Name: 교류 Cytometry 기반 약물 세포종 줄기 세포의 세포 분화를 촉진 하는 작은 분자의 식별에 대 한 시스템 검사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 배우세요 교류 Cytometry를 활용한 교모세포종 줄기 세포의 성상교세포 분화 촉진 소분자 물질 고속 스크리닝 방법입니다. GFAP:GFP 리포터 시스템으로 분화 유도 효과를 정량 분석하여 재발 가능성을 낮추는 치료 전략 개발에 활용할 수 있습니다.

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참고: Astroglial 및 신경 lentivirus 기자 시스템 사전 패키지, 집중 lentiviral 준비로 구매 되었다. 교류 cytometry 기술의 기본 지식이 필요 합니다. 또한,이 프로토콜을 사용 하는 전체에 대 한 사용자 흐름 cytometer 높은 처리량 용량 (샘플 소스로 96 잘 접시를 허용)에 대 한 액세스를 해야 합니다.
1. lentiviral Transcriptional 기자 시스템
참고: 모든 흐름 cytometric 분석에 사용 하 여 부모, 비 불리고, 셀 또는 벡터 불리고 (비 형광) 셀 설정 기준 형광. 또한, 유의 하십시오, 기계적 분쇄 이라고 어디 모든 단계에서 부드러운. 가혹한 분쇄 연약한 GSCs의 상당한 수를 죽 일 고 흐름 cytometry 결과 영향을 미칠 수 있습니다.
<ol><li>플레이트 1 x 106 셀 6 multiwell 격판덮개에 완전 한 신경 줄기 세포 성장 매체의 2 ml.</li>
	<li>Lentivirus 기자 5 크거나 감염 (moi)의 다양성에 추가 하 여 셀 transduce.</li>
	<li>8 µ g/mL의 최종 농도 대 한 polybrene의 2 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2 에서 셀을 밤새 품 어.</li>
	<li>다음 날, 성장 매체 언바운드 바이러스 제거를 교체 합니다. 37 ° C, 5% CO2 배양 기에 다시 접시를 놓고 24 h에 대 한 품 어.</li>
	<li>수확 0.5 mL 전체 볼륨; 360 x g 15 mL 원뿔 튜브에 실 온에서 5 분에 셀 아래로 회전 하 고 열망 하 여 상쾌한을 제거 합니다. 나머지 셀에 신선한 신경 줄기 세포 성장 매체의 0.5 mL을 추가 하 고 지속적인된 확장을 위한 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.</li>
	<li>분리 시 약의 200 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 5 분 동안 품 어</li>
	<li>부드럽게 위아래로 pipetting으로 세포 분열. 참고: 가혹한 분쇄 GSCs의 중대 한 살해 귀 착될 지도 모른다, 완전 한 분리는 일반적으로 20-30 시간 후 이루어집니다.</li>
	<li>셀 첨부 파일 또는 집계를 최소화 하기 위해 800 µ L의 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 1 mL의 최종 볼륨을 추가 합니다.</li>
	<li>각 세포 현 탁 액의 200 µ L 96 multiwell 격판덮개의 우물에 전송.</li>
	<li>이 절차에 대 한 96 잘 접시 기능이 여기 블루 레이저와 녹색 형광 단백질을 검출 하는 능력을 갖추고 있는 벤치탑 교류 cytometer를 사용 합니다. 각 인수에 대 한 적어도 10000 가능한 셀 흐름 cytometric 분석을 수행 합니다.</li>
	<li>Cytometry 여 GFP-긍정적인 세포의 백분율을 결정 합니다.</li>
</ol>2. subclone 선택, 확장, 및 유효성 검사
