교류 Cytometry 기반 약물 세포종 줄기 세포의 세포 분화를 촉진 하는 작은 분자의 식별에 대 한 시스템 검사
2018년 1월 10일
효율적인 심사 프로토콜 astroglial 분화 세포종 줄기 세포 (GSCs)에 홍보 하는 작은 분자의 식별을 위해 제공 됩니다. 분석 결과 줄기 세포 감 별 법 기자에 의하여 향상 된 GFP (eGFP)의 식을 인간의 GFAP 발기인에 의해 구동 됩니다 기반으로 합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 교모세포종 줄기세포에서 성상아교세포 분화를 촉진하는 제제에 대해 소분자 라이브러리를 스크리닝하는 것입니다. 이 방법은 교모세포종 줄기세포를 미분화 상태로 유지하는 데 필요한 신호 경로는 무엇인지와 같은 암 줄기세포 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술을 적절하게 실행하면 교모세포종 줄기세포 분화를 촉진하는 작은 분자를 간단하게 식별할
수 있습니다.이 기술의 의미는 교모세포종 줄기세포의 비율을 줄이면 재발 가능성을 줄일 수 있기 때문에 Ehlers-Danlos 교모세포종 치료로 확장됩니다. 이 방법은 다른 리포터 구조체를 사용하여 다른 세포 계통으로의 분화를 설정하는 데에도 적용할 수 있습니다. 본 보고서는 신경교종 줄기세포가 분화하도록 강제하는 제제를 스크리닝하기 위한 고처리량 접근법을 확립한 최초의 보고서입니다.
환자에서 유래한 암세포에서 렌티바이러스 입자를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있습니다. 따라서 혈액 매개 병원체에 대한 작업을 위한 표준 절차를 항상 따라야 합니다. 먼저 100만 개의 교모세포종 줄기세포 또는 GSC를 6웰 플레이트에 2ml의 완전한 신경 줄기 세포 성장 배지에 파종합니다.
다음으로, 렌티바이러스 리포터를 사용하여 5와 같은 감염 다중도에서 세포를 형질주입합니다. 세포와 바이러스 혼합물에 최종 농도가 밀리리터당 8마이크로그램이 되도록 2마이크로리터의 폴리브레렌을 첨가하고 하룻밤 동안 섭씨 37도, 5%CO2에서 세포를 배양합니다. 배양 후 성장 배지를 교체하여 결합되지 않은 바이러스를 제거합니다.
그리고 세포를 360배 G로 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 배지 및 플레이트 세포를 6웰 플레이트에서 조심스럽게 흡인합니다. 그리고 24 시간 동안 세포를 계속 배양하십시오.
총 배양 부피의 0.5 밀리리터를 수확합니다. 펠렛 세포를 실온에서 5분 동안 360배 G로 원심분리합니다. 0.5 밀리리터의 신선한 신경 줄기 세포 성장 배지에 세포를 재현탁시킵니다.
플레이트를 인큐베이터에 다시 넣어 최소 72시간 동안 팽창시킬 수 있습니다. 200마이크로리터의 해리 시약을 넣고 섭씨 37도로 설정된 수조에서 5분 동안 배양합니다. 위아래로 부드럽게 피펫을 하여 세포를 해리합니다.
해리된 세포에 800마이크로리터의 HBSS를 첨가하여 세포 부착 또는 응집을 최소화합니다. 다음으로, 각 세포 현탁액 200마이크로리터를 96-멀티웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 유세포 분석법(flow cytometry)을 통해 녹색 형광 단백질을 발현하는 세포의 비율을 측정합니다.
각 획득에서 최소 10, 000개의 생존 가능한 세포를 기록합니다. 모든 유세포 분석에서 parental non-transducted cells 또는 vector-transduced nonfluorescent cell을 사용하여 baseline fluorescence를 확립할 수 있습니다. 개별 서브클론을 선택하고 확장하기 위해 96웰 플레이트에서 100마이크로리터의 신경 줄기 세포 배지에서 웰당 0.7개의 세포 밀도로 세포를 시드합니다.
이 클론을 11일 동안 배양에서 유지합니다. 직경이 100미크론보다 큰 신경구를 찾으십시오. 우리는 이전에 중성구가 자가 재생 교모세포종 줄기 세포에 의해 기원되었는지 후향적으로 결정하기 위해 이 컷오프 크기를 설정했습니다.
이 컷오프 크기는 다른 교모세포종 세포 모델로 작업할 때 최적화가 필요할 수 있습니다. FITC 필터가 장착된 형광 현미경으로 세포를 관찰하고 세포의 약 1%에서 5%가 GFP 양성인 단일 신경구를 포함하는 우물을 표시합니다. 마킹 후 유세포 분석에 충분한 수의 세포를 사용할 수 있을 때까지 개별 클론을 확장합니다.
