마비 및 비주얼 시스템 부상 Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4에 대 한 T 세포 관련 하 여 쥐에서의 유도

본 프로토콜의 전반적인 목표는 aquaporin 4 특이적 T 세포의 입양 전이를 통해 중추신경계(CNS) 자가면역 질환을 유도하고, 그 결과로 나타나는 중추신경계 및 동적 시각 시스템에 미치는 영향을 모니터링하는 것입니다. 이 방법은 시신경척수염 및 기타 염증성 시각 장애에서 흔히 AQP4로 알려진 aquaporin 4 특이적 T 세포의 역할에 관한 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 것입니다. 광간섭 단층촬영의 주요 장점은 비침습적인 방식으로 망막 손상을 종단적으로 모니터링할 수 있는 능력에 있습니다.

시연을 맡은 분은 저희 연구실의 연구원인 Sharon Sagan과 RE Greens Laboratory의 펠로우인 Andreas Cruz Harans입니다. 먼저, 플런저가 없는 유리 Luer lock 주사기에 두 개의 수형 Luer lock 연결부가 있는 3방향 나일론 스톱콕을 부착하십시오. 스톱콕 레버를 주사기 방향으로 돌려 스톱콕을 닫고, 주사기의 개방된 끝이 위를 향하도록 배치하십시오.

볼텍싱 후, 펩타이드와 Complete Freund's Adjuvant 용액을 1:1 부피 비율로 시린지에 넣고, 유리 플런저를 시린지에 다시 삽입합니다. 플런저를 고정한 상태에서 스톱콕이 위를 향하도록 시린지를 뒤집고, 레버를 사용하지 않는 암형 커넥터 쪽으로 전환합니다. 플런저를 조심스럽게 눌러 시린지 내부의 과잉 공기를 제거합니다.

용액이 스톱콕의 두 번째 수컷 루어 락(Luer lock) 연결부에 채워집니다. 그런 다음, 플런저를 완전히 삽입한 두 번째 유리 주사기를 두 번째 수컷 루어 락 연결부에 부착합니다. 유화액을 만들기 위해, 약 2분 동안 두 주사기 사이로 용액이 오가도록 플런저를 교대로 누르고, 용액의 점도가 눈에 띄게 변할 때까지 약 10분 동안 용액을 냉각합니다.

매우 뻑뻑한 흰색 에멀전이 형성되면, 모든 용액을 주사기 중 하나로 옮기고, 빈 주사기를 새로운 1mm Luer lock 주사기로 교체하십시오. 새 주사기에 에멀전을 채웁니다. 스톱콕에서 주사기를 분리하고 25-gauge 바늘을 장착하십시오.

에멀젼의 일관성을 확인하기 위해 수중 테스트를 수행하려면, 에멀젼 한 방울을 작은 물 접시에 떨어뜨립니다. 에멀젼이 분산되지 않으면 주입하기에 적합한 상태입니다. 그 다음, 각 공여자 AQP4 녹아웃 마우스의 하복부 양측과 겨드랑이 내측의 흉벽 양측에 각각 한 번씩 피하 주사합니다.

면역화 후 10~12일이 지나면, 첫 번째 마우스의 서혜부에서 목까지, 그리고 각 다리를 따라 피부에 정중선 절개를 가합니다. 복막에서 피부를 당겨 보드에 단단히 고정합니다. 그런 다음 서혜 림프절과 액와 림프절을 채취하여, 완전 배지가 담긴 페트리 접시 내의 셀 스트레이너에 조직을 넣습니다.

모든 림프절을 수집한 후, 얼음 위에 놓인 신선한 완전 배지가 들어 있는 50밀리리터 원추형 튜브 위에 셀 스트레이너를 배치하고, 멸균된 5밀리리터 시린지 플런저의 평평한 끝부분을 사용하여 림프절 세포를 필터 망을 통해 밀어냅니다. 세포 회수를 용이하게 하기 위해 20~30밀리리터의 완전 배지로 망을 헹군 후, 두 차례 원심분리 세척을 수행합니다. 두 번째 원심분리가 끝나면, 세포 수를 측정하기 위해 펠렛을 T 세포 배지로 재부유시킵니다.

