Name: 마비 및 비주얼 시스템 부상 Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4에 대 한 T 세포 관련 하 여 쥐에서의 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 학습하세요 AQP4 특이 T 세포 전이를 이용한 중추신경계 자가면역 질환 유도 및 광학 일관성 단층 촬영을 통한 망막 손상 비침습적 모니터링 방법. 이 기술은 뉴로마이엘리티스 옵티카 연구에 활용됩니다.

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지원 국가 다 발성 경화 증 사회 (RG 4768, RG 5179 및 RG 5180), Maisin 재단 및 Guthy 잭슨 자선 재단은 건강의 국립 연구소 (RO1 AI073737와 RO1 NS092835-01)에 의해 S.S.Z.를 제공 했다.

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소화기 세 이건, A. 크루즈-Herranz, 입방 미터 스펜서, 피 호, L. Steinman,이 그린, 그리고 R.A. 소블 아무 공개 보고. S.S. Zamvil 신경과, Neuroimmunology 및 Neuroinflammation의 부 편집장 이며 Neuroimmunology의 국제 사회에 대 한 자문 위원회의 회원입니다. 그는 임상 조사 저널, 면역학의 저널 및 신경 과학의 저널의편집 위원회에 봉사 했다 그리고 국가 기관에 대 한 부여 검토 위원회의 위원 되었습니다. 건강 (NIH) 임상 Neuroimmunology 및 뇌 종양 (CNBT)의 연구 섹션와 국가 다 발성 경화 증 사회 (NMSS). 그는 컨설턴트를 역임 및 honoraria 바이오 젠 Idec, EMD-세로 노, Genzyme, 노바 티 스, 로슈/Genentech, Teva 제약, 주식 회사, 그리고 봉사 했다 또는 릴리, BioMS, Teva 및 Opexa 치료제에 대 한 데이터 안전 모니터링 보드에 제공. 현재, 박사 Zamvil NIH, NMSS, Maisin 재단, 바이오 젠 및 Celgene에서 연구 보조금 지원을 받습니다.

