2'- 포스 핀 올리고 뉴클레오타이드를 함유하는 올리고머의 고상 합성을위한 프로토콜 O 원형 이색 성을 통한 - 티오 페닐 메틸 변형 및 특성 분석

이 보고서의 전반적인 목표는 고체상 합성을 통해 RNA의 올리고뉴클레오티드를 얻는 절차를 설명하는 것입니다. RNA의 도데카머(Dodecamer)는 모델로 합성되고 이들의 정제 및 특성화도 시연될 것입니다. 이 책은 시각적 요소를 통해 다양한 분야의 연구자들이 사용하는 방법론과 시설의 범위를 넓힐 것입니다.

약간의 프로토콜과 함께 시각 자료를 제공하면 연구자들이 이러한 기술을 사용할 수 있습니다. 이 기술의 한 가지 장점은 광범위한 수정에 대한 편의성입니다. 오늘날의 애플리케이션이 점점 더 까다로워짐에 따라 표준 프로토콜을 갖는 것이 중요합니다.

포스포라미다이트 화학은 이 방법의 견고성과 치료 응용을 위한 올리고뉴클레오티드를 얻을 수 있는 잠재력으로 인해 부활을 경험하고 있습니다. 올리고뉴클레오티드를 구입하는 것은 매력적이지만, 변형의 가격과 가용성으로 인해 이러한 올리고머를 사내에서 준비하는 것으로 관심이 옮겨가므로 이 절차가 가장 중요합니다. 이 절차를 시작하려면 오븐에서 건조된 10ml 호박색 병에 각 포스포라미다이트의 무게를 측정하고 20게이지 바늘로 미리 구멍이 뚫린 격막으로 각 병을 덮습니다.

건조제가 포함된 건조제를 사용하여 병을 즉시 진공 아래에 두십시오. 건조제에 건조 아르곤을 채운 후 각 병을 제거하고 즉시 무수 아세토니트릴을 첨가한 후 고체상 펩타이드 합성기에 고정합니다. 다음으로, 각 병에서 격막을 제거하고 병 교체 기능을 통해 신디사이저에 놓습니다.

고체상 합성을 설정하려면 소프트웨어 아이콘을 선택합니다. 신디사이저 이름을 선택하고 확인을 클릭합니다. 그런 다음 File(파일) 및 New Synthesis Order(새 합성 순서)를 선택하여 새 합성을 만듭니다. 그런 다음 프롬프트 창을 사용하여 실행 날짜, 고객 및 실행 ID를 입력합니다.기기, 시퀀스 이름 및 시퀀스를 선택합니다.

Cycle 탭에서 이전에 만든 메서드를 할당합니다. 그런 다음 올리고뉴클레오티드가 CPG 수지에 결합된 상태로 두는 End Procedure manual(최종 절차 설명서)을 선택합니다. DMT 끄기를 선택합니다.

파일 및 다른 이름으로 저장을 선택하여 파일을 저장한 다음, 실험의 이름을 입력하고 저장을 클릭합니다. 다음으로, Order 및 Send Order to Synthesizer를 선택하여 합성을 시작할 파일을 보냅니다. 프롬프트 창에서 열 위치를 선택하고 OK(확인)를 클릭합니다. Synthesizer 창에서 Trityl Monitor를 선택합니다.

Choose Function(기능 선택)을 클릭하고 1을 입력하여 모든 단계를 Trityl Monitor합니다. Synthesizer를 선택하고 Prepare to Start를 선택하여 합성을 시작합니다. 원하는 3 프라임 끝이 있는 열을 기기에 표시된 위치에 놓습니다.

그런 다음 기기에서 시작 및 아니오를 클릭합니다. 합성이 완료되면 기기에서 컬럼을 제거하고 바닥이 둥근 플라스크에 넣습니다. 약 0.5시간 동안 감압 하에서 컬럼을 건조시킵니다.