리포터 클론이 1%to 5%의 GFP 양성 세포를 포함하고 있다고 가정하고, GFP 양성 세포의 정확한 비율을 결정하기 위해 동일한 양의 비형질 도입 대조 세포와 함께 각 클론에서 0.5밀리리터를 수확합니다. 실온에서 5분 동안 360배 G로 세포를 펠릿화한 후 상층액을 흡인합니다. 각 펠릿에 200마이크로리터의 해리 시약을 추가하고 섭씨 37도로 설정된 수조에서 튜브를 배양합니다.
배양 후, 세포를 약 20-30회 분쇄하여 단일 세포 현탁액을 달성합니다. 그런 다음 800마이크로리터의 HBSS를 첨가하여 세포 부착 또는 응집을 최소화합니다. 이제 각 세포 현탁액 200마이크로리터를 96-멀티웰 플레이트의 웰로 옮깁니다.
마지막으로, 유세포 분석을 수행하여 각 획득에서 최소 10, 000개의 생존 가능한 세포를 기록합니다. 클론 생성 능력을 평가하기 위해 세포를 약 20-30회 분쇄하여 분화 리포터 서브클론의 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 그런 다음 96-멀티웰 플레이트에서 웰당 약 5-500개의 세포 밀도로 100마이크로리터의 완전한 신경 줄기 세포 성장 배지에 이 세포를 플레이트화합니다.
이 세포를 9-11일 동안 배양에서 유지하십시오. 광학 현미경으로 신경구를 찾으십시오. 적어도 하나의 큰 신경구를 포함하는 우물은 양성으로 간주됩니다.
부모의 비형질도입 세포와 GFP 양성 렌티바이러스 형질도입 세포를 대조군으로 고려하여 ELDA 온라인 인터페이스에서 분석된 총 웰과 양성 세포의 수를 입력합니다. 스크리닝을 시작하려면 96웰 플레이트에 99마이크로리터의 완전한 신경 줄기 세포 성장 배지에 5000개의 세포를 플레이트화합니다. 그런 다음 12채널 피펫터를 사용하여 희석된 라이브러리 화합물의 최종 농도가 2마이크로몰인 세포를 처리하거나 DMSO 대조군을 사용합니다.
세포를 72시간 동안 배양합니다. 이제 각 웰에 12채널 피펫터를 사용하여 150마이크로리터의 세포 해리 시약을 추가하고 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 단일 세포 현탁액이 달성될 때까지 12채널 피펫터를 사용하여 각 웰의 세포를 약 20-30회 부드럽게 분쇄합니다.
이제 유세포 분석을 수행하고 GFAP:GFP 리포터를 발현하는 세포의 비율을 측정합니다. 먼저 전방 및 측면 산란에서 세포 크기와 생존율을 측정하고 생존 가능한 세포 집단을 게이트합니다. 그런 다음 생존 가능한 세포 집단 내에서 GFP 양성 세포를 측정합니다.
대조군에 비해 3 표준 편차만큼 GFP 양성 세포의 백분율이 증가하는 것은 엄격성에 대한 사용자 선호도를 수용하기 위해 조정될 수 있는 양성 히트로 간주됩니다. 낮은 수준과 높은 수준의 GFAP:GFP를 발현하는 HSR-GBM1 GSC 서브클론의 대표적인 이미지가 도시되어 있습니다. GFAP:GFP 발현에 양성인 서브클론은 환자 유래 신경구 라인에 대한 유세포 분석에 의해 선택되었습니다.
여기서, 낮은 GFAP:GFP는 클론 내 세포 중 5% 미만이 GFP 양성임을 나타내고, 높은 GFAP:GFP는 클론 내 세포 중 75% 이상이 GFP 양성임을 나타냅니다. 이러한 결과는 ELDA에 의해 결정된 바와 같이 GFAP-low subclones의 in vitro self-renewal capacity가 GFAP-high subclones보다 높다는 것을 보여줍니다. 따라서 GH 서브클론은 GL 서브클론보다 더 차별화됩니다.
마지막으로, GSC에서 성상아교세포 분화를 유도할 수 있는 제제를 확인하기 위해 약물 라이브러리를 스크리닝했습니다. 12개의 약물이 GFAP:GFP 리포터를 발현하는 세포의 비율을 유의하게 증가시키는 것으로 밝혀졌습니다. 일단 숙달되면 이 기술을 제대로 수행하면 몇 주 안에 완료할 수 있습니다.
이 절차에 따라 alamarBlue 분석, 반고체 매체에서의 클론 생성 분석, 측면 또는 두개내 이종그래프 주입과 같은 다른 방법을 수행하여 세포 증식 및 클론 원성에 대한 선택적 약물의 영향 in vitro 및 in vivo 종양 원성과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 교모세포종 줄기세포에서 성상교세포의 분화를 유도할 수 있는 화합물을 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
이 기사는 교모세포종 줄기 세포(GSCs)에서 성교모세포 분화를 촉진하는 작은 분자를 식별하기 위한 선별 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 인간 GFAP 프로모터에 의해 구동되는 향상된 GFP (eGFP) 발현을 사용하는 줄기 세포 분화 리포터를 활용합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 암 생물학
- 줄기 세포 연구
배경
- 교모세포종 줄기 세포(GSCs)는 교모세포종 재발을 이해하는 데 중요합니다.