AQP4는 20053NMO IgG에 주 대상으로 확인 되었습니다. 다음, 그것은 CNS autoimmunity의 AQP4 대상 동물 모델을 확립 하는 것이 중요 될 것 이라고 인정 받았다. 이러한 모델 AQP4 전용 T와 B 세포 CNS autoimmunity의 개발에 참여 하는 방법을 조사 하 고 후보 치료제 NMO 테스트 유용할 수 있었다. 비록 야생-타입 마우스에서 epitopes 201013, 그 epitopes에 응답 하는 T 세포에에서 처음 알려졌다 AQP4 전용 T 세포의 임상 또는 조직학 질병14,17를 일으키지 않았습니다. CNS 면역 면역 반응성 AQP4 기반으로 모델을 생성 하는 무 능력 2015 때까지 수수께끼에 남아 있었다 존스, 외. 25 AQP4/- 생쥐에서 기증자 AQP4 p135 153 준비 하는 T 세포 WT 쥐에서 CNS autoimmunity의 임상 및 조직학 징후를 일으키는 수 있었다 발견 했다. 관심의 높은 선호도17와 MHC II (-Ab)을 바인딩할 AQP4 p135-153 전망 이다. 단 하나의 다른 AQP4 아미노산 시퀀스, 201-220-Ab 비슷한 높은 선호도 바인딩할 전망 이다. 사실, 우리 p201-220 두 AQP4-/-, 하지만 WT 쥐에서 강력한 확산 유도 그 AQP4 p135-153를 관찰. 여기, 우리가 어떻게 분리 수 있고 확장 encephalitogenic Th17 AQP4 p135-153-및 p201-220-반응 T 세포 AQP4/- 생쥐에서 나타났습니다. WT 받는 쥐로 전송 하는 경우 기증자 AQP4 반응 Th17 세포 유도 마비, 척수와 시 신경에 단 세포 침투를 동행 했다. 성의 비주얼 시스템 부상 AQP4 seropositive NMOSD26를 가진 환자에서 잘 알려져 있다. 여기, 우리는 AQP4-반응성 고 집 고 양이 반응 Th17 세포에 의해 유도 하는 시 신경 염증은 뚜렷한 관찰 했다. 반면 AQP4 전용 Th17 세포 유도 광섬유 perineuritis, MOG 특정 Th17 세포 심각한 광학 신경 염 유발. 우리는 또한 직렬 10 월 AQP4 및 MOG 전용 T 세포에 의해 유도 하는 시 신경 염증을 모니터링 하는 데 사용 하는 기법을 설명 했습니다. 다른 수 사관은 지금 ATCA의 병원 성 기계 장치에 집중 하는 그들의 자신의 연구를 여기에 설명 된 프로토콜을 적용할 수 있어야 합니다.
하나는 쉽게 우리의 프로토콜에 3 개의 잠재적인 함정을 피할 수 있습니다. ATCA의 첫 번째, 입양 전송 AQP4-/- 기증자 쥐에서 AQP4 전용 T 세포의 사용을 요구 한다. 특히, 기증자 WT AQP4 p135-153-특정 T 세포 받는 WT 쥐 ATCA를 일으키지 않았습니다. 둘째, 그것은 "물-테스트" AQP4/- 생쥐 (프로토콜 단계 1.5)의 예방 접종 전에 펩 티 드/CFA 에멀젼 방울과 함께 수행 하는 것이 중요. 그것은 사우스 캐롤라이나 사출에 적합 때 유제 물에 분산 하지 해야. 유제 분 광 경우 하나 한 번 더 유제를 혼합 해야 다시 진정 고 물-테스트를 반복 합니다. 마지막으로, 활성화 된 기증자 CNS 항 원 특정 T 세포는 T 세포 휴식 보다 더 효율적으로 CNS 면역 유도. 하나는 시각적으로 입양 전송 위한 기증자 T 세포를 수확 전에 가벼운 현미경 그 문화를 검사 해야 합니다. 급속 하 게 세포 분할 클러스터, 쉽게 확인 양식 수 있습니다. 또한 때 많은 활성화 된 T 세포를 포함 하는 문화, 미디어 수 있습니다에서 전환 핑크 오렌지 또는 황색, ph에서 감소 때문. 프로토콜 단계 3에서 설명한 대로 하나 또한 확산에 대 한 기증자 림프절 AQP4 준비 하는 T 세포의 활성화 3H 티 미 딘 법인에 의해 평가할 수 있습니다.
두 개의 병원 성 AQP4 T 셀 epitopes는 (1) 예측 높은 선호도와 MHC II를 바인딩할 및 (2) AQP4-/-, 하지만 하지 WT에 강력한 증식 응답을 이끌어내는 우리의 발견, 쥐 그 결정을 대상으로 하는 T 세포는 일반적으로 제안 thymic 부정적인 선택17에 의해 제어. AQP4 p135-153, p201-220 AQP4/- 생쥐에서의 인식에 대 한 활용 TCR 레파토리는 독특한 (그림 2),이 클론 삭제 thymic 골 수 상피 세포에 의해 중재와 일치. 다른 tolerogenic 메커니즘 수 있습니다 일반적으로 AQP4에 대 한 면역 응답을 제 지. 우리의 초기 보고서17, 이후에 다른 그룹도 시연 했다 AQP4 p201-220 encephalitogenic T 셀 결정27포함 되어 있습니다. 때 α/β (TCRα-/-) T 세포 결핍 마우스 AQP4-/- CD4 재구성 했다+ T 셀, encephalitogenic AQP4 전용 T 세포 응답, 하지만 하지는 AQP4 특정 체액 반응, 그 암시를 이끌어내는 것이 가능 했다 WT 쥐 AQP4 특정 B 세포 응답, AQP4 전용 T 세포 응답, 비슷한 부정적인 선택 될 수 있습니다. 사실, 혼자 AQP4 전용 T 세포에 의해 유도 된 ATCA WT 쥐에서 관찰 하지는, 척추 축 삭 및 RGCs, 손실 병원 성 AQP4 특정 항 체의 참여를 요구할 수 있습니다. 그것은 분명 AQP4 대상 CNS autoimmunity의 마우스 모델 tolerogenic 메커니즘을 일반적으로 AQP4 전용 T 세포 및 B 세포 면역 제어에 대 한 자세한 내용은 진화를 계속 하는 것입니다.
AQP4 대상 CNS 면역의 다른 모델도 되 고 개발된6,16,,2829,30. 각자 공부 NMO 병 인에 관련 된 특정 측면에 대 한 장점을 제공할 수 있습니다. AQP4 전용 T 세포 WT 쥐6,,1629에서 확인 되었습니다. 그 AQP4 전용 T 세포 발생의 CNS 면역 조직학 변화 하지만, 마찬가지로 쥐에서 관찰, WT 쥐 AQP4 전용 T 세포 발생 하지 않습니다 임상 질병의 중요 한 표시. 따라서, WT 쥐의 T 세포와 B 세포 AQP4 특정 면역 응답을 제한 하는 허용의 메커니즘은 쥐에서 작동도. 관계 없이, 하나 해야 마우스 모델을 사용 하 여 질병의 병 인에 관여 하는 메커니즘을 공부에 전력을 과소 평가 하지. 녹아웃, 유전자 변형 및 기자 쥐의 부 유리할 수 있습니다. 그것은 또한 몇 가지 기본적인 발견 면역 마우스 EAE 모델을 사용 하 여 만들어진 인식 되어야 한다. 예를 들어 데모 그 T 세포 클론 자가 항 원에 대 한 특정 면역 질환31,32,33 면역에서 T 세포 costimulation의 역할 및의 발견을 중재할 수는 Th17 차별화34 에 대 한 개발 통로 처음 마우스 EAE 모델을 사용 하 여 설명 했다. 우리가 개발한 ATCA의 마우스 모델을 사용 하 여, 하나 지금가지고 연구 개발 및 병원 성 AQP4 특정 면역 응답을 vivo에서의 규제 수단 NMO 병 인에 관련 된 중요 한 통찰력을 제공 한다.

