Name: 마우스 망막 Arterioles Ex Vivo 에서 반응의 측정을 위한 준비 단계 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 배우세요 마우스 망막 동맥 반응성 측정을 위한 비디오 현미경법을. 이 기법은 망막 혈류 조절 및 안과 질환의 병태생리학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 도이치 Ophthalmologische 분야 (개)와 에른스트 und Berta Grimmke 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

이 연구의 실험 절차에 의해는 동물 관리 위원회의 라인란트-Palatinate, 독일 승인 되었다. 동물 보호 안과에서 동물의 사용에 대 한 비전과 안과 (ARVO) 성명에서 연구 및 비전 연구 기관 지침 및 협회에 맞 췄 나. 동물 동물 실험에 대 한 EU 지침 2010/63/EU에 따라 치료 했다. 남성 C57BL/6J 쥐 (The 잭슨 실험실, 바 하버, 나, 미국) 3-4 개월을 세는 실험을 위해 사용 되었다. 동물 표준 조건 (온도 23 ± 2 ° C, 습도 범위 55 ± 10% 및 12 h 명암 주기), 유 숙 했다 그리고 표준 마우스 차 우와 물 광고 libitum에 접근 했다.
1입니다. 마우스 망막의 분리
<ol><li>해 부 악기를 준비 테이블에 놓고 모든 악기 가능 빠른 준비 완료 확인 합니다.</li>
	<li>CO2 흡입에 의해 마우스를 희생.</li>
	<li>스틸가 위 마우스를 목을 벨, 두개골 sagitally가 위의 동일한 쌍을 사용 하 여 두 개의 반쪽으로 잘라 고 피부와 뇌 눈이 위 (그림 1)를 사용 하 여 제거 합니다.</li>
	<li>눈이 위를 사용 하 여 궤도 뼈를 떠나 두개골 뼈를 잘라.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 Krebs Henseleit 버퍼를 포함 하는 해 부 접시에 궤도 전송 합니다.</li>
	<li>얼음에 해 부 접시를 유지 하거나 변경할 버퍼 마다 10 분.</li>
	<li>눈이 위를 사용 하 여 궤도 뼈를 잘라내어 눈 지구 궤도 조직 유형 4 정밀 핀셋과 학생 욕실이 봄이 위 (그림 2)를 사용 하 여 함께 제거.</li>
	<li>부드럽게 Harderian 선, 결합 조직, 그리고 안구 근육 유형 5 정밀 핀셋과 안과 동맥의 주요 분기를 손상 하지 않도록 주의 복용 욕실이 capsulotomy가 위를 사용 하 여 제거 합니다.</li>
	<li>궤도 안과 동맥의 지점과 결국 10-0 나일론 봉합 (그림 3)를 사용 하 여 안과 동맥의 주요 지점의 인접 끝 선.</li>
	<li>10 s 사용 하 여 입력 4 정밀 핀셋에 대 한 70% 에탄올을 포함 하는 배양 접시에 눈 세계를 전송 합니다. 해 부 접시에 다시 눈 지구를 놓고 신선한 Krebs 솔루션으로 버퍼를 대체 합니다. 각 막 에탄올 노출 후 약간 흰 나타납니다.</li>
	<li>주변 막 30 게이지 바늘으로 찔린 고 욕실이 capsulotomy가 위를 사용 하 여 각 막 해 부. 부드럽게 잘라 아이리스 조직, 맥락 막과 망막 사이 욕실이 capsulotomy가 위 한 날카로운 시점 놓고 맥락 막 및 공 막 잘라. (그림 4) 시 신경 주위 scleral 조직 일부를 남겨 주세요.</li>
</ol>2. 망막 관류 챔버에 장착
참고: 망막 되 실험을 위해 사용 하는 관류 챔버는 집에서 만든. -및 유출 관 (그림 5)와 함께 투명 한 저수지 그것에 의하여 이루어져 있다. 실리콘 튜브의 한쪽 끝은 histoacryl 접착제와 3 방향 자 지에 연결 된 반대쪽 챔버의 바닥에 붙어 됩니다. 3 방향 자 지에 신선한 Krebs 버퍼를 포함 하는 주사기를 연결 하 고 버퍼와 튜브를 작성.
<ol><li>바늘 홀더를 가진 유리 제 micropipette 고 관류 챔버의 하단 튜브의 끝에 그것을 밀어. 다음 100 µ m 직경의 팁을 얻기 위해가 위 종류 4는 micropipette의 팁을 휴식.</li>