<ol><li>96-multiwell 격판덮개의 우물 당 0.7 세포의 밀도에서 신경 줄기 세포 매체의 100 µ L에 플레이트 세포.</li>
	<li>문화를 37 ° C, 5% CO2에 11 일에 대 한 복제. 이 단계 높은 종속 셀 종류 이며, 셀 라인 사용에 따라 조정 필요 합니다. 일반적으로 구체 직경 ≥ 100 µ m는 neurospheres에서 clonogenic GSCs의 존재의 좋은 표시 이다.</li>
	<li>FITC 필터 장착 형광 현미경을 사용 하 우물 단일 neurosphere 포함 하는 셀의 1 ~ 5% 되 GFP-긍정적인 표시 합니다. 참고: 결정 GFP-긍정적인 세포의 정확한 백분율은이 시점에서 너무 중요 하지 않다. subclones의 각 나중 cytometry에 의해 평가 됩니다. 총을 줄이기 위해이 단계를 수행 하는 수에 의해 시작 되는 neurospheres에 중점을 두고 분석 하는 클론의 undifferentiated, GFAP-부정, GSC.</li>
	<li>Cytometry 분석에 대 한 셀의 충분 한 수 있습니다 때까지 선택 된 기자 클론을 확장 합니다. ≤ 1.5x105 셀/mL를 포함 하는 6-multiwell 격판덮개의 하위 confluent 잘 셀의 충분 한 번호를 제공 해야 합니다. 참고: 격리와 GSCs의 확장에 대 한 자세한 절차는 사용할 수 17.</li>
</ol>3. Cytometry GFAP:GFP 식의 결정
<ol><li>각 기자 복제 및 GFP-긍정적인 세포의 정확한 비율을 결정 하기 위해 비 불리고 컨트롤 셀 (0.5 mL)의 약 수를 수확. 고려 기자 클론 1 ~ 5 %GFP-긍정적인 세포를 포함 하는.</li>
	<li>실 온에서 5 분 동안 360 x g에서 셀 회전 고 열망 하 여 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>각 펠 릿 세포 분리 시 약의 200 µ L을 추가 하 고 37 ° c 설정 물 욕조에 튜브를 품 어</li>
	<li>(보통 20 ~ 30 배) 사이의 단일 세포 현 탁 액을 달성 하기 위해 부드럽게 셀 triturate</li>
	<li>셀 첨부 파일 또는 집계를 최소화 하기 위해 800 µ L HBSS 1 mL의 최종 볼륨을 추가 합니다.</li>
	<li>각 세포 현 탁 액에서 96 multiwell 격판덮개의 우물 당 200 µ L를 전송 합니다.</li>
	<li>이 절차에 대 한 96 잘 접시 기능이 있는 벤치탑 교류 cytometer를 사용 합니다. 각 인수에 대 한 적어도 10000 가능한 셀 흐름 cytometric 분석을 수행 합니다.</li>
</ol>4. 엘 다 자기 갱신 분석 결과 Clonogenic 용량을 평가 하
참고: 컨트롤에 대 한 모두 부모의 비 불리고, 뿐 아니라, GFP 표현 lentivirus 불리고 셀 사용 해야 원래 GSC 문화는 그들이에 GSC 차별화 기자 라인의 상대 clonogenic 잠재력을 결정 하 파생.
<ol><li>위에서 설명한 대로 차별화 기자 subclones 단일 셀 정지로 해리.</li>
	<li>플레이트 셀 셀 밀도 잘 당 5, 500 세포 사이에서 완전 한 신경 줄기 세포 성장 매체의 100 µ L에서 96 multiwell 격판덮개에.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2에서 9 ~ 11 일에 대 한 셀을 품 어.</li>
	<li>Neurospheres는 가벼운 현미경의 직접 시각화 하 여 긍정적인 웰 스 점수. 잘 "긍정적인" 적어도 하나의 큰 neurosphere 포함 하는 경우 고려 되어야 한다.</li>