Neuromyelitis optica (NMO) 중앙 신경 시스템 (CNS) 자기 면역 염증 demyelinating 질병 잦은 마비와 영구적인 신경학 적 장애1로 이어지는 시각 손실의 원인입니다. NMO는 현재 간주 주로 체액 성 면역 질환2 aquaporin-4 (AQP4), 이다3,4에 풍부 하 게 표현 하는 수로 대상으로 하는 항 체 (Igs)와 관련으로. 그러나, CNS 염증 CNS AQP4 Ig5,6의 항목에 대 한 전제 조건입니다. 따라서, 그것은 안티-AQP4 Igs 혼자의 전송에 의해 NMO의 모델을 설치 하 게 가능 되지 않았습니다. NMO 환자에서 (1) 병원 성 AQP4 전용 Igs IgG11,2는 결과 T 세포 의존 Ig 서브 클래스7 (2) T 세포는 NMO 병 변8,9 (3) NMO 식별 됩니다 연결 된 특정 MHC II 유전자 (예: HLA-DR17 (DRB1 * 0301))10, 그리고 (4) proinflammatory AQP4-반응성 박사-제한 된 Th17 세포는 NMO 환자11,12 모든 확장 표시 AQP4 전용 T 세포는 중요 한 역할 NMO pathogenesis에서. 따라서, AQP4 전용 T 세포 NMO pathogenesis에 기여할 수는 어떻게 결정 하는 동물 모델을 개발 하는 것이 중요 하다.
몇 년 전, 여러 AQP4 T 셀 epitopes 야생-타입 (WT) 마우스13,14 와 쥐15에서 확인 되었다. AQP4 반응 T 세포 순진한 받는 사람 쥐15,16opticospinal 염증 유발 수 관찰 되었다, 그러나 CNS 질환의 중요 한 임상 증상 관찰 하지 했다. 마찬가지로, AQP4 T 셀 epitopes14,17를 포함 하는 펩 티 드와 WT 쥐의 면역을 직접 또는 그 결정 요인17를 대상으로 하는 proinflammatory T 세포의 전송, 임상 증상을 일으키지 않았습니다 또는 조직학 CNS 면역의 증거입니다.
최근에, 그것은 높은 선호도18C57BL/6 AQP4-결핍 (AQP4-/-) 마우스 AQP4 펩 티 드 (p) 135-153 또는 p201-220, MHC II (-Ab) 바인딩할 예측 결정 하는 2 개의 요인의 그 면역 관찰 했다, elicited 강한 CD4 + T 세포 응답17. 반면,이 두 펩 티 드 WT 쥐에만 겸손 증식 반응 elicited. 또한, AQP4/- 생쥐에서 T 세포에 의해 이러한 결정 요인의 인식에 대 한 사용 T 세포 수용 체 (TCR) 레 퍼 토리 독특한 했다. 샨 다, 이러한 연구 결과 AQP4의 T 세포 인식 thymic 부정적인 선택에 의해 규제 됩니다 나타냅니다. AQP4 p135-153-또는 p201-220-특정 AQP4-/- 기증자 쥐에서 Th17 세포 유도 순진한 받는 WT 쥐;의 거의 100%에 마비 이 T 세포, B 세포, monocytes의 opticospinal 침투와 연관 되었다. 직렬 opticospinal 일관성 단층 촬영 (OCT) 시연 동적 시각적 시스템 참여. AQP4 대상 CNS T 세포 중재 면역 (ATCA)와 쥐 마비 비주얼 시스템 부상에서 회복. EAE myelin oligodendrocyte 당단백질 (MOG) p35-55-특정 T 세포에 의해 지속적인 임상 질병 이끌어 유도 달리 혼자 T 세포에 의해 유도 된 ATCA axonal 손실 또는 감소 망막 신경 절 세포 (RGCs)에 연결 되지 않았습니다. 우리의 결과 명확 하 게 여러 병원 성 AQP4 T 셀 결정 요인 다는 것을 설명 했다. ATCA의이 새로운 모델은 어떻게 셀 CNS 염증을 유발 하 고 어떻게 그들이 AQP4 특정 B 세포 및 NMO 병 인을 촉진 하는 항 체와 협력 수 학습 병원 성 AQP4 전용 T 세포의 개발을 제어 하는 메커니즘을 공부 하는 데 유용 .
현재 보고서에서 우리는 유도 하 고 T 세포 유도 ATCA를 평가 하는 데 사용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리 면역, T 세포 배양 및 Th17 분극 병원 성 AQP4 전용 T 세포, 양극 화 및 그 T 세포의 입양 전송 흐름 cytometry 분석 생성을 사용 하는 기법으로 시작 합니다. 우리는 다음 임상 및 조직학 질병 및 직렬 OCT 비주얼 시스템 부상을 받는 사람 마우스 모니터를 사용 하 여 평가 하는 데 사용 하는 방법을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>M. 결핵 H37Ra</td><td>BD Difco</td><td>231141</td><td>Dessicated, killed M. tuberculosis</td></tr><tr><td>Incomplete Freund's Adjuvant</td><td>BD Difco</td><td>263910</td><td></td></tr><tr><td>AQP4 펩타이드 p135-153</td><td>Genemed</td><td>맞춤형 합성</td><td>펩타이드 서열: LVTPPSVVGGLGVTMVHGN</td></tr><tr><td>AQP4 펩타이드 p201-220</td><td>Genemed</td><td>맞춤형 합성</td><td>펩타이드 서열: HLFAINYTGASMNPARSFGP</td></tr><tr><td>MOG 펩타이드 p35-55</td><td>Genemed / Auspep</td><td>맞춤형 합성</td><td>펩타이드 서열: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK</td></tr><tr><td>3방향 스톱콕</td><td>Kimble</td><td>420163-4503</td><td></td></tr><tr><td>HyClone 태아 소 혈청(특성화)</td><td>GE 헬스케어 생명과학</td><td>SH30071</td><td></td></tr><tr><td>재조합 마우스 IL-23</td><td>R& D Systems (BioTechne)</td><td>1887-ML</td><td></td></tr><tr><td>재조합 마우스 IL-6</td><td>R& D 시스템즈(BioTechne)</td><td>406-ML</td><td></td></tr><tr><td>재조합 마우스 IL-12</td><td>R& D Systems (BioTechne)</td><td>419-ML</td><td></td></tr><tr><td>티미딘 [Methyl-3H]</td><td>PerkinElmer</td><td>NET027</td><td></td></tr><tr><td>유리 섬유 Filtermats</td><td>PerkinElmer</td><td>1450-421</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 항체</td><td>eBioscience (Affymetrix)</td><td>[다양한]</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 TCR V&beta; 스크리닝 패널</td><td>BD Biosciences</td><td>557004</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>[다양한]</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드(16%)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Iomomycin (칼슘 염)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>백일해 독소 B. pertussis</td><td>List Biological Laboratories</td><td>181</td><td></td></tr><tr><td>10% 포르말린</td><td>VWR</td><td>89370-094</td><td></td></tr><tr><td>가변 흐름 연동 펌프</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-2</td><td></td></tr><tr><td>폼 생검 패드, 직사각형</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-221</td><td></td></tr><tr><td>이소감각(이소플루란, USP)</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td></td><td>050033 NDC : 11695-0500-2</td></tr><tr><td>트로피카미드 안과 솔루션, USP (1%)</td><td>Akorn</td><td></td><td>NDC: 17478-102-12</td></tr><tr><td>Spectralis 진단 이미징 플랫폼</td><td>Heidelberg Engineering</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

