마비 및 비주얼 시스템 부상 Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4에 대 한 T 세포 관련 하 여 쥐에서의 유도

이 프로토콜의 전반적인 목표는 아쿠아포린 4 특이적 T 세포의 채택 전달을 통해 중추신경계 또는 CNS 자가면역 질환을 유발하고 CNS 및 동적 시각 시스템에 미치는 영향을 모니터링하는 것입니다. 이 방법은 일반적으로 AQP4로 알려진 아쿠아포린 4의 역할, 신경척수염 시신경 및 기타 염증성 시각 장애에서 특정 T 세포의 역할에 관한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 것입니다. 광간섭 단층촬영(optical coherence tomography)의 가장 큰 장점은 비침습적 방식으로 망막 손상에 대한 종단 모니터링을 수행할 수 있다는 것입니다.

제 연구실의 연구원인 Sharon Sagan과 RE Greens Laboratory의 연구원인 Andreas Cruz Harans가 절차를 시연할 것입니다. 플런저가 없는 유리 Luer 잠금 주사기에 두 개의 수 Luer 잠금 연결이 있는 3방향 나일론 마개를 부착하는 것으로 시작합니다. 스톱콕 레버를 주사기 쪽으로 전환하여 스톱콕을 닫고 열린 끝이 위를 향하도록 주사기를 배치합니다.

볼텍싱 후 1:1 부피의 펩타이드와 Complete Freund's Adjuvant 용액을 주사기에 첨가하고 유리 플런저를 주사기에 다시 삽입합니다. 플런저를 제자리에 잡고 스톱콕이 위를 향하도록 주사기를 뒤집고 레버를 사용하지 않는 암 연결부로 전환합니다. 플런저를 조심스럽게 눌러 주사기에서 과도한 공기를 제거합니다.

이 솔루션은 스톱콕의 두 번째 수 Luer 잠금 연결을 채웁니다. 그런 다음 플런저가 두 번째 수 Luer 잠금 연결부에 완전히 삽입된 두 번째 유리 주사기를 부착합니다. 에멀젼을 만들려면 플런저를 교대로 눌러 약 2분 동안 두 주사기 사이에 용액을 통과시키고 용액의 점도에 눈에 띄는 변화가 있을 때까지 약 10분 동안 용액을 냉각합니다.

매우 뻣뻣한 흰색 에멀젼이 형성되면 모든 용액을 주사기 중 하나로 옮기고 빈 주사기를 새로운 1mm Luer Lock 주사기로 교체합니다. 새 주사기에 에멀젼을 채웁니다. 마개에서 주사기를 제거하고 25게이지 바늘을 부착합니다.

에멀젼의 일관성을 위해 수중 테스트를 하려면 에멀젼 한 방울을 작은 물 접시에 넣으십시오. 에멀젼이 분산되지 않으면 주입에 적합합니다. 그런 다음 각 기증자 AQP4 녹아웃 마우스를 하복부의 각 측면과 겨드랑이 내측의 흉벽 각 측면에 한 번씩 피하주

면역 접종 후 10-12일 후에 사타구니부터 목까지 피부를 정중선으로 절개하고 첫 번째 마우스의 각 다리를 아래로 절개합니다. 복막에서 피부를 당겨 보드에 단단히 고정합니다. 그런 다음 서혜부 림프절과 겨드랑이 림프절을 채취하고 완전한 배지가 들어 있는 페트리 접시 안의 세포 여과기에 조직을 놓습니다.

모든 림프절이 채취되면 얼음 위에 새로운 완전한 배지가 들어 있는 50ml 원뿔형 튜브에 세포 여과기를 놓고 멸균 5ml 주사기 플런저의 평평한 끝을 사용하여 필터 메쉬를 통해 림프절 세포를 누릅니다. 세포 회수를 용이하게 하기 위해 20-30밀리리터의 완전한 배지로 메쉬를 헹군 다음 두 번의 원심분리 세척을 수행합니다. 두 번째 원심분리 후, 계수를 위해 펠릿을 T 세포 배지에 재현탁합니다.

