Name: 인간 NK 세포 활동의 평가 대 한 흐름 Cytometry 기반 세포 독성 분석 실험 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: 학습하세요 인간 NK 세포 세포독성 활동을 평가하는 흐름 세포측정법 기반 분석법을 사용하는 방법을. 이 기법은 방사성 없이 민감하고 재현성 있게 NK 세포 기능을 진단하고 연구할 수 있습니다.

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우리는 나 르 시 소 질, ucla의 Immunogenetics 센터, 원고 준비와 그녀의 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다.

샘플은 UCLA 인간 연구 보호 프로그램(Human Research Protection Program)에서 수립한 윤리 지침에 따라 수집되었으며 IRB의 승인을 받았습니다.
1. 시약의 준비
참고: 달리 명시되지 않는 한 모든 시약은 사용하기 전에 실온에서 평형을 이루도록 해야 합니다. 모든 시약은 멸균 상태를 유지해야 합니다.
<ol>
	<li>p20 피펫으로 칼슘과 마그네슘이 없는 5mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 10μL의 Tween-20 용액을 첨가하여 Tween-20의 2x 작업 용액(즉, 0.2%)을 준비합니다.
	<ol>
		<li>Tween-20의 점도가 높기 때문에 정확성을 보장하기 위해 다음 단계를 따르십시오. 기포 형성을 방지하기 위해 천천히 수집하고, 캐리오버를 방지하기 위해 전체 팁을 물에 담그지 않으며, PBS에서 여러 번 위아래로 피펫팅하여 팁에서 Tween-20을 모두 씻어냅니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2μL의 IL-2 원액(2.1E6 IU/mL)을 198μL의 완전 배지(즉, 1:100 희석)에 첨가하고, 198μL의 완전 배지(10% 페니실린-스트렙토마이신과 10% 소 태아 혈청(FBS)가 포함된 RPMI인 경우, 198μL의 완전 배지에 2μL의 IL-2 중간 용액을 추가하여 추가 1:100 희석을 진행하여 7x 작업 용액(210 IU/mL)을 준비합니다.</li>
	<li>2μL의 CFSE 원액(5mM)을 500μL의 일반 매체(RPMI)에 추가합니다. Vortex, 스핀 다운하여 캡에서 방울을 제거한 다음 50μL의 CFSE 중간 용액을 950μL의 일반 RPMI에 추가하여 추가로 1:20 희석을 진행하여 1μM의 2x 작업 용액을 얻습니다. 와류를 잘 만들고 빛으로부터 보호합니다.</li>
</ol>
2. PBMC를 effector cell로 분리
참고: 이 분석은 건강한 대조군의 총 PBMC에 효과적인 사용이 검증되었습니다. 그러나 각 PBMC 제제(그림 1)로 NK 세포 함량을 검증하는 것이 좋습니다. 또한, 채혈을 위한 전혈량은 말초 전혈 내 NK 세포의 빈도에 따라 결정되며, 이는 사람마다, 특히 건강한 기증자와 환자 간에 다를 수 있습니다.
<ol>
	<li>나트륨 또는 리튬 헤파린 혈액 채취 튜브에 최소 4mL의 인간 전혈을 수집합니다. 혈액 샘플은 채취 시 실온에서 보관하고 채취 후 30시간 이내에 사용하십시오.</li>
	<li>전혈을 PBS 4mL로 희석합니다(즉, PBS와 전혈과 동일한 부피).</li>
	<li>4mL의 밀도 구배 용액(재료 표 참조)을 15mL 원뿔형 튜브에 추가합니다. 튜브를 기울여 밀도 구배 용액 위에 희석된 전혈을 조심스럽게 오버레이합니다.</li>
	<li>브레이크를 끈 상태에서 650 x g에서 24분 동안 원심분리기.</li>
	<li>혈장과 혈소판의 최상층 아래에 있는 얇은 흰색 층인 단핵 세포층을 새로운 15mL 원뿔형 튜브에 조심스럽게 모읍니다. PBS를 사용하여 부피를 15mL로 가져옵니다.</li>
	<li>브레이크를 켠 상태에서 450 x g에서 10분 동안 원심분리기. 상층액을 흡인하고 0.5mL의 완전한 배지에서 세포를 재현탁합니다.</li>
	<li>자동 세포 계수기 또는 혈구계를 사용하여 세포를 계수하고 완전한 배지를 사용하여 PBMC 농도를 5x106 cells/mL로 조정합니다.</li>
	<li>유세포분석법으로 NK 세포 함량을 확인합니다(4단계 참조).</li>
	<li>30분 이내에 분석을 시작합니다. 세포를 최대 10분 동안 실온에 보관하거나 사용할 준비가 될 때까지 37°C의 가습된 5% CO2 인큐베이터에 넣습니다.</li>
</ol>
3. NK 세포를 effector cell로 분리
참고: 프로토콜의 이 부분은 총 PBMC를 이펙터 셀로 사용하는 대신 사용할 수 있습니다. 건강한 개인의 전혈 4mL에서 얻을 수 있는 일반적인 수율은 약 4x105 NK 세포 또는 PBMC의 약 5-15%이지만, 이 빈도는 공여자마다 다릅니다21. 분리 후 순도 검사를 수행하는 것이 좋습니다.
<ol>
	<li>나트륨 또는 리튬 헤파린 혈액 채취 튜브에 최소 4mL의 인간 전혈을 수집합니다. 전혈 50μL를 채취하여 농축 전 검체로 염색합니다.</li>
	<li>농축 칵테일을 50μL/mL의 혈액 샘플에 추가합니다(재료 표 참조). 잘 섞어 실온에서 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>PBS + 2% FBS를 동일한 부피로 첨가하여 샘플을 희석하고 부드럽게 잘 섞습니다.</li>
	<li>15mL 코니컬 튜브에 4mL의 밀도 구배 용액을 추가합니다. 밀도 구배 매체 위에 희석된 샘플을 조심스럽게 오버레이합니다.</li>
