마우스 망막 Arterioles Ex Vivo 에서 반응의 측정을 위한 준비 단계

이 망막 준비법의 전반적인 목표는 비디오 현미경을 사용하여 마우스 망막 동맥의 반응성을 측정하는 것입니다. 이 방법은 망막 혈류 조절 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있으며, 다양한 안과 질환의 병태생리학적 이해를 증진하는 데 기여할 수 있습니다. 이 새로운 기술의 주요 장점은 매우 높은 광학 해상도로 망막 혈관의 반응성을 측정할 수 있다는 점입니다.

동시에, 이 방법은 정밀한 장비가 많이 필요하지 않습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 사람들은 안동맥과 그 분지들을 찾기가 어려워 고생할 수 있습니다. 저의 연구실 대학원생인 Jenia Kouchek Zadeh 및 Wael Omran과 함께 이 절차를 시연하겠습니다.

필요한 기구들을 배치하여 실험 절차를 준비합니다. 그런 다음 강철 가위를 사용하여 마우스의 두개골을 시상면으로 이등분하고, 안과용 가위를 사용하여 피부와 뇌를 제거합니다. 안과용 가위로 안와골만 남을 때까지 두개골을 제거한 후, 수술 현미경 하에서 얼음 위에 놓인 차가운 Krebs-Henseleit 버퍼가 담긴 해부 접시에 안와를 옮깁니다.

안과용 가위로 안와골을 절개하고, 4번 정밀 핀셋과 학생용 Vanna 스프링 가위를 사용하여 안구와 안와 조직을 조심스럽게 제거합니다. 5번 정밀 핀셋과 Vanna낭 절개 가위를 사용하여 안동맥의 주분지를 손상시키지 않도록 주의하며 하더리안샘, 결합 조직 및 외안근을 조심스럽게 제거합니다. 10-0 Nylon 봉합사를 사용하여 안동맥 주분지의 근위단에 있는 안와 분지들을 결찰하고, 4번 정밀 핀셋을 사용하여 안구를 70% ethanol이 담긴 페트리 접시로 옮깁니다.

실험 중 누출을 방지하기 위해 안동맥의 모든 안와 분지를 결찰하는 것이 매우 중요합니다. 10초 후, 안구를 해부 접시로 되돌립니다. 에탄올 노출로 인해 각막이 하얗게 보일 것입니다.

완충액을 신선한 Krebs 용액으로 교체한 후, 현미경과 3게이지 바늘을 사용하여 각막 주변부를 찌릅니다. Vannas 백내장 절개 가위를 사용하여 각막을 박리하고 홍채 조직을 조심스럽게 잘라냅니다. 그런 다음 Vannas 백내장 절개 가위의 날카로운 끝 하나를 맥락막과 망막 사이에 넣고 맥락막과 공막을 잘라냅니다.

망막을 맞춤 제작된 관류 챔버에 장착하려면, 먼저 니들 홀더를 사용하여 팁 직경이 100 µm인 유리 마이크로피펫의 끝부분을 챔버의 실리콘 튜브 안으로 밀어 넣으십시오. 그런 다음 튜브의 반대쪽 끝에 시린지를 연결하여 마이크로피펫 팁에 있는 이물질을 씻어냅니다. 관류 챔버를 차가운 Krebs 버퍼로 채우고 챔버를 실체현미경 아래에 배치하십시오.

관류 챔버 내에 1.6 mm 직경의 강철 와이어 두 개 위에 1.8 mm 깊이의 홈이 있는 투명 플라스틱 플랫폼을 배치하고, 플랫폼 위에 스테인리스 스틸 링을 놓습니다. 스푼을 사용하여 안동맥이 부착된 상태의 시신경이 포함된 망막을 플랫폼 위로 옮기고, 봉합된 안동맥 끝부분을 제거합니다. 10-0 Nylon 봉합사로 만든 루프 두 개를 마이크로피펫에 걸고, 봉합사를 이용해 동맥을 마이크로피펫에 고정합니다.

미세 팁 핀셋 하나를 사용하여 망막을 투명 플랫폼 위에 배치하고, 다른 미세 팁 핀셋을 사용하여 전방 수정체 낭을 조심스럽게 찢어 엽니다. 수정체를 꺼낸 후 미세 가위로 수정체 낭 전체와 유리체를 제거합니다. 그런 다음 평평부(pars plana)에서 시신경까지 거리의 절반 지점에서 망막에 4개의 방사형 절개를 가하고, 스테인리스 스틸 링을 망막 위에 놓아 망막을 플랫폼에 고정합니다.

망막 소동맥을 분석하기 위해, 관류 챔버를 광학 현미경 아래로 옮기고 100배 수침 대물렌즈를 선택합니다. 파라사이클릭 펌프의 유입구와 유출구 포트에 튜브를 연결하고, 95% 산소로 산소화하고 5% 이산화탄소로 탄산화한 37 °C Krebs 완충액으로 챔버를 순환시킵니다. 마이크로피펫이 장착된 실리콘 튜브를 3방향 콕(three-way stopcock)을 통해 저장소 실리콘 호스에 연결하고, 저장소에 Krebs 완충액을 50 mmHg 높이에 해당하도록 채웁니다.

대물렌즈를 사용하여 망막 표면에 수동으로 초점을 맞추고 혈관이나 적혈구를 찾습니다. 혈관이 발견되면 혈관에 초점을 맞춘 뒤 3방향 스톱콕을 엽니다. 그러면 혈관의 직경이 즉시 증가하며 적혈구가 나타나야 합니다.

30분간의 평형 시간을 거치면, 세동맥은 내경 감소율이 10% 미만인 약한 내인성 긴장도를 나타내게 됩니다. 욕조 용액에 마우스 망막 수축 시약을 첨가하여 혈관의 생존 능력을 확인하십시오. 그 다음, 펌프를 작동시켜 욕조 내의 작용제를 씻어내고 챔버에 신선한 Krebs 완충액을 추가하십시오.

이 대표 실험에서, thromboxane 유사체인 U46619는 야생형 C57Bl/6J 마우스의 망막 세동맥에서 농도 의존적인 혈관 수축 반응을 유도하였으며, 1 × 10⁻⁶ M 농도에서 휴지기 내강 직경의 약 50% 감소가 나타났습니다. 작용제로 사전 수축된 세동맥에 acetylcholine을 누적 투여한 결과, 1 × 10⁻⁵ M acetylcholine 농도에서 사전 수축된 직경의 약 25%까지 농도 의존적인 내강 직경 증가가 유발되었으며, 이는 혈관 내피세포가 온전함을 나타냅니다. 이 기술을 숙달하고 적절하게 수행한다면 90분에서 120분 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때, 안구의 안구 내강을 열기 전 안동맥의 뒤틀림을 방지하기 위해 모든 안와후 동맥 분지들을 결찰하여 안구를 에탄올에 침전시켜야 하며, 마지막으로 유리 미세피펫 팁의 폐쇄 여부를 확인해야 함을 기억하십시오. 이 영상을 시청한 후에는 in vitro 비디오 현미경을 이용한 동맥 측정을 위해 마우스 망막을 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.