Name: 2- 포스 핀 올리고 뉴클레오타이드를 함유하는 올리고머의 고상 합성을위한 프로토콜 O 원형 이색 성을 통한 - 티오 페닐 메틸 변형 및 특성 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 배우세요 고상 합성을 통한 RNA 올리고뉴클레오타이드 합성 및 정제 방법을. 원형 이색성 분석으로 구조적 특성을 확인하고, 다양한 수정에 적용 가능한 표준 프로토콜을 연구에 활용하세요.

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이 원고의 작성은 Colorado University Denver (JMRE)의 창업 자금을 통해 지원되었습니다. AF는 연구 및 창조 활동 상 (RaCAS, CU Denver)에서 지원을 인정하고자합니다. 콜로라도 주립 대학 덴버 연구 서비스 사무소 (University of Colorado Denver)에서 기부금을 충당하기 위해 자금을 지원합니다. 비디오 부분에 공헌 한 Cassandra Herbert 선생님과 Yannick K. Dzowo 선생님 께 감사드립니다.

1. RNA Oligonucleotides의 고상 합성 <ol><li> 각 포스 포르 아미 다이 트를 함유 한 용액의 제조 (표 1). <ol><li> 뉴클레오타이드의 수를 세고 각 염기에 해당하는 n + 1 방정식 (n = 뉴클레오타이드의 수)에 맞추고 표에 누락 된 값을 기입하십시오. 용적 = 0.1 M 농도의 뉴클레오타이드 당 0.15 mL, 무수 아세토 니트릴에 용해. </li><li> 오븐 건조한 10 mL 앰버 병 (Septum Top Amber 394 Amidite 13 mm ID x 20 mm OD Top)에 각 phosphoramidite를 칭량하고 건조제가 들어있는 데시 케이 터를 사용하여 진공 상태로 즉시 놓습니다. </li><li> 건조한 아르곤으로 데시 케이 터를 채우고, 병을 꺼낸 다음, 해당 아세토 니트릴 (무수)의 양으로 즉시 희석하여 기기에 고정시킵니다. 참고 : 항상 기밀 식 주사기를 사용하고 무수 대기를 유지하십시오. </li><li> 병에서 셉터를 제거하고 m 위에 놓습니다.achine, 병 변경 기능을 통해. 참고 :이 과정은 합성하기 전에 라인을 프라임하기 위해 각 솔루션의 추가 0.15 mL (따라서 위의 n + 1 공식에서 초과 부피)가 필요합니다. </li></ol></li><li> 소프트웨어를 사용한 시퀀스 및 고체상 합성의 설정 ( 그림 3 ). <ol><li> 소프트웨어 아이콘 ( 예 : OligoNet 1.0.1)을 클릭하고 기기 이름&gt; 확인을 선택하십시오. 파일&gt; 새 합성&gt; 순서 로 새 합성을 만듭니다. </li><li> 입력 : 날짜; RunID; 악기 선택; 시퀀스 이름; 서열 (5 &#39;에서 3&#39;말단). 순환에서 이전에 작성된 메소드를 지정하십시오 ( 그림 3 ). 끝 절차 ( CPG 수지에 결합 된 올리고 뉴클레오타이드 잎)&gt; 수동을 선택하십시오. </li><li> DMT Off&gt;를 선택하십시오 (합성 마지막 단계에서 5&#39;-OH 그룹을 얻는 마지막 단계에서 TCA 처리) . 파일 저장&gt; 다른 이름으로 저장실험의 이름을 제공하십시오. </li><li> 파일을 보내어 합성을 시작하십시오. 순서&gt; 신디사이저에 순서를 보내고 열을 선택하십시오. 1-4 . 신시사이저 창을 열고 trityl 모니터를 선택하십시오 | 기능 | trity | 모든 단계를 선택하십시오 . </li><li> 한 번에 합성 할 올리고 뉴클레오타이드의 수에 따라 필요에 따라 단계를 반복하십시오 (모든 주문은 동일한 방법, 즉 동일한 커플 링 시간 및 일련의 사건을 가져야 함). </li><li> 합성 시작 합성기&gt; 시작 준비 . 측량기에 표시된 위치에 원하는 3 &#39;끝이있는 기둥을 놓습니다. 장비에서 시작&gt; 아니오 (ABI 준비 용)를 클릭 하십시오 . </li><li> 합성이 완료되면, 칼럼을 장비에서 꺼내어 둥근 바닥 플라스크에 넣고 약 0.5 시간 동안 감압 건조시킵니다. 참고 : 짙은 주황색이 랜드에서 관찰되는지 확인하는 것이 좋습니다옴 커플 링 (단계 1.2.4 - 1.2.7)을 사용하여 트리 틸 모니터 기능에서 발생할 수있는 오류를 피하십시오. </li></ol></li><li> RNA oligonucleotides의 탈 보호 및 정제. <ol><li> 검정색 뚜껑을 비틀어 컬럼을 열고 흰색 레진을 1.6 mL 원심 분리 튜브로 모두 옮깁니다 (필요에 따라 또는 목적에 따라 절반). 메틸 아민 (물에서 40 %) / 암모니아 (물에서 40 %) 0.5 mL를 1 : 1로 첨가한다. </li><li> Parafilm으로 원심 분리 튜브 캡을 고정하고 열 블록을 사용하여 1.5 시간 동안 60 ° C로 가열합니다. 참고 : 암모니아 농도가 반응 튜브 내부에서 일정하게 유지되도록 튜브 위에 무거운 물체를 올려 놓을 수 있습니다. </li><li> 가열 블록에서 꺼내 천천히 실온으로 식힌다. 샘플을 간단히 원심 분리하여 내용물을 회전시킨 다음 상징액을 새로운 원심 분리 튜브로 옮긴다. </li><li> 액체 질소 (또는 드라이 아이스 / 에탄올 욕조)에 튜브를 담그고 샘플을 얼려서 방치하면서 건조시킵니다감압하에 원심 분리기에 넣는다. </li><li> 0.4 mL의 triethylamine / N- methylpyrrolidinone / triethylamine-trihydrofluoride (2 : 2 : 3 비율) 용액에 고체를 재현 탁한다. 1.5 시간 동안 60 ℃로 가열 한 후 실온으로 서서히 냉각시킨다. </li><li> 0.04 mL의 NaOAc 용액 (3M, pH 5.5 - HCl로 조정)을 첨가 한 후 피펫 팁으로 부드럽게 섞는다. 에탄올 (1 mL)을 넣고 ca. -70 ℃ (드라이 아이스 / 에탄올 욕) 15 분. </li><li> 15,000 rpm 및 4 ° C에서 10 분간 원심 분리하십시오. 분액을 추출하고 결과 펠렛을 감압하에 건조 시키려면 피펫을 사용하십시오. </li><li> 수득 된 고체를 로딩 완충액 (0.2 mL, 90 % 수성 포름 아미드, 1 mM EDTA)에 재현 탁시키고, 혼합물이 균질해질 때까지 혼합한다. </li><li> 이전에 준비한 폴리 아크릴 아마이드 젤 (20 % denaturing, 잘 치수 : 30cm x 1mm) 위에 현탁액을 적재하십시오. 22 . </li><li> 브로 모 페놀 블루 마커가 1 / 2-2 / 3 사이에있을 때까지 겔을 통해 전류를가한다.(젤 치수 : ~ 21.5 cm x 30 cm). </li><li> 스탠드에서 젤을 꺼내고 젤 내용물을 유리에서 플라스틱 포장 (양면으로 덮음)으로 옮기고 실리카 (254 nm의 형광 염료를 포함)로 덮인 얇은 층 크로마토 그래피 (TLC) 판 위에 올려 놓아 밴드를 시각화합니다 자외선 램프 (λ max = 254 nm)를 사용하여 측정 하였다. </li><li> 마커를 사용하여 위쪽 밴드가있는 위치를 묘사하고 새 면도날을 사용하여 자릅니다. 50 ML 원추형 튜브에 RNA가 들어있는 젤 (플라스틱 포장 없음)을 놓고 유리 막대를 사용하여 작은 조각으로 밟아. </li><li> 겔 잔류 물을 NaCl aq에 현탁시킨다. 용액 (2 mM 및 1 mM EDTA)에 현탁시키고 37 ℃에서 12 시간 동안 현탁액을 흔든다. 10 분 동안 원추형 튜브를 원심 분리하십시오. </li><li> 역상 C18 카트리지를 사용하여 탈염하십시오. <ol><li> 다음과 같이 세척하여 10mL 주사기를 사용하여 카트리지를 준비하십시오 : 아세토 니트릴 (10 mL) H 2 O (2 회, 10 mL) 중 5 mM NH4 Cl aq. 용액 (3 mL) RNA가 포함 된 용액으로 겔 잔류 물을 부어서는 안됩니다. </li><li> H 2 O로 (세 번, 10 ml)로 세척 하였다. </li><li> 60 % aq. 