	<li>브레이크를 끈 상태에서 1,200 x g에서 10분 동안 원심분리기.</li>
	<li>농축된 세포층을 새로운 15mL 원뿔형 튜브에 조심스럽게 모읍니다. PBS + 2% FBS로 부피를 최대 50mL까지 가져와 세포를 세척합니다.</li>
	<li>300 x g에서 10분 동안 원심분리기 상층액을 버리고 세척을 반복합니다.</li>
	<li>상층액을 흡인하고 0.5mL의 완전한 배지에서 세포를 재현탁합니다.</li>
	<li>자동 세포 계수기 또는 혈구계를 사용하여 세포 계수를 수행하고 농도를 5x105 cells/mL로 조정합니다. 정제된 세포 현탁액 50μL를 취하여 농축 후 샘플로 염색합니다.</li>
	<li>세포를 최대 10분 동안 실온에 보관하거나 사용할 준비가 될 때까지 37°C의 가습된 5% CO2 인큐베이터에 두십시오.</li>
</ol>
4. NK 세포 함량 평가를 위한 면역표현형 분석
<ol>
	<li>총 50μL의 분리된 PBMC를 사용하여 사전 농축 전혈 또는 정제된 NK 세포를 NK 세포 마커로 anti-CD56 형광 접합 항체로 염색합니다. 다른 세포 유형 및 계통(즉, CD3+ T 세포, CD19+ B 세포)에 대한 마커도 오염의 원인을 평가하기 위해 포함될 수 있습니다.</li>
	<li>4 °C에서 20분 동안 배양하고 PBS 2mL + FBS 2%를 추가하여 세척합니다.</li>
	<li>450 x g에서 5분 동안 원심분리기</li>
	<li>PBMC 또는 NK 세포의 경우, 100μL PBS + 2% FBS에서 상층액을 흡인하고 세포를 재현탁합니다.</li>
	<li>전혈 샘플의 경우 적혈구(RBC) 용해를 수행합니다.
	<ol>
		<li>원심분리 후 상등액을 흡인하고 2mL 적혈구 용해 완충액(염화암모늄 31.75g + 트리스 염기 4.16g + EDTA 6.65g, 탈이온수 5000mL에 용해)에 재현탁합니다.</li>
		<li>실온에서 10분 동안 배양합니다.</li>
		<li>세척을 두 번 반복하고, 상층액을 흡인하고, 100μL의 PBS + 2% FBS. 에 용해된 샘플을 재현탁합니다.
		참고: 염색 전에 RBC 용해를 수행할 수도 있습니다.</li>
		<li>유세포 분석을 진행합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. K562 표적 세포의 해동, 배양 및 수확
<ol>
	<li>10mL의 완전한 배지를 15mL 원뿔형 튜브에 부분 표본으로 추출하고 37°C 수조에서 데웁니다. K562 세포의 해동 및 배양을 위해 모든 단계에서 37°C로 예열된 배지만 사용하십시오.</li>
	<li>대부분의 세포가 해동될 때까지 37°C 수조에 냉동 K562 세포 한 바이알을 놓습니다.</li>
	<li>반해동된 K562 세포를 15mL 코니컬 튜브에서 37°C로 예열된 완전한 배지로 옮깁니다. 예열된 매체로 극저온 바이알 내부를 세척하고 15mL 튜브에 세척액을 추가합니다.</li>
	<li>브레이크를 켠 상태에서 140 x g에서 7분 동안 원심분리기. 상등액을 제거하고 펠릿을 1mL의 완전한 배지에 재현탁합니다.</li>
	<li>자동화된 세포 계수기 또는 혈구계를 사용하여 세포를 계수하기 위해 적절한 양의 세포 현탁액을 분취합니다.</li>
	<li>농도를 1x10 5-2x105 cells/mL로 조정하고 사용하기 전에 최소 2일 동안 37°C의 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 배양합니다. 이 밀도 범위에서 배양액을 3개월 이상 유지하지 않고 유지한 다음 새로운 부분 표본을 해동합니다. 배양액에서 1x106 cells/mL의 세포 농도를 초과하지 마십시오.</li>
	<li>분석에 사용하려면 K562 세포 배양액을 10mL 혈청학 피펫과 잘 혼합하고 부분 표본을 제거하여 자동 세포 계수기 또는 혈구계 및 Trypan Blue 염색을 사용하여 세포 생존율을 계수하고 평가합니다.
	<ol>
		<li>생존율이 85% 미만인 경우 다음 dead cell 제거 단계를 진행합니다.
		<ol>
			<li>필요에 따라 15mL의 밀도 구배 용액을 50mL 코니컬 튜브에 추가합니다. 배양에서 모든 세포를 수집하고 튜브를 기울여 밀도 구배 용액 위에 세포 현탁액을 천천히 오버레이합니다.</li>
			<li>브레이크를 끈 상태에서 650 x g에서 24분 동안 원심분리기를 사용합니다.살아있는 세포층을 새로운 15mL 원뿔형 튜브에 조심스럽게 수집합니다. PBS를 사용하여 용량을 50mL로 가져옵니다.</li>
			<li>브레이크를 켠 상태에서 450 x g에서 10분 동안 원심분리기. 상등액을 제거하고 펠릿을 1mL의 완전한 배지에 재현탁합니다. 세포를 세고 세포 생존력을 확인합니다(5.7과 같이).</li>
			<li>사용하기 전에 37°C의 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 최소 2일 동안 배양합니다.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>5x105 K562 표적 세포를 수집하고 140 x g에서 7분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡입하고 1% FBS가 있는 배지에서 500μL의 세포 펠릿을 재현탁합니다.</li>
</ol>
6. K562 대상 셀의 라벨링
참고: CFSE 작업 솔루션을 추가하기 전에 K562 셀이 잘 재현탁되었는지 확인하십시오.
<ol>
