Name: 초파리 Melanogaster 성인 간접 비행 근육의 광 단면 근육 면적 결정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: 학습하세요 Drosophila 성인 간접 비행 근육의 광 단면 근육 면적 결정 방법을 통해 근육 질량을 간접 정량화하고 근위축을 분석하는 기술을 익히세요. 이 방법은 유전적 근육 질환 연구에 활용됩니다.

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저자는이 프로토콜에 피드 백 및 개선에 대 한 변환 유전체학 그룹과 캐서린 J 핸 슨의 회원을 감사 하 고 싶습니다. 이 프로젝트는 연구 그랜트 SAF2015-64500-R, 유럽 지역 개발 기금, R.A 정부의 드 Economia y Competitividad에 의해 수 여를 포함 실시 했다.

1. 고정 및 수 지 포함
<ol><li>이산화탄소 (CO2) 또는 저체온증 얼음 블록을 사용 하 여 통해 파리 anesthetize (전체 비행을 보고 낮은 확대)와 함께 해 현미경과가 위를 사용 하 여 다리, 날개, 머리와 복 부는 정착 액의 침투를 촉진 하기 위하여의 터미널 부분을 제거 하. 시체의 신중한 처리는 흉부의 변형 방지 하려면이 단계에서 필요 합니다. 참고: 프로시저의 끝에서 제대로 처리 된 개인의 충분 한 숫자를 보장 하기 위해 유전자 당 최소 12 파리와 시작.</li>
	<li>솔루션 1의 얼음 (관 당 6 개인의 최대 배치) 포함 200 µ L에 1.5 mL 튜브에 시체를 전송. 참고: 시체 20 분 이상에 대 한 솔루션 1에에서 남아 있을 수 없습니다.<ol>
<li>솔루션 1에 대 한 혼합이 볼륨 비율 구성 요소: ¼ 4 %paraformaldehyde, ¼ 8%도, ¼ 0.2 M 나2HPO4 및 ¼ 0.2 M NaH2포4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>솔루션 2의 200 µ L을 추가 하 고 30 분 동안 얼음에 품 어.<ol>
<li>해결 방법 2: 솔루션 1과 1:1 (v/v) 비율에 OsO4 혼합. 주의: OsO4 매우 독성이 있다. 적절 한 안전 및 폐기 조치 증기 두건에서 그것을 조작 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>모든 액체를 제거 합니다. 솔루션 2의 200 µ L을 추가 하 고 1-2 h에 대 한 얼음에 품 어.</li>
	<li>솔루션을 제거 하 고 다음과 같이 등급된 에탄올 시리즈를 통해 샘플을 탈수: 한 번에 30%, 50%, 70%, 90%, 그리고 두 번에 절대 에타 놀; 5 분 각입니다. 샘플을 커버 하는 에탄올의 1 mL를 추가 합니다. 참고: 지금까지 조직 90% 에탄올에 배치 되 면에 후속 단계에서 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>각 인큐베이션 10 분에 대 한 프로필 렌 산화물에 두 번 샘플을 품 어. 주의: 프로필 렌 산화물 독성, 증기 두건에서 그것을 사용 하 여.</li>
	<li>1:1 (v/v) 혼합 에폭시 수 지 및 프로필 렌 산화물의 프로필 렌 산화물을 대체 하 고 하룻밤 실 온에서 품 어. 주의: 수 지는 액체 상태에서 매우 독성이 있다. 수 지는 4 개의 구성 요소 (A, B, C, D)의 집합으로 사용할 수 있습니다.<ol>
<li>에폭시 수 지에 대 한 추가 일회용 비 커의 수 지 (A), 경화제의 44.5 g 54 g (B), 가속기의 (C)와 가소제의 10 g 2.5 g (D). 증기 두건에 모든 수 지 구성 요소를 결합 합니다. Aliquots (최대 6 개월) 동안-20 ° C 또는-80 ° C에서 (몇 년)에 수 지를 저장 합니다.</li>
		<li>수 지 폐기, 구워 그것 24 h 70 ° C에서 고체 수 지는 독성이 있기 때문에. 솔루션 OsO의 흔적을 포함 될 수 있으므로 적절 한 국제 절차에 따라 중 금속 그룹에 모든 이전 솔루션을 삭제4.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>100% 수 지, 이전 혼합물을 장착 하 고 4 h에 대 한 샘플을 품 어.</li>
	<li>새로운 수 지 (금형의 각 우물에서 한 시체)를 포함 하는 플라스틱 금형에 시체를 전송. 날카롭게 나무 막대기 또는 바늘을 전송 하 고 우물에 시체를 방향을 두고 하룻밤 70 ° c.에 파스퇴르 오븐에 유해를 수 지 사용 참고: 후부 트리밍 및 단면 시체의 적절 한 방향을 위해 시체 해야 거짓말 그들의 긴 측에 우물의 가장자리 가까이 매우 시체의 앞쪽 부분.</li>
</ol>2. 정돈 하 고 블록의 단면