메탄올 용액 (3 mL) </li></ol></li><li> 감압 농축하고 RNase가없는 물 (0.3 mL)에 재용 해한다. </li><li> 묽은 용액 (10 μL)을 준비하고 자외선 vis 스펙트럼 (200-450 nm)을 측정하기 위해 UV-vis 장비 ( 예 : Nanodrop)에 1 μL를 침전시킵니다. </li><li> Beer Lambert의 법칙을 사용하여 얻은 용액의 농도를 결정하십시오 : <img alt="방정식 1" src="/files/ftp_upload/56189/56189eq1.jpg" /> 여기서 A = 얻어진 흡광도; ε = 계산 된 몰 흡광 계수; c = 농도, 1mm의 경로 길이에 대해 l = 0.1이다. </li><li> 올리고 뉴클레오타이드의 몰 흡광 계수를 계산하십시오. 온라인 계산기로 계산DINAMelt 소프트웨어 (http://unafold.ra.albany.edu/?q=dinamelt)를 사용하는 경우 23 </li></ol></li><li> MALDI-TOF를 통한 농도 측정 및 특성 분석. <ol><li> 시료를 C18 팁으로 적재 된 피펫 팁을 사용하여 MALDI 플레이트에 올려 놓고 각 올리고 뉴클레오타이드를 관찰한다. <ol><li> 팁을 50 % 아세토 니트릴 (10 μL x 2)로 씻으십시오. 팁을 0.1 % 트리 플루오로 아세트산 (TFA; 10 μL × 2)로 평형화한다. tip을로드하십시오 (일반적으로 100-150 pmol). </li><li> 팁을 0.1 % TFA (10 μL x 2)로 씻은 다음 물 (10 μL x 2)로 씻으십시오. </li><li> 원하는 매트릭스를 포함하는 용액으로 시료를 용리십시오. 우리는 : 10 μL 25 MM - 2,4,6 - trihydroxyacetophenone 일 수화물 (THAP), 10 MM 암모늄 구연산염, 그리고 50 % 아세토 니트릴에 300 MM 암모늄 불화물의 솔루션을 사용. </li><li> 0.9 μL을 입금하고 (공기 건조 후) 필요에 따라 절차를 반복하여 MALDI 플레이트에 직접 놓습니다. 참고 : 모든 스펙트럼은 리플렉터 포지티브 모드에서 얻습니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. CD 를 통한 RNA 구조 분석 <ol><li> CD 용 솔루션 준비. <ol><li> 수정 된 RNA [3 μM], NaCl [10 mM], 인산 나트륨 완충액 [10 mM, pH 7.2] 및 MgCl 2 [5 mM]을 함유하는 0.25 mL를 준비한다. 이 샘플은 그대로 분석을위한 준비가되어 있습니다. 특히 그것이 단 분자 변환을 나타내는 경우. </li><li> 이중 구조 또는이 분자 전이를 분석하는 것이 목표 인 경우,이 시점에서 보체 (해당되는 경우 1 몰 당량)를 추가하거나 아래 단계를 계속 수행하십시오. </li><li> 샘플을 90 ° C로 예열 한 열 블록에 올려 놓고 열을 꺼서 실내 온도 (일반적으로 2 ~ 4 시간)로 서서히 식히십시오. </li></ol></li><li> 스펙트럼 획득 <ol><li> 빈 용액 (NaCl 10mM, 인산 나트륨 10mM, pH 7.3, MgCl 2 5mM)을 옮기고o 마이크로 큐벳 (경로 길이 1cm, 최소 용량 250 μL)을 채우고 샘플 체인저 홀더 위치에 놓습니다. </li><li> RNA가 들어있는 시료를 다른 마이크로 큐벳으로 옮기고 시료 교환기에 넣습니다. 열 변성 전이를 측정 할 때는 수성 층을 파괴하지 않고 조심스럽게 오일 베드를 넣고 테프론 테이프를 사용하여 큐벳의 캡을 고정시킵니다. </li><li> 질소 탱크를 열어 계기에 위치한 공기 플로터를 ca.로 이동시키는 흐름을 제공하십시오. 40. 냉각기를 켜십시오. </li><li> 기기를 켜고 소프트웨어 Spectra Manager 아이콘을 연 다음 획득 윈도우 Spectra Measurement 를 엽니 다. </li><li> 획득하기 전에 장비를 5 분 동안 질소로 퍼지하십시오. </li><li> Measure&gt; Parameters를 사용하여 스펙트럼을 획득하고 다음과 같이 매개 변수 를 조정하십시오 : <ol><li> 일반 아래에서 다음을 선택하십시오. 스캔 200-350 nm; 채널 CD 및 HT : 데이터피치 0.1nm; 100nm / 분에서 스캐닝 속도; 1nm에서의 밴드 폭; 5의 누적 횟수. </li><li> 세포 단위 아래에서 20 ° C를 선택하십시오. 제어 하에 셔터가 자동으로 열리고 닫힙니다를 선택하십시오. 정보 아래에서 이름, 농도, 운영자를 선택하십시오. </li><li> 데이터 아래에서 원하는 폴더를 찾습니다. 확인을 클릭하십시오. </li></ol></li><li> 측정&gt; 샘플 측정 을 통해 샘플 체인저 1-6 에서 큐벳의 위치를 ​​확인한 후 OK를 클릭하십시오. </li></ol></li><li> 열 변성 전이를 취하는 경우 : <ol><li> 획득 소프트웨어 닫기 파일&gt; 종료 및 새 프로그램 가변 온도 측정&gt; 측정&gt; 매개 변수를 엽니 다. </li><li> 원하는대로 조정할 수있는 열 전환을 기록하려면 다음 매개 변수를 적용하십시오. <ol><li> 온도 에서 시작 온도 를 선택하십시오 : 4 ° C; 간격 : 0.2; 고마워rget : 90 ℃; 기울기 : 1 ℃ / 분; 0 초 기다린다. Start / End 에서 Start condition &amp; end condition을 원하는대로 선택하십시오. </li><li> General (일반 ) 아래에서 3 Channels, CD / HT / Abs를 선택합니다. 대역폭 : 1 nm; 파장 : 270 nm (또는 원하는대로). 제어 에서 없음을 선택하십시오. 정보 에서 이름, 농도, 운영자를 선택하십시오. </li><li> 데이터 아래에서 원하는 폴더를 찾습니다. 확인을 클릭하십시오. </li></ol></li><li> 샘플을 4 ° C로 냉각시키고 스펙트럼 측정을 얻기 전에이 온도에서 5 분 동안 기다리십시오. </li></ol></li><li> 스펙트럼에 대한 데이터 작업. <ol><li> 소프트웨어의 기능을 사용하여 대상 획득에서 공백 스펙트럼을 뺀 다음 사용중인 버퍼 시스템에서 발생하는 백그라운드 신호를 고려하십시오 : Spectra Analysis&gt; File&gt; Open . </li><li> 빈 파일과 스펙트럼 파일이 열리면 뷰 1 (화면의 왼쪽)에서보기 2를 드래그하십시오. </li><li> Pr을 클릭하십시오.ocessing&gt; 빼기&gt; 확인 또는 데이터 교환&gt; 확인 . </li><li> ASCII 파일로 데이터 추출 : 파일&gt; 내보내기 를 선택하고 ASCII를 선택하십시오. </li><li> 소프트웨어를 사용하여 해당 스펙트럼을 그립니다. 신호 대 잡음비가 예상보다 낮을 경우 데이터 평활화는 선택 사항입니다. 이 변환은 평활화 데이터 옵션을 적용하여 적용 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 열 변성 전이에 대한 데이터 작업. <ol><li> JASCO 파일의 데이터를 ASCII 파일로 추출합니다. </li><li> 타원율 점을 온도의 함수로 플롯합니다. 일반적으로 조사되는 파장에 따라 데이터의 평활화가 필요합니다. 어떤 경우에는 210 nm에서 파장을 사용하면 평탄화가 필요한 플롯간에 큰 차이가 나타났습니다. 그러나 샘플 및 농도에 따라 여러 가지 계산이 원시 데이터를 사용하여 수행되었습니다. </li><li> 열 덴트를 계산하려면aturation transition (T m ) 값은 곡선의 1 차 미분을 얻습니다. 최대 또는 최소값은이 매개 변수를 나타냅니다. 이전 단계 에서처럼 가장 정확한 값을 얻으려면 데이터를 부드럽게 처리해야하는 경우가있었습니다. 참고 : 실험은 일반적으로 3 회 수행되어 측정에 해당하는 평균 및 표준 편차가 발생했습니다. </li></ol></li></ol>