	<li>데이터 연결: 웰 스 분석 및 http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html에서 사용할 수 있는 엘 다 온라인 인터페이스를 사용 하 여 양수 우물의 수.</li>
</ol>5. 약물 라이브러리 희석 준비
<ol><li>-80 ° C에 저장에서 라이브러리 번호판을 제거, 알루미늄 호 일 커버 (빛에 민감한 화합물 보호). 실 온에서 1 시간 30 분 약 thaw.</li>
	<li>12 채널 멀티 채널 pipettor를 사용 하 여 완전 한 신경 줄기 세포 매체에 0.2 m m를 라이브러리 화합물을 희석. 성장 매체에서 10 %DMSO 희석 참고: DMSO의 최종 농도 0.1% 셀에 추가 해야 합니다. 문화에 있는 DMSO의 높은 농도 독성에 발생할 수 있습니다. 이러한 이유로, 치료 전에 사용 세포 선에서 DMSO에 감도 테스트 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>차량 제어로 DMSO를 사용 하 여 셀 (열 1, 12; 각 판의 왼쪽 및 오른쪽 열에서 발견 치료 웰 스 A H 통해)입니다.</li>
	<li>커버 알루미늄 호 일로 희석된 라이브러리 접시 하 고 장기 저장을 위한-80 ° C 냉장고를 원래 라이브러리 접시를 반환 합니다.</li>
</ol>6. 약 스크린
참고: DMSO 치료 셀 설정 기준 형광 게이팅 조정 하는 사용 되어야 한다.
<ol><li>5 x 103 셀 완전 한 신경 줄기 세포 성장 매체의 99 µ L에서 96 multiwell 격판덮개에 격판덮개.</li>
	<li>12 채널 멀티 채널 pipettor를 사용 하 여 셀 2 µ M (세포 현 탁 액의 99 µ L에 0.2 m m 약 1 µ L)의 최종 농도에 희석된 라이브러리 화합물 또는 DMSO (제어) 취급 합니다. 37 ° C, 5% CO2에서 72 h에 대 한 번호판을 품 어.</li>
	<li>12 채널 멀티 채널 pipettor를 사용 하 여 각 잘 하 셀 분리 시 약의 150 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 20 분 동안 품 어</li>
	<li>단일 셀 서 스 펜 션 (20 ~ 30 번) 사이 보통 달성 될 때까지 부드럽게 12 채널 멀티 채널 pipettor 함께 분쇄 하 여 세포를 분리. Neurospheres를 완전히 분리 하는 데 필요한 시간의 양을 GSC 라인 사이 달라질 수 있습니다. 권장된 셀 분리 시 안전은 (자료 참조) 최대 45 분간 인큐베이션 했다 생존 능력에 영향을 주지 않습니다 여러 GSC 라인 테스트 하는 동안 심사에 사용 될 각 GSC 라인에 대 한 확인 합니다. 참고: 각 최종 볼륨 잘 이어야 한다 대략 250 µ L (세포 현 탁 액의 100 µ L +의 세포 분리 시 약 150 µ L).</li>
	<li>GFAP:GFP 기자 cytometry로 표현 하는 세포의 백분율을 결정 합니다. 표준 제어 전략을 사용 합니다. 먼저, 셀 크기와 생존의 일반적인 감각을 얻을 하 고 측면 없앤다 플롯. 다음 가능한 단일 세포 인구에 게이트를 놓습니다. 이것은 인구 녹색 형광 (eGFP) 결정 됩니다. "히트" 긍정적으로 간주 됩니다 (DMSO 처리) 어떤 화합물 GFP-긍정적인의 비율에 있는 증가 세포 3 표준 편차에 의해 제어 이 임계값에 따라 특정 응용 프로그램 및 원하는 엄중 조정 되어야 한다. 참고: 높은 처리량에 대 한 스크린은 권장 단일 GSC 기자 subclone를 사용 하 여. 히트 식별 다음 각 히트 같은 GSC 선에서 추가 기자 subclones에 대 한 확인 되어야 합니다. 사실 조회에 대 한 신뢰도 증가 하는 또한 것이 좋습니다 라인 다른 GSC neurospheres에서 격리 화합물 기자 subclones에 대 한 테스트.</li>
</ol>