	<li>CFSE 작업 용액 500 μL를 K562 세포 500 μL에 피펫팅하여 최종 농도 0.5 μM를 만듭니다. 동일한 1000-1250 μL 팁을 사용하여 위아래로 3-5회 부드럽게 피펫팅하여 즉시 혼합합니다.</li>
	<li>37 ° C 수조 또는 37 ° C의 가습 된 5 % CO2 인큐베이터에서 어둠 속에서 10 분 동안 배양하십시오 . 
	참고: 수조에 비해 인큐베이터의 온도 평형 지연 시간이 더 길기 때문에 특히 1mL> 용량의 경우 배양 시간을 조정해야 할 수 있습니다.</li>
	<li>실온에서 암흑 상태에서 10분 동안 10mL의 완전한 배지로 라벨링 반응을 담금질합니다.</li>
	<li>라벨링된 K562 세포를 140 x g에서 7분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하고 1mL의 완전한 배지에 재현탁합니다.</li>
	<li>자동 세포 계수기 또는 혈구계를 사용하여 세포를 계수하고 완전한 배지에서 농도를 1x105 cells/mL로 가져옵니다.</li>
	<li>사용할 준비가 될 때까지 37°C의 가습된 5% CO2 인큐베이터에 세포를 놓습니다. 셀은 최대 10분 동안 실온에서 보관하거나 사용할 준비가 될 때까지 37°C의 가습된 CO2 인큐베이터에서 보관할 수 있습니다. 냉장 보관하지 마십시오.</li>
</ol>
7. 도금
참고: NK 세포가 제한되는 경우 K562 및 NK 세포의 농도를 모두 절반으로 줄여 세포의 절반이 분석에서 도말되도록 할 수 있습니다. 이 분석은 세포 수의 절반으로 비슷한 결과를 산출합니다(비율이 일정하게 유지되는 한).
<ol>
	<li>총 PBMC를 사용하는 경우, 웰당 다음 조건에 대해 96웰, U-바닥, 조직 배양 처리된 플레이트에 라벨을 부착합니다: (1) 효과기 (E) : 타겟 (T) = 50 : 1 + IL-2 - NK 세포 독성에 대한 양성 대조군; (2) E : T = 50 : 1; (3) E : T = 25 : 1; (4) E : T = 12.5 : 1; (5) E : T = 6.25 : 1; (6) T - 표적 세포만 - K562 사멸에 대한 음성 대조군; (7) E-효과기 셀만 해당; (8) T + Tween - K562 사멸에 대한 양성 대조군</li>
	<li>정제된 NK 세포를 사용하는 경우, 웰당 다음 조건에 대해 96-well, U-bottom, 조직 배양 처리된 플레이트를 라벨링합니다: (1) 효과기 (E) : 타겟 (T) = 5: 1 + IL-2 - NK 세포 독성에 대한 양성 대조군; (2) E : T = 5 : 1; (3) E : T = 2.5 : 1; (4) E : T = 1.25 : 1; (5) E : T = 0.625 : 1; (6) T - 표적 세포만 - K562 사멸에 대한 음성 대조군; (7) E-효과기 셀만 해당; (8) T + Tween - K562 사멸에 대한 양성 대조군</li>
	<li>100μL의 완전한 배지를 조건 3, 4, 5, 6, 7에 추가합니다. 이 단계와 모든 후속 단계에는 (권장) 멀티채널 파이펫을 사용하십시오.</li>
	<li>100μL의 effector cell(5x106 cells/mL의 PBMC 또는 5x105 cells/mL의 정제된 NK cell)을 조건 1, 2, 3에 추가합니다. 조건 4-7에 대한 effector cell을 연속 희석으로 추가합니다. 조건에 따라 팁을 변경하지 마십시오.
	<ol>
		<li>조건 3을 혼합하고 100μL를 취한 다음 조건 4로 전환합니다.</li>
		<li>조건 4를 혼합하고 100μL를 취한 다음 조건 5로 전환합니다.</li>
		<li>조건 5를 혼합하고 100μL를 취한 다음 조건 7로 전환합니다. 조건 6에는 효과기 세포가 없습니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>준비된 2x 0.2% Tween 작업 용액 100μL를 조건 8(최종 농도: 0.1% Tween-20)에 추가합니다. 조건 8에는 effector cell이 없습니다.</li>
	<li>30μL의 IL-2 작업 용액을 조건 1에 추가합니다. 표적 세포 현탁액을 추가하기 전에 효과기 세포 현탁액에 IL-2를 첨가해야 합니다(최종 농도: 27 IU/mL).</li>
	<li>100μL의 타겟 세포(1x105 cells/mL에서 K562 세포로 라벨링됨)를 조건 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8에 추가합니다. 조건 7에는 타겟 셀이 없습니다.</li>
	<li>모든 웰을 멀티채널 피펫과 혼합하고 120 x g에서 플레이트를 2분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>가습 된 CO2 인큐베이터에서 37 ° C에서 4 시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 플레이트를 얼음 위에 놓고 30분 이내에 생존력 염색을 진행합니다.</li>
</ol>
8. 생존 및 획득을 위한 염색
<ol>
	<li>600μL의 PBS에 3μL의 5μM 원액을 첨가하여 사체 염색을 준비합니다(재료 표 참조).</li>
	<li>250 μL의 최종 부피와 0.005 μM의 최종 농도를 위해 각 웰에 50 μL의 희석된 사체 염색을 추가합니다.멀티채널 피펫과 잘 혼합합니다.</li>
	<li>유세포 분석을 진행합니다. 유세포분석기를 사용하여 통계적으로 유의미한 결과를 얻기 위해 타겟 세포 게이트(그림 2)에서 최소 1,000개의 이벤트를 수집합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 금융 관심의 없습니다 충돌을 선언합니다.