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이 원고의 취지는 DNA 또는 RNA의 올리고 뉴클레오타이드의 합성을 성공적으로 달성하거나 향상시키기위한 분야의 연구자, 초보자 또는 전문가에게 가이드 역할을하는 것입니다. 설명 된 방법론은 표준 phosphoramidite 화학을 통해 자동화 된 DNA / RNA 합성기를 사용하는 고상 합성의 사용에 중점을 둡니다. 보고서는 RNA dodecamer의 합성, 정제 및 특성 분석을 단계별로 설명합니다. 또한, CD의 사용은 2 차 구조 모티프 및 열 변성 전이를 확인하는데 사용된다. 이 작업은 다른 상황, 즉 고상 합성에서 다양한 브랜드의 장비, 개조, 보호 그룹 및 / 또는 시약에 적용 할 수 있다는 점에 유의해야합니다. 따라서,이 과정에 관여하는 많은 매개 변수 중 하나 이상을 변경하거나 반응 조건을 조정하여 개선 할 수 있습니다. 나는또한 여기에 제공된 상세한 구조 분석 (CD를 통해)은 일반적으로 UV-vis 를 통해 유사한 분석 <em...

DNA / RNA의 올리고 뉴클레오타이드를 얻기위한 고상 합성은 포스 포르 아미 다이 빌딩 블록 4를 사용하는 1970 년대 1 , 2 , 3 이후 여러 분야에서 여러 분야에서 응용되고있다. 그 광범위한 영향의 예는 다음과 같습니다 : 클릭 화학 반응을 통한 라벨링에 미치는 영향 5 , 구조적 탐침 6 및 안티센스 기술 7 , 생물학적 메커니즘 8 , 9 , 유전 물질 10의 출처 및 다양한 천연 및 / 또는 화학적 변형 11 , 12를 포함 한다. 우리가 여기에서 사용하는 변형은 포함하는 RNA 올리고 뉴클레오타이드를 얻기위한 우리의 노력의 첫 번째 단계를 나타낸다.이 중요한 생체 고분자의 구조와 기능을 일시적으로 제어 할 수있는 광활성 프로브. 5 &#39;- [CUA CG G A AU CAU] -3&#39;/ 5 &#39;- [AUG AUU CCG UAG] -3&#39;(밑줄 친 위치는 C2&#39;- O- 티오 페닐 메틸 변형의 도입을 나타낸다. )이 연구의 초점을 구성합니다. 이 서열은 RNA 가닥의 단일 가닥 또는 이들의 상응하는 이중 구조 (다른 2 차 구조는 열역학적으로 안정한 것으로 예측되지 않음)의 정량 및 측정을 가능하게하기 위해 선택되었다. CD는 구조 파라미터, 즉 이중 형성 및 열 변성 전이를 확립하는 데 사용되었습니다. 합성 이러한 올리고 뉴클레오타이드를 얻는 전반적인 절차는 그림 1 에 나와 있으며 단계별 프로세스를 따르고 있습니다 : 자동화 된 고체상 합성 → Depr→ 정제 → 정량 → 특성화. 그림 2 는이 절차에서 필요한 단량체 단위를 표시합니다. RNA의 고체상 합성 (도 2 좌측) 및 예 G, A 및 C에 친 핵성 엑소 사이 클릭 아민을위한 염기 - 불안정성 보호기의 사용이 포스 화학에 기초한다는 점에서 DNA의 것과 유사 아세틸, 벤조일, 페녹시 아세틸, t- 부틸 또는 N , N- 디메틸 포름 아미드 ( 도 2 , 오른쪽). C2&#39;-OH 그룹 (데 옥시 올리고 뉴클레오타이드 바이오 폴리머에서 결핍 됨)의 존재로 인해 RNA에서 고려해야 할 또 하나의 측면은이 친 핵성 위치의 보호 및 후속 탈 보호에 통합되어야하는 추가 단계이다. 이와 관련하여, 실리콘 기반의 보호 그룹은 biorthogonal moieties (특정tert- 부틸 디메틸 실릴 (TBDMS) 및 트리 이소 프로필 실릴 옥시 메틸 (TOM)기를 대중적인 선택 ( 도 2 , 좌측 하단)으로 사용하여 불소 존재 하에서 탈 보호시켰다. 이 작업에서 표준화 된 phosphoramidite 화학을 사용하는 DNA / RNA 합성기에서 자동 합성을 수행했습니다. 인스트루먼트의 제조업체 설정에는 DNA 용 인산염 버전을 사용하는 경우 자동 희석 단계가 포함되며 사용자가 설정 한 양으로 희석하는 옵션이 포함됩니다. 그러나, 우리는 RNA phosphoramidite의 중량을 측정하고 수동으로 희석하기로 결정했다. 1) 표준 RNA의 가격은 더 높다 (어떤 경우에는 50 배 이상 비싸다). 2) 개질 된 포스 포르 아미 다이 트는 종종 소량으로 얻어진다; 3) 자동화 된 희석 단계 (제조자에 의해 설정 됨)를 사용할 때 낭비되는 물질의 양이 많다. 또한, 1) 상업적으로 입수 가능한 고체 지지체3 &#39;말단으로 기능하는 보호 된 핵 염기를 포함하는 핵산 ( 예 , CPG); 및 2) C2&#39;- O- 위치에서 TBDMS 그룹으로 보호 된 상업적 포스 포르 아미 다이 트 (표준 핵 염기). RNA 합성을 위해 조정 된 단계에 대한 자세한 설명과 설명과 함께 합성 단계의 자세한 목록이 그림 3 과 표 1 에 나와 있습니다. 또한, 그림 4 는 각각의 트리 트리 틸화 단계에서 방출 된 트리 튬 양이온을 정량화하는 &#39;Trityl Monitor&#39;옵션을 선택한 후 모든 단계에서 관찰되는 단계별 수율을 보여줍니다. 전형적으로, 우리의 경험에서, 제한 요인은 원하는 변형을 함유하는 포스 포르 아미 다이 트를 얻는 것이었다는 점은 주목할 가치가있다. 즉, 선택 사이트에서 수정 사항을 통합 할 수있는 합성 방법론을 개발하는 것입니다. 이 보고서에서 우리는우리가 상응하는 합성 방법론 인 C2&#39;- O- 티오 페닐 메틸기를 확립 한 변형 된 뉴클레오타이드의 혼입. 이 그룹은 크기가 작으며 어떤 방식 으로든 고상 합성에 영향을 미치지 않습니다. 이 그룹을 RNA의 올리고 뉴클레오타이드에 혼입시키는 것이 구조적 및 열역학적 파라미터 4 와 함께보고 되었기 때문에, 변형 된 포스 포르 아미 다이 트를 유도하는 유기 합성의 어떠한 측면도 본원에서 기술되지 않을 것이다. 탈 보호, 정제 및 특성화 외래 아민 및 β- 시아 노 에틸 기의 탈 보호는 CPG- 수지로부터의 절단과 동일한 단계에서 일어난다. 우리는 AMA의 수용액의 존재 하에서 얻어진 수지를 가열하고, 플루오 라이드 이온의 존재하에 C2&#39;- O- 실릴기를 절단하고,이어서 겔을 통해 정제하는 통상적으로 사용되는 조건을 적용 하였다전기 영동. 이들이 많은 경우에 표준 조건이되었지만, 염기성 조건이나 불소 이온에 불안정한 변형은 메탄올 / 탄산 칼륨 (MeOH / K 2 CO 3 ) 또는 부틸 아민과 같은 보다 온화한 조건 13 , 14 가 필요할 수 있습니다. 따라서, 대응하는 포스 포르 아미 다이 트상의 상이한 세트의 보호기가 필요하다. 또한, 우리는이 방법으로 이전의 경험과 다른 계기의 부족을 감안할 때 탈 보호 된 올리고머를 정제하는 데 바람직한 대안으로 전기 영동을 선택했습니다. 그러나 HPLC를 효과적인 방법으로 사용할 수도 있습니다 15 . 정제 된 올리고 뉴클레오티드의 특성 우리 그룹 (16)에 의해보고 된 절차를 사용하여, 질량 분석법, 비행의 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 시간 (MALDI-TOF)을 통하여 수행 하였다. 구조적 특성 분석 및<html> 얻어진 이중 가닥의 안정성은 CD 를 통해 수행되었다. 구체적으로, 우리는 CD를 이용하여, RNA의 변형 된 및 변형되지 않은 올리고 뉴클레오티드의 열 변성 전이를 결정하는데, 이는 ca에서 밴드의 타원율의 감소를 따른다. 270 nm, 그리고 210 nm에서 λ max 의 밴드 (음의 타원율)의 소멸. 하이브리드 화 전후의 스펙트럼 비교는 그들의 차이점을 설명하고 사용 된 방법론의 타당성을 입증하기 위해 제공됩니다. CD의 사용은 널리 핵산 구조적 모티프의 결정으로 인정하고 17 아미노산, 따라서 다양한 구조 및 열역학적 파라미터 (18)를 결정하는 도구로 이용 될 수있다; 그러나이 기술이 열 변성 전이를 평가하는 데 사용되는 예는 많지 않습니다. 일부 경우에는 G-quadruplexes를 포함하는 DNA에 대한 열 안정성 결정이 포함됩니다19 , 20 또는 RNA의 이중 가닥과 머리핀 21 . 이 보고서는 전문가가 아닌 독자 또는 시청자에게 이러한 유형의 조사를 원활하게 시작할 수있는 도구 세트를 제공 할 계획입니다. 이 흥미로운 과학 분야와 관련된 다른 연구소의 방법론 및 기술을 향상시키고 비교하는 데 도움이 될 것입니다. 이 보고서의 내용은 다양한 소스에서이 기술의 기존 프로토콜을 추가하고 각 단계에 대한 시각적 지원을 강화하고 경험을 촉진합니다.

