Name: 낮은 풍부 배아 샘플 chromatin Immunoprecipitation (칩) 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: 배우세요 낮은 풍부 닭 배아 샘플에서 히스톤 변형 결합 프로파일을 분석하는 ChIP 및 ChIP-seq 프로토콜을 통해 전사 조절과 세포 이질성을 연구하는 방법을 알아보세요.

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저자는이 프로토콜의 설립 동안에 그의 우수한 기술 지원에 대 한 1 월 Appel 감사합니다. Rada Iglesias 실험실에서 작업 CMMC 교내에서 지원 자금, DFG 연구 보조금 (RA 2547/1-1, RA 2547/2-1, 그리고 테 1007/3-1), UoC 고급 연구원 그룹 그랜트, 그리고 CECAD 그랜트.

<ol><li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li>
<li>Wang, Z., Schones, D. E., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin.+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Characterization of human epigenomes.</a> Curr Opin. Genet Dev. 19 (2), 127-134 (2009).</li>
<li>ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Roadmap Epigenomics Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+chromatin+signature+uncovers+early+developmental+enhancers+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans.</a> Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).</li>
<li>Creyghton, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K27ac+separates+active+from+poised+enhancers+and+predicts+developmental+state%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (50), 21931-21936 (2010).</li>
<li>Benayoun, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K4me3+breadth+is+linked+to+cell+identity+and+transcriptional+consistency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">H3K4me3 breadth is linked to cell identity and transcriptional consistency.</a> Cell. 158 (3), 673-688 (2014).</li>
<li>Rehimi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomics-Based+Identification+of+Major+Cell+Identity+Regulators+within+Heterogeneous+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Epigenomics-Based Identification of Major Cell Identity Regulators within Heterogeneous Cell Populations.</a> Cell Rep. 17 (11), 3062-3076 (2016).</li>
<li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li>
<li>Valouev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+transcription+factor+binding+sites+based+on+ChIP-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data.</a> Nat Methods. 5 (9), 829-834 (2008).</li>
<li>Dahl, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+histone+H3K4me3+domains+in+mouse+oocytes+modulate+maternal-to-zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition.</a> Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nat Biotech. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+reprogramming+of+the+histone+modification+H3K4me3+in+early+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development.</a> Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dynam%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Dev Dynam. 195 (4), 231-272 (1951).</li>
<li>Ho, J. W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+metazoan+chromatin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of metazoan chromatin organization.</a> Nature. 512 (7515), 449-452 (2014).</li>
<li>Calo, E., Wysocka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+enhancer+chromatin%3A+what%2C+how%2C+and+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Modification of enhancer chromatin: what, how, and why?</a> Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).</li>
<li>Spitz, F., Furlong, E. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors%3A+from+enhancer+binding+to+developmental+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcription factors: from enhancer binding to developmental control.</a> Nat Rev Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).</li>
</ol>

저자는 공개 해야 경쟁 금융 관심사를 있지 않습니다.

다른 세포질 문맥4,,518에 척 추가 있는 게놈의 기능적인 주석을 개선 하기 위해 Epigenomic의 히스톤 수정 칩 seq를 사용 하 여 프로 파일링을 사용할 수 있습니다. 이러한 epigenomic 프로필 사용할 수 있습니다, 다른 것 들 중, 증강 요소, (즉, 활성, 준비, 또는 태세), 강화의 규제 상태를 정의 하 고 다른 생물에 주요 셀 정체성 레 귤 레이 터를 정의 식별 하 또는 병 적인 컨텍스트 (예: 광범위 한 H3K4me3 발기인 도메인 및 슈퍼 강화)6,7,,910,</su...