	<li>micropipette 끝에 집중 하 고 통해 주사기 튜브에 연결 그것을 플러시. 모 세관 파편에 의해 가려진 하지 주의. 폐색, 경우 그것을 제거 하 고 튜브를 플러시 다른 micropipette 삽입.</li>
	<li>차가운 Krebs 버퍼 관류 챔버와 스테레오 현미경 챔버를 넣어.</li>
	<li>관류 챔버에 투명 한 플라스틱 플랫폼을 놓습니다. 이 플랫폼은 시 신경 및 눈 동맥에 대 한 1.8 m m 폭의 들여쓰기 하 고 1.6 m m 직경의 2 개의 강철 와이어에 배치 됩니다. 다음, 2.8 m m 내경 및 플랫폼에 4.0 m m 외부 직경의 스테인레스 스틸 반지 장소.</li>
	<li>숟가락을 사용 하 여 주의 해 부 챔버 관류 챔버로 망막 시 신경 및 연결 된 안과 동맥 전송. 이 단계는 가능성을 방지 하기 위해 중요 한 조직의 스트레칭으로 실험에 해로운 수 있습니다.</li>
	<li>안과 동맥의 근 위 끝의 sutured 부분을, 장소는 micropipette에 10-0 나일론 봉합의 두 미리 형성한 루프 잘라내어는 micropipette와 안과 동맥을 cannulate. Micropipette (그림 6)에 동맥 고 괜 찮 아 요-포인트-핀셋을 사용 하 여 투명 한 플랫폼에 망막을 놓습니다.</li>
	<li>부드럽게 두 괜 찮 포인트 핀셋으로 앞쪽 렌즈 capsula을 열고 눈물, 렌즈를 꺼내와 microscissors를 사용 하 여 전체 렌즈 capsula를 잘라.</li>
	<li>그 후, 망막 시 신경에 동위 플에서 절반 거리에 4 개의 방사형 절 개를 확인 하 고 바닥에 그것을 해결 하기 위해 망막에는 스테인레스 스틸 반지를 배치. 망막은 이제 실험 (그림 7)에 대 한 준비.</li>
</ol>3. 실험에 대 한 망막 Arterioles의 준비
<ol><li>가벼운 현미경 관류 챔버를 놓습니다. 목표는 100 X 물 침수 렌즈입니다.</li>
	<li>Pericyclic 펌프는 두 개의 튜브에 대 한에-및 아웃-flow를 연결 하 고 95% O2 산소 하 고 37 ° c.에 5% CO2 탄산 Krebs 버퍼와 챔버를 순환 100 사이 120 mL/min 유량을 사용 합니다.</li>
	<li>저수지 실리콘 호스를 통해 3 방향 자 지에는 micropipette에 연결 된 실리콘 튜브를 연결 합니다. 그런 다음 Krebs 버퍼 높이 50 mm Hg에 해당 하는 저수지를 채울 하지만 3 방향 자 지 아직 열지 마십시오.</li>
	<li>현미경과 망막 표면에 초점의 목표 통해 보세요. 혈관 또는 붉은 혈액 세포에 대 한 검색. 혈관은 완전히 붕괴, 그래서 때로는 일부 붉은 혈액 세포를 볼 수 있습니다만 가능 하다.</li>
	<li>혈관 발견 되 면 그것에 집중 하 고 3 방향 자 지를 엽니다. 혈관의 직경은 즉시 증가 해야 하 고 붉은 혈액 세포 이동 중 배, 한 되는 경우 또는 centripetally는 venule 경우. arterioles 직경 venules의 순서에 비해 작은 수 있습니다.</li>
	<li>잘 보이는 벽 혈관 발견 되 면 그것은 30 분 (그림 8)의 재래식 기간 뒤 실험에 대 한 사용할 수 있습니다. 재래식 기간 동안는 arterioles 결과 luminal 직경 감소 10% 미만에 약한 내장 음색을 개발 합니다.</li>
</ol>4. 실험 수행
<ol><li>목욕 솔루션에 추가 하 여는 thromboxane 모방 9,11-미치기-9α, 11α methanoepoxy 스타 글란 딘 F2α (U46619)와 혈관의 생존 능력을 테스트 합니다. 이 에이전트는 ≥ 10의 농도에서 휴식 하는 직경에서 약 50% 마우스 망막 arterioles 수축-6 M.</li>
	<li>일단 그릇은 가능한 확인, 순환 펌프에 의해 목욕에서 길 항 제를 세척 하 고 목욕으로 신선한 Krebs 버퍼를 공급.</li>
</ol>

