Name: 세균성 성장의 정확한, 높은 처리량 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 배우세요 정확한 고처리량 세균 성장 분석 방법을 통해 E. coli 및 다양한 미생물의 최대 성장률과 최대 균체 밀도를 평가하는 기술을 익히세요. 이 방법은 미생물 생리학 및 시스템 생물학 연구에 필수적입니다.

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저자는 공개 없다.

1. 성장 매체를 준비 참고: 최소한의 중간 M63의 화학 조성은 다음과 같습니다: 62 m K m 2 HPO 4, 39mm KH 2 포 4, 15 밀리미터 (NH 4) 2 등 4, 1.8 µ M FeSO 4, 15 µ M 티 아민-HCl, 0.2 m m MgSO 4 및 22 m m 포도 당. M63 3 재고 솔루션을 혼합 하 여 이루어집니다: 5 X 솔루션, 20% 포도 당 및 MgSO 4 티 아민 솔루션. 4 모든 솔루션을 저장 ° C.
<ol><li>FeSO 4 솔루션을 준비 하는 5 X 솔루션 <ol><li>준비를 사용 하 여 전기 피 펫, 일회용 혈 청 학적인 피 펫 ddH 2 O 50 mL 원심 분리기 튜브를 추가. P-200 0.06 mL HCl 0.01 M HCl. 추가 36 mg FeSO 4-7 H 2 O를 섞어 잘 추가를 사용 하 여.</li>
		<li>160 mL ddH 2 O 측정 실린더에 측정 하 고 500 mL 비 커에 추가. 이 순서 대로 다음을 추가: 10.72 g K 2 HPO 4, 5.24 g KH 2 포 4, 2.0 g (NH 4) 2 등 4, 그리고 0.5 mL FeSO 4 솔루션 (단계 1.1.1에서에서 준비).</li>
		<li>2 분 코를 추가 하 여 7.0에 pH를 조정 하는 정밀 pH 미터를 사용 하 여. 측정 실린더에 솔루션을 붓는 다 고 200 mL의 총 볼륨 ddH 2 O를 추가 합니다. 250 mL 여과 장치 (PVDF, 0.22 μ M)를 사용 하 여 솔루션을 소독.</li>
	</ol></li> <li>준비 20% 포도 당 솔루션 <ol><li>200 mL ddH 2 O 측정 실린더에 측정 하 고는 500 mL 비이 커에 부 어. 자력 교 반기를 사용 하 여 혼합 하는 동안 포도 당 50g을 추가 합니다. 250 mL의 총 볼륨 측정 실린더에 솔루션을 희석. 1.1.3 단계에 설명 된 대로 솔루션을 소독.</li>
	</ol></li> <li>MgSO 4 티 아민 솔루션 준비 <ol><li>500 mL 비 커에 150 mL ddH 2 O를 추가. 자력으로 혼합 될 때 200 mL의 총 볼륨 측정 실린더에 있는 티 아민-HCl와 MgSO 4-7 H 2 o. Dilute 솔루션의 10 g 1.0 g을 추가 합니다. 1.1.3 단계에 설명 된 대로 솔루션을 소독.</li>
	</ol></li> <li>최소 중간 M63 준비 <ol><li>5 X 솔루션, 20% 포도 당 솔루션, MgSO 4 티 아민 솔루션, 전자 피 펫, P-200 피 펫 및 깨끗 한 벤치에 200 µ L 피 펫 팁.</li>
		<li>155.8 mL ddH 2 O 측정 실린더에 측정 하 고 500 mL 비 커에 부 어.</li>
		<li>전자 피 펫, 일회용 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 추가 5 X 솔루션 및 4 mL 20% 포도 당 용액 40 mL 측정된 ddH 2 o. 그런 다음, 추가 0.2 mL는 P-200 MgSO 4 티 아민 솔루션. 1.1.3 단계에 설명 된 대로 솔루션을 소독.</li>
	</ol></li></ol> 2. 글리세롤 재고 준비 <ol><li>셀 문화 참고: (예를 들어, W3110 및 그것의 감소 된 게놈) 세균성 긴장 스트레인 은행 조직에서 사용할 수 있습니다. 긴장 한 천 배지에서 식민지의 형태로 일반적으로 얻을 수 있습니다.
	<ol><li>장소 5 소독된 유리 튜브와 실리콘 고무 마 개, 전자 피 펫, P-1,000, 1000 µ L 피 펫 팁, P-200, 200 µ L 피 펫 팁, 클린 벤치에 대상 긴장 (접시에 식민지).</li>
		<li>는 실리콘 고무 마 개를 열기 전에 분 젠 버너 유리 튜브의 입 노출. 튜브 열 후 불꽃에 실리콘 고무 마 개를 노출 하 고 가볍게 유리 튜브에 다시 뚜껑을 배치.</li>
		<li>전자 피 펫, 일회용 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 유리 튜브와 4.5 mL M63 다른 4 개의 튜브 중 하나에 5 mL M63 추가.</li>
		<li>P-200 팁을 사용 하 여 식민지를 선택 5 mL M63 포함 된 유리 튜브에 접종을.</li>
		<li>소용돌이 관 정지 수 있도록입니다. 그런 다음 솔루션을 10 배 희석 4.5 mL M63 포함 된 4 개의 튜브 중 하나에이 솔루션의 0.5 mL를 옮겨서.</li>
		<li>는 2.1.5 나머지 튜브에 대 한 단계에서 설명 하는 프로세스를 반복 합니다. 5 다른 농도로 희석 시리즈 (1, 10, 100, 1000, 희석 및 10000) 이제.</li>