히스톤 포스트 번역 상 수정 녹음 방송, 복제 및 DNA 복구1,2,3를 포함 하 여 다양 한 chromatin 종속 프로세스에 직접 참여 하는. 또한, 다른 히스톤 수정 보여 긍정적인 (예를 들어, H3K4me3 및 H3K27ac) 또는 음수 (예를 들어, H3K9me3 및 H3K27me3) 유전자 발현 상관 관계 광범위 하 게 정의 될 수 있는 활성화 또는 억압 적인 히스톤 표시로 각각2,은3. 따라서, 글로벌 히스톤 수정 지도, epigenomic 지도 라고도 기능적으로 척 추가 있는 게놈4,5주석을 강력 하 고 보편적인 도구로 떠오르고 있다. 예를 들어 원심 규제 시퀀스와 같은 강화를 확인할 수 있습니다에 따라 특정 chromatin 서명의 존재 (예를 들어, 활성 강화: H3K4me1 및 H3K27ac)는 근 위 발기인 지구에서 그들을 구분 (예를 들어, 활성 발기인: H3K4me3)6,,78. 다른 한편으로, 정체성 규정 하는 주요한 세포 기능을 가진 유전자는 일반적으로 넓은 chromatin 도메인 기본 유전자의 transcriptionally 활성 또는 비활성 상태에 따라 H3K4me3 또는 H3K27me3, 각각 표시 된9 발견 ,10. 마찬가지로, 주요 셀 정체성 유전자의 표현을 자주 여러 고 공간적 제어를 클러스터 강화 (즉, 슈퍼 강화), 광범위 한 H3K27ac 표시 된 도메인11로 확인 될 수 있다 보인다.
현재, 히스톤 수정 지도 칩 (칩 microarrays 결합) 같은 이전 방법에 비해 더 적은 소음, 큰 범위, 및 낮은 적은 유물 높은 해상도 제공 하는 칩 seq 기술을 사용 하 여 생성 됩니다. 비용12. 그럼에도 불구 하 고, epigenomic 맵 칩 seq 기술을 사용 하 여 생성의 한계, 주로 관심의 샘플에서 칩을 성공적으로 수행 하는 능력을 연관 있다. 전통적인 칩 프로토콜은 일반적으로 수백만의 세포를 체 외에서 세포를이 방법의 적용 라인 또는 세포는 제한 쉽게 격리 수 vivo에서 (예를 들어, 혈액 세포) 필요 합니다. 지난 몇 년 동안, 여러 수정된 칩 프로토콜 낮은 셀 숫자와 호환 설명된13,14,,1516되었습니다. 그러나, 이러한 프로토콜은 다음-세대 시퀀싱 (즉, 칩 seq)와 결합 하도록 특별히 설계 된 그리고 그들은 일반적으로 임시 라이브러리 준비 방법13,14, 를 사용 하 여 15 , 16.
여기, 우리는 히스톤 수정 프로필 중간에 낮은 셀 숫자 (5 x 104 -5 x 105 셀)를 사용 하 여 조사 하는 데 사용할 수 있는 칩 프로토콜 설명 (즉, 칩 정량) 중 선택한 loci 또는 전역 (즉, 칩 seq) (그림 1). 칩 seq 기술 결합 때 우리의 칩 프로토콜 표준 라이브러리 준비 방법, 따라서 많은 실험실10에 광범위 하 게 액세스할 수 있도록 함께 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 여러 히스톤 부호를 조사 하기 위해 사용 되었습니다 (예를 들어, H3K4me3, H3K27me3, 및 H3K27ac) 다른 닭 배아 조직 (예를 들어, 척추 신경 관 (SNT), frontonasal 굴지, 및 epiblast)에. 그러나, 우리는 그것은 다른 유기 체는 생물학적 및 임상 관련 샘플만 얻을 수 낮은 금액에 광범위 하 게 적용 해야 예상.