<ol><li>Toda, N., Nakanishi-Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide%3A+ocular+blood+flow%2C+glaucoma%2C+and+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy.</a> Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).</li>
<li>Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography-based+retinal+vessel+analysis+for+the+evaluation+of+hypertensive+vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography-based retinal vessel analysis for the evaluation of hypertensive vasculopathy.</a> Acta Ophthalmol. 93 (2), e148-e153 (2015).</li>
<li>Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+perfusion+pressure+and+ocular+blood+flow+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma.</a> Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).</li>
<li>Faraci, F. M., Sigmund, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+biology+in+genetically+altered+mice+%3A+smaller+vessels%2C+bigger+insight%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight.</a> Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).</li>
<li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Retinal+Blood+Flow+Using+Fluorescently+Labeled+Red+Blood+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells.</a> eNeuro. 2 (2), (2015).</li>
<li>Guevara-Torres, A., Joseph, A., Schallek, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label+free+measurement+of+retinal+blood+cell+flux%2C+velocity%2C+hematocrit+and+capillary+width+in+the+living+mouse+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Label free measurement of retinal blood cell flux, velocity, hematocrit and capillary width in the living mouse eye.</a> Biomed Opt Express. 7 (10), 4229-4249 (2016).</li>
<li>Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+topography+of+retinal+pericytes+in+the+living+mouse+retina+using+in+vivo+adaptive+optics+imaging+and+ex+vivo+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8237-8250 (2013).</li>
<li>Gericke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+muscarinic+acetylcholine+receptor+subtype+mediating+cholinergic+vasodilation+in+murine+retinal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of the muscarinic acetylcholine receptor subtype mediating cholinergic vasodilation in murine retinal arterioles.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7479-7484 (2011).</li>
<li>Gericke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+alpha1-adrenoceptor+subtypes+in+murine+ophthalmic+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Functional role of alpha1-adrenoceptor subtypes in murine ophthalmic arteries.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4795-4799 (2011).</li>
<li>Bohmer, T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24749494">The alpha(1)B -adrenoceptor subtype mediates adrenergic vasoconstriction in mouse retinal arterioles with damaged endothelium.</a> Br J Pharmacol. 171 (16), 3858-3867 (2014).</li>
</ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사 있다.

마우스 망막에 혈관 반응의 측정은 망막 혈관의 작은 크기 때문에 도전 이다. 제시 기법으로 망막 arterioles 전송된 가벼운 현미경 검사 법에 의해 시각화 됩니다. 이 격리 된 망막은 반투명 하기 때문에 가능 하다. 기술의 장점은 높은 광학 해상도입니다. 계산된 공간 해상도 11 픽셀 / µ m 이다. 그러나, 하얀 빛을 사용 하 여이 광 시스템에 대 한 실제 해상도 Abbe 회절 한계에 의해 설명 된다 200, 300 nm 사이입니다. 마우스 망막 arterioles의 첫 번째 분기에는 20 ~ 30 μ m의 내부 직경, 이후 약 1%의 직경 변화가이 시스템으로 알 수 있습니다. 작은 망막 arterioles5,,67시각화에 추가 기술 장치 또는 다른 연구에서 보고 형광 염료의 필요가 있다. 기술의 단점은 훈련 된 수 사관 90 ~ 120 분 사이 긴 준비...