<ol><li>금형에서 생산 수 지 블록을 제거 합니다. 면도날을 사용 하 여 수 지를 떨어져 트림 하 고 시체를 둘러싼 사다리꼴 모양을 형성 하 고는 톰에 적절 한 방향 제공. 비교 결과 얻으려면 가로 봉합 후 모든 시체를 단면 시작 합니다. 참고: 섹션은 샘플을 제대로 트림 DLMs의 anteroposterior 축에 수직 해야 합니다. ( 그림 3).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig3.jpg"> 그림 3 . Myotonic 영양 장애의 수 지 포함 성인 thoraces의 dorsoventral 섹션 모델 파리. (A), 샘플의 트리밍 섹션 이미지의 오른쪽 지 느 러 미 부분에는 근육을 완전히 횡단 잘못 되었습니다. 결과적으로, 오른쪽 상단에 3 개의 근육 뭉치는 왼쪽의 것 들 보다 더 큰 것. 이 실수 근육 영역의 귀 착될 것 이다. (B)는 제대로 트림된 수 지 블록에서 섹션. 눈금 막대: 200 µ m.
<ol><li>1.5 µ m는 ultramicrotome 두꺼운 섹션 잘라내어 gelatinized 슬라이드 위에 물 방울으로 섹션을 전송.<ol>
<li>비교 결과 얻기 위해 모든 샘플 mesothorax 세그먼트에서 섹션을 가져옵니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>H2O 증발 될 때까지 70-80 ° C에가 열 블록에 대 한 섹션을 포함 하는 슬라이드를 놓습니다. 이 시점에서, 샘플 OsO4 대조 (그림 4A)와 함께 관찰할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 얼룩 IFM 섹션
<ol><li>충분 한 톨루이 약 30 블루와 섹션 커버 열 블록에 s.<ol>
<li>톨루이 블루 솔루션에 대 한 해산 톨루이 블루의 1%와 1% 붕 사 H2o.</li>
	</ol>
</li>
	<li>H2O 헹 구 고 물을 증발 하는 따뜻한 접시에 슬라이드를 두고. 반복 하는 얼룩 톨루이와 블루 대비 해야 하는 경우 향상 된 (그림 4B).</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig4.jpg"> 그림 4 . 다른 대비 stainings와 수 지 포함 성인 thoraces의 dorsoventral 섹션. 두 패널 그림 2D로 Abp1를 품고 DM1 모델의 이미지를 표시 합니다. (A) 섹션 OsO4 대조의 이미지. (B) 섹션 톨루이 블루 물 근육 번들의 더 나은 시각화 수 있습니다. 눈금 막대: 200 µ m.
4. 장착 IFM 섹션
<ol><li>H2O 증발 될 때까지 난방 블록 슬라이드를 건조.</li>
	<li>섹션에 장착 매체의 1 또는 2 방울을 넣고는 coverslip에 넣어. 주의: 설치 매체는 독성 때문에 증기 두건에서이 단계를 실시 합니다.</li>
</ol>5. 이미지와 근육의 부 량 인수
<ol><li>DLM 근육의 전체 세트 초점에 되도록 낮은 확대에서 이미지를 받아. 우리는 일반적으로 10 배를 사용합니다.<ol>
<li>통계 분석에 대 한 비행 당 적어도 5 직렬 이미지 하 고 분석 하는 실험 그룹 당 적어도 5 파리.</li>
	</ol>
</li>
	<li>전체 근육 (그림 5A)를 포함 하는 이미지를 선택 합니다. 축 또는 섹션의 방향을 확인 하 고 결과 왜곡할 것 이다 부적 절 한 방향으로 샘플을 삭제 (비교 그림 3A / 3B 심하게 구분 하 고 잘 지향된 섹션, 각각).</li>
	<li>ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 선택 영역 (픽셀) DLMs (그림 5A/5B)를 포함 하. 다른 실험적인 그룹 간의 비교에 대 한 참조 영역을 사용할 수 항상 큰 근육과 비행 것입니다. 비교할 다른 genotypes의 모든 이미지에 DLMs 동일한 치수 참조 영역 (그림 5B)를의 포함 하는 영역을 선택 합니다.</li>
	<li>이미지-J 명령으로 이미지를 binarize: 프로세스/이진/확인 이진 분야 또는 관심 (그림 5C)의 근육에 일치 하지 않는 픽셀 삭제.<ol>
<li>Artefactual 검은 반점 근육 이외의 지역에 나타나는 경우, 명령 그리기 도구 와 그들을 삭제 하 고 지우개 기호를 선택 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig5.jpg"> 그림 5 . 근육 지역 결정을 위한 분석 절차 이미지. (A) 횡단 부분의 Myotonic 영양 장애 유형 1 모델은 DLM을 포함 하는 사각형으로 흉부 비행. (만 간접 비행 근육과 내장 (*)와 B) 선택 된 영역입니다. (C) Binarized 이미지입니다. 검정 영역은 관심의 근육에 해당합니다. 소장이 근육의 정확한 정량화에 대 한 삭제 되었습니다. 눈금 막대: 200 µ m.
<ol start="5"><li>근육 조직 (검은 픽셀) 명령으로 총 중에 해당 하는 픽셀의 비율 계량: 분석/측정 및 선택 옵션 영역 분수. 지역의이 비율은 각의 DLM 근육 질량의 추정 이다.</li>
</ol>