<table><tbody><tr><td>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA 분말</td><td>Carl Roth</td><td>3737.3</td><td></td></tr><tr><td>인산염 식염수 완충액(PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL pH 8.0</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>칼 로스</td><td>3054.2</td><td></td></tr><tr><td>Na-데옥시콜레이트</td><td>시그마 알드리치</td><td>D6750-24</td><td></td></tr><tr><td>N-라우로일사르코신</td><td>시그마 알드리치</td><td>61743-25G</td><td></td></tr><tr><td>헤페스</td><td>애플리켐</td><td>A3724,0250</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>칼 로스</td><td>3739.2</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>시그마 알드리치</td><td>I3021-100ml</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Carl Roth</td><td>1833</td><td></td></tr><tr><td>단백질 G/마그네틱 비드</td><td>Invitrogen</td><td>1004D</td><td></td></tr><tr><td>37% 포름알데히드</td><td>시그마 알드리치</td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>Peqlab</td><td>12-RA-03</td><td></td></tr><tr><td>단백질 분해 효소 K</td><td>시그마 알드리치</td><td>46.35 E</td><td></td></tr><tr><td>Na-부티레이트</td><td>시그마 알드리치</td><td></td><td></td>SLB2659V</tr><tr><td>단백질분해효소 억제제</td><td>Roche</td><td>5892791001</td><td></td></tr><tr><td>SYBRgreen Mix</td><td>바이오짐</td><td>617004</td><td></td></tr><tr><td>dH2O</td><td>시그마 Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>1 Kb ladder</td><td>Thermofisher</td><td>SM1333</td><td></td></tr><tr><td>오렌지 G</td><td>시그마 Alrich</td><td>03756-25</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>인바이트로겐</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신-EDTA (1x)</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>옥틸페놀 에톡실레이트(트리톤 X 100)</td><td>Roth</td><td>3051.4</td><td></td></tr><tr><td>DMEM(Dulbecco&acute; s Modified Eagle Medium)</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>젤 로딩 팁 Multiflex</td><td>A.Hartenstein</td><td>GS21</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 플레이트</td><td>Sarstedt</td><td>721,985,202</td><td></td></tr><tr><td>384 웰</td><td>Sarstedt</td><td>721,985,202</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>72,706</td><td></td></tr><tr><td>100 - 1,000 &micro; L 필터 팁</td><td>Sarstedt</td><td>70,762,211</td><td></td></tr><tr><td>2 - 20 &micro; L 필터 팁</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,213</td><td></td></tr><tr><td>2 - 200 &micro; L 필터 팁</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,211</td><td></td></tr><tr><td>0.5 - 10 &마이크로; L 필터 팁</td><td>Sarstedt</td><td>701,116,210</td><td></td></tr><tr><td>H3K27me3 항체</td><td>Active Motif</td><td>39155</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac 항체</td><td>Active Motif</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me3 항체</td><td>Active Motif</td><td>39159</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me2 항체</td><td>Active Motif</td><td>39141</td><td></td></tr><tr><td>End Repair Mix</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>상자성 비드</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>부유 완충액</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>A-테일링 믹스</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>라이게이션 믹스</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>RNA 어댑터 인덱스</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2101</td><td></td></tr><tr><td>정지 결찰 버퍼</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>PCR 프라이머 칵테일</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Enhanced PCR Mix</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>게놈 DNA 래더</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>용리 완충액</td><td>Agilent</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Sample Buffer</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>라이브러리 정량화 키트</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4835 &ndash; 07960204001</td><td></td></tr><tr><td>비옥한 닭 흰자 달걀</td><td>LSL Rhein Main</td><td>KN: 15968</td><td></td></tr><tr><td>바늘 (Neoject)</td><td>A.Hartenstein</td><td>10001</td><td></td></tr><tr><td>주사기 (Ecoject 10 mL)</td><td>Dispomed witt oHG</td><td>21010</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td>strong>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Hermle</td><td>Z 216 MK</td><td></td></tr><tr><td>Thermoshaker</td><td>ITABIS</td><td>MKR13</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Active Motive</td><td>EpiShear probe sonicator Sonicator</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Diagenode</td><td>Bioruptor Plus</td><td></td></tr><tr><td>로테이터</td><td>스튜어트</td><td>SB3</td><td></td></tr><tr><td>가변 볼륨(5 &ndash; 1,000 &뮤; L) 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>Sigma</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>마그네틱 홀더</td><td>Thermo Fisher</td><td>DynaMag-2 12321D</td><td></td></tr><tr><td>테이블 스피너</td><td>Heathrow Scientific</td><td>새싹</td><td></td></tr><tr><td>믹서</td><td>LMS</td><td>VTX 3000L</td><td></td></tr><tr><td>Real-Time PCR Cycler</td><td>Roche</td><td>Light Cycler; 시리얼 Nr.5662</td><td></td></tr><tr><td>PCR Cycler</td><td>응용 바이오시스템</td><td>유전자 앰프 PCR 시스템 9700</td><td></td></tr><tr><td>DNA 및 RNA 품질 관리 시스템</td><td>애질런트</td><td>애질런트 4200 TapeStation 시스템</td><td></td></tr><tr><td>겸자</td><td>Dumont</td><td>5-Inox-H</td><td></td></tr><tr><td>천공 스푼</td><td>세계 정밀 기기</td><td>501997</td><td></td></tr></tbody></table>