여기 설명 하는 방법을 NK 세포의 세포 독성 활동을 평가 하기 위해 전통적인 51Cr 자료 분석 결과에 대 한 간단 하 고 비용 효율적인 대안을 제공 합니다. 이 방법은, 재현성, 민감하고 CRA, 같은 이전 표준 방법 보다 적게 시간이 걸리는 임상 모두에 사용할 수 있습니다 이며 응용 연구.
동안 분석 결과 총 PBMCs와 풍부한 NK 세포, 세포 인구를 정화 필요 없이 PBMCs을 사용 하 여 환자의 샘플에서 수집 된 혈액 또는 몇 또는 가난한 품질 셀의 작은 볼륨을 다룰 때 큰 혜택입니다. 이 분석 결과 CFSE와 죽은 셀 제외 생존 얼룩만 활용합니다. 혼자 이러한 두 개의 매개 변수를 보고 진단 목적, 흐름 cytometric 분석에서 보상을 더 요구 하지 않기의 추가 혜택에 대 한 간결 하 고 충분 한 정보를 제공 합니다.
이 방법은 또한 기본 NK 세포 생물학을 연구 하 고 소설 NK 세포 타겟 치...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56191/a-flow-cytometry-based-cytotoxicity-assay-for-assessment-human-nk">A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity</a>. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.
Figure 4 was updated from:
<img alt="Target cell death vs effector ratio graph; healthy donor vs patient comparison, percent cell death." src="/files/ftp_upload/56191/56191fig4v1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4">
to:
<img alt="Effector:Target cell death comparison graph, healthy donor vs patient, cytotoxicity analysis." src="/files/ftp_upload/56191/56191fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4">