망막 관류에 장애 당뇨병 성 망막 증, 고혈압 성 망막 증, 녹 내장1,2,3등 다양 한 안구 질환의 병 인에 연루 되었습니다. 따라서, 망막 혈관 반응성을 측정 하기 위한 연구는 이러한 질병의 병 태 생리학을 이해 하는 것이 중요 하 고 접근 새로운 치료를 개발 하.
Murine 게놈에서 유전자 조작의 가능성으로 인해 마우스4심장 혈관 시스템 연구에 대 한 널리 사용 되는 동물 모델 되고있다. 그러나, 망막 혈관 (≤ 30 µ m)의 작은 크기 때문에 측정 마우스 망막 혈관 반응성의 도전 이다. 예를 들어 stereomicroscopic vivo에서 측정을 위한 그들의 광학 해상도 제한 기술과 따라서 ≤ 30 µ m 직경 장비 될 때 보다는 더 적은의 작은 피에 지름 또는 혈액 흐름에 변화를 정확 하 게 탐지를 허용합니다 confocal 현미경 또는 적응 광학 스캔 빛 Ophthalmoscope5,6형광 염료를 사용 하 여 같은 추가 정교한 장치 합니다. 또한, 해석 vivo 측정 지역 식별 목적으로 조직 혈압과 retrobulbar 혈관의 영향 변화 신호 망막 혈관에서 메커니즘 마 취약에 의해 혼동 될 수 있습니다.
따라서, 우리는 ex vivo높은 광학 해상도와 마우스 망막 혈관의 반응을 측정 하는 방법을 개발 했다. 여기에 소개 하는 기술 망막 arterioles 통해 전송 가벼운 현미경 검사 법의 시각화 수 있습니다. 이 메서드를 사용할 수 있는 또한 쥐에, 안구 혈관 연구에서 기술을 대상으로 하는 유전자의 장점에 대 한 액세스를 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>강철 가위</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3576.1</td><td>1x 140 mm</td></tr><tr><td>눈 가위</td><td>Geuder</td><td>G-19390</td><td>1x 스트레이트, 10.5cm</td></tr><tr><td>정밀 핀셋, 가는 팁이 있는 스트레이트</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>LH68.1</td><td>2x 타입 4</td></tr><tr><td>정밀 핀셋, 엑스트라 파인 팁이 있는 스트레이트</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>LH53.1</td><td>2x 타입 5</td></tr><tr><td>Vannas 캡슐 절개술 가위</td><td>Geuder</td><td>19760</td><td>1x 직선, 77mm</td></tr><tr><td>학생 Vannas 스프링 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>91501-09</td><td>1x 곡선,</td></tr> <tr><td>Barraquer 바늘 홀더</td><td>Geuder</td><td>G-17500</td><td>1x 곡선, 120mm</td></tr><tr><td>바늘</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td></td><td>305128 1x 30G</td></tr><tr><td>유리 모세 필라리 (마이크로 피펫 생산 용)</td> <td>Drummond Scientific Company</td><td>9-000-1211</td><td>1x (1.2 x 0.8 mm, 외경/내경)</td></tr><tr><td>나일론 봉합</td>사 <td>Alcon</td><td>198001</td><td>1x 10-0</td></tr><tr><td>Nunclon 세포 배양 접시</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>153066 1x 35 mm 직경</td></tr><tr><td>Nunclon 세포 배양 접시</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>172931</td><td>1x 100 mm 직경</td></tr><tr><td>Discofix C</td><td>Braun</td><td>16500C</td><td>10 cm</td></tr><tr><td>Histoacryl 접착제</td><td>B. 브라운 외과, S.A.</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pericyclic pump&nbsp; (싸이클로 II)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>EP76.1</td><td>1x</td></tr><tr><td>수직 피펫 풀러 모델 700C</td><td>David Kopf Instruments</td><td></td><td>1x</td></tr><tr><td>현미경(Vanox-T AH-2)</td><td>Olympus</td><td></td><td>1x</td></tr><tr><td>침수 대물렌즈 LUMPlanFL, 1.0 NA</td><td>Olympus</td><td></td><td>1x</td></tr><tr><td>디지털 카메라(TK-C1381)</td><td>JVC</td><td></td><td>1x</td></tr><tr><td>관류 챔버</td><td>자체 제작</td><td></td><td>1배</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>><Drugs and Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>K928.4</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물(CaCl2)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>5239.1</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨 (KCl)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>인산이수소칼륨 (KH2PO4)</td><td>Carl Roth</td><td>GmbH 3904.2</td><td></td></tr><tr><td>황산마그네슘 (MgSO4)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>261.2</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨 (NaCl)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9265.2</td><td></td></tr><tr><td>탄산 수소 나트륨 (NaHCO3)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>0965.3</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-(D)-(+)- 포도당 일수화물</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6780.1</td><td></td></tr><tr><td>9,11-dideoxy-9&alpha;,11&alpha;-methanoepoxy prostaglandin F2&alpha; (U-46619)</td><td>케이맨 화학</td><td>16450</td><td></td></tr><tr><td>아세틸 콜린 클로라이드</td><td>시그마 Aldrich</td><td>A6625-25G</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 망막 arterioles ex vivo 에서 반응의 측정을 위한 준비 단계