컬럼의 백색 수지를 1.6ml 원심분리기 튜브로 옮기고 0.5ml의 메틸아민 및 암모니아 수용액을 추가합니다. 원심분리기 튜브 캡을 파라필름으로 고정하고 내용물을 섭씨 60도까지 1시간 30분 동안 가열합니다. 농도가 일정하게 유지되도록 튜브 위에 무거운 물체를 올려 놓습니다.

실온으로 냉각한 후 샘플을 잠시 원심분리하여 내용물을 회전시킵니다. 그런 다음 상층액을 새 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 드라이아이스 에탄올 수조에 5분 동안 넣어 튜브를 섭씨 70도로 냉각한 다음 스피드 진공 농축기를 사용하여 건조될 때까지 농축합니다.

이제 0.4 밀리리터의 아민 트리히드라플루오라이드 용액에 고체를 재현탁시킨 다음 실험실 필름으로 캡을 고정합니다. 용액을 섭씨 60도까지 1시간 30분 동안 가열합니다. 일정한 집중을 보장하기 위해 튜브 위에 무거운 물체를 올려 놓습니다.

용액을 실온으로 냉각한 후 0.04ml의 아세트산나트륨 용액을 첨가한 다음 피펫 팁으로 부드럽게 혼합합니다. 에탄올 1ml를 넣고 드라이아이스 에탄올 수조로 용액을 약 섭씨 70도까지 15분 동안 냉각합니다. 그 다음, 15, 000 RPM에서 4°C에서 10분 동안 용액을 원심분리하십시오.

피펫을 사용하여 상등액을 추출하고 생성된 펠릿을 감소된 압력으로 건조시킵니다. 건조 후, 얻어진 고체 및 로딩 버퍼를 재현탁하고 용액이 균질해질 때까지 혼합합니다. 그런 다음 이전에 준비된 폴리아크릴아미드 겔에 현탁액을 로드합니다.

bromethymol 파란 마커가 젤의 1/2에서 2/3 사이 위치에 있을 때까지 젤을 통해서 전류를 적용하십시오. 스탠드에서 젤을 제거한 후 유리의 젤 내용물을 플라스틱 랩으로 옮기고 실리카로 덮인 박층 크로마토그래피 플레이트 위에 올려 UV 램프를 사용하여 밴드를 시각화합니다. 마커를 사용하여 상단 밴드가 있는 위치를 표시하고 면도날을 사용하여 자릅니다.

RNA가 들어있는 겔을 50 밀리리터 원뿔형 튜브에 넣고 유리 막대를 사용하여 작은 조각으로 부수십시오. 이제, 겔 잔류 물을 염화나트륨 수용액에 현탁시키고 현탁액을 섭씨 37도에서 12 시간 동안 흔듭니다. 서스펜션을 15mm 튜브로 옮긴 다음 3400RPM에서 10분 동안 원심분리합니다.

역상 C18 카트리지를 사용하여 샘플을 탈염하려면 먼저 아세토니트릴, 물, 염화암모늄 수성 및 RNA 용액으로 카트리지를 세척하고 겔 잔류물은 남기십시오. 물로 세척한 후 3밀리리터의 60% 수성 메탄올 용액을 사용하여 컬럼에서 RNA를 3개의 다른 시험관으로 용리합니다. 드라이아이스 수조에서 튜브를 섭씨 70도로 5분 동안 냉각한 다음 스피드 진공 농축기를 사용하여 내용물을 농축하여 건조시킵니다.

감소된 압력 하에서 용리액을 농축한 후 잔류물을 0.3ml의 RNase-free 물에 다시 용해시킵니다. 용액을 희석한 후 UV VIS 기기에 1마이크로리터를 증착하여 200 - 450 나노미터 사이의 UV VIS 스펙트럼을 측정합니다. MALDI-TOF 분석을 위해 먼저 C18 피펫 팁을 50% 아세토니트릴로 세척하십시오.