적절한 농도의 항원, 재조합 마우스 인터루킨 마우스 23 및 재조합 마우스 IL-6을 세포에 첨가하고, 이 Th17 편광 혼합물의 웰당 2밀리리터의 세포를 12웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 5%CO2로 가습된 섭씨 37도 인큐베이터에 72시간 동안 놓습니다. 편광 3일째에 각 웰의 배양물을 몇 차례 분쇄하여 편광된 세포를 제거하고 계수를 위해 얼음 위의 50ml 원뿔형 튜브에 모읍니다.

PBS에서 2회 세척한 후, PBS에서 밀리리터당 8번째 세포 농도에 대해 1배의 10으로 세포를 희석하고 소용돌이치면서 세포 현탁액을 부드럽게 혼합합니다. 채취 후 1시간 이내에 세포를 1밀리리터 주사기로 옮기고 꼬리 정맥을 통해 각 수용 동물에게 200마이크로리터의 세포를 정맥 주사합니다. 그런 다음 각 마우스에 즉시 복강내로 주입하고 2일 후에 200마이크로리터의 PBS에 희석된 200나노그램의 B 백일해 독소를 주입합니다.

광간섭 단층촬영을 통한 수용 동물의 생체 내 망막 이미징을 위해 이미징 5분 전에 한쪽 눈당 1%트로피카마이드 한 방울로 동공을 확장하고 열 매트를 켭니다. 이미징 실린더에 마우스를 놓고 그에 따라 마취 흐름의 방향을 바꿉니다. 0.3% 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스로 눈을 보호하여 눈을 촉촉하게 유지하고 굴절 연속성을 보장하며 검사할 눈에 맞춤형 콘택트렌즈를 끼웁니다.

적외선 안저 이미지에 따라 레이저를 렌즈로 덮인 눈으로 향하게 하고 빔이 시신경두의 중심에 있도록 주의합니다. 고해상도 모드에서 25개의 B 스캔을 수행하고 30개의 평균 A 스캔에서 이미지를 래스터화합니다. 양쪽 눈을 촬영한 후 콘택트렌즈를 점안용 젤로 교체하고 마우스를 따뜻한 회복 케이지에 넣습니다.

자동 분할을 위해 모듈식 이미징 소프트웨어를 사용하여 획득한 이미지를 분석하려면 먼저 내부 한계 막과 내부 망상층에 해당하는 세그먼트를 수동으로 수정하여 내부 망막 층의 한계를 나타냅니다. 그런 다음 망막 신경 섬유층과 신경절 세포층이 내부 망막층의 한계 내에 있는지, 그리고 겹치지 않는지 확인합니다. 병원성 T 세포 항원결정기를 포함하는 AQP4 펩타이드를 사용한 피하 면역은 야생형 T 세포 반응에 비해 AQP4 녹아웃 마우스의 배액 림프절에서 강력한 증식 T 세포 반응을 유도합니다.

개별 V 베타 발현에 대한 유세포 분석은 병원성 T 세포 항원결정기를 포함하는 AQP4 펩타이드에 특이적인 T 세포가 고유한 TCR 레퍼토리를 활용하고, 이러한 결정 요인에 대한 병원성 T 세포 반응이 일반적으로 흉선 음성 선택에 의해 조절됨을 나타내는 선택적 과증식을 입증합니다. 편광 T 세포 주입 후 약 6-9일 후, 거의 모든 투여받은 마우스에서 절뚝거리는 꼬리와 뒷다리 마비를 포함한 CNS 자가면역 질환의 임상 징후가 나타났습니다. Th17 편광 AQP4 특이적 T 세포는 Th1 편광 AQP4 특이적 T 세포보다 더 심각한 임상 질환을 유발합니다.

예를 들어, 이 마우스는 Th17 편광 AQP4 펩타이드 특이적 T 세포 투여 후 완전한 뒷다리 마비가 발생했습니다. AQP4 펩타이드 특이적 Th17 세포에 의해 유발되는 임상 질환은 또한 시신경 염증뿐만 아니라 CNS 실질 및 수막으로의 단핵 세포의 침투와 관련이 있으며, 이는 마우스가 질병에서 회복됨에 따라 기준선으로 돌아가는 내부 망막층의 팽창 및 두께 증가에 의해 추가로 입증됩니다. 이 비디오를 시청한 후에는 AQP4 표적 자가면역을 유도하고 모니터링하는 방법을 잘 이해하게 될 것이며, 이를 통해 T 세포가 시신경척수염에 어떻게 참여하는지 이해하기 위한 추가 연구를 할 수 있습니다.