마우스 망막 Arterioles Ex Vivo 에서 반응의 측정을 위한 준비 단계
May 8th, 2018
많은 비전을 위협 눈 질병 장애 망막 microvessels와 연결 됩니다. 따라서, 망막 되 응답의 측정은 기본 병 태 생리 기계 장치를 조사 하는 것이 중요. 이 문서에서는 마우스 망막 되 격리와 혈관 직경에 vasoactive 물질의 효과 평가 하기 위해 준비에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다.
이 망막 준비 방법의 전반적인 목표는 비디오 현미경을 사용하여 마우스 망막 동맥 반응을 측정하는 것입니다. 이 방법은 망막 혈류 조절 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며 다양한 안구 질환의 병태 생리학에 대한 이해를 높이는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 새로운 기술의 주요 장점은 매우 높은 광학 해상도에서 망막 혈관 반응성을 측정할 수 있다는 것입니다.
동시에 많은 정교한 장비가 필요하지 않습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 안과 동맥과 그 가지를 찾는 것이 어려울 수 있기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 저는 제 연구실의 대학원생인 Jenia Kouchek Zadeh 및 Wael Omran과 함께 이 절차를 시연할 것입니다.
필요한 도구를 배치하여 실험 절차를 준비합니다. 그런 다음 강철 가위를 사용하여 쥐의 두개골을 두 반으로 자르고 눈 가위를 사용하여 피부와 뇌를 제거합니다. 안구 가위를 사용하여 안와뼈만 남을 때까지 두개골 뼈를 제거하고 수술용 현미경으로 얼음 위에 얼음처럼 차가운 크렙스-헨셀레이트 완충액이 들어 있는 해부 접시로 안와를 옮깁니다.
안와 가위로 안와 뼈를 자르고 4형 정밀 핀셋과 학생용 Vannas 스프링 가위를 사용하여 안구와 안와 조직을 부드럽게 제거합니다. 5형 정밀 핀셋과 Vannas 캡슐 절개술 가위를 사용하여 안과 동맥의 주요 가지가 손상되지 않도록 주의하면서 하데리안샘, 결합 조직 및 안구 외 근육을 조심스럽게 제거합니다. 10-0 나일론 봉합사를 사용하여 안과 동맥의 주요 분지 근위 끝에 있는 안와 가지를 접합하고 4형 정밀 핀셋을 사용하여 안구 지구를 70% 에탄올이 함유된 페트리 접시로 옮깁니다.
실험 중 누출을 방지하기 위해 안과 동맥의 모든 안와 가지를 연결하는 것이 매우 중요합니다. 10초 후 안구를 해부 접시에 다시 넣습니다. 각막은 에탄올 노출로 인해 희끄무레하게 보일 것입니다.
완충액을 새 크렙스 용액으로 교체하고 현미경과 3게이지 바늘을 사용하여 주변 각막에 구멍을 뚫습니다. Vannas 캡슐 절개술 가위를 사용하여 각막을 절개하고 홍채 조직을 부드럽게 잘라냅니다. 그런 다음 맥락막과 망막 사이에 Vannas 캡슐 절개술 가위의 날카로운 점 하나를 놓고 맥락막과 공막을 잘라냅니다.
맞춤형 관류 챔버에 망막을 장착하려면 먼저 바늘 홀더를 사용하여 100마이크로미터 직경의 팁이 있는 유리 마이크로피펫의 끝을 챔버의 실리콘 튜브에 밀어 넣습니다. 그런 다음 주사기를 튜브의 다른 쪽 끝에 연결하여 마이크로피펫 끝에서 이물질을 씻어냅니다. 관류 챔버를 차가운 크렙스 버퍼로 채우고 챔버를 실체 현미경 아래에 놓습니다.