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<li>Meyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell-derived+clonal+analysis+of+human+glioblastoma+links+functional+and+genomic+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 851-856 (2015).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

그들을 정의 하는 표식에 주로 집중 하는 GSCs의 이전 연구의 대부분,이 연구에서 우리가 결정 역 접근 하는 것. 우리는 GSCs (예를 들어, 셀 astroglial와 신경 마커)에 의해 생성 된 차별화 된 progenies에 주로 집중 한다. 여기 우리 인간의 GFAP 발기인 종속 식을 GFP의 기반 시스템 심사 높은 처리량 셀 기반 약물의 사용을 보여 줍니다. 모든 실험 환자 파생 neurosphere 세포종 세포 라인을 활용 하 여 수행 했다. 분리와이 라인의 확장을 설명 하는 상세한 프로토콜 Galli 외17에 설명 되어 있습니다.
시스템 뿐만 아니라 GSCs의 세포 분화를 유도 할 수 있다 그러나 또한 도움이 우리가 astroglial 분화 마커 GFAP 표현 결정 명백 하 게 결정 하는 작은 분자의 식별에 우리를 원조는 GSC 주파수를 비교 하 여 개별 GBM 셀의 clonogenic 용량. ELDA 분석 ...

최근 연구는 작은 인구를 포함 하는 종양 세포, 암 줄기 세포 (CSCs) 또는 시작 하는 종양 세포 나의 종양 진행, 전이, 그리고 항 암 치료 및 라디오 치료 1, 저항에 대 한 책임은 2. 암 줄기 세포 및 종양 내의 그들의 분화 progenies intratumoral이 추진 하는 중요 한 요소를 간주 하 고 따라서 암3치료에 주요 장애물을 나타냅니다. 종양 세포 계층, 암 줄기 세포 이론에 의해 제공 된 치료 암 4새로운 전략의 개발 영감 하고있다. 암 줄기 세포를 대상으로 하는 한 가지 방법은 식별 하 고 영향을 받는 장기의 배아 발달 동안에 필요한 것으로 알려져 있습니다 신호 경로 억제 하는 것입니다. 사실, 우리와 다른 사람 신경 줄기 세포 관련 신호 경로 소닉 고슴도치와 노치 세포종5,,67에 대 한 지속적인 요구를 설명 하는 여러 논문을 출판 이전 했습니다. 이 작품은 여러 GBM 임상 시험에 대 한 근거를 응고에 도움이 되었습니다. 암 줄기 세포를 대상으로 두 번째 방법은 그들의 차별화 홍보 하는 것입니다. 이 방법은 retinoic 산 (ATRA, 비타민 A 아날로그)와 급성 promyelocytic 백혈병 치료에 전 임상 및 임상 연구에서 유리한 결과로 인해 지원 많이 받았습니다. 여기 ATRA 성숙 블록을 제거 하 고 암 세포 감 별 법8촉진 발견 됐다. 더 최근에, Piccirillo와 동료 우아하게 나타났습니다 BMP-4 중요 한 안티-GBM 효과 생체 외에서 그리고 vivo에서9이다에 GSC 차별화를 촉진.
현재 연구에 대 한 근거 GSCs를 대상으로 "역된 공학" 접근을 기반으로 합니다. GBM와 암의 특징 중 하나 되 고 불 쌍 한 차별화와 광대 한이 감안할 때, 우리는 경우 우리는 호의 베푸는 표현 형-사이토와 같은 상태로 차별화 홍보 수 물었다. 여기, 우리가 특정된 종양 견본에서 GSCs를 유지 하지만 오히려 원하는 표현 형 (예: GFAP 양성) 달성을 목표로 하는 신호 통로의 사전 지식이 필요가 없습니다.
이 보고서는 GSC 차별화 기자-라인 GSC 농축 문화 변환에서 GSC 클론 선택 영역을 설정 하는 데 사용 하는 절차를 설명 합니다. 세포종 neurosphere 라인 사용 병원 산 라파엘 레-밀라노, 이탈리아에서 기본 세포종의 진단 가진 환자에서 교수 안젤로 Vescovi의 실험실에서 설립 되었다. 이 라인은 여러 간행물 6,10,,1112,13,14에서 광범위 하 게 연구 되었습니다. 그들의 실험실에서 이러한 기술을 구현에 관심이 있는 개인 공부를 계획 하는 세포에서 암 줄기 세포 자체 갱신 용량 기자의 관련성 확인 것이 좋습니다 (이 어떤 기자). 생체 외에서 clonogenic 분석 실험은 분야에서 허용 중 하나에 대 한 자세한 프로토콜이15,16을 달성 하기 위해 제공 됩니다. 마지막으로, cytometry 기반 약 스크린에 차별화 기자-라인의 활용을 설명 하는 상세한 프로토콜 끝에 제공 됩니다. 노트, 마찬가지로 astroglial 차별화 시스템 설명, 우리 성공적으로 설립 하 고 GSC 기자 라인 MAP2:GFP (신경 분화) 기자를 통합 검증. 따라서,이 방법론 설명 종이 다양 한 세포 계보에 세포 분화 연구에 적용할 수 있습니다.
이 보고서에 있는 숫자 중 일부는 최근 간행물에서 찾을 수 있습니다: "Atracurium Besylate 다른 신경 근육 차단 에이전트 astroglial 차별화 홍보 및 세포종 줄기 세포18고갈.

