낮은 풍부 배아 샘플 chromatin Immunoprecipitation (칩) 프로토콜

이 절차의 전반적인 목표는 척추동물 게놈의 기능적 주석을 개선하기 위해 저농도 배아 샘플을 사용하여 다양한 히스톤 변형의 결합 프로파일을 조사하는 것입니다. 이 방법은 특정 배아 조직의 정체성을 정의하는 핵심 인핸서 및 유전자와 같은 발생 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 제한된 양의 특정 물질이 필요하고 국소 특이적 및 게놈 전체 분석 모두에 사용할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 배아 조직과의 전사 조절 또는 세포 이질성에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 특허 샘플과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 실험을 위한 닭 배아인 HH19 단계를 얻으려면 수정이 가능한 흰색 레그혼 암탉 알을 섭씨 37도, 습도 80%에서 3일 동안 수평 방향으로 부화합니다. HH19 배아를 분리하기 시작하려면 10mm 주사기로 3ml의 알부민을 추출하여 배배엽을 낮춰 배아에 접근할 수 있도록 합니다.

여분의 배아 막을 제거하려면 가는 가위를 사용하여 눈에 작은 구멍을 만드십시오. 잠금 용액 1ml를 추가합니다. 구부러진 바늘을 사용하여 0.5ml의 인디언 블랙 잉크를 추가합니다.

가느다란 수술용 가위와 집게를 사용하여 배아를 둘러싸고 있는 여분의 배아 막을 잘라냅니다. 그런 다음 구멍이 뚫린 숟가락으로 배아를 20ml의 PBS 용액이 들어 있는 4.5cm 페트리 접시에 옮깁니다. 실체 현미경으로 얼음 위에서 작업하면서 가는 가위와 집게를 사용하여 양막과 여분의 배아 막의 나머지 부분을 해부하고 버립니다.

그런 다음 배아의 상완 수준에서 횡방향 척추 신경관 또는 SNT 분절을 절단합니다. SNT를 분리하기 위해 절개를 꼬리 쪽으로 흉부 부위로 확장하십시오. 마무리하려면 집게를 사용하여 SNT를 측면과 복부로 둘러싸고 있는 조직을 제거합니다.

SNT를 분리한 후 각 세그먼트를 섭씨 3.5도의 따뜻한 트립신이 함유된 37cm 페트리 접시에 담그십시오. 실체 현미경에서 SNT 주변의 비신경 조직이 느슨해지는 것이 보이면 샘플을 차가운 1x PBS로 옮깁니다. 트립신화를 중지하려면 10%FBS가 함유된 차가운 DMEM이 있는 새 접시에 샘플을 옮깁니다.

겸자를 사용하여 SNT에 남아 있는 중간엽 및 외배엽 조직을 수동으로 제거합니다. 이 깨끗한 SNT 섹션을 1.5ml 튜브로 옮기고 액체 질소에서 급속 동결합니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 따라 조직을 균질화합니다.

13.5마이크로리터의 37%포름알데히드를 넣고 실온의 회전체에서 15분 동안 배양합니다. 포름알데히드를 소멸시키려면 2.5 몰 글리신 25마이크로리터를 튜브에 넣고 실온의 회전체에서 10분 동안 배양합니다. 튜브를 원심분리기한 다음 텍스트 프로토콜에 따라 펠릿을 세척합니다.

교차결합 후, 펠릿을 300마이크로리터의 얼음처럼 차갑게 다시 현탁시키고 피펫팅으로 완전한 용해 완충액을 만듭니다. 섭씨 4도의 흔들 플랫폼에서 10분 동안 샘플을 배양합니다. 다음으로, 섭씨 4도에서 샘플을 초음파 처리합니다.

초음파 처리 후, 10 분 동안 섭씨 4도에서 16, 000 x G에서 샘플을 원심 분리하십시오. 상등액 또는 용해액을 새 1.5ml 튜브로 옮기고 세포 파편 펠릿을 버립니다. 텍스트 프로토콜에 따라 용해물을 희석합니다.

그런 다음 각 샘플의 작은 부분 표본을 입력 제어로 유지하고 섭씨 20도에서 동결합니다. 염색질 침전을 적용하거나 텍스트 프로토콜에 따라 적절한 항체를 가진 칩을 주입할 나머지 샘플을 배양합니다. 그런 다음 300마이크로리터의 항체 결합 염색질을 이전에 세척한 마그네틱 비드에 추가합니다.

샘플을 혼합하기 위해 튜브를 뒤집습니다. 항체를 비드에 결합하려면 튜브를 튜브 로테이터에 놓고 최소 4시간 동안 섭씨 4도에서 수직으로 회전합니다. 염색질 결합 비드를 세척하려면 얼음이 보관된 튜브에 얼음처럼 차가운 RIPA 세척 버퍼 1ml를 추가하고 튜브를 뒤집거나 튕겨 혼합합니다.