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56191/a-flow-cytometry-based-cytotoxicity-assay-for-assessment-human-nk">A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity</a>. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.

Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

자연적인 살인자 (NK) 세포는 virally 감염 된 세포, 변형 된 세포, 그리고 다른 병원 성 위협 1,2의 제거에서 비판적으로 관련 된 인간의 타고 난 세포의 정교한 부분 집합. NK 세포 용균성 립 집 perforin 등 granzymes 세포 독성 단백질. 활성화, NK 세포는 직접 대상 세포 세포의 용 해 및 apoptosis, cytokine 및 chemokine 릴리스 함께 결과로 이러한 cytolytic 분자 로컬로 출시 되 면 면역 시 냅 스로 알려진 그들의 목표와 복잡 한 상호 작용을 형성 하 고 궁극적으로 염증의 유도에서 상태 1,,34.
NK 세포 활성화 활성화의 복잡 한 문자열을 포함 하 고 억제 상호작용 NK 세포 수용 체와 ligands 단단히 규제 시스템을 형성 하는 대상 셀의 표면에 표현. NK 세포 활성화의 가장 공부 메커니즘 중 하나는 "누락 자가"입니다. 사실, 내가 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC), 또는 인간 백혈구 항 원 (HLA) 분자에 클래스의 탐지의 부족 감염 또는 변형 세포 트리거 NK 세포 세포 독성. 종양과 바이러스 감염 세포 일반적으로 downregulate T 세포 중재 면역, 따라서 기본 NK 지 고 탈출이 항 원 셀 대상 1,,34.
NK 세포의 기능에 대 한 평가 주로 degranulation 또는 세포 독성으로 분류 분석 실험. 그러나, degranulation 관련 마커 CD107a의 흐름 cytometric 감지와 같은 degranulation 분석 실험, NK 세포 활성화 그리고 그들의 궁극적인 기능, 대상 셀 5,6,,78의 직접적인 살인의 아닙니다 나타내는 있습니다. 따라서,이 제한 더 이야기 하 고 더 직접적인 대안으로 세포 독성 분석 실험에 조사를 받고 있다.
T와 NK 세포의 세포 독성 활동 셀 중재를 평가 하기 위한 오랜 "금 표준" 크롬 방출 분석 결과 (CRA) 이다. CRA 포함 방사성 51Cr 대상 셀의 라벨 공동 effector 세포 배양. 이 분석 결과 세포 세포의 용 해 단백질 바인딩 51Cr 감마 계산에 의해 측정 될 수 있는 상쾌한에의 릴리스 결과 원리에 가득한은. 효과적인, 반면이 분석 결과 여러 가지 이유로 문제가: 높은 물자 비용, 처리 및 방사성 51Cr의 처리, 51Cr의 자발적인 릴리스 및 어려운 표준화-그건 전부 허무 9,10.
다양 한 형광 라벨, 효소 릴리스, 그리고 심지어 생물 발광, 관련 된 비 방사능 분석 실험 이후 CRA 11,12,,1314대 안으로 개발 되었다. 여기의 NK 세포 세포 독성 활동 K562 대상 셀에, 민감한, 간단 하 고 재현성 있는 측정 흐름 cytometry 기반 방법을 설명 합니다. K562 세포는 인간의 erythroleukemic 셀 라인 감소 표현의 HLA 클래스와 내가 그들을 특히 NK 세포 독성 세포 중재 15에 취약 하 게 activatory NK 수용 체에 ligands의 과장 된 표현. 이 분석 결과에서 K562 셀 carboxyfluorescein diacetate succinimidyl 에스테 르 (CFSE) 표시 미리 어느 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)와 함께 다양 한 비율에서 공동 경작 또는 NK 세포 1정화. CFSE는 안정, 단백질 바인딩 형광 염료 이펙터 NK 세포 16,17에서 대상 셀의 차별 수 있습니다. 공동 부 화 후 특히 permeating 죽은 세포의 막, 핵 산 얼룩 살해 대상 세포 (재료의 표 참조)를 식별 하는 데 사용 됩니다. 샘플은 죽은 (즉, 얼룩 +)의 비율을 결정 하는 흐름 cytometer에 취득 CFSE + 대상 셀.
이 분석 결과는 약 30 알려진된 결함 기능 또는 고전적인 NK 세포 결핍을 일으키는 원인이 되는 NK 세포 구획에 영향을 미치는 monogenic 결함에 대 한 및 기본 또는 보조 hemophagocytic lymphohistiocytosis에 대 한 일상적인 진단 심사로 사용할 수 있습니다. 그것은 또한 기초 연구 응용 프로그램의 호스트에 대 한 조 혈 모 세포 이식 또는 게시물 immunomodulatory 치료 18,,1920다음 면역 재구성을 평가 하기 위해 재발, 심한 헤 르 페 스 바이러스 감염 환자에서 NK 세포 활동을 조사 하는 데 유용.