<table><tbody><tr><td>ESGRO Complete Accutase</td><td>EMD Millipore</td><td>SF006</td><td></td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드(DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Human GFAP Differentiation Reporter(pGreenZeo, 바이러스)</td><td>SBI(System Biosciences)</td><td>SR10015VA-1</td><td></td></tr><tr><td>50ml 멸균 일회용 시약 저수지</td><td>Corning</td><td>4870</td><td></td></tr><tr><td>6 웰 플레이트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130184</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 플레이트</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Biolite T25 cm&sup2; 플라스크 벤티드</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>130189</td><td></td></tr><tr><td>바이올라이트 T75 cm&sup2; 플라스크 벤티드</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>130190</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 원심분리기 튜브</td><td>Celltreat</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Ovation 멀티 채널 피펫, 12 채널, 0.5 - 20uL</td><td>VistaLab Technologies</td><td>1060-0020</td><td></td></tr><tr><td>Ovation 멀티 채널 피펫, 12 채널, 5-250uL</td><td>VistaLab Technologies</td><td>1060-0250</td><td></td></tr><tr><td>멀티 12채널 피펫 팁 25 &mu; l</td><td>VistaLab Technologies</td><td>4060-1002</td><td></td></tr><tr><td>멀티 12채널 피펫 팁 250 &mu; l</td><td>VistaLab Technologies</td><td>4060-9025</td><td></td></tr><tr><td>Guava easyCyte 5HT 벤치탑 유세포 분석기</td><td>EMD Millipore</td><td>0500-4005</td><td></td></tr><tr><td>NIH Clinical Collections 1 및 2 small molecule libraries</td><td>Evotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>신경 줄기 세포 배지(500mL) 제조용</td><td></td><td></td><td>최종 농도</td></tr><tr><td>BSA</td><td>GoldBio.com</td><td>A-421-250</td><td>0.20%</td></tr><tr><td>DMEM/F12 10X</td><td>Corning</td><td>90-091-PB</td><td>1X</td></tr><tr><td>헤파린 나트륨 염</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149</td><td>0.0002%</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4036</td><td>5.4 mM</td></tr><tr><td>인슐린-트랜스페린- 셀레늄 (ITS -G) (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>41400-045</td><td>1X</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>시그마 알드리치</td><td>S-5761</td><td>14.5 mM</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL) 100X</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>1X</td></tr><tr><td>프로게스테론</td><td>시그마 알드리치</td><td>P8783</td><td>16 nM</td></tr><tr><td>푸트레신</td><td>시그마 알드리치</td><td>P5780</td><td>4.8 &마이크로; M</td></tr><tr><td>Basic FGF (FGF2), Human</td><td>GoldBio</td><td>1140-02-50</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>EGF, Human</td><td>GoldBio</td><td>1150-04-100</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>보틀탑 필터, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind</td><td>Corning</td><td>431160</td><td>Sterlize 매체를 필터링하는 데 사용</td></tr></tbody></table>