관류 챔버 내에 1.6mm 직경의 강철 와이어 2개 위에 1.8mm 움푹 들어간 투명 플라스틱 플랫폼을 놓고 플랫폼에 스테인리스 스틸 링을 놓습니다. 숟가락을 사용하여 안과 동맥이 플랫폼에 여전히 부착된 시신경이 있는 망막을 옮기고 안과 동맥의 봉합된 끝을 제거합니다. 10-0 나일론 봉합사의 두 개의 루프를 마이크로 피펫에 놓고 봉합사로 동맥을 마이크로 피펫에 고정합니다.
세세한 핀셋 하나를 사용하여 망막을 투명 플랫폼에 놓고 두 번째 세세한 핀셋을 사용하여 전방 수정체 캡슐을 부드럽게 뜯어냅니다. 렌즈를 당겨 빼내고 마이크로 가위를 사용하여 렌즈 캡슐 전체와 유리체를 제거합니다. 그런 다음 pars plana에서 시신경까지의 거리의 절반인 망막에 방사상 절개를 4개 만들고 스테인리스 스틸 링을 망막에 올려 망막을 플랫폼에 고정합니다.
분석을 위해 망막 세동맥을 준비하려면 광학 현미경으로 관류 챔버를 옮기고 100X 침수 대물 렌즈를 선택합니다. 튜브를 파라고리식 펌프의 유입 및 유출 포트에 연결하고 섭씨 37도의 크렙스 버퍼로 챔버를 순환시키며, 산소는 95%로, 탄산화탄소는 5%입니다. 마이크로피펫이 장착된 실리콘 튜브를 3방향 마개를 통해 저장소 실리콘 호스에 연결하고 저장소를 크렙스 버퍼로 수은 50mm에 해당하는 높이까지 채웁니다.
목표를 사용하여 수동으로 망막 표면에 초점을 맞춰 혈관 또는 적혈구를 검색합니다. 혈관이 발견되면 혈관에 초점을 맞추고 삼방향 마개를 엽니다. 혈관의 직경이 즉시 증가하고 적혈구가 나타나야 합니다.
30분의 평형 기간 후, 세동맥은 내강 직경이 10% 미만으로 감소하는 약한 고유 톤을 발달시킵니다. 수용액에 마우스 망막 제한 시약을 첨가하고 혈관 생존력을 확인합니다. 그런 다음 펌프를 순환시켜 수조에서 작용제를 씻어내고 챔버에 새로운 크렙스 완충액을 추가합니다.
이 대표적인 실험에서, 트롬복산 모방자인 U46619는 야생형 C57Bl/6J 마우스의 망막 세동맥에서 농도 의존적 혈관 수축 반응을 일으켜 1 곱하기 10에서 음의 6 어금니 농도로 내강 직경이 약 50% 감소했습니다. 작용제와 사전 수축 된 세동맥에서, 아세틸 콜린의 누적 투여는 내강 직경의 농도 의존적 증가를 유발하여 1 곱하기 10에서 음의 5 대구치 아세틸 콜린 농도로 사전 수축 직경의 약 25 %까지 증가했으며, 이는 손상되지 않은 혈관 내피를 나타냅니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 90분에서 120분 안에 수행할 수 있습니다.
이러한 절차를 시도하는 동안 안과 동맥의 비틀림을 피하기 위해 지구를 열기 전에 모든 후구강 동맥 가지를 접합하여 눈을 에탄올에 담그고 마지막으로 유리 마이크로피펫 팁의 폐색을 확인하는 것을 잊지 마십시오. 이 비디오를 시청한 후에는 비디오 현미경 in vitro로 동맥 측정을 위해 마우스 망막을 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
이 기사는 동영상 현미경을 사용하여 마우스 망막 동맥 반응성을 측정하는 방법을 제시합니다. 이 기술은 망막의 혈류 조절 및 그것이 안과 질환에 미치는 영향에 대한 이해를 향상시키는 것을 목표로 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 안과
- 혈관 생물학
배경
- 기능 장애가 있는 망막 미세 혈관은 다양한 안과 질환과 연관되어 있습니다.