		<li>소독 유리 튜브 및 실리콘 고무 stoppers 2.1.2 단계에 설명 된 대로 입. 모자는 stoppers 튜브. 하지 주름 실리콘 고무 마 개에 의해 오염 방지.</li>
		<li>37 ° C에 미리 데워 진된 떨고 인큐베이터에서 5 개의 튜브를 배치 하 고 200 rpm에서 흔들어. 하룻밤 또는 10 ~ 30 헤에 대 한 문화를 품 어</li>
	</ol></li> <li>글리세롤 주식에 대 한 문화의 선택 <ol><li>깨끗 한 벤치에 미리 따뜻하게 실내 온도 M63 매체, P-1,000, 1000 µ L 피 펫 팁, 그리고 일회용 cuvette 장소.</li>
		<li>추가 1000 µ L P-1, 000와 일회용 cuvette에 M63. 분 광 광도 계에 일회용 cuvette, 600의 고정된 파장에서 프로그램을 시작, 및 측정 빈.</li>
		<li>떨고 인큐베이터에서 클린 벤치 5 유리 튜브를 이동.</li>
		<li>삭제 M63 일회용 cuvette에서 1000 µ L 문화 P-1, 000와 같은 일회용 cuvette에 추가. 2.2.2 단계에서 설명한 대로 세포 배양 (OD 600)의 광 탁도 측정. 
		참고: 모든 오염을 방지 하 고 정확한 측정을 달성 하기 위해 노출 유리 튜브와 같이 불꽃을 소용돌이 샘플링 하기 전에 문화 stoppers. 신뢰할 수 있는 결과 보장 하기 위해, 반복된 측정은 것이 좋습니다, 특히 때 셀 밀도.</li>
		<li>다섯 셀 문화, 초기 지 수 성장 단계에 있는 하나를 선택 (OD 600 = 0.01-0.05) 글리세롤 주식. 
		참고: 여러 문화 최적의 범위 내에서 밀도, 가장 가까운 0.05에 일반적으로 선택 됩니다.</li>
	</ol></li> <li>반복된 테스트에 대 한 글리세롤 주식 확인. 
	참고: 10 주식을 준비 하기 위한이 설명 합니다. 실험 요구 사항에 따라 더 크게 또는 더 작은 금액을 만들 수 있습니다.
	<ol><li>소독된 60% 글리세롤 용액 10 1.5 mL microtubes, P-1,000 소독 놓고 P-200, 1000 그리고 200 µ L 피 펫 팁, 그리고는 microtube 깨끗 한 벤치에 서 서.</li>
		<li>추가 250 µ L pipetting에 의해 60% 글리세롤 솔루션 및 1.5 mL microtube 믹스를 선택한 세포 배양의 750 µ L 소독. 
		참고: 스톡 볼륨 변수 이지만 항상 셀 문화; 60% 글리세롤의 1:3 비율을 유지 이 결과 15% 글리세롤의 최종 농도.</li>
		<li>는 Microtube 서에서 나머지 9 microtubes 놓고 준비 단계 2.3.2 각 관에서에서 혼합물의 100 µ L를 분배 합니다. 지금 미래 사용을 위해 10 동일한 글리세롤 주식 있다.</li>
		<li>주식-80에서 깊은 냉동 실에 저장 ° c.</li>
	</ol></li></ol> 3. 성장 곡선 인수 <ol><li>microplate 리더 설정. 
	참고: (재료의 표 참조) 플레이트 리더에 사용 하는 특정 말 씨는 여기에 사용 된 인용 부호 표시에 표시 된 조건.
	<li>오픈 소프트웨어 <ol>입니다. 오픈 &#34; 프로토콜 &#34;에 &#34; 작업 관리자 &#34; 선택 &#34; 새로 만들기 &#34;. 선택 &#34; 표준 프로토콜 &#34;.</li>
		<li>오픈 &#34; 프로시저 &#34;, 설정을 조정 하 고. 오픈 &#34; 설정 온도 &#34;, 선택 하 고 &#34; 인큐베이터에 &#34;. 설정 &#34; 온도 &#34; 37 ° C에 그리고 &#34; 그라데이션 &#34;을 0 ° C. 확인 &#34; 예 열 &#34; 다음 단계를 계속 하기 전에. 오픈 &#34; 운동 시작 &#34;, set &#34; 실행 시간 &#34; 24시: 00 또는 48:00:00, 및 &#34; 간격 &#34; 00시 30분: 00 또는 01시: 00. 
		참고: 전체 96 잘 접시 읽을 약 1 분 걸립니다.</li>
		<li>오픈 &#34; 흔들어 &#34; 설정 &#34; 흔들 모드 &#34;으로 &#34; 선형 &#34;. 체크 &#34; Constitution 쉐이크 &#34; 설정 &#34; 주파수 &#34; 567 cpm에서. 오픈 &#34; 읽기 &#34;, 확인 &#34; 흡 광도 &#34;, &#34; 끝점/운동 &#34;, 및 &#34; Monochromators. &#34; 설정 &#34; 파장 &#34; 600.</li>
		<li>클릭 &#34; 유효성 검사 &#34; 절차 올바른지 확인 합니다. 클릭 &#34; 저장 &#34; 미래 사용을 위한 새로운 프로그램으로 그것을 저장 하.</li>
	</ol></li> <li>성장의 기록 실시간 <ol><li>96 잘 접시에 접종된 문화 샘플의 위치를 나타내기 위해 96 잘 접시 그림 (8 × 12 테이블)를 그립니다. 테이블을 출력 하 고 실험에 대 한 참조로 사용. 