<ol><li>Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+indirect+flight+muscles+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of the indirect flight muscles of Drosophila.</a> Development. 113, 67-77 (1991).</li>
<li>Fernandes, J. J., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+the+dorsal+longitudinal+flight+muscles+%28DLM%29+of+Drosophila%3A+insights+from+the+ablation+of+larval+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds.</a> Development. 122, 3755-3763 (1996).</li>
<li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.sdbonline.org/sites/fly/atlas/00atlas.htm">Atlas of Drosophila Development.</a> Atlas Drosoph. Dev. , 1-57 (1993).</li>
<li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fate+in+the+Drosophila+ommatidium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell fate in the Drosophila ommatidium.</a> Dev. Biol. 123, 264-275 (1987).</li>
<li>Griffith, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmium+Tetroxide+And+Its+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Platin+Met+Rev%22%5BJournal%5D)">Osmium Tetroxide And Its Applications.</a> Platin Met Rev. 18, 94-96 (1974).</li>
<li>Bird, T. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1165/">Myotonic Dystrophy Type 1.</a> GeneReviews. 1, 1-23 (1993).</li>
<li>Bargiela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+autophagy+and+apoptosis+contribute+to+muscle+atrophy+in+a+myotonic+dystrophy+type+1+Drosophila+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Increased autophagy and apoptosis contribute to muscle atrophy in a myotonic dystrophy type 1 Drosophila model.</a> Dis Model Mech. 8, 679-690 (2015).</li>
<li>Llamusi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscleblind%2C+BSF+and+TBPH+are+mislocalized+in+the+muscle+sarcomere+of+a+Drosophila+myotonic+dystrophy+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model.+Mech%22%5BJournal%5D)">Muscleblind, BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model.</a> Dis. Model. Mech. 6, 184-196 (2012).</li>
<li>García-López, A., Llamusí, B., Orzáez, M., Pérez-Payá, E., Artero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+discovery+of+a+peptide+that+prevents+CUG-RNA+hairpin+formation+and+reverses+RNA+toxicity+in+myotonic+dystrophy+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo discovery of a peptide that prevents CUG-RNA hairpin formation and reverses RNA toxicity in myotonic dystrophy models.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11866-11871 (2011).</li>
<li>van der Plas, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Dystrophin+is+required+for+integrity+of+the+musculature%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Drosophila Dystrophin is required for integrity of the musculature.</a> Mech. Dev. 124, 617-630 (2007).</li>
<li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flightless+flies%3A+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+New+York+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann New York Acad Sci. , 1184(2010).</li>
<li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+accurate+and+rapid+measurement+of+flight+performance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. , e51223(2014).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언.