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

혈관 불충분 그리고 정상 망막 관류 변경 다양 한 시력을 위협 하 고 안구 질환, 당뇨병 성 망막 증, 고혈압 성 망막 증 및 녹 내장 등의 병 인에 대 한 주요 요인 중입니다. 따라서 망막 microvascular 준비 중추적인 도구 기본 병 태 생리 기계 장치 윤곽을 그리 다 생리 및 약리 연구 및 질병에 대 한 치료를 디자인 하는. 안과 연구에 마우스 모델의 광범위 한 사용에도 불구 하 고 망막 혈관 반응성에 대 한 연구는이 종에서 부족. 이 불일치에 대 한 주요 이유는 도전적인 격리 절차는 이러한 망막 혈관의 작은 크기 때문 ~ luminal 직경에서 ≤ 30 µ m. 기능 연구에 대 한 이러한 망막 microvessels의 직접 분리의 문제를 회피, 우리 ex vivo 마우스 망막 vasoactivity 근처 생리 적 조건 하에서 연구를 가능 하 게 절연 및 준비 기술 설립 . 현재 실험 준비 특히 마우스 망막 arterioles를 참조 것입니다, 하지만이 방법은 쉽게 사용할 수 있습니다 microvessels에 쥐에서.

U-46619 농도-종속 vasoconstrictor 응답 망막 arterioles 야생-타입 마우스 C57Bl/6J 배경에서 생산. 10-6 M의 농도에서 luminal 직경에서 감소는 휴식 직경에서 ≈50 %를 했다. 그림 9A 한 망막 되의 대표적인 농도-응답 곡선을 보여 줍니다. U46619와 preconstricted arterioles에 아 세 틸 콜린의 누적 관리 갖는 luminal 직경 농도 의존 증가 ≈25 %를 10-5 M, 그대로 혈관 내 피 (지표에 preconstricted 직경에서 그림 9B)입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_u...

많은 비전을 위협 눈 질병 장애 망막 microvessels와 연결 됩니다. 따라서, 망막 되 응답의 측정은 기본 병 태 생리 기계 장치를 조사 하는 것이 중요. 이 문서에서는 마우스 망막 되 격리와 혈관 직경에 vasoactive 물질의 효과 평가 하기 위해 준비에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다.