적절한 농도의 항원, 재조합 마우스 인터루킨 mouse 23 및 재조합 마우스 IL-6를 세포에 첨가하고, 이 Th17 분화 유도 혼합물이 포함된 세포 현탁액을 12-웰 플레이트의 각 웰에 2 mL씩 분주합니다. 그 다음, 플레이트를 5% CO2가 포함된 37 °C 습윤 인큐베이터에 넣고 72시간 동안 배양합니다. 분화 유도 3일째에, 각 웰의 배양물을 몇 차례 파이펫팅하여 분화된 세포를 떼어낸 후, 세포 수를 측정하기 위해 얼음 위에 놓인 50 mL 원심 분리 튜브에 모읍니다.

PBS로 두 번 세척한 후, 세포를 PBS에서 1×10⁸ cells/mL 농도로 희석하고, 원형으로 흔들어 세포 현탁액을 부드럽게 혼합합니다. 세포 수집 후 1시간 이내에 세포를 1mL 주사기에 옮겨, 각 수용 동물에 200 µL의 세포를 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사합니다. 그 후, 200 µL의 PBS에 희석한 200 ng의 B pertussis toxin을 각 마우스에 즉시 그리고 2일 후에 복강 내 주사합니다.

광간섭 단층촬영(OCT)을 이용하여 수혜 동물의 망막을 생체 내(in vivo) 영상화하기 위해, 영상 촬영 5분 전에 각 눈에 1% tropicamide 한 방울을 점안하여 동공을 확장시키고 가열 매트를 켭니다. 마우스를 영상 촬영용 실린더 위에 놓고 그에 맞게 마취 가스 흐름을 조정합니다. 눈의 습도를 유지하고 굴절의 연속성을 확보하기 위해 0.3% hydroxypropyl methylcellulose로 눈을 보호하며, 검사할 눈 위에 맞춤형 콘택트렌즈를 장착합니다.

적외선 안저 영상을 가이드로 삼아, 레이저 빔이 시신경 유두 중심에 위치하도록 주의하며 렌즈가 장착된 눈에 레이저를 조준합니다. 고해상도 모드에서 25회의 B-스캔을 수행하고, 30회의 평균 A-스캔으로부터 이미지를 래스터화합니다. 양안의 영상을 모두 촬영한 후, 접촉 렌즈를 안과용 겔로 교체하고 마우스를 따뜻한 회복 케이지에 넣습니다.

자동 분할을 위한 모듈형 이미징 소프트웨어를 사용하여 획득한 이미지를 분석하려면, 먼저 내경계막과 내망상층에 해당하는 분할 영역을 수동으로 수정하여 내망막층의 경계를 나타내도록 합니다. 그런 다음 망막신경섬유층과 신경절세포층이 내망막층의 경계 내에 위치하며 서로 겹치지 않는지 확인합니다. 병원성 T 세포 에피토프를 포함하는 AQP4 펩타이드의 피하 면역은 야생형 T 세포 반응과 비교하여 AQP4 녹아웃 마우스의 배출 림프절에서 강력한 T 세포 증식 반응을 유도합니다.

개별 V beta 발현에 대한 유세포 분석 결과, 병원성 T 세포 에피토프를 포함하는 AQP4 펩타이드 특이적 T 세포는 고유한 TCR 레퍼토리를 사용하며, 선택적 과증식을 보임을 확인하였습니다. 이는 이러한 결정인자에 대한 병원성 T 세포 반응이 정상적으로는 흉선 음성 선택에 의해 조절됨을 나타냅니다. 분극화된 T 세포 주입 후 약 6~9일이 지나자, 수혜 마우스 거의 대부분에서 꼬리 처짐 및 뒷다리 마비 등 중추신경계(CNS) 자가면역 질환의 임상 증상이 나타났습니다. 특히 Th17 분극화 AQP4 특이적 T 세포가 Th1 분극화 AQP4 특이적 T 세포보다 더 심각한 임상 질환을 유발하였습니다.

예를 들어, 이 마우스는 Th17-편향 AQP4 펩타이드 특이적 T 세포 투여 후 완전한 후지 마비가 발생했습니다. AQP4 펩타이드 특이적 Th17 세포에 의해 유도된 임상 질환은 CNS 실질과 뇌수막으로의 단핵구 침윤 및 시신경 염증과도 관련이 있으며, 이는 마우스가 질병에서 회복됨에 따라 기저치로 돌아오는 망막 내층의 부종 및 두께 증가를 통해 추가적으로 입증됩니다. 이 영상을 시청한 후에는 AQP4 표적 자가면역을 유도하고 모니터링하는 방법을 충분히 이해하게 될 것이며, 이를 통해 T 세포가 시신경척수염에 어떻게 관여하는지 이해하기 위한 추가 연구가 가능해질 것입니다.