낮은 풍부 배아 샘플 chromatin immunoprecipitation (칩) 프로토콜

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (칩) post-translationally 수정된 히스톤, 히스톤 변형, 녹음 방송 요인, 또는 주어진된 장소에서 또는 게놈 넓은 규모로 chromatin 수정 효소의 지역화를 매핑하기 위한 널리 사용 기법입니다. 다음-세대 시퀀싱 (즉, 칩 Seq) 칩 분석 실험의 조합 세계적으로 유전자 규제 네트워크를 폭로 하 고 특히 비 코딩 규제 시퀀스의 유전자의 기능 주석 개선 하기 강력한 접근 이다. 칩 프로토콜은 일반적으로 많은 양의 세포 소재, 따라서 희귀 세포 유형 또는 작은 조직 생 검 조사 하는 것이 방법의 적용 제외 필요 합니다. 칩 분석 결과 얻어질 수 있는 일반적으로 생체 내에서 초기 척추 embryogenesis 동안 생물 학적 물질의 양을와 호환을 위해 여기 있는 단계 수를 완료 하는 데 필요한 간단한 칩 프로토콜 설명 합니다 분석 결과 샘플 손실을 최소화 하기 위해 감소 했다. 이 칩 프로토콜은 다양 한 배아 닭고기와 성인 마우스 조직 낮은 중간 셀 숫자 (5 x 104 -5 x 105 셀)를 사용 하 여 다른 히스톤 수정 조사를 성공적으로 사용 되었습니다. 중요 한 것은,이 프로토콜은 표준 라이브러리 준비 방법을 사용 하 여 칩 seq 기술과 호환, 관련성이 높은 배아 조직에 지도 글로벌 epigenomic 제공.

우리의 칩 프로토콜의 성능을 설명 하기 위해 수행 하는 칩 seq 실험 HH19 닭 배아에서 풀링된 SNT 섹션을 사용 하 여, HH22의 상 악 굴지 닭 배아, 그리고 무대 HH3 닭 배아의 바인딩 프로필을 조사 하 다양 한 히스톤 수정 (즉, H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3, 및 H3K27me3). 일단 칩 DNAs 가져온 쥡니다 효율 해당 입력된 DNAs (그림 3)의 agarose 젤 전기 이동 법에 의해 평가 되었습니다. 다음, 칩 및 입력된 DNAs 사용 되었다 칩 정량 분석을 위해 측정 수 바운드 또는 언바운드 조사 히스톤 수정 (그림 4A)에 의해 예상 loci에서 풍부 하. 그림 4A, H3K27me3 및 H3K4me3 농축에 나와 있는 예제에서 HH19 SNT 섹션...