마우스 망막 Arterioles Ex Vivo 에서 반응의 측정을 위한 준비 단계

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

이 망막 준비법의 전반적인 목표는 비디오 현미경을 사용하여 마우스 망막 동맥의 반응성을 측정하는 것입니다. 이 방법은 망막 혈류 조절 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있으며, 다양한 안과 질환의 병태생리학적 이해를 증진하는 데 기여할 수 있습니다. 이 새로운 기술의 주요 장점은 매우 높은 광학 해상도로 망막 혈관의 반응성을 측정할 수 있다는 점입니다.동시에, 이 방법은 정밀한 장비가 많이 필요하지 않습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 사람들은 안동맥과 그 분지들을 찾기가 어려워 고생할 수 있습니다. 저의 연구실 대학원생인 Jenia Kouchek Zadeh 및 Wael Omran과 함께 이 절차를 시연하겠습니다.필요한 기구들을 배치하여 실험 절차를 준비합니다. 그런 다음 강철 가위를 사용하여 마우스의 두개골을 시상면으로 이등분하고, 안과용 가위를 사용하여 피부와 뇌를 제거합니다. 안과용 가위로 안와골만 남을 때까지 두개골을 제거한 후, 수술 현미경 하에서 얼음 위에 놓인 차가운 Krebs-Henseleit 버퍼가 담긴 해부 접시에 안와를 옮깁니다.안과용 가위로 안와골을 절개하고, 4번 정밀 핀셋과 학생용 Vanna 스프링 가위를 사용하여 안구와 안와 조직을 조심스럽게 제거합니다. 5번 정밀 핀셋과 Vanna낭 절개 가위를 사용하여 안동맥의 주분지를 손상시키지 않도록 주의하며 하더리안샘, 결합 조직 및 외안근을 조심스럽게 제거합니다. 10-0 Nylon 봉합사를 사용하여 안동맥 주분지의 근위단에 있는 안와 분지들을 결찰하고, 4번 정밀 핀셋을 사용하여 안구를 70% ethanol이 담긴 페트리 접시로 옮깁니다.실험 중 누출을 방지하기 위해 안동맥의 모든 안와 분지를 결찰하는 것이 매우 중요합니다. 10초 후, 안구를 해부 접시로 되돌립니다. 에탄올 노출로 인해 각막이 하얗게 보일 것입니다.완충액을 신선한 Krebs 용액으로 교체한 후, 현미경과 3게이지 바늘을 사용하여 각막 주변부를 찌릅니다. Vannas 백내장 절개 가위를 사용하여 각막을 박리하고 홍채 조직을 조심스럽게 잘라냅니다. 그런 다음 Vannas 백내장 절개 가위의 날카로운 끝 하나를 맥락막과 망막 사이에 넣고 맥락막과 공막을 잘라냅니다.망막을 맞춤 제작된 관류 챔버에 장착하려면, 먼저 니들 홀더를 사용하여 팁 직경이 100 µm인 유리 마이크로피펫의 끝부분을 챔버의 실리콘 튜브 안으로 밀어 넣으십시오. 그런 다음 튜브의 반대쪽 끝에 시린지를 연결하여 마이크로피펫 팁에 있는 이물질을 씻어냅니다. 관류 챔버를 차가운 Krebs 버퍼로 채우고 챔버를 실체현미경 아래에 배치하십시오.관류 챔버 내에 1.6 mm 직경의 강철 와이어 두 개 위에 1.8 mm 깊이의 홈이 있는 투명 플라스틱 플랫폼을 배치하고, 플랫폼 위에 스테인리스 스틸 링을 놓습니다. 