초파리 melanogaster 인간의 신경 근육 학 질병7,,1011, Myotonic Dystrophies의 모양으로 특징을 포함 하 여 연구에 유용한 모델 임을 입증 되었습니다. 근육 위축입니다. 여기에 제시 된 프로토콜 발병 또는 플라이 모델에서 특정 질병의 진행으로 인 한 근육 퇴보를 측정을 위한 유용한 도구입니다. 예를 들어 따라 다양 한 연령대의 파리에서이 분석을 수행 하 여 근육 섬유의 변성을 계량 하 이기도 합니다.
프로토콜에 중요 한 단계가 있습니다. 그들의 고정 하기 전에 파리를 해 부 하는 데 필요한 시간이 조직의 저하를 방지를 최소화 시켜야 한다. (그림 6) 근육에서 통 솔루션의 침투에 대 한 제거 머리, 날개, 다리의 내부에 솔루션에 대 한 액...

과일 파리의 흉부 비행 근육, 기능, 생리학 및 해부학 적 구분의 두 개의 서로 다른 클래스를 포함 합니다. 이 근육은: dorso 경도 (DLM)와 (DVM) dorso-복 부 근육 (그림 1), 및 동기 비행으로 구성 된 간접 비행 근육 (IFM), 제어 근육1,2. 이 근육은 함께 비행에 필요한 높은 기계적인 힘을 생성 합니다. 크기, 분포 및 rostro 꼬리 처리는 IFMs의 횡단 단면3 (그림 2A)에 대 한 쉬운 방향을 허용. 이러한 이유로, 우리는 이러한 근육 근육 위축 초파리 melanogaster에서 공부 하를 선택 했습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig1.jpg"> 그림 1입니다. 보여주는 간접적인 비행 근육 (IFMs) 배열 하는 과일 파리의 흉부의 도표. (왼쪽) 측면 보기 나타내고 (오른쪽) 가슴의 크로스 섹션을 나타냅니다. IFMs (레드)에서 Dorso 경도 (DLM) 근육의 구성 그리고 Dorso-복 부 (DVM) (녹색)에 근육.
조직 구조 및 조직학 섹션의 dorso 복 부 축 방향 제어할 보존 근육 단면적의 적절 한 평가 위해 중요 하다. 근육 구조를 유지 하기 위해 사용 하는 톰 린 슨 외 에서 수정 고정 혼합물 4 . 또한, 근육 내부 조직 이기 때문에, 초파리의 외 골격의 불 침투성 혼합물 대상 조직에 침투 수 없습니다 고정으로 문제를 이다. 이 문제를 회피, 비행 머리, 다리, 날개와 고정 혼합 입력을 허용 하는 구멍을 만드는 복 부의 마지막 2 개의 세그먼트를 제거 했습니다. 우리는 오스뮴 tetroxide (OsO4)5, 광범위 하 게 사용 되는 기능 지방을 수정 하는 치료를 포함 하는 고정 프로토콜의 일환으로 트리 글리세라이드를 포함 하 여. OsO4 cytological 수준에서 특히 매우 잘 대부분의 구조를 유지 하 고 동시에 이미지에 대 한 대비를 제공 합니다. 고정, 후 초파리 thoraces 횡단 반 얇은 단면 (1.5 µ m)에 대 한 수 지에 포함 했다. 향상 된 대비에 대 한 조직의 수 또한 얼룩이 질 톨루이와 블루. 완전 한 thoraces의 이미지 10 배에서 찍은 하 고 근육 지역 binarizing (같은 크기)의 이미지와 총 ImageJ 소프트웨어와 함께 근육 조직 (검은 픽셀)에 해당 하는 픽셀의 비율을 측정 하 여 계량 했다.