여기, 우리는 chromatin immunoprecipitation (칩) 및 칩 seq 라이브러리 준비 프로토콜 낮은 풍부한 닭 배아 샘플에서 글로벌 epigenomic 프로 파일 생성을 설명 합니다.

낮은 풍부 배아 샘플 chromatin Immunoprecipitation (칩) 프로토콜

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

이 절차의 전반적인 목표는 척추동물 게놈의 기능적 주석을 개선하기 위해 저농도 배아 샘플을 사용하여 다양한 히스톤 변형의 결합 프로파일을 조사하는 것입니다. 이 방법은 특정 배아 조직의 정체성을 정의하는 핵심 인핸서 및 유전자와 같은 발생 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 제한된 양의 특정 물질이 필요하고 국소 특이적 및 게놈 전체 분석 모두에 사용할 수 있다는 것입니다.이 방법은 배아 조직과의 전사 조절 또는 세포 이질성에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 특허 샘플과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 실험을 위한 닭 배아인 HH19 단계를 얻으려면 수정이 가능한 흰색 레그혼 암탉 알을 섭씨 37도, 습도 80%에서 3일 동안 수평 방향으로 부화합니다. HH19 배아를 분리하기 시작하려면 10mm 주사기로 3ml의 알부민을 추출하여 배배엽을 낮춰 배아에 접근할 수 있도록 합니다.여분의 배아 막을 제거하려면 가는 가위를 사용하여 눈에 작은 구멍을 만드십시오. 잠금 용액 1ml를 추가합니다. 구부러진 바늘을 사용하여 0.5ml의 인디언 블랙 잉크를 추가합니다.가느다란 수술용 가위와 집게를 사용하여 배아를 둘러싸고 있는 여분의 배아 막을 잘라냅니다. 그런 다음 구멍이 뚫린 숟가락으로 배아를 20ml의 PBS 용액이 들어 있는 4.5cm 페트리 접시에 옮깁니다. 실체 현미경으로 얼음 위에서 작업하면서 가는 가위와 집게를 사용하여 양막과 여분의 배아 막의 나머지 부분을 해부하고 버립니다.그런 다음 배아의 상완 수준에서 횡방향 척추 신경관 또는 SNT 분절을 절단합니다. SNT를 분리하기 위해 절개를 꼬리 쪽으로 흉부 부위로 확장하십시오. 마무리하려면 집게를 사용하여 SNT를 측면과 복부로 둘러싸고 있는 조직을 제거합니다.SNT를 분리한 후 각 세그먼트를 섭씨 3.5도의 따뜻한 트립신이 함유된 37cm 페트리 접시에 담그십시오. 실체 현미경에서 SNT 주변의 비신경 조직이 느슨해지는 것이 보이면 샘플을 차가운 1x PBS로 옮깁니다. 트립신화를 중지하려면 10%FBS가 함유된 차가운 DMEM이 있는 새 접시에 샘플을 옮깁니다.겸자를 사용하여 SNT에 남아 있는 중간엽 및 외배엽 조직을 수동으로 제거합니다. 이 깨끗한 SNT 섹션을 1.5ml 튜브로 옮기고 액체 질소에서 급속 동결합니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 따라 조직을 균질화합니다.13.5마이크로리터의 37%포름알데히드를 넣고 실온의 회전체에서 15분 동안 배양합니다. 포름알데히드를 소멸시키려면 2.5 몰 글리신 25마이크로리터를 튜브에 넣고 실온의 회전체에서 10분 동안 배양합니다. 튜브를 원심분리기한 다음 텍스트 프로토콜에 따라 펠릿을 세척합니다.교차결합 후, 펠릿을 300마이크로리터의 얼음처럼 차갑게 다시 현탁시키고 피펫팅으로 완전한 용해 완충액을 만듭니다. 섭씨 4도의 흔들 플랫폼에서 10분 동안 샘플을 배양합니다. 다음으로, 섭씨 4도에서 샘플을 초음파 처리합니다.초음파 처리 후, 10 분 동안 섭씨 4도에서 16, 000 x G에서 샘플을 원심 분리하십시오. 상등액 또는 용해액을 새 1.5ml 튜브로 옮기고 세포 파편 펠릿을 버립니다. 텍스트 프로토콜에 따라 용해물을 희석합니다.그런 다음 각 샘플의 작은 부분 표본을 입력 제어로 유지하고 섭씨 20도에서 동결합니다. 염색질 침전을 적용하거나 텍스트 프로토콜에 따라 적절한 항체를 가진 칩을 주입할 나머지 샘플을 배양합니다. 그런 다음 300마이크로리터의 항체 결합 염색질을 이전에 세척한 마그네틱 비드에 추가합니다.샘플을 혼합하기 위해 튜브를 뒤집습니다. 항체를 비드에 결합하려면 튜브를 튜브 로테이터에 놓고 최소 4시간 동안 섭씨 4도에서 수직으로 회전합니다. 