<table><tbody><tr><td>AbsolveTM</td><td>PerkinElmer</td><td>6NE9711</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴 99.9%, HPLC 등급</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴 99.9%, DNA 염기서열분석용 무수</td><td>Fisher BioReagents</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>아크릴아미드, 99+%</td><td>ACROS 유기물</td><td>164850025</td><td></td></tr><tr><td>염화암모늄 98+%</td><td>Alfa Aesar</td><td>12125-02-9</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 시트레이트, 이염기성 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3012-65-5</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 플루오라이드&nbsp; 98.0%, ACS 등급</td><td>Alfa Aesar</td><td>12125-01-8</td><td></td></tr><tr><td>수산화암모늄 28 - 30% 물, ACS Plus</td><td>Fisher Chemical</td><td>1336-21-6</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 퍼설페이</td>트 <td>ACROS Organics</td><td>1444</td><td></td></tr><tr><td>아르곤-초고순도</td><td>&nbsp; Airgas</td><td>7440-37-1</td><td></td></tr><tr><td>비스-아크릴아미드 초순수</td><td>VWR-Amresco</td><td>172</td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td>Fisher Scientific</td><td>A73-1</td><td></td></tr><tr><td>디에틸 피로카보네이트, 97%</td><td>ACROS 유기물</td><td>A0368487</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, 무수, 조직학 등급</td><td>Fisher Chemical</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민 테트라아세트산, 디소듐 염 탈수 100.2%</td><td>Fisher Chemical</td><td>6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>포름아미드&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-12-7</td><td></td></tr><tr><td>염산, 36.5 - 38.0%, 인증된 ACS Plus</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 클로라이드 헥사하이드레이트, 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>메탄올, 99.9%,&nbsp; HPLC 등급</td><td>피셔 화학</td><td>물질 67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>메틸아민 40% 물 중</td><td>시그마 알드리치</td><td>74-89-5</td><td></td></tr><tr><td>1-메틸-2-피롤리디논, 및 무수, 99.5%</td><td>알드리치</td><td>872-50-4</td><td></td></tr><tr><td>Opti-TOFTM 96 웰 인서트 (123 x 81 mm)&nbsp;</td><td>MDS SCIEX</td><td>1020157</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away Molecular</td><td>BioProducts</td><td>7005-11</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 나트륨, 무수 99.2 %, ACS</td><td>Fisher Chemical</td><td>인증 127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨, 100.5 %, ACS</td><td>Fisher Chemical</td><td>인증 7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 일 염기성 이수화물 99.0 %</td> <td>Sigma</td><td>13472-35-0</td><td></td></tr><tr><td>2',4' 트리에틸아민, 99+%</td><td>Alfa Aesar</td><td>121-44-8</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Amresco</td><td>761</td><td></td></tr><tr><td>트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드, 98%</td><td>Aldrich</td><td>73602-61-6</td><td></td></tr><tr><td>트리플루오로아세트산, 99%</td><td>Alfa Aesar</td><td>76-05-1</td><td></td></tr><tr><td>6'-트리하이드록시아세토페논 일수화물 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>480-66-0</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-3</td><td></td></tr><tr><td>요소</td><td>Fisher Scientific</td><td>U15-3</td><td></td></tr><tr><td>RNA 합성을 위한 시약:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deblocking mix, 3% trichloroacetic acid in dichloromethane</td><td>Glen Research</td><td>&nbsp; 40-4140-57</td><td></td></tr><tr><td>캡 믹스 A, THF/피리딘/아세트산 무수물</td><td>Glen Research</td><td>40-4110-52</td><td></td></tr><tr>캡 믹스 B, THF <td>Glen Research</td><td>40-4120-52</td><td></td>활성제의<td>10% 1-메틸이미다졸</td></tr>, <tr><td>0.25 M 무수 아세토니트릴 내 5-에틸티오-1H-테트라졸</td><td>Glen Research</td><td>&nbsp; 30-3140-52</td><td></td></tr><tr><td>산화 용액, THF/피리딘/물에 0.02 M 요오드 Glen</td><td>Research</td><td>40-4330-52</td><td></td></tr><tr><td>U-RNA-CPG</td><td>글렌 연구</td><td>20-3330-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-G-RNA-CPG&nbsp;</td><td>글렌 리서치</td><td>20-3324-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-G-CE 포스포라미다이트&nbsp;</td><td>Glen Research</td><td>10-3025-xx</td><td></td></tr><tr><td>U-CE 인산</td>염 <td>Glen Research</td><td>10-3030-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-C-CE 인산</td>염 <td>Glen Research</td><td>10-3015-xx</td><td></td></tr><tr><td>Bz-A-CE 인산</td>염<td>글렌 리서치</td><td>10-3003-xx</td><td></td></tr></tbody></table>

2&#39;- 포스 핀 올리고 뉴클레오타이드를 함유하는 올리고머의 고상 합성을위한 프로토콜<em&gt; o</em&gt; 원형 이색 성을 통한 - 티오 페닐 메틸 변형 및 특성 분석