		참고: 웰 스는 미 판의 가장자리에 있는 포함 빈 매체 증발 때문.</li>
		<li>장소 소독된 96 잘 평면 바닥 microplate와 뚜껑, P-1000, 1000 µ L 피 펫 팁, P-200, 200 µ L 피 펫 팁, 여러 1.5 mL microtubes, 8-멀티 채널 피 펫, 멸 균된 시 저수지, 실내 온도 M63, 글 리세 린 주식 (2.3 단계에서 준비) 깨끗 한 벤치에.</li>
		<li>시 저수지에 M63 약 25 mL를 추가합니다. 이 저수지 주식에 대 한 모든 다음 단계 사용 하 여.</li>
		<li>추가 900 µ L 직렬 희석을 만들기 위한 준비에 microtubes에 M63.</li>
		<li>는 글리세롤 재고 실 온에서 해 동. 900 µ L을 추가 해 동된 글리세롤 주식과 소용돌이에 M63. 그러면 원래 글리세롤 주식의 10 희석.</li>
		<li>다른 microtube M63 및 소용돌이의 900 µ L을 포함 하 게 10 희석의 전송 100 µ L. 그러면 100 희석.</li>
		<li>3.2.6 희석의 원하는 숫자를 얻을 때까지 반복 단계.</li>
		<li>채우기 200 µ L M63 사용 microplate의 가장자리에서 웰 스는 8 개 채널 피 펫 (P-200). 
		참고:이 웰 스는 빈으로 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>부하 200 µ L 각 샘플 준비 단계-3.2.4 3.2.7 참조 테이블 (단계 3.2.1)에 따르면 미 판 우물을 희석. 소용돌이 희석된 샘플 전에 로드 및 로드 같은 샘플에 여러 우물에 다양 한 접시에 위치.</li>
		<li>플레이트 리더에 96-잘 미 판 배치.</li>
		<li>오픈 &#34; 읽기 지금 &#34;에 &#34; 작업 관리자 &#34; (3.1 단원) 프로그램을 선택 하십시오. 클릭 &#34; 확인 &#34;를 측정 시작. 데이터 분석 (제 4)에 대 한 새로운 실험 파일로 녹음을 저장.</li>
	</ol></li></ol> 4. 데이터 분석 <ol><li>수출 USB 메모리를 실시간 성장 율 데이터 (3.2 단원)의 결과 텍스트 파일로 스틱. 
	참고: 96-잘 포맷 된 결과 (곡선) 실시간으로 플레이트 리더에 표시 됩니다. 시간별 레코드 (OD 값); 테이블로 내보낼 수 있습니다. 행과 열 대표 잘 번호 (예를 들어, A1, B1)과 측정 시간 (예: 00시: 59), 각각.</li>
	<li>스프레드시트 소프트웨어와 함께 텍스트 파일을 엽니다.</li>
	<li>96 잘 microplate의 시간별 OD 600 읽기 추가 분석에 대 한 새 워크시트에 복사.</li>
	<li>빼기 배경에서 읽는 시간 각 샘플의 시간별 읽기에서 제로 잘. 
	참고: 편의 위해, 빈의 평균값이 우물 포함 하 M63 (단계 3.2.8) 배경 값으로 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>최대 인구 밀도 추정을 5 연속 세 600 읽기의 평균을 계산. 
	참고: 5 연속 세 600 읽기의 가장 큰 평균 값 해당 성장 곡선의 최대 OD 600으로 정의 됩니다.</li>
	<li>OD 600의 모든 연속적인 값 쌍에 대 한 다음 방정식을 적용 하 여 성장 율, μ (h -1), 계산: 
	<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56197/56197eq1.jpg" /> 참고:이 수식에서는 C 나 및 C i + 1 어떤 두 연속 시간 포인트 (t i t i + 1의 OD 600 값을 나타냅니다 각각). LN 자연 로그값을 나타냅니다.</li>
	<li>계산 시간별 OD 600을 기반으로 시간이 지남에 성장 속도 변화 단계 4.6 따라 읽습니다. 평균 및 최대 성장 율 추정 5 연속 성장률의 표준 편차를 계산. 
	참고: 작은 표준 편차와 함께 가장 큰 의미는 해당 성장 곡선의 극대 성장 율으로 정의 됩니다.</li>
</ol> 5. 96-잘 읽기 (선택 사항)의 글로벌 바이어스 확인 참고: 두 접시 리더 및 소모품 96 잘 접시 한쪽으로 치우친된 측정을 발생할 수 있습니다. 매우 정확 하 고 재현 가능한 양적 결과 얻기 위해 96 잘 접시의 글로벌 바이어스를 확인 것이 좋습니다.
<ol><li>3.2.2 섹션에서 설명한 대로 96 잘 접시 및 플레이트 리더 바이어스 테스트에 대 한 준비.</li>
	<li>추가 20 mL M63 소독된 50 mL 원심 분리기 튜브. 같은 원심 분리기 튜브와 소용돌이에 글리세롤 주식을 추가 합니다. 멸 균된 시 저수지에 정지 솔루션 전송.</li>
	<li>8 채널 피 펫을 사용 하 여 일시 중단 된 솔루션의 200 µ L 96 잘 접시에 전송.</li>
	<li>플레이트 리더에 96 잘 접시를 놓고 측정 시작.</li>
	<li>기록 시간별 OD 600 읽어들이고 분석 섹션 4에서에서 설명한 대로. 96-잘 읽기의 locational 바이어스를 결정 하기 위해 각 잘 계산 된 최대 성장 속도 인구 밀도 비교.</li>
</ol>