마비 및 비주얼 시스템 부상 neuromyelitis optica autoantigen aquaporin-4에 대 한 t 세포 관련 하 여 쥐에서의 유도

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

그것은 인식 하는 동안 그 aquaporin-4 (AQP4)-특정 T 세포와 항 체 neuromyelitis optica (NMO), 인간 중앙 신경 시스템 (CNS) 면역 demyelinating 질병, 둘 다 AQP4 타겟 모델의 생성의 병에 참여 CNS autoimmunity의 임상 및 조직학 발현 어려운 입증 했다. 그 T 세포 순진한 받는 사람 마우스 질병을 전송할 수 있지만 AQP4 펩 티 드와 야생-타입 (WT) 쥐의 면역 T 세포 증식을 elicited. 최근에, 2 개의 소설 AQP4 T 셀 epitopes, 펩 티 드 (p) 135-153, p201-220, 발견 했다 공부 하는 T 세포 반응성이이 epitopes 제안 하는 AQP4 불충분 한 (AQP4-/-) 마우스에서 AQP4에 대 한 면역 응답을 일반적으로 thymic 의해 제어 부정적인 선택입니다. AQP4-/- Th17 편광 p135-153 또는 p201-220 유발된 마비에 받는 WT 쥐에서 척수와 시 신경의 주로 환자의 염증에 연결 됐다는 T 세포. 염증 주변 시 신경 및 내부 망막 레이어 (IRL)의 참여 변화 직렬 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)에 의해 각 성 했다. 여기, 우리는이 생체 내에서 의 새로운 모델 AQP4 대상 CNS 면역 (ATCA), 병원 성 AQP4 전용 T 세포와 그들이 어떻게 B 협조 수 있습니다의 개발을 허용 하는 메커니즘을 연구를 지금 사용할 수를 만드는 데 사용 하는 방법 설명 NMO 병 인에 셀입니다.