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

고상 합성은 핵산, 특히 DNA 또는 RNA의 정식 및 변형 중합체를 수득하는데 사용되어 다양한 분야의 응용 및 상이한 연구 목적을 위해 널리 사용되는 방법론이되었다. 본원에 기술 된 절차는 C2&#39;- O- 위치에 위치한 0 개, 1 개 또는 2 개의 변형을 함유하는 RNA 5 &#39;- [CUA CGG AAU CAU] -3&#39;의 도데 카머의 합성, 정제 및 특성 규명에 초점을 둔다. 프로브는 2- 티오 페닐 메틸기를 기본으로하며, 표준 유기 합성법을 통해 RNA 뉴클레오타이드에 통합되고 각각의 포스 포르 아미 다이 트를 통해 상응하는 올리고 뉴클레오타이드로 도입된다. 이 보고서는 2&#39;- O- 아미노 말단에서 변형 된 2- 티오 페닐 메틸 작용 화 된 뉴클레오타이드뿐만 아니라 4 개의 정준 핵산 염기 (Uridine (U), Cytosine (C), Guanosine (G), Adenosine (A))를 통한 포스 포르 아미 다이 트 화학 반응을 이용한다. 위치; 그러나이 방법론은 큰 var수년에 걸쳐 개발 된 수정 사항들. 올리고 뉴클레오타이드는 표준 조건, 즉 암모니아와 메틸 아민 (AMA)과 불화 수소 / 트리 에틸 아민 / N- 메틸 피 롤리 디논의 혼합물 하에서 수지로부터 분리하고 탈 보호 한 제어 된 구멍 유리 (CPG) 지지체상에서 합성 하였다. 상응하는 올리고 뉴클레오티드는 역상 크로마토 그래피 (9 월 박, C (18) 칼 럼)을 통해 용출 탈염하고, 분리 한 다음 폴리 아크릴 아미드 전기 영동 (20 % 변성)를 통해 정제 하였다. 정량 및 구조 파라미터는 자외선 - 가시 광선 (UV-vis) 및 원 편광 이색 성 (CD) 광도 분석을 통해 각각 평가되었습니다. 이 보고서는이 분야에 착수하는 데 관심이있는 초보자 및 전문가를위한 자료 및 가이드 역할을하는 것을 목표로합니다. 새로운 기술과 방법론이 개발되면서 진행중인 작업으로 기대됩니다. 방법론과 기술에 대한 설명(phosphoramidite) 화학을 사용하는 DNA / RNA 신디사이저 (2013 년에 리퍼브되고 구매 됨)에 해당합니다.

C2&#39;- O- 위치에서 0, 1 또는 2 개의 2- 티오 페닐 메틸 변형을 함유하는 RNA 도데 카머의 합성은 상응하는 정제 및 특성화와 함께 기술된다. 또한 CD를 통해 수행 된 구조 분석에 대한 자세한 설명이 포함되어 있습니다. RNA의 4 가닥 (상보적인 서열을 갖는 가닥 포함)은 고상 합성을 통해 얻어졌으며,이어서 각 올리고 뉴클레오타이드의 정제율이 300 - 700 nmol이었다. 질량 분광법은 ~ 150 pmol의 각 시료를 탈염시킨 다음 MALDI-TOF 분석을 위해 플레이트에 침착시킴으로써 수행되었다 ( 그림 5 ). CD는 이중 구조의 형성을 확인하고 그에 상응하는 T의 m을 기록하는 동안 정량화 각 용액의 분석을 통해 자외선 photometrica...

이 기사는 C2&#39;- O 위치에서 변형 된 RNA의 dodecamer의 고체상 합성, 정제 및 특성화에 대한 자세한 절차를 제공합니다. UV-vis 및 원 편광 이색 광도 분석을 사용하여 구조적 측면, 즉 단일 가닥 또는 이중 가닥을 정량화하고 특성을 분석합니다.

2&#39;- 포스 핀 올리고 뉴클레오타이드를 함유하는 올리고머의 고상 합성을위한 프로토콜<em&gt; O</em&gt; 원형 이색 성을 통한 - 티오 페닐 메틸 변형 및 특성 분석