교류 cytometry 기반 약물 세포종 줄기 세포의 세포 분화를 촉진 하는 작은 분자의 식별에 대 한 시스템 검사

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

세포종 (GBM)은 미국 에서만 매년 약 14000 죽음을 일으키는 원인이 되는 성인에서 가장 일반적이 고 가장 치명적인 기본 뇌 종양. 메디아 생존 진단 다음 최대한 외과 절제술, 방사선 및 temozolomide 요법으로 15 개월 미만 이다. 더 효과적인 GBM 치료법 개발에 도전 점점 더 분명 되 고 등의 탄력성이 침입, 표준 치료에 그것의 저항, 그것의 복잡 한 유전 및 분자 적응성, GBM의 모집단 정상 줄기 세포, phenotypic 유사성과 셀 본 세포종 줄기 세포 (GSCs) 라고. GSCs 종양 성장 및 진행을 위해 필요 하기 때문에 차별화에 기초를 둔 치료가 불 치의 신생에 대 한 가능한 치료 양식 적임을 나타냅니다.
다음 프로토콜 플랫폼 GSC astroglial 차별화를 홍보 하는 작은 분자의 식별 목적으로 상영 높은 처리량을 설정 하는 절차의 컬렉션을 설명 합니다. 시스템의 핵심에는 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP) 차별화 기자-구문입니다. 다음과 같은 일반적인 절차를 포함 하는 프로토콜: (1) 설립 GSC 차별화 기자 라인; (2) 테스트/유효성 검사 GSC 자체-갱신/clonogenic 용량; 기자의 관련성 그리고 (3) 높은-용량 cytometry 마약 검사를 기반으로.
심사 플랫폼 GSCs 차별화를 홍보 하는 작은 분자를 식별 하는 간단 하 고 저렴 한 접근을 제공 합니다. 또한, FDA 승인 약품의 라이브러리의 활용 더 급속 하 게 내리거나 수 에이전트의 식별에 대 한 가능성을 보유 하고있다. 또한, 암 줄기 세포 분화를 촉진 하는 치료 대상 및 주로 더 차별화 된 암 세포를 제거 하기 위해 표시 되었습니다 현재 "표준 치료" 치료 공동 성으로 작동 하도록 예상 된다.

3 개의 독립적인 환자 파생 neurospheres 라인 Zeocin 저항 카세트 녹색 형광 단백질 (GFP) 융합에 프레임에 대 한 인코딩 lentivirus astroglial 기자와 불리고 되었고 인간의 GFAP 발기인 요소 ( 에 의해 구동 그림 1). 다음 개별 클론 96 잘 접시 (그림 2)에 잘 당 0.7 셀을 도금 하 여 고립 되었다,이 GFP (그림 3)를 표현 하는 세포의 백분율의 흐름 cytometric 결정에 의해 그 뒤를 이었다. Neurosphere 클론, ≤ 5 %GFP-긍정적인 세포를 포함 하는 단일 셀에서 파생 이라고 GL (GFAP 낮은) ≥75 %GFP 긍정적인 세포를 포함 하는 클론 GH (GFAP 높은) 라고 하 고는 GL에 비해 더 분화 될 것으로 간주 됩니다. subclo...

효율적인 심사 프로토콜 astroglial 분화 세포종 줄기 세포 (GSCs)에 홍보 하는 작은 분자의 식별을 위해 제공 됩니다. 분석 결과 줄기 세포 감 별 법 기자에 의하여 향상 된 GFP (eGFP)의 식을 인간의 GFAP 발기인에 의해 구동 됩니다 기반으로 합니다.