<table><tbody><tr><td>인산염 완충 식염수(1x, Ca2+ 및 Mg2+ 제외)</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>열 비활성화 소 태아 혈청</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-02</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>생명 기술</td><td>15140-163</td><td>10,000 U/mL</td></tr><tr><td>IL-2</td><td>R&의 원액 D Systems</td><td>202-IL-050</td><td>0.2 &mu에서 동결 건조; BSA를 운반체 단백질로 사용하는 Acetonitrile 및 TFA의 m 여과 용액. 100 &mu에서 500 ul로 재구성하십시오. 최소 0.1%의 소 혈청 알부민 (2.1x10E6 IU/ml)K562 세포를 포함하는 멸균 100 mM 아세트산의 g/mL</td></tr> <tr><td></td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td>암 세포주&nbsp;</td></tr><tr><td>T-75 세포 배양 플라스크</td><td>Corning</td><td>431464</td><td></td></tr><tr><td>CFSE 세포 증식 키트</td><td>Life Technologies (CellTrace)</td><td>C34554</td><td>I 바이알을 18ul DMSO로 재구성하여 5mM 스톡 용액을 준비합니다. 동결/해동하지 마십시오.</td></tr><tr><td>Sytox Red</td><td>Life Technologies</td><td>S34859</td><td>재고 솔루션은 5 &mu에서 제공됩니다. 1mL DMSO의 M. DMSO 용액은 시약 분해 없이 여러 번의 동결-해동 주기를 거칠 수 있습니다.</td></tr><tr><td>나트륨/리튬 헤파린 채혈 튜브</td><td>BD</td><td>02-687-95</td><td></td></tr><tr><td>U-bottom 96-well plate</td><td>Corning</td><td>CLS3897</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 둥근 바닥 튜브(5mL)</td><td>BD Falcon</td><td>14959-5</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 폴리프로필렌 원추형 튜브</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 폴리프로필렌 원뿔형 튜브</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>시약 저장소</td><td>USA Scientific</td><td>2321-2230</td><td></td></tr><tr><td>Human NK cell enrichment cocktail</td><td>StemCell Technologies (RosetteSep)</td><td>15065</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 nk 세포 활동의 평가 대 한 흐름 cytometry 기반 세포 독성 분석 실험

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

타고 난 면역 계통 내에서 이펙터 세포 자연 킬러 (NK) 세포로 알려진 탈 선 셀, 구체적으로 종양을 제거 하 고 virally 감염 된 세포에 대 한 호스트 방어에 필수적인 역할을 재생할. 다른 병 적인 상태의 호스트 함께 약 30 알려진된 monogenic 결함 발생 기능 또는 고전적인 NK 세포 결핍에서 만들어 낸 감소 또는 세포 독성 활동을 결 석. 역사적으로, 세포 독성은, 비싼 복잡 하 고 잠재적으로 위험한 방사성 방법 조사 하고있다. 이 문서는 NK 세포의 세포 독성 활동을 계량 유선형, 임상 적용 흐름 cytometry 기반 메서드를 설명 합니다. 이 분석 결과에 주변 혈액 단 세포 (PBMCs) 또는 순화 된 NK 세포 준비는 다른 비율에서 공동 incubated NK 세포 중재 된 세포 독성 (NKCC)에 민감한 것으로 알려져 대상 종양 세포 라인. 대상 세포는 효과 기 세포 (NK 세포)에서 그들의 차별 수 있도록 형광 염료와 사전 분류. 잠복기, 후 살해 대상 세포 특히 죽은 세포를 침투 하는 핵 산 얼룩에 의해 식별 됩니다. 이 방법은 의무가 모두 진단 및 연구 애플리케이션과, cytometry의 다중 매개 변수 기능에 감사 합니다는, 잠재적으로 NK 세포 표현 형 및 기능에 대 한 깊은 분석의 추가한 이점이 있다.

분석 결과 설정 하기 전에 NK 셀 내용 선택의 이펙터 인구에 평가 될 것이 좋습니다. 그림 1 에 일반적인 CD56 얼룩 (밝은 파란색) 전에 나와 (빨간색) NK 세포 농축 후. NK 세포 PBMCs의 최대 15% 고 농축 후 순수 80% 이상 이어야 한다.
흐름 cytometric 분석이 분석이 결과에 두 개의 매개 변수 검색 포함: CFSE, FITC;로 같은 채널에서 감지 그리고 죽은 세포 얼룩, APC (그림 2AB)로 같은 채널에서 감지. 데이터 수집 후 그림 2에서 제어 전략은 데이터를 분석 하는 데 사용 됩니다. CFSE + 인구, 타깃 집단 내의 사망된 세포...

양적 인간의 자연 킬러 세포의 세포 독성 활동을 결정 하는 흐름 cytometry 기반 방법은 여기에 표시 됩니다.

