 표지하는 다양한 생체 내 이미징 방법을 보여줍니다.

경동공 이광자 마우스 망막의 생체 내 이미징

여기에서는 장미 벵골을 사용한 망막 정맥 폐색에 최적화된 프로토콜과 유전자 변형 균주에서 재현성을 극대화하기 위한 권장 사항과 함께 레이저 유도 망막 영상 현미경 시스템에 대해 설명합니다.

가변성을 제한하기 위한 망막 정맥 폐색 마우스 모델의 최적화

여기에서는 마우스에서 망막병증의 진단 및 정량적 측정을 용이하게 하기 위해 광학 간섭 단층 촬영을 사용하는 생체 내 이미징 기술에 대해 설명합니다.

망막병증의 마우스 모델에 대한 광학 간섭 단층 촬영의 적용

여기에서는 망막 정맥 폐색(RVO) 연구에서 형광 혈관 조영술(FA) 및 광학 간섭 단층 촬영(OCT) 이미지에 대한 세 가지 데이터 분석 프로토콜을 제시합니다.

생체 내 재현성 촉진을 위한 마우스 망막의 혈관 손상 판독

현재 프로토콜은 광간섭 단층촬영을 사용하여 쥐 맥락막에 흑색종의 이식 및 평가를 설명합니다.

광간섭 단층촬영을 통한 쥐 맥락막의 흑색종 이식 및 평가

학습하세요 마우스 레이저 유도 맥락막 신생혈관화 모델에서 SD-OCT와 형광안저촬영을 활용한 생체 내 복합 이미징 방법을. 이 기술은 망막 병리 진행을 추적하고 항혈관신생 치료제 효능을 평가하는 데 활용됩니다.

Vivo에서 복합 이미징 및 마우스 레이저 유도 안 Neovascularization 모델의 분석

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