교류 Cytometry 기반 약물 세포종 줄기 세포의 세포 분화를 촉진 하는 작은 분자의 식별에 대 한 시스템 검사

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

이 절차의 전반적인 목표는 교모세포종 줄기세포의 성상교세포 분화를 촉진하는 약물을 찾기 위해 소분자 라이브러리를 스크리닝하는 것입니다. 이 방법은 교모세포종 줄기세포를 미분화 상태로 유지하는 데 필요한 신호 전달 경로가 무엇인지와 같은 암 줄기세포 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술을 적절히 수행하면 교모세포종 줄기세포 분화를 촉진하는 소분자를 간단하게 식별할 수 있습니다.이 기술의 함의는 에흘러스-단로스 교모세포종 치료로까지 확장될 수 있는데, 이는 교모세포종 줄기세포의 비율을 낮춤으로써 재발 가능성을 줄일 수 있기 때문입니다. 또한 이 방법은 다른 리포터 컨스트럭트를 사용하여 다른 세포 계보로의 분화를 유도하는 설정에도 적용될 수 있습니다. 본 보고서는 신경교종 줄기세포의 분화를 강제하는 약물을 스크리닝하기 위한 고처리량 접근 방식을 확립한 최초의 사례입니다.환자 유래 암세포에서 렌티바이러스 입자를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있습니다. 따라서 혈액 매개 병원체 취급을 위한 표준 절차를 항상 준수해야 합니다. 먼저, 6-well 플레이트에 2 mL의 완전 신경줄기세포 성장 배지를 사용하여 글리오블라스토마 줄기세포(GSC) 100만 개를 분주합니다.다음으로, 감염 다중도(MOI)를 5로 하여 렌티바이러스 리포터를 세포에 형질도입합니다. 세포와 바이러스 혼합물에 최종 농도가 8 µg/mL가 되도록 polybrene 2 µL를 첨가하고, 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 세포를 배양합니다. 배양 후, 결합되지 않은 바이러스를 제거하기 위해 성장 배지를 교체합니다.그리고 세포를 360 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거하고 세포를 6-well 플레이트에 다시 분주합니다. 이어서 세포를 24시간 동안 계속 배양합니다.전체 배양액 부피 중 0.5 milliliters를 수확합니다. 상온에서 360 times G로 5분간 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 세포를 0.5 milliliters의 신선한 신경줄기세포 성장배지에 다시 현탁합니다.플레이트를 배양기에 다시 넣고 최소 72시간 동안 확장 배양합니다. 해리 시약을 200 µL 첨가하고 37 °C로 설정된 항온수조에서 5분 동안 배양합니다. 피펫팅을 통해 부드럽게 상하로 섞어 세포를 해리시킵니다.분리된 세포에 HBSS 800 µL를 첨가하여 세포 부착이나 응집을 최소화합니다. 다음으로

flow-cytometry-based-drug-screening-system-for-identification-small

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오 프로토콜은 세포 분열의 주파수에 따라 인간 glioblastoma의 셀의 다른 하위 집단의 식별 및 분리를위한 형광 염료 carboxyfluorescein succinimidyl 에스테르 (CFSE)의 응용 프로그램을 보여줍니다.

카르복시 Fluorescein Succinimidyl 에스터 (CFSE)를 사용 인간 Glioblastoma의 속도가 느린 - 나누면 전지의 식별 및 분리

이 비디오에서는 약물의 민감하고 신속한 스크리닝을 위한 생물 발광 분석의 유용성을 강조하는 방법에 대해 설명합니다. 이러한 약물은 단독으로 또는 조합하여 작용 방식의 시너지 효과를 평가할 수 있습니다.

세포 생물 발광 기반 분석법: 조합 약물 스크리닝을 위한 고처리량 방법

이 비디오는 교모세포종 줄기세포(GSC)의 성상아교세포로의 분화를 식별하기 위해 교모세포종 줄기세포 리포터 라인을 생성하는 기술을 보여줍니다. GSC 파종, GFP를 인코딩하는 렌티바이러스로 transduction, 유세포 분석을 통한 GFP 리포터 발현 측정과 관련된 단계를 간략하게 설명합니다.

교모세포종 줄기세포 분화 리포터 라인을 생성하기 위한 렌티바이러스 전사 리포터 시스템

혈청이 없는 신경권 배지에서 해리된 고급 신경종 수술 용 시편을 전파하여 암 줄기 세포 표현형을 가진 세포를 선택한다. 신경구로 성장하지 못하는 표본의 경우 대체 프로토콜이 제안됩니다. 면역 세포화학을 위한 3D 신경구 아키텍처를 유지하기 위한 파라핀 임베딩 기술이 설명된다.