- 망막 동맥 반응을 측정하는 것은 병리생리학적 메커니즘을 조사하는 데 중요합니다.
- 정확한 측정을 위해서는 높은 광학 해상도가 필수적입니다.
- 초보자에게는 안과 동맥 및 그 분지를 찾는 것이 어려울 수 있습니다.
연구 목적
- 마우스 망막 동맥을 분리하고 준비하는 프로토콜을 개발하는 것.
- 혈관 직경에 대한 혈관 활성 물질의 영향을 평가하는 것.
- 망막 혈류 조절에 대한 이해를 향상시키는 것.
사용된 방법
- 동맥 반응성 측정을 위한 동영상 현미경.
- 마우스 망막 동맥 분리 및 준비.
- 혈관 활성 물질에 대한 혈관 반응 평가.
- 연구원들과의 협력을 통한 시연.
주요 결과
- 이 방법은 망막 혈관 반응성의 고해상도 측정을 가능하게 합니다.
- 안과 질환의 병태생리학에 대한 통찰력을 제공합니다.
- 망막 혈류 조절에 대한 연구를 촉진합니다.
- 최소한의 장비로 이 기술의 타당성을 시연합니다.
결론
- 제시된 방법은 망막 동맥을 연구하는 데 효과적입니다.
- 이 방법은 망막의 혈관 반응에 대한 이해를 향상시킵니다.
- 이 기술은 시력을 위협하는 질환의 연구에 도움을 줄 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Reliable measurement of retinal arteriole reactivity in mouse models addresses a critical gap in early-stage ophthalmic drug discovery, enabling mechanistic de-risking for vascular targets implicated in sight-threatening diseases. High-resolution, quantitative assessment of microvascular function supports predictive confidence in target validation and informs portfolio triage for vascular-modulating therapeutics. This ex vivo methodology enhances translational continuity by providing physiologically relevant data on retinal microcirculation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of vascular reactivity hypotheses in disease-relevant retinal tissue.
- Supports functional validation of vascular targets by quantifying responses to vasoactive agents.
- Reduces mechanistic ambiguity in microvascular pathophysiology for ocular indications.
- Facilitates predictive confidence in early-stage asset selection for vascular modulation.
Screening & Assay Development
- Establishes a reproducible ex vivo platform for quantitative measurement of arteriole diameter changes.
- Supports assay standardization and cross-study comparability through defined perfusion and imaging conditions.
- Enables screening of candidate compounds for vasoactivity in a physiologically relevant system.
- Provides high-resolution outputs suitable for downstream pharmacological profiling.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical vascular responses with human disease mechanisms in diabetic and hypertensive retinopathies.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by modeling microvascular function ex vivo.
- Informs risk-adjusted advancement decisions for vascular-targeted therapies in ophthalmology.
- Offers mechanistic de-risking for lead candidates prior to in vivo studies.
Pipeline & Workflow Integration
This ex vivo retinal arteriole reactivity assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early target validation and compound screening with translational vascular biology.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing and pathway clarification in retinal microcirculation.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible readouts of vascular reactivity for compound evaluation.
- Analytics: Enables precise measurement of luminal diameter changes and concentration-response relationships.
- Translational Research: Aligns ex vivo findings with disease-relevant vascular endpoints for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, reusable assay for multiple vascular-modulating programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces biological risk in vascular target validation.
- Operational Value: Promotes assay standardization, reproducibility, and scalability across discovery teams.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of vascular-modulating assets for ophthalmic indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microdissection, perfusion, and high-resolution video microscopy.
- Demands access to specialized imaging and perfusion instrumentation for ex vivo assays.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of preparation and measurement protocols.
- Adaptable to rat microvessels but may require protocol optimization for other species.
- Potential limitations include technical challenges in vessel isolation and operator-dependent variability.