스푼을 사용하여 안동맥이 부착된 상태의 시신경이 포함된 망막을 플랫폼 위로 옮기고, 봉합된 안동맥 끝부분을 제거합니다. 10-0 Nylon 봉합사로 만든 루프 두 개를 마이크로피펫에 걸고, 봉합사를 이용해 동맥을 마이크로피펫에 고정합니다.미세 팁 핀셋 하나를 사용하여 망막을 투명 플랫폼 위에 배치하고, 다른 미세 팁 핀셋을 사용하여 전방 수정체 낭을 조심스럽게 찢어 엽니다. 수정체를 꺼낸 후 미세 가위로 수정체 낭 전체와 유리체를 제거합니다. 그런 다음 평평부(pars plana)에서 시신경까지 거리의 절반 지점에서 망막에 4개의 방사형 절개를 가하고, 스테인리스 스틸 링을 망막 위에 놓아 망막을 플랫폼에 고정합니다.망막 소동맥을 분석하기 위해, 관류 챔버를 광학 현미경 아래로 옮기고 100배 수침 대물렌즈를 선택합니다. 파라사이클릭 펌프의 유입구와 유출구 포트에 튜브를 연결하고, 95% 산소로 산소화하고 5% 이산화탄소로 탄산화한 37 °C Krebs 완충액으로 챔버를 순환시킵니다. 마이크로피펫이 장착된 실리콘 튜브를 3방향 콕(three-way stopcock)을 통해 저장소 실리콘 호스에 연결하고, 저장소에 Krebs 완충액을 50 mmHg 높이에 해당하도록 채웁니다.대물렌즈를 사용하여 망막 표면에 수동으로 초점을 맞추고 혈관이나 적혈구를 찾습니다. 혈관이 발견되면 혈관에 초점을 맞춘 뒤 3방향 스톱콕을 엽니다. 그러면 혈관의 직경이 즉시 증가하며 적혈구가 나타나야 합니다.30분간의 평형 시간을 거치면, 세동맥은 내경 감소율이 10% 미만인 약한 내인성 긴장도를 나타내게 됩니다. 욕조 용액에 마우스 망막 수축 시약을 첨가하여 혈관의 생존 능력을 확인하십시오. 그 다음, 펌프를 작동시켜 욕조 내의 작용제를 씻어내고 챔버에 신선한 Krebs 완충액을 추가하십시오.이 대표 실험에서, thromboxane 유사체인 U46619는 야생형 C57Bl/6J 마우스의 망막 세동맥에서 농도 의존적인 혈관 수축 반응을 유도하였으며, 1 × 10⁻⁶ M 농도에서 휴지기 내강 직경의 약 50% 감소가 나타났습니다. 작용제로 사전 수축된 세동맥에 acetylcholine을 누적 투여한 결과, 1 × 10⁻⁵ M acetylcholine 농도에서 사전 수축된 직경의 약 25%까지 농도 의존적인 내강 직경 증가가 유발되었으며, 이는 혈관 내피세포가 온전함을 나타냅니다. 이 기술을 숙달하고 적절하게 수행한다면 90분에서 120분 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때, 안구의 안구 내강을 열기 전 안동맥의 뒤틀림을 방지하기 위해 모든 안와후 동맥 분지들을 결찰하여 안구를 에탄올에 침전시켜야 하며, 마지막으로 유리 미세피펫 팁의 폐쇄 여부를 확인해야 함을 기억하십시오. 이 영상을 시청한 후에는 in vitro 비디오 현미경을 이용한 동맥 측정을 위해 마우스 망막을 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