임상적으로 관련동물 모델 및 3D 면역화학에 사용하기 위한 외과 표본에서 고학년 신경교종 세포 배양의 최적화

전임상 시험에서 인간 대상 시험으로 전환되는 새로운 약물 표적을 식별하는 것은 과학적인 우선 순위입니다. 이를 위해 여기에서는 유전자 고갈이 암 세포주 스페로이드에 미치는 영향을 조사하기 위한 기능적 유전체학 접근 방식을 설명하며, 이는 생체 내에서 인간 암을 보다 적절하게 모델링합니다.

기능 유전체학에게 검사를 활용하여 암 세포 회전 타원체 문화에 잠재적으로 소설 약 표적을 식별하는

우리는 현재의 연구에서 형질 전환 마우스에서 파생 된 림프구를 사용하여 새로운 형광 기반의 분석을 제시한다. 이 분석은 억제 또는 림프구의 활성을 촉진하거나 용량을 부여 소분자의 고 처리량 스크리닝 (HTS)에 적합하다.

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

이 프로토콜은 약물 을 평가하기 위해 증식, 세포 독성 테스트, 유세포 분석, 면역 형광 염색 및 공초점 이미징의 정량화를 포함한 환자 유래 스페로이드 생성 및 하류 분석을 설명합니다. 반대로 신생물 치료제로 후보자의 잠재력. 이 프로토콜은 각 환자 및 질병 단계에 대한 특정 약물을 식별하여 정밀 의학을 지원합니다.

암 줄기 세포를 표적으로 하는 반대로 신 생물 성 약 검열을 위한 생리학 환자 파생된 3D Spheroids

신경교종 줄기 세포 (GSC)는 가장 널리 퍼진 파괴적인 1 차뇌종양인 교모세포종 (GBM)에서 종양 개시, 혈관 신생 및 약물 내성에서 필수적인 역할을하는 암세포의 작은 부분입니다. GSC의 존재는 GBM개별 표적 에이전트의 대부분에 아주 불응성, 그래서 높은 처리량 검열 방법은 잠재적인 효과적인 조합 치료제를 확인하기 위하여 요구됩니다. 프로토콜은 시너지 상호 작용을 가진 잠재적인 조합 치료를 위한 신속한 검열을 가능하게 하는 간단한 워크플로우를 설명합니다. 이 워크플로우의 일반적인 단계는 루시파아제 태그가 지정된 GSC를 확립하고, 마모젤 코팅 플레이트를 준비하고, 조합 약물 검사, 분석 및 결과 유효성을 검사하는 것으로 구성됩니다.

환자 유래 신경종 줄기 세포를 사용하여 GBM에 대한 잠재적인 조합 요법을 식별하는 신속한 선별 워크플로우

여기에서 우리는 세포외 플럭스 분석을 통해 3차원(3D) 신경아교종 스페로이드와 이미징 기반 정규화를 통합하는 대사 프로파일링 플랫폼을 구축합니다. 이 접근법을 통해 약물 치료에 대한 종양 대사 반응을 보다 정확하게 평가할 수 있으며 잠재적인 내성 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

약물 스크리닝을 위한 3차원 뇌종양 스페로이드의 대사 프로파일링의 발전

우리는 새로 진단되고 재발한 종양에서 생성된 환자 유도 자기 교모세포를 이용한 3D 교모세포종 이동 모델을 제시합니다. 이 플랫폼은 환자별 이동 역학을 시각화하고 치료 효과 평가를 가능하게 합니다. 이 분석법은 이동 후 다중화되어 단백질 위치와 발현 패턴을 평가할 수 있습니다.

저산소 조건에서 자기 나노입자를 이용한 구형 위치 측정을 이용한 재현 가능한 3D 교모세포종 이동 검사

배우세요 교류 Cytometry를 활용한 교모세포종 줄기 세포의 성상교세포 분화 촉진 소분자 물질 고속 스크리닝 방법입니다. GFAP:GFP 리포터 시스템으로 분화 유도 효과를 정량 분석하여 재발 가능성을 낮추는 치료 전략 개발에 활용할 수 있습니다.

교류 Cytometry 기반 약물 세포종 줄기 세포의 세포 분화를 촉진 하는 작은 분자의 식별에 대 한 시스템 검사

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