염색질 결합 비드를 세척하려면 얼음이 보관된 튜브에 얼음처럼 차가운 RIPA 세척 버퍼 1ml를 추가하고 튜브를 뒤집거나 튕겨 혼합합니다.튜브를 실온에서 마그네틱 홀더에 넣은 후 비드가 측면에 가라앉을 때까지 기다립니다. 맑은 액체를 붓고 이 세척을 세 번 더 반복합니다. 튜브에 TE 50 밀리몰 염화나트륨 1ml를 첨가한 후 이 용액의 염색질 결합 비드를 새로운 1.5mm 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.튜브를 마그네틱 홀더에 넣고 구슬이 가라앉으면 액체를 붓습니다. 다음으로, 사전 냉각된 원심분리기에서 섭씨 4도에서 900 x G의 비드를 3분 동안 원심분리합니다. 비드가 마그네틱 홀더에 정착된 후 젤 로딩 팁을 사용하여 남아 있는 모든 TE를 제거합니다.실온에서 작업하면서 비드에 210마이크로리터의 용리 버퍼를 추가하고 플릭하여 다시 현탁합니다. 섭씨 65도의 예열된 열 블록에서 15분 동안 흔들면서 튜브를 배양합니다. 배양 후에, 1 분 동안 실내 온도에 16, 000 x G에 구슬을 가진 관을 분리기.비드가 마그네틱 홀더에 정착하면 상층액을 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 이전에 동결된 입력 제어 샘플을 섭씨 20도에서 실온으로 해동합니다. 샘플에 90마이크로리터의 용리 완충액을 추가하고 간단히 와류로 혼합합니다.교차 결합을 역전시키려면 칩을 배양하고 밤새 섭씨 65도에서 샘플을 제어합니다. 실온에서 작업하면서 튜브당 한 부피의 TE 버퍼를 추가하고 뒤집어 혼합합니다. RNA를 분해하려면 RNAse A를 대조군에 추가하고 샘플을 최종 농도인 밀리리터당 0.2mg으로 칩하고 튜브를 뒤집어 혼합합니다.섭씨 37도의 예열된 열 블록에서 튜브를 2시간 동안 배양합니다. 후속 DNA 정제를 위해 단백질을 소화하려면 프로테아제 K를 튜브에 밀리리터당 0.2mg의 최종 농도로 추가하고 튜브를 뒤집어 혼합합니다. 섭씨 55도의 예열된 가열 블록에서 튜브를 2시간 동안 배양합니다.보충 자료에 따라 DNA를 추출하고 정제합니다. 이 DNA는 이제 정량적 PCR 및 칩 탐색 라이브러리 준비에 사용할 수 있습니다. 성공적인 칩에 필수적인 초음파 처리 효율은 입력 제어 샘플의 아가로스 젤 전기영동에 의해 확인됩니다.이 예에서는 닭 척추 신경관 또는 SNT 절편을 사용하여 200에서 500 염기쌍에 이르는 최적의 단편 크기를 얻기 위해 11개의 초음파 처리 주기를 사용했습니다. 부서진 DNA는 닭 SNT에서 활성 및 비활성 유전자의 프로모터 영역 주변의 활성화 및 억제 히스톤 표시의 농축 수준을 측정하기 위해 정량적 PCR에 의해 분석되었습니다. 이는 추가 분석을 위해 많은 DNA를 잃지 않고 몇 개의 low side만 정량화하여 chipped 품질을 평가할 수 있음을 보여줍니다.칩 탐색 라이브러리가 순서대로 준비된 후, 닭 SNT에서 생성된 H3K27 tri methylation 및 H3K4 tri methylation chip seek 데이터에 대한 대표적인 메뚜기가 표시됩니다. 유사한 칩 탐색 프로파일은 또한 상악 돌출부 및 HH3 단계 배아와 같은 다른 닭 배아 조직에서 성공적으로 생성되었습니다. 이는 여기에 제시된 칩 프로토콜이 제한된 양의 다양한 배아 조직으로부터 후성유전체 프로파일을 생성하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다.이 프로토콜을 사용하여 배아 조직에서 히스톤 변형 프로파일을 생성함으로써 신호는 이러한 조직에 존재하는 모든 다른 세포 유형에서 나온다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에 따라 더 많은 시작 생물학적 물질을 사용하면 전사 인자, 공동 활성제 또는 RNA 중합효소 2 하위 단위와 같은 전사 조절에 관여하는 다른 단백질의 결합 프로파일을 조사할 수 있어야 합니다. 일단 확립되면, 이러한 프로토콜은 발달 생물학 또는 의학 유전학 분야의 연구자들이 척추동물 게놈의 기능적 변화를 개선하고 근육 발생, 진화 및 인간 질병의 분자적 기초에 대한 중요한 통찰력을 얻을 수 있도록 할 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