- GSCs를 미분화 상태로 유지하는 경로를 식별하는 것이 필수적입니다.
- 성교모세포 분화는 GSC 개체군을 감소시킬 수 있습니다.
- 이 연구는 분화 작용제에 대한 고처리량 선별 방법을 소개합니다.
연구 목적
- GSCs에서 성교모세포 분화를 촉진하는 작용제를 찾기 위해 작은 분자 라이브러리를 선별합니다.
- GSC 유지에 관여하는 신호 전달 경로를 탐색합니다.
- 다른 리포터 구성체를 사용하여 다른 세포 계통에 적용할 수 있는 방법을 제공합니다.
사용된 방법
- 작은 분자 라이브러리의 고처리량 선별.
- 줄기 세포 분화 리포터 시스템의 활용.
- 인간 GFAP 프로모터에 의해 구동되는 eGFP 발현의 평가.
- 교모세포종 줄기 세포에 대한 분화 효과의 분석.
주요 결과
- 성교모세포 분화를 효과적으로 촉진하는 작은 분자의 식별.
- GSC 유지에 필요한 신호 전달 경로에 대한 통찰.
- 교모세포종 재발을 감소시키기 위한 잠재적 치료적 의미.
- 신규 고처리량 선별 접근법의 확립.
결론
- 개발된 프로토콜은 분화 촉진 작용제를 선별하는 데 효과적입니다.
- 연구 결과는 교모세포종에 대한 치료 전략에 기여할 수 있습니다.
- 이 방법은 다른 분화 연구에 적용될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This flow cytometry-based screening system enables biopharma R&D to identify small molecules that promote differentiation of glioblastoma stem cells, addressing a key mechanism of tumor recurrence. By quantifying astroglial differentiation via GFAP:GFP reporter expression, the platform provides predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for oncology pipelines. The approach supports lead identification and portfolio triage through scalable, reproducible assays compatible with FDA-approved drug library screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking small molecule treatment to astroglial differentiation in patient-derived GSCs.
- Operational Value: Enables functional target validation through quantitative flow cytometry readouts of GFP-positive cells.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by identifying compounds that reduce stemness and self-renewal capacity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes a high-throughput flow cytometry platform for screening compound libraries with Z'-factor compatible metrics.
- Quantitative Output: Measures percentage of GFP-positive cells as a direct readout of differentiation efficacy.
- Scalability: Compatible with 96-well format and 12-channel pipetting for screening thousands of compounds.
- Reporter Flexibility: GFAP:GFP construct can be substituted with other lineage-specific promoters for broad target validation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models human glioblastoma stem cell biology using patient-derived neurospheres.
- Translational Continuity: Differentiation phenotype aligns with astroglial maturation, a clinically relevant endpoint.
- Preclinical De-risking: Identifies compounds that reduce clonogenic potential, informing go/no-go decisions.
- Biomarker Alignment: GFAP expression serves as a translational biomarker for astroglial commitment.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows following target identification and preceding lead optimization, enabling phenotypic screening of differentiation-inducing agents in a disease-relevant system.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of signaling pathways governing GSC maintenance via small molecule perturbation.
- Screening: Delivers assay standardization and reproducibility through flow cytometry gating and viability controls.
- Analytics: Enables quantitative comparison of compound effects using GFP-positive cell percentages and statistical hit calling (3 SD over control).
- Translational Research: Connects to preclinical validation by identifying agents that reduce tumorigenic potential in stem cell-enriched populations.
- Enterprise Reuse: Platform is adaptable to other cancer stem cell models and differentiation endpoints via reporter exchange.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into differentiation pathways and reduces ambiguity in stem cell-targeted mechanisms.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized transduction, selection, and flow cytometry protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by prioritizing compounds with differentiation activity over cytotoxic effects alone.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by identifying differentiation inducers that may synergize with standard-of-care therapies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lentiviral transduction, flow cytometry, and neural stem cell culture.
- Dependent on flow cytometer with FITC detection and 96-well plate automation compatibility.
- Necessitates standardization of reporter validation and clonogenic assays across cell lines.
- Adaptation to other models may require optimization of neurosphere size cutoffs and differentiation thresholds.
- Practical limitations include variability in primary GSC cultures and need for careful viability gating.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:17
Generation of Lentiviral Transcriptional Reporter Cell Lines
3:47
Subclone Selection, Expansion, and Validation
4:47
Determination of GFAP:GFP Expression by Flow Cytometry
5:58
ELDA Self-renewal Assay to Assess Clonogenic Capacity
7:01
Drug Screen
8:27
Results: Selection and Drug Screening of Glioblastoma Stem Cell Subclones
9:46
Conclusion