피펫 팁을 0.1%트리플루오로아세트산으로 평형을 이룹니다. 그런 다음 피펫 팁에 100-150피코몰의 샘플이 들어 있는 용액을 로드합니다. 피펫 팁을 0.1%TFA와 물로 세척한 후 샘플을 원하는 매트릭스가 포함된 용액으로 용리시킵니다.

0.9마이크로리터의 용액을 MALDI 플레이트에 주입하고 샘플을 건조시킵니다. RNA 구조 분석을 위해 RNA가 포함된 샘플을 마이크로큐벳으로 옮기고 원형 이색성 기기의 샘플 교환기에 배치합니다. 질소 탱크를 열어 기기에 있는 공기 부유물을 약 40도로 이동시키는 흐름을 제공합니다.

그런 다음 쿨러를 켭니다. 이제 기기를 켭니다. Spectrum Manager(스펙트럼 관리자) 아이콘을 클릭하여 소프트웨어를 연 다음 Spectrum Measurement(스펙트럼 측정)를 클릭하여 Acquisition 창을 엽니다.

기기를 질소로 퍼징한 후 Measure and Parameters를 선택하여 원형 이색성 스펙트럼을 획득합니다. 일반 탭에서 스캔으로 200-350나노미터, 채널로 CD 및 HT, 데이터 피치로 0.1나노미터, 스캔 속도로 분당 100나노미터, 대역폭으로 1나노미터, 누적 수로 5를 선택합니다. Cell Unit(셀 단위) 탭에서 20°C(20°C)를 선택합니다.

Control 탭에서 Shutter is opened and closed automatically를 선택합니다. Information(정보) 탭에서 시료 이름, 작업자, 농도 및 용매를 입력합니다. 데이터 탭에서 원하는 폴더로 이동하고 확인을 클릭합니다. Measure(측정)와 Sample Measurement(샘플 측정)를 클릭하여 스펙트럼을 획득합니다.

마지막으로, 샘플 교환기 1에서 6까지 큐벳의 위치를 식별하고 확인을 클릭합니다. RNA의 4개 가닥은 고체상 합성을 통해 얻어졌으며 정제 후 각 올리고뉴클레오티드가 300 및 700 나노몰 사이였습니다. 올리고뉴클레오티드의 MALDI-TOF 크로마토그램이 여기에 나와 있습니다. 260 나노미터의 대역과 표준 및 변형 올리고뉴클레오티드를 비교하는 경우, 단일 가닥 샘플 또는 이중 구조를 비교하는 경우 정규화된 UV vis 스펙트럼의 큰 차이는 관찰되지 않습니다.

그러나 원형 이색성 스펙트럼을 측정할 때 사소한 변화가 관찰됩니다. 또한, 3개의 이중 구조의 Tm 측정은 가닥 중 하나에 2개의 프라임 오티오 페닐메틸 변형의 혼입에 의해 유도된 불안정화를 나타내는 뚜렷한 값을 표시했습니다. 고체상 합성의 수율은 시약 순도에 따라 달라진다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

수분은 각 단계에 부정적인 영향을 미치므로 존재하는 물의 양은 항상 시약이어야 합니다. 보고된 방법론은 과학자들을 위한 일반적인 리소스 역할을 하기 위한 것입니다. 이 기술은 원하는 수정, 사용 가능한 계측 또는 시간 제약 조건에 따라 달라질 수 있습니다.

본 명세서에 사용된 화학 유형은 1980년대부터 사용되어 온 매우 강력한 방법론을 나타내며, 여전히 학술 및 산업 환경에서 많이 사용되고 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 RNA 또는 DNA의 변형 또는 표준 올리고뉴클레오티드의 합성, 정제 및 특성화를 수행할 수 있어야 합니다. 필요한 시약으로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 보안경, 장갑, 실험복과 같은 보호 장비를 항상 착용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

모든 시약은 주의해서 다루어야 하며 적절한 경우 흄 후드 내부에 보관해야 합니다.