이 프로토콜에서 우리는 C57BL/6 AQP4/- 생쥐에서 기증자 T 세포를 사용합니다. 병원 성 T 세포 epitopes를 포함 하는 AQP4 p135-153 또는 p201-220,이 쥐의 피하 접종 elicited 강한 증식 T 세포 응답 배출 림프절 (그림 1)에이 두 펩 티 드 훨씬 약한 T 세포를 유도 하는 반면 WT 쥐에서 확산입니다. 비교에서는, AQP4 p91-110와 예방 접종 비 병원 성 AQP4 T 셀 결정13또는 MOG p35-55, 실험적인 자기 면역 뇌 (EAE)22,23 시키는 T 세포를 활성화 하는 수 초 펩 티 드를 포함 하 ,24, 유도에 AQP4-/- WT 쥐 T 세포 확산의 유사한 크기. 교류 cytometry 얼룩 TCR 사용률 분석 개별 Vβ 또는 Vβ, AQP4/- 생쥐에서 p135-153-및 p201-220-특정 T 세포 독특한 TCR 레파토리 활용 시연에 대 한. 선택적 하이퍼-확산 p135-153, p201-220 AQP4/- 생쥐로 독특한 TCR 활용 (그림 2), AQP4의 이러한 결정에 대 한 병원 성 T 세포 응답은 일반적으로 thymic 네거티브에 의해 규제 표시 선택, AQP4-/- 기증자 T 셀이이 프로토콜을 사용 하 여에 대 한 중요성을 강조.
ATCA의 유도 대 한 입양 전송 전에 림프절 세포 AQP4 펩 티 드 액 쥐에서 3 일 동안 Th17 또는 Th1 편광 조건에서 생체 외에서 경작 했다. 어느 정도 분극 기증자 CD4의+ T의 세포 (ICS)를 얼룩이 지는 세포내 cytokine에 의해 확인 되었고 cytometry (그림 3)에 의해 측정. 순진한 받는 사람 마우스는 2 x 107 기증자 AQP4 펩 티 드 관련 T 세포와 정 맥 주입 했다. 약 6 일 후, 거의 100% 받는 사람 마우스의 개발 CNS 자가 면역 질환, 다리를 절 며 꼬리와 뒷 다리 마비 (그림 4)를 포함 하 여 임상 증상. Th17 편광 AQP4 전용 T 세포 Th1 편광 AQP4 전용 T 세포 보다 더 심한 임상 질환을 유발. Th17 AQP4-펩 티 드-특정 받은 완전 한 뒷 다리 마비 (하반신 마비)를 개발 하는 대표적인 마우스 비디오 1에 표시 됩니다. MOG 특정 Th17 세포의 관리 후 EAE를 개발 하는 쥐와 받는 사람 마우스 AQP4 전용 Th17 세포에 의해 유도 된 임상 질병에서 회복. EAE MOG p35-55-특정 Th17 세포에 의해 유도 된에 관해서는 p135-153-특정 AQP4에 의해 유도 된 임상 질환 또는 p201-220-특정 Th17 세포 CNS 실질에서 meninges (그림 5) 단 세포의 침투와 관련 되었다. 병 변 더 AQP4 특정 Th17 세포에 의해 유도 된 CNS 면역에 대 한 실질에 보다 meninges에 풍부 했다.
조직학 평가 및 직렬 10 월 AQP4 관련 하 여 시 신경 관련 입증 되었다 고 집 고 양이 특정 Th17 세포 두 유도 시 신경 염증, 단 세포의 존재에 의해 특징 했다. 반면 AQP4 전용 Th17 세포 발생 광섬유 perineuritis, MOG 특정 Th17 세포 유도 심각한 광학 신경 염 (그림 5). 직렬 OCT를 사용 하 여, 시 신경 염증 분명 불어서 고 AQP4 또는 MOG 특정 Th17 세포 (그림 6)에 의해 유도 된 임상 질환에 대 한 내 망막 층 (IRL) 두께 증가. AQP4 Th17 유도 CNS 면역에 대 한 쥐로 기준선을 반환 IRL 두께 임상 질병에서 회복. 반면, EAE MOG 특정 Th17에 의해 유도 된의 지 속성 대응 IRL 엷게 하 고, 살펴본 바와 같이 이전17, 망막 신경 절 세포의 감소와 관련 되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig1.jpg"> 
그림 1 : AQP4/- 생쥐 하지만 하지 WT 쥐에서 강력한 T 세포 증식을 유도 하는 AQP4 p135-153, p201-220. 마우스 접종 했다 CFA에 표시 된 펩 티 드와 사우스 캐롤라이나. 11 일 후, 림프절 제거 하 고 중 아무 항 원 또는 펩 티 드 면역에 대 한 사용을 경작 했다. 확산 3H 티 미 딘 법인 (평균 ± SEM, 5 실험의 대표)에 의해 측정 되었다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig2.jpg"> 
그림 2 : AQP4/- 생쥐에서 AQP4 전용 T 세포 활용 독특한 TCR 레파토리. 표시 된 펩 티 드 AQP4-/- 와 WT 쥐 접종 했다. 11 일 후, 림프절 제거 하 고 예방 접종에 대 한 사용 하는 펩 티 드와 경작 했다. 세포를 수확 했다. TCR Vβ 사용률 cytometry에 의해 분석 되었다 (± sem의 의미 n = 5). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig3.jpg"> 
그림 3 : 기증자 AQP4 전용 T 세포의 양극 화 Proinflammatory. 11 일 AQP4 p135-153 또는 p201-220, 예방 접종 후 림프절 세포 수확 되었고 비 편광 조건, Th1 또는 Th17 편광 조건에서에서 예방 접종에 대 한 사용 하는 펩 티 드와 경작. Th17 Th1 분극 시험 되었다 IC 및 흐름 cytometry에 의해 IL-17 또는 IFN-γ, 각각. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig4.jpg"> 
그림 4 : Th17 편광 AQP4 전용 T 세포 유도 WT 받는 사람 마우스 마비. WT 받는 사람 마우스 AQP4/- 생쥐에서 2 x 107 기증자 Th17 편광 AQP4 p135-153 또는 p201-220-특정 T 세포를 받았다. Th17 편광 MOG 전용 T 세포 긍정적인 컨트롤로 제공 됩니다. 8 실험의 결과 (n = 5/그룹). * p &#60; 0.05, * * p &#60; 0.01, * * * p &#60; 0.001. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig5.jpg"> 
그림 5 : AQP4 특정 Th17 세포 유도 WT 쥐에 opticospinal 염증. 받는 사람 마우스 2 x 107 기증자 Th17 AQP4 p135-153-또는 p201-220-액 Th17 세포 AQP4/- 생쥐에서 또는 Th17 MOG p35-55-특정 셀을 접수 하 고 10 일 후를 희생 했다. 척수와 시 신경 조직 준비 되었고 H로 얼룩진 &#38; E/LFB 염증과 demyelination의 증거에 대 한 평가를각각. 결과 5 쥐/그룹의 대표입니다. 눈금 막대 = 50 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig6.jpg"> 
그림 6 : 시 신경 염증 AQP4 전용 Th17 세포에 의해 유도 된 경도 망막 10 월에 의해 모니터링할 수 있습니다 WT 받는 사람 마우스 하루 0에 2 x 107 기증자 Th17 편광 AQP4 p201-220-특정 또는 MOG p35-55-특정 T 세포를 받았다. 그들은 전날 0 (T 세포의 관리)에 10 월에 의해 시험 되었다 일에 다음 4, 7, 8, 9 10, 11 14 및 21. IRL 두께 측정된 (평균 ± SEM) 했다. 통계는 순진한 컨트롤과 비교를 나타냅니다. 결과 3 실험 (5 쥐/그룹)의 대표. * p &#60; 0.05, * * p &#60; 0.01, * * * p &#60; 0.001. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기, 선물이 aquaporin-4 (AQP4)의 양도 의해 마비 및 opticospinal 염증 유도 프로토콜-WT 쥐로 AQP4/- 생쥐에서 특정 T 세포. 또한, 우리는 시각 시스템 장애 모니터링을 직렬 광학 일관성 단층 촬영을 사용 하는 방법을 보여 줍니다.