인간 NK 세포 활동의 평가 대 한 흐름 Cytometry 기반 세포 독성 분석 실험

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

이 절차의 전반적인 목표는 인간 NK 세포의 세포독성 활성을 평가하는 것입니다. 이 방법은 기능적 또는 전형적인 NK 세포 결핍 환자를 모니터링하는 데 사용될 수 있습니다. 유세포 분석 기반 기술의 주요 장점은 민감도가 높고 재현성이 뛰어나며, 방사성 크롬 방출 분석과 같은 표준 NK 세포 기능 평가 방법보다 빠르다는 점입니다.이 방법은 새로운 NK 세포 표적 치료제를 테스트하는 것뿐만 아니라, 이전에는 불가능했던 NK 세포 생물학의 심층적인 다중 파라미터 유세포 분석에 활용될 수 있습니다. 먼저 표준 프로토콜에 따라 밀도 구배 분리법을 사용하여 전혈 샘플에서 말초혈액 단핵구(PBMC)를 분리하십시오. 정제된 NK 세포 대신 PBMC를 사용하는 것은 임상 시료를 다룰 때 매우 유용합니다.분리된 세포를 완전 배지에서 5 × 10⁶ cells/mL 농도로 희석하고, 즉시 원심분리를 통해 K562 표적 세포를 수집합니다. 5 × 10⁵개의 562 세포를 1% FBS가 보충된 500 µL의 신선한 배지에 재현탁합니다. 다음으로, 500 µL의 CFSE 작업 용액으로 표적 세포를 라벨링하고, 피펫팅을 3~5회 반복하여 세포 용액을 부드럽게 혼합합니다.빛이 차단된 상태에서 37 °C로 10분간 반응시킨 후, 실온의 암소에서 완전 배지 10 mL를 가하여 10분 동안 표지 반응을 중단시킵니다. 중단 배양 단계가 끝나면 원심분리로 세포를 수집하고, 표지된 표적 세포 펠렛을 1 mL의 완전 배지에 다시 현탁하여 세포 수를 측정합니다. 그런 다음, 신선한 완전 배지를 사용하여 세포 농도를 1 × 10⁵ cells/mL로 희석하고, 표적 세포를 습도가 유지되는 37 °C, 5% CO₂ 배양기에 넣습니다.성공적인 분석을 위해 표적 세포의 스트레스를 최소화하고, 수집 후 가능한 한 빨리 작동 세포를 테스트하십시오. 표적 세포 라벨링 후 30분 이내에 표에 따라 96-웰 U-바닥 조직 배양 처리 플레이트를 라벨링하십시오. 다음으로 25:1, 12.5:1, 6.25:1 작동 세포 대 표적 세포 비율 웰, 표적 세포 전용 웰, 그리고 작동 세포 전용 웰에 완전 배지 100 µL를 추가하십시오.세포독성 대조군 웰과 작동 세포 대 표적 세포 비율이 50:1 및 25:1인 웰에 작동 세포 100 µL를 추가합니다. 그다음, 작동 세포 대 표적 세포 비율이 25:1인 웰부터 시작하여, 표적 세포만 있는 웰은 제외하고 다음으로 낮은 세포 비율 농도의 웰로 100 µL의 세포를 순차적으로 두 개의 웰에 옮깁니다. 이때 각 세포 전송 단계 사이에 충분히 혼합하며, 마지막 100 µL의 세포는 작동 세포만 있는 웰에 추가합니다. Tween 전용 K562 사멸 양성 대조군 웰에는 2X 0.2% Tween 작동 용액 100 µL를 추가합니다.NK 세포 세포독성 양성 대조군 웰에 vial 2 작동 용액 30 µL를 추가합니다. 그런 다음, 작동 세포 전용 웰을 제외한 모든 웰에 완전 배지 100 µL에 희석된 1 × 10⁵ cells/mL 농도의 K562 표적 세포를 추가합니다. 모든 세포의 분주가 완료되면 멀티 채널 피펫을 사용하여 모든 웰을 혼합합니다.짧은 원심분리를 통해 세포를 가라앉힌 후, 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣고 4시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 플레이트를 얼음이나 콜드 플랫폼 위에 올려두고, 각 웰에 갓 준비한 dead cell stain 50 µL를 첨가합니다. 그 다음 모든 웰을 부드럽게 혼합하고 유세포 분석법으로 세포를 분석합니다.방금 시연한 바와 같이 4시간 동안의 저온 배양 후 CFSE 및 사멸 세포 염색에 대해 유세포 분석을 수행하면, 표적 세포만 있는 웰의 세포 사멸률은 15% 이하인 것으로 나타납니다. 작동 세포만 있는 웰에서는 CFSE 신호가 검출되지 않으며, 이들 웰에서 관찰되는 세포 사멸률은 5% 미만입니다. 반면, Tween 매개 표적 세포 살해 웰의 세포 사멸률은 일반적으로 85% 이상입니다. NK 세포 기능에 결함이 있는 환자의 경우, 건강한 대조군과 비교했을 때 테스트한 대부분 또는 모든 비율에서 살해 활성이 감소한 것이 관찰되며, 이는 이러한 환자의 NK 세포가 작동 세포 대 표적 세포 비율의 감소와 상관관계가 있는 차별적인 세포독성 감소를 보인다는 것을 입증합니다.이 기술에 숙련되면 준비 및 플레이팅 2시간, 배양 4시간, 데이터 획득 30분을 포함하여 총 6시간 30분 만에 완료할 수 있습니다. 이 실험 절차를 수행할 때는 세포 준비와 공동 배양 시작 사이의 지연 시간을 최소화하기 위해 표적 세포와 작동 세포를 병렬로 준비하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면 유세포 분석법을 통해 형광 표지된 표적 세포에 대한 인간 NK 세포의 세포 독성 활성을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

a-flow-cytometry-based-cytotoxicity-assay-for-assessment-human-nk

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

여기 우리는 효율적으로 확장하고 정화 인간 NK 세포의 큰 숫자를하고 기능을 평가하는 방법을 설명합니다.

