세균성 성장의 정확한, 높은 처리량 분석

이 실험의 전반적인 목표는 고처리량 방식으로 박테리아 성장을 정밀하게 분석하는 것입니다. 이 절차를 통해 여러 가지 배지 또는 다양한 균주를 동시에 테스트할 수 있습니다. 이 방법은 세포 성장의 결정 요인이 무엇인지와 같은 시스템 생물학 및 미생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 연구자가 세균 세포의 성장 곡선에서 최대 성장률과 최대 개체군 밀도라는 전역적 파라미터를 정밀하게 평가할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 e. Coli 성장에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 환경 세균의 성장 분석 및 스크리닝과 같은 다른 미생물에게도 적용될 수 있습니다.

먼저, 실리콘 고무 마개가 달린 멸균 유리관 5개와 피펫, 그리고 대상 균주를 클린 벤치 위에 준비합니다. 실리콘 고무 마개를 열기 전, 유리관 입구를 분젠 버너의 불꽃에 노출시킵니다. 유리관을 연 후에는 실리콘 고무 마개를 불꽃에 노출시킨 다음, 유리관의 캡을 다시 가볍게 닫습니다.

다음으로, 전자 피펫과 일회용 혈청 피펫을 사용하여 유리 튜브 하나에 M63 5 mL를 넣고, 나머지 4개의 튜브에는 M63 4.5 mL를 넣습니다. p200 팁을 사용하여 콜로니를 채취한 후, M63 5 mL가 들어 있는 유리 튜브에 접종합니다. 튜브를 볼텍싱하여 현탁액을 만듭니다.

그런 다음, 이 용액 0.5 milliliters를 M63 4.5 milliliters가 들어 있는 4개의 튜브 중 하나로 옮겨 용액을 10배 희석합니다. 나머지 튜브들에 대해서도 이 과정을 반복합니다. 유리 튜브의 입구와 실리콘 고무 마개를 멸균한 후, 마개로 튜브를 밀봉합니다.

그런 다음, 5개의 튜브를 37 °C로 예열된 진탕 배양기에 넣고 200 rpm으로 흔들어 줍니다. 하룻밤 또는 10에서 30시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 p1000 피펫을 사용하여 일회용 큐벳에 M63 1,000 µL를 넣습니다.

일회용 큐벳을 분광광도계에 넣습니다. 600 nanometers의 고정 파장에서 프로그램을 시작하고 블랭크를 측정합니다. 쉐이킹 인큐베이터에서 유리 시험관 5개를 꺼내 클린벤치로 옮깁니다.

일회용 큐벳에서 M63을 제거하고, p1000을 사용하여 동일한 일회용 큐벳에 배양액 1,000 µL를 넣습니다. 그다지 세포 배양액의 광학적 탁도를 측정합니다. 다음으로, 1.5 mL 마이크로튜브에 멸균된 60% glycerol 용액 250 µL와 선택한 세포 배양액 750 µL를 넣고 피펫팅하여 혼합합니다.

나머지 9개의 마이크로튜브를 마이크로튜브 랙에 세우고, 준비된 혼합물 100 µL를 각 튜브에 분주합니다. 스톡 용액을 -80 °C 초저온 냉동고에 보관하십시오. 마이크로플레이트 리더를 설정하려면, 먼저 소프트웨어를 실행하고 작업 관리자에서 프로토콜을 연 뒤 '새로 만들기'를 선택합니다.

그런 다음, 표준 프로토콜을 선택하십시오. 절차를 열고 설정을 조정합니다. 온도 설정을 열고 인큐베이터 켜짐을 선택하십시오.

그런 다음, 온도를 37 °C로 설정하고 그라디언트를 0 °C로 설정합니다. 다음 단계로 넘어가기 전에 예열 상태를 확인하십시오. 키네틱 시작(start kinetic)을 열고 실행 시간을 24분 또는 48분으로 설정한 후, 간격을 30분 또는 1시간으로 설정합니다.

쉐이킹(shake) 설정을 열고 쉐이킹 모드를 선형(linear)으로 설정하십시오. 연속 쉐이킹(continuous shake)을 확인하고 주파수를 567 cpm으로 설정하십시오. 다음으로 읽기(read) 설정을 열어 흡광도(absorbance), 엔드포인트/키네틱(endpoint/kinetic) 및 모노크로메터(monochromators)를 확인하십시오.

파장을 600으로 설정하십시오. 마지막으로, validate를 클릭하여 절차가 정확한지 확인합니다. 그리고 save를 클릭하여 향후 사용할 수 있도록 새로운 프로그램으로 저장하십시오.

성장을 실시간으로 기록하려면, 멸균된 시약 저장조에 M63 약 25 milliliters를 넣습니다. 그다음, 연속 희석 준비를 위해 마이크로튜브에 M63 900 microliters를 넣습니다. 이어서, 해동된 글리세롤 스톡에 M63 900 microliters를 넣고 볼텍싱합니다.

10배 희석액 100 µL를 M63 900 µL가 들어 있는 다른 마이크로튜브에 옮기고 볼텍싱합니다. 원하는 희석 배수가 될 때까지 이 단계를 반복합니다. 이제 8채널 피펫을 사용하여 멸균된 96-웰 평底 마이크로플레이트의 가장자리 웰에 M63 200 µL를 채웁니다.

참조 표에 따라 희석된 각 샘플 200 µL를 마이크로플레이트 웰에 분주합니다. 가열로 인한 층 분리와 시딩 효율을 방지하기 위해, 마이크로플레이트의 가장자리 웰은 샘플에 사용하지 말고 동일한 샘플을 마이크로플레이트의 다양한 위치에 있는 여러 웰에 분주하십시오. 96-웰 마이크로플레이트를 플레이트 리더기에 넣습니다.

ReadNow 및 작업 관리자를 열고 프로그램을 선택하십시오. 확인을 클릭하여 측정을 시작합니다. 마지막으로, 데이터 분석을 위해 녹화 내용을 새로운 실험 파일로 저장하십시오.

여기에 실험 수행 전에 작성한 참조 표의 예시가 제시되어 있습니다. 96웰 플레이트의 픽토그램을 8x12 표로 그려 96웰 플레이트상에 접종된 배양 시료의 위치를 표시하였습니다. 성장률은 모든 연속된 OD600 값의 쌍에 해당 공식을 적용하여 계산합니다.

최대 성장률을 추정하기 위해 5회 연속 성장률의 평균과 표준 편차를 계산하였습니다. 총 60개 세포 배양물의 성장률을 표시된 히트맵으로 나타내었습니다. 흰색에서 빨간색으로 변하는 색상 단계는 성장률이 낮음에서 높음으로 이어짐을 나타냅니다.

이 기술을 숙달하면, 적절한 순서에 따라 올바르게 수행할 경우 몇 분 내에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 고처리량 방식으로 박테리아 성장을 정밀하게 측정하기 위해 마이크로플레이트에 샘플을 준비하고 로딩하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도할 때, 세포 배양 밀도가 너무 낮아지는 것을 방지하고 세포가 24시간 이내에 성장을 시작하도록 하기 위해 실험 전 참조 표를 작성하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.

이 절차에 따라 실험 조작의 자동화 및 컴퓨터 분석과 같은 다른 방법들을 수행하여, 집단 증식 및 역학의 결정 요인이 무엇인지와 같은 추가적인 질문들에 답할 수 있습니다. 개발 이후, 이 기술은 시스템 생물학 및 미생물학 분야의 연구자들에게 길을 열어주었으며, 세포 성장의 기본 원리를 탐구하고 배양 배지의 조성을 최적화하는 데 기여하였습니다.