ESC의 차별은 셀 타입의 특정 구조의 변화와 염색질의 구성과 일치한다. 이러한 변화의 감지는 stemcellness 및 세포 분화를 정의하는 메커니즘에 중요한 통찰력을 제공합니다. 염색질 immunoprecipitation (칩)은 줄기 세포 분화를 기본 분자 메커니즘을 해부하다하는 소중한 방법을 나타냅니다.

인간 배아 줄기 세포에서 염색질의 Immunoprecipitation

우리는 마우스 배아 조직에서 조직 특정 유전자 발현의 시작하는 동안이나 이후에 조직 특정 유전자의 상호 작용 요소를 식별하는 방법은 염색질의 immunoprecipitation (칩)을 보여줍니다. 그것이 정상적인 배아 발달 동안 발생으로이 프로토콜은 조직 특정 유전자 활성화의 연구에 대해 광범위하게 적용되어야합니다.

초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 Immunoprecipitation 분석

우리는 기본 T 세포를 사용하여 염색질의 immunoprecipitation위한 강력한 방법을 설명합니다. 이 방법은 표준 방법에 설립 있지만, 세포의 제한된 수량에 대한 효율성을 개선 조건과 시약의 특정 집합을 사용합니다. 중요한 데이터 분석 단계에 대한 자세한 설명이 표시됩니다.

바이오 매스의 제한 금액을 사용하여 효율적으로 염색질 immunoprecipitation의

염색질의 immunoprecipitation과 매우 높은 처리량 시퀀싱 (칩 SEQ)의 조합은 특정 조직이나 세포주에서 단백질 DNA 상호 작용을 파악하고 매핑 할 수 있습니다. 설명은 예를 들어 전사 인자 TCF7L2 경험을 사용하여 다음 순서를위한 고품질 칩 템플릿을 생성하는 방법이다.