preparation-steps-for-measurement-reactivity-mouse-retinal-arterioles

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

망막 질환의 동물 모델에서 혈액-망막 장벽 투과성과 내부 제한 막 무결성을 조사하기 위해 여러 아데노 관련 바이러스(AAV) 변종을 망막 뉴런과 신경교세포를 라벨링하는 도구로 사용했습니다. 그런 다음 바이러스 매개 리포터 유전자 발현을 망막 장벽 투과성의 지표로 사용합니다.

도구로 아데노 관련 바이러스를 사용하여 질병 망막 장벽을 연구하는

이 원고는 arterioles, electrophysiological 칼슘 이미징 및 압력 myography 연구에 사용 될 수 있는 쥐 망막에서의 격리에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다.

Ex Vivo 세포 생리학 연구에 대 한 망막 Arterioles의 절연

이 기술은 산소 소비와 세포 외 산성화 속도 explanted 마우스 망막 조직 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 실시간으로 녹음을 설명 합니다.

Explanted 망막 조직 세포 외 유출 분석을 사용 하 여 신진 대사 에너지의 측정

산소 유발 망막병증(OIR)은 미숙아 및 증식 성 당뇨병 망막증의 망막병증과 같은 허혈성 망막 질환을 모델링하고 신생아 질환에 대한 항 혈관 신생 약물을 평가하는 개념 증명 연구의 모델로 사용될 수 있다. OIR는 정량화 될 수있는 망막에서 견고하고 재현 가능한 신생 혈관화를 유도합니다.

설치류에 있는 허혈성 망막 질병을 위한 산소 유도한 망막병증 모형

이 프로토콜은 망막 플랫 마운트 마우스의 제조 및 면역형광 염색 및 분석을 위한 상세한 방법을 기술한다. 마우스 새끼를위한 fluorescein 안저 혈관 조영술 (FFA)의 사용 및 이미지 처리도 자세히 설명되어 있습니다.

산소 유발 망막병증 마우스 모델에서 망막 혈관의 동적 성장 모니터링

여기에 기재된 미토콘드리아 응력 분석기 및 글리코리질 속도 분석기의 상세한 프로토콜은 상용 생체 분석기를 이용한 전 생체 망 막 조직 샘플에서 이다.

전 비보 망막 조직 샘플에서 미토콘드리아 호흡 및 글리코리시스의 결정

당뇨병성 망막증은 실명의 주요 원인 중 하나입니다. 조직학, 혈액-망막 장벽 파괴 분석, 및 형광 혈관조영술은 망막의 병태생리학을 이해하는 데 유용한 기술이며, 이는 당뇨병성 망막병증에 대한 효율적인 약물 스크리닝을 더욱 향상시킬 수 있다.

쥐 모델에서의 망막 병리생리학적 평가

이 문서에서는 전체 마운트 망막 제제및 증식 및 비증식 망막병에서 자주 변경되는 혈관 매개 변수의 정량적 측정에 필요한 프로토콜에 대해 잘 확립되고 재현 가능한 렉틴 얼룩 분석법에 대해 설명합니다.

비증식 및 증식 망막증을 가진 마우스의 전체 산 망막에 있는 혈관 매개변수의 정량화

여기에서는 망막 정맥 폐색(RVO) 연구에서 형광 혈관 조영술(FA) 및 광학 간섭 단층 촬영(OCT) 이미지에 대한 세 가지 데이터 분석 프로토콜을 제시합니다.

생체 내 재현성 촉진을 위한 마우스 망막의 혈관 손상 판독

생쥐의 망막 혈관 구조는 혈관 패턴 형성의 메커니즘을 이해하는 데 특히 흥미롭습니다. 이 프로토콜은 광학 디스크에서 고정된 거리에서 형광 혈관 조영술 안저 영상에서 마우스 망막 혈관의 직경을 자동으로 측정합니다.

Mouse Fluorescent Angiography 이미지에서 망막 혈관 직경 측정

우리는 최근에 당뇨병과 관련된 망막 기능 장애에 대한 새로운 패러다임으로 망막 모세 혈관 경직을 확인했습니다. 이 프로토콜은 망막 내피 배양에서 마우스 망막 모세혈관과 내피하 기질을 분리하는 단계를 자세히 설명한 다음 원자력 현미경을 사용한 강성 측정 기술에 대해 설명합니다.

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배우세요 마우스 망막 동맥 반응성 측정을 위한 비디오 현미경법을. 이 기법은 망막 혈류 조절 및 안과 질환의 병태생리학 연구에 활용됩니다.

마우스 망막 Arterioles Ex Vivo 에서 반응의 측정을 위한 준비 단계

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