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</ol>

고헤이 츠치야는 CFU 분석 결과 예제를 제공 하는 감사 합니다. 이 작품 부분적으로 재정적으로 지원 했다는 선진적인 26506003 과학 연구 (C) 호에 대 한 (BWY)에 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술, 일본에서.

프로토콜에 중요 한 단계는 기 하 급수적으로 성장 하는 세포와 같은 샘플은 microplate에 다양 한 위치에서 여러 우물에서의 복제의 보통주 준비 포함 됩니다. 이전, 미생물학 하룻밤 사전 문화에서 문화를 시작 했다. 이 방법은 세균 성장의 지연 시간을 줄일 수 있습니다, 하는 동안 재현할 수 성장 곡선을 달성 하기 어렵다. 그림 2에서 같이 거의 동일한 성장 곡선, 재현할 수 및 정확한 결과 제공 하는 일반적인 글리세롤 주식을 사용 하 여 독립 측정 결과. 그림 3에서 보듯이 다양 한 위치에서 웰 스는 측정의 글로벌 배경 이라고 여겨진다 약간 다른 읽기에 제공 합니다. 세균성 성장의 양적 평가 대 한이 배경 고려 되어야 한다. 실험적인 복제에 대 한 다양 한 플레이트 위치에 여러 우물을 샘플의 접종이 글로벌 바이어스에 대 한 계정에 좋습니다.
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미생물 연구는 종종 세균 세포의 문화, 그리고 세균 생리학1,2,3의 기본적인 현상을 대표 하는 세균성 성장 곡선의 평가로 시작 합니다. 세균성 문화는 근본적인 방법론 때문에 기본적인 문화 원리 교과서 출판된 연구 문학에 널리 사용할 수 있습니다. 벤치 수준에서 상당한 관심은 전통적으로에 초점을 맞춘 성장 미디어 최적화와 배양 조건, 하지만 성장 속도 제어는 미생물 생리학의 더 큰 이해를 제공할 것입니다 가능성이 되지 않았습니다. 광범위 하 게 공부4. 기 하 급수적으로 성장 하는 박테리아, 세포의 주요 매개 변수는 성장률, 게놈, transcriptome와 프로테옴5,6,7,8 조정 될 것으로 보고 되었습니다. . 따라서, 세균성 성장의 양적 평가 미생물 생리학을 이해 결정적 이다.
세균성 성장 평가, 바이오 매스를 추정 하는 데 사용 하는 실험 방법 잘 설립된9,10 있으며 광 탁 등, 물리적, 생화학 또는 생물 학적 매개 변수의 탐지에 기반. 또한, 성장 변경의 동적 속성을 캡처하는 데 사용 하는 분석 방법 설립된 비선형 모델11,,1213, 예를 들어 로지스틱 방정식에 일반적으로 근거한 다. 성장 역학 광 탁도 측정 하거나 콜로 니 형성 단위 (CFU) 분석 실험을 수행 하 여 셀 성장 문화에서의 시간된 샘플링에 의해 일반적으로 획득 됩니다. 이러한 배양 및 검출 방법의 한계는 데이터 요소는 없습니다 인구 역학의 진정한 반사 측정 간격 시간에 종종 있기 때문에 때문에 문화 조건 (예를 들어, 온도 변경 및 통 기 통풍) 샘플링 시간에 교란 된다. 문화 및 분석 기술은 최근 개발 기술 및 이해를 사용 하 여 업데이트 해야 합니다. Microplate 리더의 최근 발전 세균 성장의 실시간 관찰을 허용 하 고 노동 비용을 크게 감소. 이러한 고급 장치를 사용 하 여, 세균성 성장에 대 한 최신 연구는 높은 처리량 측정14,15에 대 한 분석 방법 보고.
이 프로토콜의 목적은 궁극적으로 어떻게 성장 율 결정 되 고 어떤 요인에 영향을 미치는 성장 율의 질문 하는 양적 연구에 대 한 가치가 있을 것입니다 높은 처리 방식으로 정확한 성장 역학을 평가 하는 것입니다. 프로토콜 세균 성장의 반복 가능 하 고 정확한 정량에 대 한 계정으로 이동 해야 하는 모든 요소를 해결 합니다. 실험 방법 및 분석 주요 텍스트에서 자세히 설명 합니다. 이 메서드는 높은 처리량 방법에서 세균 성장의 정확 하 고 재현성 분석을 허용합니다. 미생물학은 그들의 실험적인 증거 추가 양적 결과 파생이 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 개념적 결론 또는 성장에 대 한 이론적 개요를 달성 하기 위해 시도 하는 시스템 생물학에서 연구를 위해 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>K2HPO4</td><td>Wako</td><td>164-04295</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Wako</td><td>166-04255</td><td></td></tr><tr><td>(NH4)2SO4</td><td>Wako</td><td>019-03435</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4-7H2O</td><td>Wako</td><td>138-00415</td><td></td></tr><tr><td>Thiamine-HCl</td><td>Wako</td><td>201-00852</td><td></td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>Wako</td><td>049-31165</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Wako</td><td>080-01066</td><td></td></tr><tr><td>철 (II) 황산 헵타하이드레이트 (FeSO4-7H2O)</td><td>Wako</td><td>094-01082</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Wako</td><td>168-21815</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Wako</td><td>075-00611</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브 (50 mL, 멸균)</td><td>WATSON</td><td>1342-050S</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁, 200 &마이크로; L</td><td>WATSON</td><td>110-705Y</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁, 1,000 &마이크로; L</td><td>WATSON</td><td>110-8040</td><td></td></tr><tr><td>Microtube (1.5 mL)</td><td>WATSON</td><td>131-715C</td><td></td></tr><tr><td>8 멀티채널 피펫</td><td>WATSON</td><td>NT-8200</td><td></td></tr><tr><td>PASORINA STIRERER</td><td>AS ONE</td><td>2-4990-02</td><td></td></tr><tr><td>유리 실린더(200 mL)</td><td>AS</td><td>ONE 1-8562-07</td><td></td></tr><tr><td>정밀 pH</td><td>mater AS</td><td>ONE AS800 / 1-054-01</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-200</td><td>GILSON</td><td>1-6855-05</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-1000</td><td>GILSON</td><td>1-6855-06</td><td></td></tr><tr><td>일회용 혈청 항 피펫 (10 mL)</td><td>SANPLATEC</td><td>SAN27014</td><td></td></tr><tr><td>일회용 혈청 항 피펫 (25 mL)</td><td>SANPLATEC</td><td>SAN27015</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 튜브 스탠드</td><td>BM Bio</td><td>801-02Y</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>BM Bio</td><td>BM-V1</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Corning, 3370</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 시약 reservoir (50 mL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Corning, 4870</td><td></td></tr><tr><td>Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 &micro; M)</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGVU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Aid XP</td><td>DRUMMOND</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>Bioshaker (BR-23UM MR)</td><td>TAITEC</td><td>0053778-000</td><td></td></tr><tr><td>Disposal cell (1.5 mL)</td><td>Kartell</td><td>1938 / 2-478-02</td><td></td></tr><tr><td>DU 730 Life Science UV/Vis 분광 광도계</td><td>Beckman Coulter</td><td>A23616</td><td></td></tr><tr><td>EPOCH2</td><td>BioTek</td><td>2014- EP2-002 / EPOCH2T</td><td></td></tr><tr><td>비커 (500 mL)</td> <td>IWAKI</td><td>82-0008</td><td></td></tr><tr><td>BIO 클린 벤치</td><td>Panasonic</td><td>MCV-B131F</td><td></td></tr><tr><td>유리관</td><td>NICHIDEN RIKA GLASS</td><td>P-10M ~ P-30 / 101019</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 고무 마개</td><td>ShinEtsu Polymer</td><td>T-19</td><td></td></tr><tr><td>박테리아 균주 균주 균주</td><td>은행 조직; 일본 국가 바이오 자원 프로젝트(NBRP)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