높은 처리량 시퀀싱을위한 고품질 염색질 면역 침전의 DNA 템플릿의 생성 (칩 SEQ)

방법 염색질 규제 및 염색질 상태의 문제는 생체 내에서 유전자가 세포 운명 결정이 배아에서 어떻게 만들어 지는지 초기에 대한 우리의 이해의 열쇠입니다 영향을 미칩니다. 칩 서열 번호 - 글로벌 수준입니다 Xenopus의 배아 여기 설명에서 크로 마틴의 기능을 조사하기 가장 인기있는 방법.

염색질 레귤레이터 및 미국에서의 게놈 전체의 스냅 샷<em&gt; 아프리카 발톱 개구리</em칩 서열 번호&gt; 태아

유전자 전사의 미세 조정 규정은 배아 세포 운명 결정의 기초가. 여기서, 우리는 줄기 세포와 마우스 배아 심장 개발 모두 심장 분화의 후생 유전 학적 조절을 조사하기 위해 사용 염색질 면역 침전 분석법을 설명한다.

배아 줄기 세포와 조직의 심장 차별화의 성적인 규정

여기, 우리는 칩 Seq를 수행 하는 방법을 설명 및 CARIP-Seq, 다음-세대 시퀀싱, 라이브러리 준비 등 글로벌 epigenomic 및 chromatin 관련 RNA 생성 하 ES 세포에 지도.

CARIP-Seq와 칩 Seq: Chromatin 관련 된 RNAs 및 배아 줄기 세포에 단백질 DNA 상호 작용을 식별 하는 방법

여기는 갈색 지방이 많은 직물 (박쥐)는 마우스에서 분리의 높은 처리량 DNA 연속 (칩 seq) 다음 효율적인 chromatin immunoprecipitation (칩)에 대 한 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜은 히스톤 수정 매핑와 관심 비보의 비 히스톤 단백질의 게놈 넓은 지역화 조사에 적합 합니다.

Murine 갈색 지방이 많은 직물의 염색 질 Immunoprecipitation

크로마틴 면역 침전 (ChIP)은 유전자 조절의 분자 메커니즘을 이해하는 강력한 도구입니다. 그러나, 이 방법은 기계적 전단에 의한 재현가능한 크로마틴 단편화를 얻는 데 어려움을 수반한다. 여기서, 우리는 효소 소화를 사용하여 ChIP 분석에 대한 향상된 프로토콜을 제공한다.

포유류 세포에서 미세 Coccal 뉴클레아제사용 염색질 면역침전 분석

이 논문은 ChIP 액체 처리기 플랫폼을 사용하여 특정 히스톤 수정(H3K27ac)과 관련된 DNA 영역의 반자동 마이크로스케일드 ChIP-Seq 프로토콜을 설명하고 태그를 사용하여 라이브러리 준비를 수행합니다. 이 절차는 품질 및 수량 목적에 대한 제어 평가를 포함하고 다른 히스톤 수정 또는 전사 요인에 채택 될 수있다.

대규모 후생유전학 연구를 위한 반자동 ChIP-Seq 절차

이 프로토콜은 스냅 냉동 조직의 염색질 준비에 중점을 두고 있으며 X-ChIP(Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation)에 이어 정량적 PCR 분석(X-ChIP-qPCR) 또는 차세대 시퀀싱 접근법(X-ChIP-seq)에 적합합니다.

염색질 면역침전 분석을 위한 냉동 키메라 간 조직에서 염색질 추출

배우세요 낮은 풍부 닭 배아 샘플에서 히스톤 변형 결합 프로파일을 분석하는 ChIP 및 ChIP-seq 프로토콜을 통해 전사 조절과 세포 이질성을 연구하는 방법을 알아보세요.

낮은 풍부 배아 샘플 chromatin Immunoprecipitation (칩) 프로토콜

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