마비 및 비주얼 시스템 부상 Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4에 대 한 T 세포 관련 하 여 쥐에서의 유도

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 aquaporin 4 특이적 T 세포의 입양 전이를 통해 중추신경계(CNS) 자가면역 질환을 유도하고, 그 결과로 나타나는 중추신경계 및 동적 시각 시스템에 미치는 영향을 모니터링하는 것입니다. 이 방법은 시신경척수염 및 기타 염증성 시각 장애에서 흔히 AQP4로 알려진 aquaporin 4 특이적 T 세포의 역할에 관한 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 것입니다. 광간섭 단층촬영의 주요 장점은 비침습적인 방식으로 망막 손상을 종단적으로 모니터링할 수 있는 능력에 있습니다.시연을 맡은 분은 저희 연구실의 연구원인 Sharon Sagan과 RE Greens Laboratory의 펠로우인 Andreas Cruz Harans입니다. 먼저, 플런저가 없는 유리 Luer lock 주사기에 두 개의 수형 Luer lock 연결부가 있는 3방향 나일론 스톱콕을 부착하십시오. 스톱콕 레버를 주사기 방향으로 돌려 스톱콕을 닫고, 주사기의 개방된 끝이 위를 향하도록 배치하십시오.볼텍싱 후, 펩타이드와 Complete Freund's Adjuvant 용액을 1:1 부피 비율로 시린지에 넣고, 유리 플런저를 시린지에 다시 삽입합니다. 플런저를 고정한 상태에서 스톱콕이 위를 향하도록 시린지를 뒤집고, 레버를 사용하지 않는 암형 커넥터 쪽으로 전환합니다. 플런저를 조심스럽게 눌러 시린지 내부의 과잉 공기를 제거합니다.용액이 스톱콕의 두 번째 수컷 루어 락(Luer lock) 연결부에 채워집니다. 그런 다음, 플런저를 완전히 삽입한 두 번째 유리 주사기를 두 번째 수컷 루어 락 연결부에 부착합니다. 유화액을 만들기 위해, 약 2분 동안 두 주사기 사이로 용액이 오가도록 플런저를 교대로 누르고, 용액의 점도가 눈에 띄게 변할 때까지 약 10분 동안 용액을 냉각합니다.매우 뻑뻑한 흰색 에멀전이 형성되면, 모든 용액을 주사기 중 하나로 옮기고, 빈 주사기를 새로운 1mm Luer lock 주사기로 교체하십시오. 새 주사기에 에멀전을 채웁니다. 스톱콕에서 주사기를 분리하고 25-gauge 바늘을 장착하십시오.에멀젼의 일관성을 확인하기 위해 수중 테스트를 수행하려면, 에멀젼 한 방울을 작은 물 접시에 떨어뜨립니다. 에멀젼이 분산되지 않으면 주입하기에 적합한 상태입니다. 그 다음, 각 공여자 AQP4 녹아웃 마우스의 하복부 양측과 겨드랑이 내측의 흉벽 양측에 각각 한 번씩 피하 주사합니다.면역화 후 10~12일이 지나면, 첫 번째 마우스의 서혜부에서 목까지, 그리고 각 다리를 따라 피부에 정중선 절개를 가합니다. 복막에서 피부를 당겨 보드에 단단히 고정합니다. 그런 다음 서혜 림프절과 액와 림프절을 채취하여, 완전 배지가 담긴 페트리 접시 내의 셀 스트레이너에 조직을 넣습니다.모든 림프절을 수집한 후, 얼음 위에 놓인 신선한 완전 배지가 들어 있는 50밀리리터 원추형 튜브 위에 셀 스트레이너를 배치하고, 멸균된 5밀리리터 시린지 플런저의 평평한 끝부분을 사용하여 림프절 세포를 필터 망을 통해 밀어냅니다. 세포 회수를 용이하게 하기 위해 20~30밀리리터의 완전 배지로 망을 헹군 후, 두 차례 원심분리 세척을 수행합니다. 두 번째 원심분리가 끝나면, 세포 수를 측정하기 위해 펠렛을 T 세포 배지로 재부유시킵니다.적절한 농도의 항원, 재조합 마우스 인터루킨 mouse 23 및 재조합 마우스 IL-6를 세포에 첨가하고, 이 Th17 분화 유도 혼합물이 포함된 세포 현탁액을 12-웰 플레이트의 각 웰에 2 mL씩 분주합니다. 그 다음, 플레이트를 5% CO2가 포함된 37 °C 습윤 인큐베이터에 넣고 72시간 동안 배양합니다. 