세균성 성장의 정확한, 높은 처리량 분석

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

세균성 성장 시스템 수준에서 세포 역학 조사에서 뿐만 아니라 현대 미생물 생리학의 발달에 중앙 개념 이다. 최근 연구는 세균성 성장 및 게놈 감소와 transcriptome 개편 같은 게놈 넓은 이벤트 사이의 상관 관계를 보고 했다. 올바르게 박테리아의 성장을 분석 유전자 기능 및 세포 구성 성분의 성장-종속 조정 이해 결정적 이다. 따라서, 높은 처리량으로 세균 성장의 정확한 정량적 인 평가 필요 합니다. 신흥 기술 개발 공부 하는 박테리아의 성장을 위해 사용 하는 방법의 업데이트를 허용 하는 새로운 실험 도구를 제공 합니다. 여기 소개 하는 프로토콜 세균성 성장의 재현 하 고 정확한 평가 위해 고도로 최적화 된 실험적인 절차 microplate 리더를 사용 합니다. 이 프로토콜의 성장을 평가 하는 데 사용 되었다 대장균 변종 설명한. 프로토콜의 주요 단계는 다음과 같습니다: 재현할 결과와 높은 처리량 성장 평가 96 잘 접시를 사용 하 여, 두 가지 주요의 수동 계산 반복된 테스트에 대 한 작은 튜브에서 셀 주식의 많은 수의 준비 매개 변수 (즉, 최대 성장 속도 인구 밀도) 성장 역학을 나타내는. 전통적인 식민지 형성 단위 (CFU) 분석 결과, 한 천 배지에서 시간이 지남에 따라 유리 튜브에 교양 있는 셀을 계산, 비교 현재의 방법 보다 효율적 고 성장 변화, 자세한 시간 레코드를 제공 합니다 하지만 엄격한 낮은 인구 밀도에 검색 제한입니다. 요약, 설명된 방법 개념적 결론 또는 이론적 관찰 하도록 이용 될 수 있는 세균 성장의 정확 하 고 재현성 높은 처리량 분석을 위해 유리 하다.

설명된 방법 96-잘 형식 리더는 여러 광학 밀도 측정 (일 분)에서 다양 한 시간 간격을 이용 하 여 동적 세균성 성장을 지속, 높은 처리량으로에서 잡으려고 수단을 제공 합니다. 다양 한 유전자를 표현 하는 E. 콜라이 긴장의 구색의 성장 곡선 단일 실험 (그림 1A)에서 정확 하 게 취득 될 수 있다. 설명된 방법에 비해 전통적인 방법 (CFU 분석 결과) 일반적으로 필요 이상 샘플링 시간 간격 (그림 1B) 이며 노동 집약적인 여러 문화 필요한 경우. 또한, 각 문화 샘플링 시간 CFU 분석 결과 대 한 작은 양의 세포 배양을 반복된 측정에 사용할 수 없습니다 사용을 해야 합니다. 또한, 검색 시간 포인트의 제한 된 숫자는 성장 속도 및 최대 OD600의 정확한 계산에 필요한 샘플링 포인트를 놓칠 수 있습니다. 그러나, CF...

세균성 성장의 양적 평가 시스템 수준 현상으로 미생물 생리학을 이해 하는 데 필수적입니다. 실험적인 조작 및 분석 접근 프로토콜, 세균성 성장, 시스템 생물학의 핵심 주제는의 정확한, 높은 처리량 분석에 대 한 허용 소개.