OsO4 와 솔루션 도입이 프로토콜의 농도의 증가 조직 준비 및 고정 혼합물에 수정 허용 근육 조직의 고유 보존. 이 프로토콜 저하 및 Myotonic 영양 장애 (DM) 등 신경 근육 퇴행 성 질환과 관련 된 매우 위축 한 조건에도 더 신뢰할 수 있는 샘플의 사후 분석을 만드는 조직의 변형 방지 때문입니다. 더 일반적인 형태로 DM 타입-1,이 희귀 한 유전적 장애 myotonic 영양 단백질 키 니 아 제 (DMPK) 성적표에 확장된 CUG 반복에 대 한 가져온입니다. 돌연변이 DMPK RNA 격리 Muscleblind 같은 핵 RNA 의무적인 단백질 (MBNL1-3; 폼 ribonuclear foci 집계 초파리에서 Muscleblind (Mbl))6. 근육 myosin 무거운 체인 발기인 (Mhc-Gal4)에서 250 CTG 반복 표현 하 여 Myotonic 영양의 초파리 모델을 생성 했습니다. 모델 파리 전형적인 최대 개최 '날개' 형으로 날지 되었고 심각한 근육 그들의 IFMs (그림 2B)에서 쇠 약 했다. 우리 연구실에서 수행 하는 이전 연구는 IFMs의 근육 영역의 결정이 모델 파리7근육 위축 증의 다른 화학 또는 유전 한정자의 효과 계량 하는 신뢰할 수 있는 방법을 나타났습니다. 예를 들어, C 250 CTG를 표현 하는 파리에는 근육에 반복 하는 Mbl isoform의 overexpression 격리 하 여 Mbl 고갈 DM1 pathogenesis8 (그림 2C) 트리거 요인으로, 근육의 구조를 달성. Abp1, 입증 된 안티-DM1 활동9 (그림 2D) hexapeptide와 파리 DM 모델 먹이 후에 근육 영역 구출 되었다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig2.jpg"> 그림 2입니다. 수 지 포함 성인 thoraces의 dorsoventral 섹션 부 량이 고 (A-D) 표시 관련 genotypes 초파리 melanogaster 의 간접 비행 근육. (A) 제어 (영웅) 난다. (B) 비 코딩 CTG 250의 표정 근육에 반복 (UAS-CTG(250)x) 제어 파리에 비해 DLMs에서 근육의 감소를 발생. (C)이 근육 위축 형 Muscleblind (MblC)의 overexpression에 의해 구출 되었다 (UAS-CTG (250) UAS MblC x) 및 (D) 먹이 (UAS-CTG (250) x Abp1)에 hexapeptide Abp1와 모델의 파리. 모든 이미지에 지 면 위에. Transgenes는 Myosin 중 연쇄 발기인 (Mhc)를 사용 하 여 근육을 주도 했다-Gal4. (E) 제어 파리에 상대적으로 근육의 비율의 정량화 차이가 상당한 했다 확인 했다. 히스토그램 표시 수단 ± S.E.M. * *p< 0.01와 * p < 0.05 (Student´s t-검정). 눈금 막대: 200 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56179/56179fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
여기 보고 방법은 근육 개발, 유지 보수 및 노화, 질병 병 리 및 마약 테스트 근육 조직 내 생 및 외부 요인에 응답 하는 방법에 대 한 신뢰할 수 있는 정보를 제공 하기 때문에 연구원에 게 관심이 될 것입니다.