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

이 보고서의 전반적인 목표는 고체상 합성을 통해 RNA의 올리고뉴클레오티드를 얻는 절차를 설명하는 것입니다. RNA의 도데카머(Dodecamer)는 모델로 합성되고 이들의 정제 및 특성화도 시연될 것입니다. 이 책은 시각적 요소를 통해 다양한 분야의 연구자들이 사용하는 방법론과 시설의 범위를 넓힐 것입니다.약간의 프로토콜과 함께 시각 자료를 제공하면 연구자들이 이러한 기술을 사용할 수 있습니다. 이 기술의 한 가지 장점은 광범위한 수정에 대한 편의성입니다. 오늘날의 애플리케이션이 점점 더 까다로워짐에 따라 표준 프로토콜을 갖는 것이 중요합니다.포스포라미다이트 화학은 이 방법의 견고성과 치료 응용을 위한 올리고뉴클레오티드를 얻을 수 있는 잠재력으로 인해 부활을 경험하고 있습니다. 올리고뉴클레오티드를 구입하는 것은 매력적이지만, 변형의 가격과 가용성으로 인해 이러한 올리고머를 사내에서 준비하는 것으로 관심이 옮겨가므로 이 절차가 가장 중요합니다. 이 절차를 시작하려면 오븐에서 건조된 10ml 호박색 병에 각 포스포라미다이트의 무게를 측정하고 20게이지 바늘로 미리 구멍이 뚫린 격막으로 각 병을 덮습니다.건조제가 포함된 건조제를 사용하여 병을 즉시 진공 아래에 두십시오. 건조제에 건조 아르곤을 채운 후 각 병을 제거하고 즉시 무수 아세토니트릴을 첨가한 후 고체상 펩타이드 합성기에 고정합니다. 다음으로, 각 병에서 격막을 제거하고 병 교체 기능을 통해 신디사이저에 놓습니다.고체상 합성을 설정하려면 소프트웨어 아이콘을 선택합니다. 신디사이저 이름을 선택하고 확인을 클릭합니다. 그런 다음 File(파일) 및 New Synthesis Order(새 합성 순서)를 선택하여 새 합성을 만듭니다. 그런 다음 프롬프트 창을 사용하여 실행 날짜, 고객 및 실행 ID를 입력합니다.기기, 시퀀스 이름 및 시퀀스를 선택합니다.Cycle 탭에서 이전에 만든 메서드를 할당합니다. 그런 다음 올리고뉴클레오티드가 CPG 수지에 결합된 상태로 두는 End Procedure manual(최종 절차 설명서)을 선택합니다. DMT 끄기를 선택합니다.파일 및 다른 이름으로 저장을 선택하여 파일을 저장한 다음, 실험의 이름을 입력하고 저장을 클릭합니다. 다음으로, Order 및 Send Order to Synthesizer를 선택하여 합성을 시작할 파일을 보냅니다. 프롬프트 창에서 열 위치를 선택하고 OK(확인)를 클릭합니다. Synthesizer 창에서 Trityl Monitor를 선택합니다.Choose Function(기능 선택)을 클릭하고 1을 입력하여 모든 단계를 Trityl Monitor합니다. Synthesizer를 선택하고 Prepare to Start를 선택하여 합성을 시작합니다. 원하는 3 프라임 끝이 있는 열을 기기에 표시된 위치에 놓습니다.그런 다음 기기에서 시작 및 아니오를 클릭합니다. 합성이 완료되면 기기에서 컬럼을 제거하고 바닥이 둥근 플라스크에 넣습니다. 약 0.5시간 동안 감압 하에서 컬럼을 건조시킵니다.컬럼의 백색 수지를 1.6ml 원심분리기 튜브로 옮기고 0.5ml의 메틸아민 및 암모니아 수용액을 추가합니다. 원심분리기 튜브 캡을 파라필름으로 고정하고 내용물을 섭씨 60도까지 1시간 30분 동안 가열합니다. 농도가 일정하게 유지되도록 튜브 위에 무거운 물체를 올려 놓습니다.실온으로 냉각한 후 샘플을 잠시 원심분리하여 내용물을 회전시킵니다. 그런 다음 상층액을 새 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 드라이아이스 에탄올 수조에 5분 동안 넣어 튜브를 섭씨 70도로 냉각한 다음 스피드 진공 농축기를 사용하여 건조될 때까지 농축합니다.이제 0.4 밀리리터의 아민 트리히드라플루오라이드 용액에 고체를 재현탁시킨 다음 실험실 필름으로 캡을 고정합니다. 용액을 섭씨 60도까지 1시간 30분 동안 가열합니다. 일정한 집중을 보장하기 위해 튜브 위에 무거운 물체를 올려 놓습니다.용액을 실온으로 냉각한 후 0.04ml의 아세트산나트륨 용액을 첨가한 다음 피펫 팁으로 부드럽게 혼합합니다. 에탄올 1ml를 넣고 드라이아이스 에탄올 수조로 용액을 약 섭씨 70도까지 15분 동안 냉각합니다. 그 다음, 15, 000 RPM에서 4°C에서 10분 동안 용액을 원심분리하십시오.피펫을 사용하여 상등액을 추출하고 생성된 펠릿을 감소된 압력으로 건조시킵니다. 건조 후, 얻어진 고체 및 로딩 버퍼를 재현탁하고 용액이 균질해질 때까지 혼합합니다. 그런 다음 이전에 준비된 폴리아크릴아미드 겔에 현탁액을 로드합니다.bromethymol 파란 마커가 젤의 1/2에서 2/3 사이 위치에 있을 때까지 젤을 통해서 전류를 적용하십시오. 스탠드에서 젤을 제거한 후 유리의 젤 내용물을 플라스틱 랩으로 옮기고 실리카로 덮인 박층 크로마토그래피 플레이트 위에 올려 UV 램프를 사용하여 밴드를 시각화합니다. 