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

이 실험의 전반적인 목표는 고처리량 방식으로 박테리아 성장을 정밀하게 분석하는 것입니다. 이 절차를 통해 여러 가지 배지 또는 다양한 균주를 동시에 테스트할 수 있습니다. 이 방법은 세포 성장의 결정 요인이 무엇인지와 같은 시스템 생물학 및 미생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 연구자가 세균 세포의 성장 곡선에서 최대 성장률과 최대 개체군 밀도라는 전역적 파라미터를 정밀하게 평가할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 e. Coli 성장에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 환경 세균의 성장 분석 및 스크리닝과 같은 다른 미생물에게도 적용될 수 있습니다.먼저, 실리콘 고무 마개가 달린 멸균 유리관 5개와 피펫, 그리고 대상 균주를 클린 벤치 위에 준비합니다. 실리콘 고무 마개를 열기 전, 유리관 입구를 분젠 버너의 불꽃에 노출시킵니다. 유리관을 연 후에는 실리콘 고무 마개를 불꽃에 노출시킨 다음, 유리관의 캡을 다시 가볍게 닫습니다.다음으로, 전자 피펫과 일회용 혈청 피펫을 사용하여 유리 튜브 하나에 M63 5 mL를 넣고, 나머지 4개의 튜브에는 M63 4.5 mL를 넣습니다. p200 팁을 사용하여 콜로니를 채취한 후, M63 5 mL가 들어 있는 유리 튜브에 접종합니다. 튜브를 볼텍싱하여 현탁액을 만듭니다.그런 다음, 이 용액 0.5 milliliters를 M63 4.5 milliliters가 들어 있는 4개의 튜브 중 하나로 옮겨 용액을 10배 희석합니다. 나머지 튜브들에 대해서도 이 과정을 반복합니다. 유리 튜브의 입구와 실리콘 고무 마개를 멸균한 후, 마개로 튜브를 밀봉합니다.그런 다음, 5개의 튜브를 37 °C로 예열된 진탕 배양기에 넣고 200 rpm으로 흔들어 줍니다. 하룻밤 또는 10에서 30시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 p1000 피펫을 사용하여 일회용 큐벳에 M63 1,000 µL를 넣습니다.일회용 큐벳을 분광광도계에 넣습니다. 600 nanometers의 고정 파장에서 프로그램을 시작하고 블랭크를 측정합니다. 쉐이킹 인큐베이터에서 유리 시험관 5개를 꺼내 클린벤치로 옮깁니다.일회용 큐벳에서 M63을 제거하고, p1000을 사용하여 동일한 일회용 큐벳에 배양액 1,000 µL를 넣습니다. 그다지 세포 배양액의 광학적 탁도를 측정합니다. 다음으로, 1.5 mL 마이크로튜브에 멸균된 60% glycerol 용액 250 µL와 선택한 세포 배양액 750 µL를 넣고 피펫팅하여 혼합합니다.나머지 9개의 마이크로튜브를 마이크로튜브 랙에 세우고, 준비된 혼합물 100 µL를 각 튜브에 분주합니다. 스톡 용액을 -80 °C 초저온 냉동고에 보관하십시오. 마이크로플레이트 리더를 설정하려면, 먼저 소프트웨어를 실행하고 작업 관리자에서 프로토콜을 연 뒤 '새로 만들기'를 선택합니다.그런 다음, 표준 프로토콜을 선택하십시오. 절차를 열고 설정을 조정합니다. 온도 설정을 열고 인큐베이터 켜짐을 선택하십시오.그런 다음, 온도를 37 °C로 설정하고 그라디언트를 0 °C로 설정합니다. 다음 단계로 넘어가기 전에 예열 상태를 확인하십시오. 키네틱 시작(start kinetic)을 열고 실행 시간을 24분 또는 48분으로 설정한 후, 간격을 30분 또는 1시간으로 설정합니다.쉐이킹(shake) 설정을 열고 쉐이킹 모드를 선형(linear)으로 설정하십시오. 연속 쉐이킹(continuous shake)을 확인하고 주파수를 567 cpm으로 설정하십시오. 다음으로 읽기(read) 설정을 열어 흡광도(absorbance), 엔드포인트/키네틱(endpoint/kinetic) 및 모노크로메터(monochromators)를 확인하십시오.파장을 600으로 설정하십시오. 마지막으로, validate를 클릭하여 절차가 정확한지 확인합니다. 그리고 save를 클릭하여 향후 사용할 수 있도록 새로운 프로그램으로 저장하십시오.성장을 실시간으로 기록하려면, 멸균된 시약 저장조에 M63 약 25 milliliters를 넣습니다. 그다음, 연속 희석 준비를 위해 마이크로튜브에 M63 900 microliters를 넣습니다. 이어서, 해동된 글리세롤 스톡에 M63 900 microliters를 넣고 볼텍싱합니다.10배 희석액 100 µL를 M63 900 µL가 들어 있는 다른 마이크로튜브에 옮기고 볼텍싱합니다. 원하는 희석 배수가 될 때까지 이 단계를 반복합니다. 이제 8채널 피펫을 사용하여 멸균된 96-웰 평底 마이크로플레이트의 가장자리 웰에 M63 200 µL를 채웁니다.참조 표에 따라 희석된 각 샘플 200 µL를 마이크로플레이트 웰에 분주합니다. 가열로 인한 층 분리와 시딩 효율을 방지하기 위해, 마이크로플레이트의 가장자리 웰은 샘플에 사용하지 말고 동일한 샘플을 마이크로플레이트의 다양한 위치에 있는 여러 웰에 분주하십시오. 96-웰 마이크로플레이트를 플레이트 리더기에 넣습니다.ReadNow 및 작업 관리자를 열고 프로그램을 선택하십시오. 확인을 클릭하여 측정을 시작합니다. 마지막으로, 데이터 분석을 위해 녹화 내용을 새로운 실험 파일로 저장하십시오.여기에 실험 수행 전에 작성한 참조 표의 예시가 제시되어 있습니다. 96웰 플레이트의 픽토그램을 8x12 표로 그려 96웰 플레이트상에 접종된 배양 시료의 위치를 표시하였습니다. 성장률은 모든 연속된 OD600 값의 쌍에 해당 공식을 적용하여 계산합니다.최대 성장률을 추정하기 위해 5회 연속 성장률의 평균과 표준 편차를 계산하였습니다. 총 60개 세포 배양물의 성장률을 표시된 히트맵으로 나타내었습니다. 흰색에서 빨간색으로 변하는 색상 단계는 성장률이 낮음에서 높음으로 이어짐을 나타냅니다.이 기술을 숙달하면, 적절한 순서에 따라 올바르게 수행할 경우 몇 분 내에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 고처리량 방식으로 박테리아 성장을 정밀하게 측정하기 위해 마이크로플레이트에 샘플을 준비하고 로딩하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도할 때, 세포 배양 밀도가 너무 낮아지는 것을 방지하고 세포가 24시간 이내에 성장을 시작하도록 하기 위해 실험 전 참조 표를 작성하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.이 절차에 따라 실험 조작의 자동화 및 컴퓨터 분석과 같은 다른 방법들을 수행하여, 집단 증식 및 역학의 결정 요인이 무엇인지와 같은 추가적인 질문들에 답할 수 있습니다. 개발 이후, 이 기술은 시스템 생물학 및 미생물학 분야의 연구자들에게 길을 열어주었으며, 세포 성장의 기본 원리를 탐구하고 배양 배지의 조성을 최적화하는 데 기여하였습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Kurokawa, M. 외. 세균 성장의 정밀하고 고처리량 분석. J. Vis. 경험 (2017)이 영상은 마이크로플레이트 리더를 이용한 박테리아 성장의 고처리량 정량을 시연합니다. 배양 준비, 광학 밀도 측정, 성장 역학 분석에 포함된 단계를 개괄합니다.