<table><tbody><tr><td>Image-J 소프트웨어</td><td>, National Institutes of Health</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>초박 절편기</td>, <td>Leica Leica</td><td>UC6</td><td></td></tr>, <tr><td>현미경</td>, <td>Leica Leica</td><td>MZ6</td>, <td>명시야 기술.</td></tr><tr><td>면도날</td><td>전자 현미경 과학</td><td>71970</td><td>여러 대체 제공 업체가 있습니다.</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>World Precision World</td><td>14003</td><td>여러 대체 공급자가 있습니다.</td></tr><tr><td>임베딩 금형</td><td>전자 현미경 과학</td><td>70900</td><td>여러 대체 제공 업체가 있습니다.</td></tr><tr><td>글루타르알데히드</td><td>플루카(시그마)</td><td>49624</td><td>독성.</td></tr><tr><td>OsO4</td><td>Polyscience</td><td>0972A</td><td>매우 독성이 있습니다.</td></tr><tr><td>프로필렌 옥사이드</td><td>시그마 알드리치</td><td>82320-250ML</td><td>매우 독성이 있습니다.</td></tr><tr><td>수지 (Durcupan)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44611-44614</td><td>중합되지 않은 경우 발암성.</td></tr><tr><td>Toluidine 블루</td><td>Panreac</td><td>251176</td><td>독성.</td></tr><tr><td>장착, 매체 (DPX)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>44581</td><td>위험.</td></tr><tr><td>파라포름 알데히드</td><td>시그마 알드리치</td><td>P6148-500G</td><td>유해한.</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Panreac</td><td>122507</td><td>0.2M 희석.</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Panreac</td><td>121677</td><td>0.2M 희석.</td></tr><tr><td>붕사</td><td>Panreac</td><td>3052</td><td>독성.</td></tr></tbody></table>

초파리 melanogaster 성인 간접 비행 근육의 광 단면 근육 면적 결정

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

근육 질량을 낭비 하 고, 근육 위축으로 알려진 신경 근육 학 질병의 초파리 모델에 일반적인 표현 형 이다. 우리는 파리, 특히 dorso 경도 근육 (DLM), 위축 형 다른 유전적 원인에 의해 초래 하는 측정 대상 실험으로 간접 비행 근육 (IFMs)를 사용 했습니다. 이 프로토콜에서 우리 반 얇은 단면에 대 한 비행 흉부 근육을 포함 하는 방법, 근육과 주위 조직 사이 좋은 대조를 방법 및 반자동 수집 가능한 데이터의 광학 현미경 이미지를 처리 하는 방법을 설명 하 고 분석입니다. 우리는 방법론 파이프라인의 세 가지 특정 응용 프로그램을 설명합니다. 첫째, 우리가 어떻게 방법 myotonic 영양 플라이 모델; 근육 퇴보를 계량에 적용할 수 있는 표시 둘째, 근육 단면적의 측정 홍보 하거나 근육 위축 및 근육 퇴보; 방지 유전자를 식별 하는 데 도움이 수 있습니다. 셋째,이 프로토콜 후보 화합물은 크게 질병 유발 돌연변이 의해 유도 된 주어진된 위축 한 표현 형을 수정할 수 있는지 여부를 결정에 적용할 수 있는또는 환경 방 아 쇠.

척도 MblC의 overexpression 또는 Abp1의 관리 Myotonic 영양 비행 모델의 위축 형에 어떤 영향을 미쳤다 여부를 우리가 IFMs (그림 1)의 일부인 DLMs에 집중 했다. 우리는 모델 파리는 Myosin 중 연쇄 발기인 (Mhc)에 의해 구동 하는 근육에 걸쳐 250 비 코딩 CTG 반복 표현 결정-Gal4, 파리 제어에 비해 근육의 50% 감소 했다. 반면, 동일한 드라이버 MblC 및 확장 된 CTG 반복의 공동 식 강력 하 게 억제 같은 표현 형 그리고 crossectional 근육 지역 제어 (일반)의 70%를 했다. 영양 미디어에서 Abp1 hexapeptide의 관리는 마찬가지로 위축 형, 그리고 화합물 DM1 파리;의 전형 50% (대신 정상적인 근육의 대략 60%를 보여준 찍은 모델 파리 억제 그림 2E)입니다...