분화 유도 3일째에, 각 웰의 배양물을 몇 차례 파이펫팅하여 분화된 세포를 떼어낸 후, 세포 수를 측정하기 위해 얼음 위에 놓인 50 mL 원심 분리 튜브에 모읍니다.PBS로 두 번 세척한 후, 세포를 PBS에서 1×10⁸ cells/mL 농도로 희석하고, 원형으로 흔들어 세포 현탁액을 부드럽게 혼합합니다. 세포 수집 후 1시간 이내에 세포를 1mL 주사기에 옮겨, 각 수용 동물에 200 µL의 세포를 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사합니다. 그 후, 200 µL의 PBS에 희석한 200 ng의 B pertussis toxin을 각 마우스에 즉시 그리고 2일 후에 복강 내 주사합니다.광간섭 단층촬영(OCT)을 이용하여 수혜 동물의 망막을 생체 내(in vivo) 영상화하기 위해, 영상 촬영 5분 전에 각 눈에 1% tropicamide 한 방울을 점안하여 동공을 확장시키고 가열 매트를 켭니다. 마우스를 영상 촬영용 실린더 위에 놓고 그에 맞게 마취 가스 흐름을 조정합니다. 눈의 습도를 유지하고 굴절의 연속성을 확보하기 위해 0.3% hydroxypropyl methylcellulose로 눈을 보호하며, 검사할 눈 위에 맞춤형 콘택트렌즈를 장착합니다.적외선 안저 영상을 가이드로 삼아, 레이저 빔이 시신경 유두 중심에 위치하도록 주의하며 렌즈가 장착된 눈에 레이저를 조준합니다. 고해상도 모드에서 25회의 B-스캔을 수행하고, 30회의 평균 A-스캔으로부터 이미지를 래스터화합니다. 양안의 영상을 모두 촬영한 후, 접촉 렌즈를 안과용 겔로 교체하고 마우스를 따뜻한 회복 케이지에 넣습니다.자동 분할을 위한 모듈형 이미징 소프트웨어를 사용하여 획득한 이미지를 분석하려면, 먼저 내경계막과 내망상층에 해당하는 분할 영역을 수동으로 수정하여 내망막층의 경계를 나타내도록 합니다. 그런 다음 망막신경섬유층과 신경절세포층이 내망막층의 경계 내에 위치하며 서로 겹치지 않는지 확인합니다. 병원성 T 세포 에피토프를 포함하는 AQP4 펩타이드의 피하 면역은 야생형 T 세포 반응과 비교하여 AQP4 녹아웃 마우스의 배출 림프절에서 강력한 T 세포 증식 반응을 유도합니다.개별 V beta 발현에 대한 유세포 분석 결과, 병원성 T 세포 에피토프를 포함하는 AQP4 펩타이드 특이적 T 세포는 고유한 TCR 레퍼토리를 사용하며, 선택적 과증식을 보임을 확인하였습니다. 이는 이러한 결정인자에 대한 병원성 T 세포 반응이 정상적으로는 흉선 음성 선택에 의해 조절됨을 나타냅니다. 분극화된 T 세포 주입 후 약 6~9일이 지나자, 수혜 마우스 거의 대부분에서 꼬리 처짐 및 뒷다리 마비 등 중추신경계(CNS) 자가면역 질환의 임상 증상이 나타났습니다. 특히 Th17 분극화 AQP4 특이적 T 세포가 Th1 분극화 AQP4 특이적 T 세포보다 더 심각한 임상 질환을 유발하였습니다.예를 들어, 이 마우스는 Th17-편향 AQP4 펩타이드 특이적 T 세포 투여 후 완전한 후지 마비가 발생했습니다. AQP4 펩타이드 특이적 Th17 세포에 의해 유도된 임상 질환은 CNS 실질과 뇌수막으로의 단핵구 침윤 및 시신경 염증과도 관련이 있으며, 이는 마우스가 질병에서 회복됨에 따라 기저치로 돌아오는 망막 내층의 부종 및 두께 증가를 통해 추가적으로 입증됩니다. 이 영상을 시청한 후에는 AQP4 표적 자가면역을 유도하고 모니터링하는 방법을 충분히 이해하게 될 것이며, 이를 통해 T 세포가 시신경척수염에 어떻게 관여하는지 이해하기 위한 추가 연구가 가능해질 것입니다.

induction-paralysis-visual-system-injury-mice-t-cells-specific-for

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질과 불활성화된 결핵균의 조합을 주입하여 마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염을 유도하는 방법을 보여줍니다. 이 모델을 통해 연구원들은 질병 메커니즘을 연구하고 치료 개입을 테스트할 수 있습니다.