확장, 정화, 그리고 사람 말초혈 NK 세포 기능 평가

이 비디오는 형광으로 염색된 표적 세포에 대한 자연 살해 세포의 용해 활성을 보여줍니다. 이 방법은 죽은 세포를 염색하고 유세포 분석기를 사용하여 살아있는 세포와 죽은 표적 세포를 정량화함으로써 NK 세포 유도 세포 독성을 측정할 수 있습니다.

유세포 분석을 위한 Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity Assay 시료 전처리

이 프로토콜은 민감한 세포 기반 세포 독성 분석을 설명합니다. 이 분석은 effector CD8+ T 세포의 수가 증가할 때 살아있는 표적 CD4+ T 세포의 빈도 감소를 열거함으로써 항원 특이적 CD8+ T 세포의 세포 용해 활성을 직접 평가할 수 있습니다.

세포독성 활성을 측정하기 위한 세포 기반 유세포 분석 분석

간단하고 신뢰할 수있는 방법은 상이한 NK 세포의 서브 세트 내의 탈과립, 사이토 카인 및 케모카인 생산 등의 NK 세포의 기능 세트를 분석하기 위해 여기에 설명된다.

흐름 NK 세포의 기능을 모니터링 분석을 기반 세포 계측법

이 작업은 인간 혈액 샘플에서 NK(Natural Killer) 세포 수와 NK 세포 독성을 정확하고 빠르게 측정하기 위한 고급 워크플로우를 설명합니다.

인간의 전체 혈액 자연 살해 세포 용 균성 활동의 유세포 분석

암세포에 의한 자연살해(NK) 세포 매개 박멸의 회피는 암 개시 및 진행에 중요하다. 여기에서, 우리는 간 종양 세포를 향해 NK 세포 매개 세포 독성을 평가하기 위하여 2개의 비 방사능 기지를 둔 프로토콜을 제시합니다. 또한 NK 세포 마이그레이션을 분석하기 위해 세 번째 프로토콜이 제시됩니다.

간 종양 세포의 맥락에서 자연 킬러 세포 매개 세포 독성 및 이동의 측정

인간 자연 킬러 세포에서 치료 항체에 의한 FcγRIIIa 구동 이벤트를 연구하기 위한 프로토콜이 여기에 설명되어 있다. 이 인공 자극 플랫폼은 결합에 관여하는 항체의 FcγRIIa 및 Fc 부분에 의해 매개되는 디그라니션, 케모킨/사이토카인 생성, 시그널링 경로 와 같은 다운스트림 이펙터 기능의 심문을 허용합니다.

치료 항체의 존재에 FcγRIIIa 참여에 의해 구동 인간 자연 킬러 세포 이벤트의 평가

이 프로토콜은 렌즈가 없는 섀도우 이미징 기술을 사용하여 자연 살해(NK) 세포 수 및 활성의 신속한 단일 세포 분석을 위한 무표지 방법을 설명합니다. 이 방법은 회절 패턴의 컴퓨터 분석을 통해 개별 NK 세포의 형태학적 변화를 정량화합니다.

자연 살해 세포 활성화의 신속한 무표지 분석을 위한 현장 배치 가능한 렌즈 프리 이미징 플랫폼

이 프로토콜은 생세포 영상과 유세포분석을 사용하여 인간 자연 살해 세포의 자연 키메라 항원 매개 매개 항체 의존성 세포독성을 일관되게 측정하기 위한 표준화된 시험 관 내 워크플로우를 제공합니다.

키메라 항원 수용체와 치료용 항체에 의해 증강되는 NK 세포 독성을 생세포 영상 및 유동 세포분석을 이용해 정량화합니다

Tregs는 면역 시스템의 강력한 진압하고 있습니다. 그들을 정의하는 독특한 표면 마커의 부족이있다, 그러므로, Tregs의 정의는 주로 기능입니다. 여기서 우리는 최적화된...

사람의 체외에서</em면역 불균형의 초기 국가의 인정을위한 심사 도구를> 억제

학습하세요 인간 NK 세포 세포독성 활동을 평가하는 흐름 세포측정법 기반 분석법을 사용하는 방법을. 이 기법은 방사성 없이 민감하고 재현성 있게 NK 세포 기능을 진단하고 연구할 수 있습니다.

인간 NK 세포 활동의 평가 대 한 흐름 Cytometry 기반 세포 독성 분석 실험

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