우리는 초파리 성인 근육 질량을 결정 하는 간접적인 방법 근육 영역을 측정 하는 방법을 보고 합니다. 간접 비행을 분석 하 여 우리의 방법론의 응용 근육 Myotonic 영양 질병의 초파리 모델에서 설명 합니다.

초파리 Melanogaster 성인 간접 비행 근육의 광 단면 근육 면적 결정

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 성체 초파리(Drosophila) 근육의 단면적을 정량화하여 근육량을 간접적으로 측정하고, 근육의 생성 또는 위축 정도를 정확하게 파악하는 것입니다. 이를 위해 우리는 크기, 분포, 그리고 횡단면 절단 시 방향 설정이 쉽고 용이하다는 점을 고려하여 등쪽 세로근(dorsal longitudinal muscles)에 집중하였습니다. 첫 번째 단계는 고정 및 레진 포매입니다.절차의 첫 번째 단계는 CO2를 사용하여 파리를 마취시킨 후, 가위와 핀셋을 이용해 다리, 날개, 그리고 복부의 끝부분을 제거하는 것입니다. 둘째로, 흉부의 변형을 방지하기 위해 사체를 조심스럽게 얼음 위에 놓인 1.5 mL 튜브로 옮기며, 용액 1 200 µL가 들어 있는 튜브당 최대 6마리까지 넣습니다. 사체는 이 용액에 20분 이상 방치해서는 안 됩니다.마지막으로, 용액 2를 200 µL 첨가하고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 모든 액체를 제거하고 용액 2를 200 µL 다시 첨가한 뒤 사체를 얼음 위에서 1~2시간 동안 배양합니다. 다음 단계는 용액을 제거하고 단계별 에탄올 시리즈를 통해 샘플을 탈수시키는 것입니다.샘플을 프로필렌 옥사이드(propylene oxide)에 넣고 10분씩 두 번 배양합니다. 그 후, 프로필렌 옥사이드를 레진 500 µL와 프로필렌 옥사이드 500 µL의 혼합물로 교체하고 샘플을 실온에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 혼합물을 100% 레진으로 교체하고 샘플을 4시간 동안 배양합니다.그 후, 새로운 레진이 들어 있는 플라스틱 몰드에 사체를 옮기되, 몰드의 각 웰에 사체를 하나씩 넣으십시오. 나무 막대를 사용하여 웰 안의 사체 방향을 조절하고, 70 °C의 파스퇴르 오븐에서 하룻밤 동안 레진을 중합시킵니다. 고체 상태로 구워진 레진은 독성이 없으므로, 레진을 폐기하려면 70 °C에서 24시간 동안 굽습니다.둘째, 블록의 트리밍 및 섹셔닝 단계입니다. 면도날을 사용하여 레진을 깎아내고, 마이크로톰에서 적절한 방향을 잡을 수 있도록 사체 주변을 사다리꼴 모양으로 만듭니다. 현미경을 통해 근육의 방향이 완벽하게 정렬되었는지 확인하십시오.그 후, 울트라마이크로톰을 사용하여 1.5 µm 두께의 절편을 자르고, 이 절편들을 젤라틴 처리된 슬라이드 위의 물방울로 옮깁니다. 마지막으로, 절편이 놓인 슬라이드를 가열 블록의 70~80 °C에서 모든 물이 증발할 때까지 건조합

optical-cross-sectional-muscle-area-determination-drosophila

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

근육 손상을 기본 메커니즘의 확인이 중요합니다. 여기 파라핀 - 임베디드 및 Drosophila 흉부 근육의 부분을 냉동을 준비 histological 기술을 제시한다. 이것은 근육 형태학 및 단백질 및 기타 근육 세포 구성 요소의 로컬 리 제이션의 분석이 가능합니다.

