세균성 성장의 정확한, 높은 처리량 분석

이 실험의 전반적인 목표는 높은 처리량 방식으로 박테리아 성장을 정확하게 분석하는 것입니다. 이 절차를 사용하여 여러 매체 또는 다양한 균주를 동시에 테스트할 수 있습니다. 이 방법은 세포 성장의 결정 요인이 무엇인지와 같은 시스템 생물학 및 미생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 연구자들이 박테리아 세포의 성장 곡선에서 최대 성장률과 최대 인구 밀도의 전체 매개변수를 정확하게 평가할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 e에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 대장균 성장, 그것은 또한 성장 분석 및 환경 박테리아의 스크리닝과 같은 다른 미생물에 적용될 수 있습니다.

먼저 실리콘 고무 마개, 피펫 및 대상 균주가 있는 5개의 멸균된 유리관을 깨끗한 벤치에 놓습니다. 실리콘 고무 마개를 열기 전에 유리관의 입구를 분젠 버너에 노출시키십시오. 튜브를 연 후 실리콘 고무 마개를 화염에 노출시킨 다음 캡을 유리관에 가볍게 다시 놓습니다.

다음으로, 전자 피펫과 일회용 혈청 피펫을 사용하여 유리관 중 하나에 5ml의 M63을 추가하고 다른 4개의 튜브에 4.5ml의 M63을 추가합니다. p200 팁을 사용하여 집락을 선택하고 5ml의 M63이 들어 있는 유리관에 접종합니다. 튜브를 소용돌이쳐 서스펜션을 만듭니다.

그런 다음 이 용액 0.5ml를 M63 4.5ml를 포함하는 4개의 튜브 중 하나에 전달하여 용액을 10배 희석합니다. 나머지 튜브에 대해 이 과정을 반복합니다. 유리관과 실리콘 고무 마개의 입구를 살균한 후 마개로 튜브를 덮습니다.

그런 다음 5개의 튜브를 섭씨 37도로 예열된 진탕 인큐베이터에 넣고 200rpm으로 흔듭니다. 하룻밤 또는 10-30시간 동안 배양을 배양하십시오. 배양 후 p1000을 사용하여 일회용 큐벳에 1, 000 마이크로리터의 M63을 추가합니다.

일회용 큐벳을 분광 광도계에 놓습니다. 600나노미터의 고정 파장에서 프로그램을 시작하고 블랭크를 측정합니다. 5개의 유리관을 진탕 인큐베이터에서 깨끗한 벤치로 옮깁니다.

일회용 큐벳에서 M63을 버리고 p1000과 동일한 일회용 큐벳에 1, 000마이크로리터의 배양액을 추가합니다. 그런 다음 세포 배양의 광학적 탁도를 측정합니다. 다음으로, 멸균된 60%글리세롤 용액 250마이크로리터와 선택한 세포 배양 750마이크로리터를 1.5ml 마이크로튜브에 첨가하고 피펫팅으로 혼합합니다.

나머지 9개의 마이크로튜브를 마이크로튜브 스탠드에 놓고 준비된 혼합물 100마이크로리터를 각 튜브에 분배합니다. 재고는 섭씨 80도의 급속 냉동고에 보관하십시오. 마이크로플레이트 리더를 설정하려면 먼저 소프트웨어를 열고 작업 관리자에서 프로토콜을 연 다음 새로 만들기를 선택합니다.

그런 다음 표준 프로토콜을 선택합니다. 절차를 열고 설정을 조정하십시오. 설정 온도를 열고 인큐베이터를 켭니다.

그런 다음 온도를 섭씨 37도로 설정하고 그라디언트를 섭씨 0도로 설정합니다. 다음 단계를 계속하기 전에 예열을 확인하십시오. 오픈 스타트 키네틱을 선택하고 실행 시간을 24분 또는 48분으로 설정한 다음 간격을 30분 또는 1시간으로 설정합니다.

흔들림을 열고 흔들림 모드를 선형으로 설정합니다. 연속 흔들림을 확인하고 주파수를 567cpm으로 설정합니다. 다음으로, open read를 확인하고 흡광도, 종말점/kinetic 및 monochromators를 확인합니다.

파장을 600으로 설정합니다. 마지막으로 유효성 검사를 클릭하여 절차가 올바른지 확인합니다. 그리고 저장을 클릭하여 나중에 사용할 수 있도록 새 프로그램으로 저장합니다.

성장을 실시간으로 기록하려면 약 25ml의 M63을 멸균된 시약 저장소에 추가합니다. 그런 다음 연속 희석을 준비하기 위해 900마이크로리터의 M63을 마이크로튜브에 추가합니다. 다음으로, 900마이크로리터의 M63을 해동된 글리세롤 스톡과 와류에 추가합니다.

10배 희석 중 100마이크로리터를 900마이크로리터의 M63 및 와류를 포함하는 다른 마이크로튜브로 옮깁니다. 원하는 희석 수에 도달할 때까지 이 단계를 반복합니다. 이제 8채널 피펫을 사용하여 멸균된 96웰 평평한 바닥 마이크로플레이트의 가장자리에 있는 웰에 200마이크로리터의 M63을 채웁니다.

200마이크로리터의 희석된 샘플을 참조 표에 따라 마이크로플레이트 웰에 로드합니다. 가열 및 파종 효율로 인한 층의 할당을 피하려면 샘플에 대해 마이크로플레이트 가장자리에 있는 웰을 사용하지 말고 동일한 샘플을 마이크로플레이트의 다양한 위치에 있는 여러 웰에 로드하십시오. 96웰 마이크로플레이트를 플레이트 리더에 놓습니다.

지금 읽기 및 작업 관리자를 열고 프로그램을 선택하십시오. 확인을 클릭하여 측정을 시작합니다. 마지막으로 데이터 분석을 위해 기록을 새 실험 파일로 저장합니다.

다음은 실험을 수행하기 전에 만든 참조 테이블의 예입니다. 96웰 플레이트(96 well plate)는 96웰 플레이트에서 접종된 배양 샘플의 위치를 나타내기 위해 8 x 12 테이블로 그려졌습니다. 성장률은 OD600의 모든 연속 값 쌍에 대해 방정식을 적용하여 계산됩니다.

최대 성장률을 추정하기 위해 5회 연속 성장률의 평균과 표준편차를 계산하였다. 총 60개의 세포 배양의 성장률이 표시된 히트 맵으로 표시됩니다. 흰색에서 빨간색으로 저하되는 것은 낮은 것에서 높은 것으로 성장률을 나타냅니다.

일단 숙달되면 이 기술을 적절하고 순서대로 수행하면 몇 분 안에 완료할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 고처리량 방식으로 박테리아 성장을 매우 정밀하게 측정하기 위해 샘플을 준비하고 마이크로플레이트에 로드하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 저밀도의 세포 배양을 피하고 세포가 24시간 이내에 성장하기 시작하는지 확인하기 위해 실험을 수행하기 전에 참조 테이블을 만드는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 실험 조작의 자동화 및 계산 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 개체군 번식에 대한 결정 요인 및 역학과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 시스템 생물학 및 미생물학 분야의 연구자들을 위한 길을 열었습니다. 세포 성장의 기본 원리를 탐구하고 배양 배지의 구성을 최적화합니다.