마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염 유도

이 동영상은 뇌로 이동하는 자가반응성 T세포를 활성화하기 위해 미엘린 유래 펩타이드에 보조제를 주입하여 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 유발하는 방법을 보여줍니다. 백일해 독소는 혈액 뇌 장벽 투과성을 증가시켜 이러한 T 세포와 다른 면역 세포가 뇌로 들어갈 수 있도록 하기 위해 투여됩니다. 이러한 면역 세포는 탈수초화를 일으켜 신경 전달 장애와 EAE 발병을 유발합니다.

마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염의 발생

이 비디오에서는 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 사용하여 다발성 경화증의 마우스 모델을 구축합니다. 마우스에 뉴런 펩타이드와 보조제가 포함된 에멀젼을 주입하여 자가반응성 T세포를 활성화하는 면역 반응을 유발합니다. 그 다음에는 백일해 독소(PTX)를 주입하여 혈액뇌장벽 투과성을 높여 자가반응성 T세포가 뇌에 침투할 수 있도록 합니다. 이 침투는 궁극적으로 수초성 손상을 초래하는 신호 폭포를 시작하여 다발성 경화증의 탈수초성 상태를 모방합니다.

이 비디오는 아쿠아포린-4를 표적으로 하는 활성화된 Th17 세포를 마우스 모델로 전달하여 마비를 유도하는 절차를 보여줍니다. 중추신경계에서 활성화된 Th17 세포는 아쿠아포린-4 발현 성상세포와 상호 작용하여 면역 반응을 유발하여 마우스의 꼬리와 사지 마비를 유발합니다.

Aquaporin-4 특이적 Th17 세포의 전달을 통한 마우스 모델의 마비 유도

이 비디오는 백일해 독소와 미엘린 모방 펩타이드 및 보조제를 함유한 접종을 통해 마우스 모델의 운동 기능 장애를 평가한 후 운동 기능을 평가하고 면역 활성화 및 탈수초화로 인한 신경 손상을 평가하기 위한 트레드밀 테스트를 수행하는 과정을 보여줍니다.

실험적 자가면역 신경염 마우스 모델에서 운동 기능 평가

우리는 실험적인 자가면역 뇌척수염을 연구하기 위해 성체 쥐의 노출된 척수에 유리창을 이식하고 유지하는 방법을 설명합니다. 이 창은 이광자 현미경을 사용하여 살아있는 동물의 세포 내 수준에서 세포 역학을 모니터링하기 위해 척수에 대한 만성 광학 접근을 제공합니다.

실험자가 면역 뇌척수염 성인 마우스에 유리 척수 Windows를 이식

이 원고는 다양한 질병 단계에서 각각 유세포 분석 및 정량적 PCR을 사용하여 림프절, 비장, 혈액 및 척수의 면역 세포 분포 및 mRNA 사이토카인 수치를 평가하는 방법과 함께 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 모델의 유도 및 채점 방법을 설명합니다.

다양한 조직에서 면역 세포의 질병에 의존하는 유통의 마우스 및 평가에 실험자가 면역 뇌척수염의 유도

이 보고서는 성공적으로 유도 실험 자가 면역 신경 염 (EAN) myelin 단백질을 사용 하 여 0 (P0)180-199 펩타이드 Freund의 완전 한 보조 및 백 일 해 독 소와 함께 하는 간단한 방법을 설명 합니다. 우리는 정확 하 게 기능적인 적자와이 상품에서 발생 하는 neuropathology의 정도 평가 정교한 패러다임 제시.

기능과 Neuropathological 평가 대 한 C57BL/6 쥐에 실험 자가 면역 신경 염을 유발 하는 간단한 방법

세포 기반 분석 결과 세럼 안티-aquaporin-4 면역 글로불린 g.를 검출 하기 위하여 널리 사용 방법은 이 메서드는 임상 진단 및 neuromyelitis 광학 스펙트럼 장애의 과학적 연구에 적용할 수 있습니다.

세포 기반 분석 결과 의해 인간의 혈 청 안티-aquaporin-4 면역 글로불린 G 검출

본 프로토콜은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질을 사용하는 마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염의 유도 및 임상 스코어링 시스템을 사용하여 질환 과정을 모니터링하는 것을 설명한다. 실험적 자가면역 뇌척수염 관련 증상은 마우스 대퇴골 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 분석 및 오픈 필드 테스트를 사용하여 분석되어 질병 과정을 종합적으로 평가합니다.

실험적 자가면역 뇌척수염의 유도 및 다양한 평가 지표

실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 다발성 경화증(MS)의 동물 모델로, 인간 질병과 강력한 체액성 자가면역 반응을 공유합니다. 여기에서는 EAE 면역 마우스의 혈청에서 자가항체를 정량화하기 위한 간단하고 유연한 ELISA 프로토콜을 보고합니다.

Quantification of Autoreactive Antibodies in Mice on Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (실험적 자가면역 뇌척수염 시 마우스의 자가반응성 항체 정량화)

학습하세요 AQP4 특이 T 세포 전이를 이용한 중추신경계 자가면역 질환 유도 및 광학 일관성 단층 촬영을 통한 망막 손상 비침습적 모니터링 방법. 이 기술은 뉴로마이엘리티스 옵티카 연구에 활용됩니다.

마비 및 비주얼 시스템 부상 Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4에 대 한 T 세포 관련 하 여 쥐에서의 유도

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