의 파라핀 - 임베디드 및 냉동 섹션 Drosophila 성인 근육

성인의 준비 Drosophila</em씬 Sectioning 및 현미경 분석을위한> 눈

초파리 비행 근육은 근육 발달 및 생리학을 위한 모델 시스템으로 사용됩니다. 이 비디오는 성인의 비행 근육 조직에 대해 설명하고 번데기의 RNA 염기서열 분석에 적합한 간접 비행 근육 발달을 해부하는 프로토콜을 강조합니다.

초파리 Late Pupa IFM(Indirect Flight Muscle) 해부: 고처리량 조직 수집 방법

C. elegans는 단일 sarcomere 근육과 다중 sarcomere 또는 줄무늬 근육의 두 가지 유형의 근육을 가지고 있습니다. 이 비디오는 벌레의 운동을 담당하는 줄무늬 체벽 근육의 배열을 설명하고 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 근육 형태를 측정하기 위한 샘플 프로토콜을 포함합니다.

C. elegans 근육 면적 측정: 줄무늬 근육 형태를 정량화하기 위한 표준화된 방법

이 프로토콜, 초파리 간접 비행 근육의 미토 콘 드리 아 구조를 명료 하 게 직렬 섹션 전자 단층 촬영의 응용 프로그램 보여 줍니다.

3D 미토 콘 드 리아 열 대권 외의 직렬 섹션 전자 단층 촬영에 의해 밝혀 초파리 간접 비행 근육의

여기, 우리 라이브 이미징 일반 및 근육-힘 줄 morphogenesis 개발 프로세스의 특히 생활에서 수행 하는 쉬운--사용 하 고 다양 한 방법 제시 초파리 번데기.

Vivo에서 근육-힘 줄 Morphogenesis 초파리 번데기에의 이미징

여기에서, 우리는 비침습적이고 세부지향적인 방식으로 Drosophila 배아에서 배아 근육 수축을 기록하는 방법을 제시한다.

초파리 배아에서 근육 수축의 라이브 이미징 및 분석

초파리 비행 근육은 전사 조절, 대체 접합, 신진 대사 및 메카노생물학을 연구하는 강력한 모델입니다. 우리는 프로테오믹스및 깊은 시퀀싱에 이상적인 고농축 샘플을 생성하기 위해 살아있는 번데기에서 형광 표지된 비행 근육의 해부를 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 견본은 근육 발달의 다양한 양상에 중요한 기계론적인 통찰력을 제공할 수 있습니다.

오믹스 접근법에 대한 드로소필라 멜라노가스터 비행 근육의 해부

우리는 신경 근육 접합의 건축을 보존하고 성인 Drosophila 다리에 있는 운동 신경의 상세한 면역 세포화학 연구 를 가능하게 하는 해부 기술을 기술합니다.

확인된 모터 뉴런을 위한 신경근육 정션에서 변경을 검출하기 위하여 Drosophila 성인 다리의 해부 및 면역 조직 화학

여기에서는 패터닝 및 성장 결함을 정량화하기 위해 성인 초파리 눈의 고해상도 이미징을 위한 빠르고 저렴한 워크플로우를 제시합니다. 포인트 마운팅(point-mounting), 고해상도 이미지 획득(high-resolution image acquisition) 및 이미지 분석을 통한 시료 전처리를 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

외부 성체 초파리 구조의 정량화를 위한 빠르고 간단한 워크플로우

초파리는 근발생의 기본 메커니즘을 이해하는 강력한 모델입니다. 흉부 반절편 절편을 해부 및 준비하기 위한 이 프로토콜은 번데기 및 성인 단계 모두에서 간접 비행 근육의 현미경 분석을 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 세포 형태, 단백질 국소화, 근육 구조 및 근형성의 기타 여러 측면의 공초점 이미징을 가능하게 합니다.

현미경 접근을 위한 Drosophila melanogaster 간접 비행 근육의 해부

학습하세요 Drosophila 성인 간접 비행 근육의 광 단면 근육 면적 결정 방법을 통해 근육 질량을 간접 정량화하고 근위축을 분석하는 기술을 익히세요. 이 방법은 유전적 근육 질환 연구에 활용됩니다.

초파리 Melanogaster 성인 간접 비행 근육의 광 단면 근육 면적 결정

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