마커를 사용하여 상단 밴드가 있는 위치를 표시하고 면도날을 사용하여 자릅니다.RNA가 들어있는 겔을 50 밀리리터 원뿔형 튜브에 넣고 유리 막대를 사용하여 작은 조각으로 부수십시오. 이제, 겔 잔류 물을 염화나트륨 수용액에 현탁시키고 현탁액을 섭씨 37도에서 12 시간 동안 흔듭니다. 서스펜션을 15mm 튜브로 옮긴 다음 3400RPM에서 10분 동안 원심분리합니다.역상 C18 카트리지를 사용하여 샘플을 탈염하려면 먼저 아세토니트릴, 물, 염화암모늄 수성 및 RNA 용액으로 카트리지를 세척하고 겔 잔류물은 남기십시오. 물로 세척한 후 3밀리리터의 60% 수성 메탄올 용액을 사용하여 컬럼에서 RNA를 3개의 다른 시험관으로 용리합니다. 드라이아이스 수조에서 튜브를 섭씨 70도로 5분 동안 냉각한 다음 스피드 진공 농축기를 사용하여 내용물을 농축하여 건조시킵니다.감소된 압력 하에서 용리액을 농축한 후 잔류물을 0.3ml의 RNase-free 물에 다시 용해시킵니다. 용액을 희석한 후 UV VIS 기기에 1마이크로리터를 증착하여 200 - 450 나노미터 사이의 UV VIS 스펙트럼을 측정합니다. MALDI-TOF 분석을 위해 먼저 C18 피펫 팁을 50% 아세토니트릴로 세척하십시오.피펫 팁을 0.1%트리플루오로아세트산으로 평형을 이룹니다. 그런 다음 피펫 팁에 100-150피코몰의 샘플이 들어 있는 용액을 로드합니다. 피펫 팁을 0.1%TFA와 물로 세척한 후 샘플을 원하는 매트릭스가 포함된 용액으로 용리시킵니다.0.9마이크로리터의 용액을 MALDI 플레이트에 주입하고 샘플을 건조시킵니다. RNA 구조 분석을 위해 RNA가 포함된 샘플을 마이크로큐벳으로 옮기고 원형 이색성 기기의 샘플 교환기에 배치합니다. 질소 탱크를 열어 기기에 있는 공기 부유물을 약 40도로 이동시키는 흐름을 제공합니다.그런 다음 쿨러를 켭니다. 이제 기기를 켭니다. Spectrum Manager(스펙트럼 관리자) 아이콘을 클릭하여 소프트웨어를 연 다음 Spectrum Measurement(스펙트럼 측정)를 클릭하여 Acquisition 창을 엽니다.기기를 질소로 퍼징한 후 Measure and Parameters를 선택하여 원형 이색성 스펙트럼을 획득합니다. 일반 탭에서 스캔으로 200-350나노미터, 채널로 CD 및 HT, 데이터 피치로 0.1나노미터, 스캔 속도로 분당 100나노미터, 대역폭으로 1나노미터, 누적 수로 5를 선택합니다. Cell Unit(셀 단위) 탭에서 20°C(20°C)를 선택합니다.Control 탭에서 Shutter is opened and closed automatically를 선택합니다. Information(정보) 탭에서 시료 이름, 작업자, 농도 및 용매를 입력합니다. 데이터 탭에서 원하는 폴더로 이동하고 확인을 클릭합니다. Measure(측정)와 Sample Measurement(샘플 측정)를 클릭하여 스펙트럼을 획득합니다.마지막으로, 샘플 교환기 1에서 6까지 큐벳의 위치를 식별하고 확인을 클릭합니다. RNA의 4개 가닥은 고체상 합성을 통해 얻어졌으며 정제 후 각 올리고뉴클레오티드가 300 및 700 나노몰 사이였습니다. 올리고뉴클레오티드의 MALDI-TOF 크로마토그램이 여기에 나와 있습니다. 260 나노미터의 대역과 표준 및 변형 올리고뉴클레오티드를 비교하는 경우, 단일 가닥 샘플 또는 이중 구조를 비교하는 경우 정규화된 UV vis 스펙트럼의 큰 차이는 관찰되지 않습니다.그러나 원형 이색성 스펙트럼을 측정할 때 사소한 변화가 관찰됩니다. 또한, 3개의 이중 구조의 Tm 측정은 가닥 중 하나에 2개의 프라임 오티오 페닐메틸 변형의 혼입에 의해 유도된 불안정화를 나타내는 뚜렷한 값을 표시했습니다. 고체상 합성의 수율은 시약 순도에 따라 달라진다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.수분은 각 단계에 부정적인 영향을 미치므로 존재하는 물의 양은 항상 시약이어야 합니다. 보고된 방법론은 과학자들을 위한 일반적인 리소스 역할을 하기 위한 것입니다. 이 기술은 원하는 수정, 사용 가능한 계측 또는 시간 제약 조건에 따라 달라질 수 있습니다.본 명세서에 사용된 화학 유형은 1980년대부터 사용되어 온 매우 강력한 방법론을 나타내며, 여전히 학술 및 산업 환경에서 많이 사용되고 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 RNA 또는 DNA의 변형 또는 표준 올리고뉴클레오티드의 합성, 정제 및 특성화를 수행할 수 있어야 합니다. 필요한 시약으로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 보안경, 장갑, 실험복과 같은 보호 장비를 항상 착용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.모든 시약은 주의해서 다루어야 하며 적절한 경우 흄 후드 내부에 보관해야 합니다.