튜브를 실온에서 마그네틱 홀더에 넣은 후 비드가 측면에 가라앉을 때까지 기다립니다. 맑은 액체를 붓고 이 세척을 세 번 더 반복합니다. 튜브에 TE 50 밀리몰 염화나트륨 1ml를 첨가한 후 이 용액의 염색질 결합 비드를 새로운 1.5mm 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

튜브를 마그네틱 홀더에 넣고 구슬이 가라앉으면 액체를 붓습니다. 다음으로, 사전 냉각된 원심분리기에서 섭씨 4도에서 900 x G의 비드를 3분 동안 원심분리합니다. 비드가 마그네틱 홀더에 정착된 후 젤 로딩 팁을 사용하여 남아 있는 모든 TE를 제거합니다.

실온에서 작업하면서 비드에 210마이크로리터의 용리 버퍼를 추가하고 플릭하여 다시 현탁합니다. 섭씨 65도의 예열된 열 블록에서 15분 동안 흔들면서 튜브를 배양합니다. 배양 후에, 1 분 동안 실내 온도에 16, 000 x G에 구슬을 가진 관을 분리기

비드가 마그네틱 홀더에 정착하면 상층액을 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 이전에 동결된 입력 제어 샘플을 섭씨 20도에서 실온으로 해동합니다. 샘플에 90마이크로리터의 용리 완충액을 추가하고 간단히 와류로 혼합합니다.

교차 결합을 역전시키려면 칩을 배양하고 밤새 섭씨 65도에서 샘플을 제어합니다. 실온에서 작업하면서 튜브당 한 부피의 TE 버퍼를 추가하고 뒤집어 혼합합니다. RNA를 분해하려면 RNAse A를 대조군에 추가하고 샘플을 최종 농도인 밀리리터당 0.2mg으로 칩하고 튜브를 뒤집어 혼합합니다.

섭씨 37도의 예열된 열 블록에서 튜브를 2시간 동안 배양합니다. 후속 DNA 정제를 위해 단백질을 소화하려면 프로테아제 K를 튜브에 밀리리터당 0.2mg의 최종 농도로 추가하고 튜브를 뒤집어 혼합합니다. 섭씨 55도의 예열된 가열 블록에서 튜브를 2시간 동안 배양합니다.

보충 자료에 따라 DNA를 추출하고 정제합니다. 이 DNA는 이제 정량적 PCR 및 칩 탐색 라이브러리 준비에 사용할 수 있습니다. 성공적인 칩에 필수적인 초음파 처리 효율은 입력 제어 샘플의 아가로스 젤 전기영동에 의해 확인됩니다.

이 예에서는 닭 척추 신경관 또는 SNT 절편을 사용하여 200에서 500 염기쌍에 이르는 최적의 단편 크기를 얻기 위해 11개의 초음파 처리 주기를 사용했습니다. 부서진 DNA는 닭 SNT에서 활성 및 비활성 유전자의 프로모터 영역 주변의 활성화 및 억제 히스톤 표시의 농축 수준을 측정하기 위해 정량적 PCR에 의해 분석되었습니다. 이는 추가 분석을 위해 많은 DNA를 잃지 않고 몇 개의 low side만 정량화하여 chipped 품질을 평가할 수 있음을 보여줍니다.

칩 탐색 라이브러리가 순서대로 준비된 후, 닭 SNT에서 생성된 H3K27 tri methylation 및 H3K4 tri methylation chip seek 데이터에 대한 대표적인 메뚜기가 표시됩니다. 유사한 칩 탐색 프로파일은 또한 상악 돌출부 및 HH3 단계 배아와 같은 다른 닭 배아 조직에서 성공적으로 생성되었습니다. 이는 여기에 제시된 칩 프로토콜이 제한된 양의 다양한 배아 조직으로부터 후성유전체 프로파일을 생성하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다.

이 프로토콜을 사용하여 배아 조직에서 히스톤 변형 프로파일을 생성함으로써 신호는 이러한 조직에 존재하는 모든 다른 세포 유형에서 나온다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에 따라 더 많은 시작 생물학적 물질을 사용하면 전사 인자, 공동 활성제 또는 RNA 중합효소 2 하위 단위와 같은 전사 조절에 관여하는 다른 단백질의 결합 프로파일을 조사할 수 있어야 합니다. 일단 확립되면, 이러한 프로토콜은 발달 생물학 또는 의학 유전학 분야의 연구자들이 척추동물 게놈의 기능적 변화를 개선하고 근육 발생, 진화 및 인간 질병의 분자적 기초에 대한 중요한 통찰력을 얻을 수 있도록 할 것입니다.