마이크로플레이트 리더를 이용한 세균 성장의 정밀하고 고처리량 분석

출처: 케이빈, M. T. 외 Bacillus subtilis의 단세포 미세유체 분석. J. Vis. Exp. (2018)이 영상은 단일 세포 수준에서 박테리아 성장을 관찰하기 위해 마이크로플루이딕 장치를 사용하는 방법을 시연합니다. 이 연구는 미세한 도랑 내에 갇힌 비운동성 박테리아 세포가 형광 현미경 아래에서 지속적으로 영양을 공급받고 영상화되는 과정을 보여줍니다. 이 장치는 여러 세대에 걸친 세포 분열 및 계통 추적의 실시간 시각화를 가능하게 합니다.

마이크로플루이딕 시스템에서 단일 세포 해상도로 박테리아 성장 추적

ScanLag는 성장 지연, 즉 지연 시간뿐만 아니라 병렬로 연결된 수천 개의 세포에 대한 콜로니의 성장 속도를 측정하기 위한 고처리량 방법입니다. ScanLag을 사용한 스크리닝을 통해 단일 변이 수준에서 긴 지연 시간과 느린 성장을 구별할 수 있습니다.

ScanLag : 높은 처리량 식민지 성장의 정량화 및 시간 지연

(1) 세포 내 세균 병원체를 표적으로 하는 진핵 세포 침투 항균제를 동시에 식별하고 (2) 진핵 세포 독성을 평가하기 위해 고처리량 실시간 분석이 개발되었습니다. 그 후 동일한 기술의 변형이 디지털 디스펜싱 기술과 결합되어 용이한 고해상도, 용량 반응, 2차원 및 3차원 시너지 연구를 가능하게 했습니다.

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

마이크로티터 접시에 방사성 표지된 세균 배양물의 성장은 (p)ppGpp를 포함하여 뉴클레오티드 풀 풍부의 다중 기술적 및 생물학적 복제 측정을 허용하는 높은 처리량 샘플링을 용이하게 합니다. 생리 적 스트레스의 소스에 의해 자극 성장 전환의 효과 뿐만 아니라 스트레스에서 복구 모니터링할 수 있습니다.

대장균 (p)ppGpp의 여러 생체 내 측정을위한 마이크로 티터 접시 방사성 라벨링 사용 및 얇은 층 크로마토그래피

이 방법에서, 우리는 세균 세포에서 단순, 살아있는, 리포터 분석법을 사용하여 동축 및 비동종 결합 부위에 RNA 결합 단백질(RBPs)의 결합 친화도를 정량화한다. 분석은 기자 유전자의 억압에 근거를 둔다.

박테리아에서 단백질 RNA 결합을 정량화하기위한 분석

세균 적합성을 결정하기 위한 이 분자 기반 접근법은 디지털 PCR을 통해 정량화되는 독특한 게놈 DNA 바코드를 사용하여 미생물을 정확하고 정확하게 검출할 수 있도록 합니다. 프로토콜은 살모넬라 균주에 대한 경쟁 지수를 계산하는 것을 설명합니다. 그러나 이 기술은 유전적으로 가단성 유기체의 절대 정량화를 요구하는 프로토콜에 쉽게 적응할 수 있습니다.

살모넬라에서 피트니스의 높은 처리량 분석을 위한 디지털 PCR 기반 경쟁 지수

이 프로토콜은 단일 세포 및 세포 집단 수준에서 스트레스 조건 하에서 세균 성장의 시간 해결 설명을 허용합니다.

스트레스 치료하에 세균 성장의 다단계 분석

효모 성장 표현형은 마이크로콜로 성장하는 고정 된 세포의 매우 병렬 시간 경과 이미징을 통해 정확하게 측정됩니다. 동시에, 스트레스 내성, 단백질 발현 및 단백질 국소화를 모니터링할 수 있고, 통합된 데이터 세트를 생성하여 환경 및 유전적 차이뿐만 아니라 동종 세포 간의 유전자 발현 이질성, 변조 성장을 연구할 수 있습니다.

성장과 유전자 발현의 이질성을 측정하는 마이크로콜로니의 높은 처리량 라이브 이미징

여기에 플라스미드 overexpression 화면...

높은 처리량 효모 플라스미드 Overexpression 화면

배우세요 정확한 고처리량 세균 성장 분석 방법을 통해 E. coli 및 다양한 미생물의 최대 성장률과 최대 균체 밀도를 평가하는 기술을 익히세요. 이 방법은 미생물 생리학 및 시스템 생물학 연구에 필수적입니다.

세균성 성장의 정확한, 높은 처리량 분석

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