protocol-for-solid-phase-synthesis-oligomers-rna-containing-2-o

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

이 작품은 염색체 수준에서 RNA / DNA 복합체를 형성하고 효모 세포의 게놈 DNA와 RNA의 유전 정보의 전송을 공개하는 방법을 보여줍니다.

RNA 함유 Oligonucleotides를 사용하여 변환하여 게놈 DNA에서 RNA / DNA 하이브리드의 생성

프라이머 확장 (SHAPE)에 의해 분석 높은 처리량의 선택 2 '수산기 실화는 단일 염기 해상도에서 수천 개의 뉴클레오티드로 수백에서의 RNA 구조를 결정하는 기술을 프로빙 소설 화학, 역전사, 모세관 전기 영동 및 이차 구조 예측 소프트웨어를 사용합니다.

높은 처리량 SHAPE를 사용하여 RNA 이차 구조 예측

여기에 설명 된 프로토콜은 수정 된 뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트로 이어지는 복잡한 경로의 방법으로 다양한 장애물을 설명하고 요약하다하는 것을 목표로하고있다. 따라서,이 프로토콜은 이러한 활성화 된 빌딩 블록의 합성과 실제 응용 프로그램의 가용성 모두를 용이하게합니다.

뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트 - 합성에서 생화학 적 특성에

광안정 시아닌 염료는 올리고뉴클레오티드에 부착되어 에너지 전달에 의한 혼성화를 모니터링합니다.

광 안정성 시아닌 염료를 사용하여 파장 변환 DNA 혼성화 프로브의 합성

우리는 합성에 대 한 프로토콜와 펩 티 드 핵 산 (PNA) 올리고 통합의 정화 수정 잔류물. 수정된 PNAs에 의해 RNA duplexes의 인식 특성에 대 한 생화학 및 생물 방법은 설명 합니다.

시퀀스 및 선택적 인식 하 여 단일 가닥 RNAs에 더블-좌초 RNAs의 화학적 펩 티 드 핵 산 수정

여기 선물이 spirocyclic heterocycles의 합성을 위한 효율적인 방법 설명 하는 프로토콜. 5 단계 프로세스 활용 고체 상 합성 및 마이클 링커 전략을 다시 생성 합니다. 일반적으로 합성 하기 어려운, 우리 다른 현대 접근에 그렇지 않으면 액세스할 수 spirocyclic 분자의 합성에 대 한 사용자 정의 방법 제시.

[4.4] Spirocyclic Oximes의 고체 상 합성

여기서, 우리는 짧은 합성 DNA 및 RNA 올리고뉴클레오티드 및 정제된 Pol II를 필요로 하는 RNA 폴리머라제 II(Pol II) 신장 복합체의 조립을 기술한다. 이들 복합체는 Pol II 신장 복합체와 관련된 전사체의 기본 공동 전사 처리를 연구하는 데 유용하다.

인공 RNA 폴리머라제 II 연신복합체 해부 공동 전사 RNA 처리 이벤트

여기에서 우리는 RNA의 DNAzyme 의존적인 절단을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이를 통해 RNA 2'-O-메틸화의 신속하고 현장 의존적인 분석을 가능하게 합니다. 이러한 접근법은 스노RNA 활성의 예비 또는 주요 평가를 위해 사용될 수 있다.

RRNA 2'-O-메틸화의 DNAzyme 의존분석

여기에서는 cDNA 중간체 없이 짧은 RNA(실행당 &lt;35nt)를 염기서열분석하는 직접 방법과 단일 염기 정밀도에서 단일 연구에서 다른 뉴클레오티드 변형을 염기서열분석하는 일반적인 방법으로 사용할 수 있는 LC-MS 기반 염기서열분석 방법에 대한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다.

2D-HELS MS 염기서열분석(2D-HELS MS SEQ): 뉴클레오티드 변형이 다른 RNA 혼합물의 직접 및 새로운 염기서열분석을 위한 일반적인 LC-MS 기반 방법

우리는 13C/ 15N 라벨 및 1 H R1θ  이완 분산 핵 자기 공명 (NMR) 분광기로 표시되지 않은 RNA에 마이크로 밀리초 역학을 측정하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜의 초점은 NMR 실험의 고순도 샘플 준비 및 설정에 있습니다.

RNA의 1 H R 1θ 이완 분산 실험의 샘플 준비 및 설치의 실제적인 양상

올리고뉴클레오티드 5'-트리포스페이트는 필수 생물학적 경로에서 유비쿼터스 성분이며 생명 공학 응용에 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 여기에서, 우리는 표준 자동화 합성 기술에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드로부터 출발하여 올리고뉴클레오티드 5'-트리포스페이트의 일상적인 합성 및 정제를 위한 기술을 기술한다.

올리고뉴클레오티드의 화학적 트리포스포릴화

배우세요 고상 합성을 통한 RNA 올리고뉴클레오타이드 합성 및 정제 방법을. 원형 이색성 분석으로 구조적 특성을 확인하고, 다양한 수정에 적용 가능한 표준 프로토콜을 연구에 활용하세요.

2'- 포스 핀 올리고 뉴클레오타이드를 함유하는 올리고머의 고상 합성을위한 프로토콜

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