인간 NK 세포 활동의 평가 대 한 흐름 Cytometry 기반 세포 독성 분석 실험

이 절차의 전반적인 목표는 인간 NK 세포의 세포독성 활성을 평가하는 것입니다. 이 방법은 기능적 또는 전형적인 NK 세포 결핍 환자를 모니터링하는 데 사용될 수 있습니다. 유세포 분석 기반 기술의 주요 장점은 민감도가 높고 재현성이 뛰어나며, 방사성 크롬 방출 분석과 같은 표준 NK 세포 기능 평가 방법보다 빠르다는 점입니다.

이 방법은 새로운 NK 세포 표적 치료제를 테스트하는 것뿐만 아니라, 이전에는 불가능했던 NK 세포 생물학의 심층적인 다중 파라미터 유세포 분석에 활용될 수 있습니다. 먼저 표준 프로토콜에 따라 밀도 구배 분리법을 사용하여 전혈 샘플에서 말초혈액 단핵구(PBMC)를 분리하십시오. 정제된 NK 세포 대신 PBMC를 사용하는 것은 임상 시료를 다룰 때 매우 유용합니다.

분리된 세포를 완전 배지에서 5 × 10⁶ cells/mL 농도로 희석하고, 즉시 원심분리를 통해 K562 표적 세포를 수집합니다. 5 × 10⁵개의 562 세포를 1% FBS가 보충된 500 µL의 신선한 배지에 재현탁합니다. 다음으로, 500 µL의 CFSE 작업 용액으로 표적 세포를 라벨링하고, 피펫팅을 3~5회 반복하여 세포 용액을 부드럽게 혼합합니다.

빛이 차단된 상태에서 37 °C로 10분간 반응시킨 후, 실온의 암소에서 완전 배지 10 mL를 가하여 10분 동안 표지 반응을 중단시킵니다. 중단 배양 단계가 끝나면 원심분리로 세포를 수집하고, 표지된 표적 세포 펠렛을 1 mL의 완전 배지에 다시 현탁하여 세포 수를 측정합니다. 그런 다음, 신선한 완전 배지를 사용하여 세포 농도를 1 × 10⁵ cells/mL로 희석하고, 표적 세포를 습도가 유지되는 37 °C, 5% CO₂ 배양기에 넣습니다.

성공적인 분석을 위해 표적 세포의 스트레스를 최소화하고, 수집 후 가능한 한 빨리 작동 세포를 테스트하십시오. 표적 세포 라벨링 후 30분 이내에 표에 따라 96-웰 U-바닥 조직 배양 처리 플레이트를 라벨링하십시오. 다음으로 25:1, 12.5:1, 6.25:1 작동 세포 대 표적 세포 비율 웰, 표적 세포 전용 웰, 그리고 작동 세포 전용 웰에 완전 배지 100 µL를 추가하십시오.

세포독성 대조군 웰과 작동 세포 대 표적 세포 비율이 50:1 및 25:1인 웰에 작동 세포 100 µL를 추가합니다. 그다음, 작동 세포 대 표적 세포 비율이 25:1인 웰부터 시작하여, 표적 세포만 있는 웰은 제외하고 다음으로 낮은 세포 비율 농도의 웰로 100 µL의 세포를 순차적으로 두 개의 웰에 옮깁니다. 이때 각 세포 전송 단계 사이에 충분히 혼합하며, 마지막 100 µL의 세포는 작동 세포만 있는 웰에 추가합니다. Tween 전용 K562 사멸 양성 대조군 웰에는 2X 0.2% Tween 작동 용액 100 µL를 추가합니다.

NK 세포 세포독성 양성 대조군 웰에 vial 2 작동 용액 30 µL를 추가합니다. 그런 다음, 작동 세포 전용 웰을 제외한 모든 웰에 완전 배지 100 µL에 희석된 1 × 10⁵ cells/mL 농도의 K562 표적 세포를 추가합니다. 모든 세포의 분주가 완료되면 멀티 채널 피펫을 사용하여 모든 웰을 혼합합니다.

짧은 원심분리를 통해 세포를 가라앉힌 후, 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣고 4시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 플레이트를 얼음이나 콜드 플랫폼 위에 올려두고, 각 웰에 갓 준비한 dead cell stain 50 µL를 첨가합니다. 그 다음 모든 웰을 부드럽게 혼합하고 유세포 분석법으로 세포를 분석합니다.

방금 시연한 바와 같이 4시간 동안의 저온 배양 후 CFSE 및 사멸 세포 염색에 대해 유세포 분석을 수행하면, 표적 세포만 있는 웰의 세포 사멸률은 15% 이하인 것으로 나타납니다. 작동 세포만 있는 웰에서는 CFSE 신호가 검출되지 않으며, 이들 웰에서 관찰되는 세포 사멸률은 5% 미만입니다. 반면, Tween 매개 표적 세포 살해 웰의 세포 사멸률은 일반적으로 85% 이상입니다. NK 세포 기능에 결함이 있는 환자의 경우, 건강한 대조군과 비교했을 때 테스트한 대부분 또는 모든 비율에서 살해 활성이 감소한 것이 관찰되며, 이는 이러한 환자의 NK 세포가 작동 세포 대 표적 세포 비율의 감소와 상관관계가 있는 차별적인 세포독성 감소를 보인다는 것을 입증합니다.

이 기술에 숙련되면 준비 및 플레이팅 2시간, 배양 4시간, 데이터 획득 30분을 포함하여 총 6시간 30분 만에 완료할 수 있습니다. 이 실험 절차를 수행할 때는 세포 준비와 공동 배양 시작 사이의 지연 시간을 최소화하기 위해 표적 세포와 작동 세포를 병렬로 준비하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면 유세포 분석법을 통해 형광 표지된 표적 세포에 대한 인간 NK 세포의 세포 독성 활성을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.