Name: Dissociated 마우스 두피 신경 세포 배양의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 2 s
Description: 배우세요 생후 초기 마우스 대뇌피질에서 분리된 신경 세포 배양법을 통한 전기생리학 및 이미징 연구 방법. 이 기술은 신경 발달과 유전자 돌연변이 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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culturing의 하루 전에 준비 : <ul><li> 무균 해부 솔루션 (DS)를 준비합니다. </li><li> NBM/B27 (B27 보충제로 Neurobasal Mediom)를 준비합니다. </li><li> 필요한 경우 압력솥 ddH 2 O가 있으며, 유리 coversilps을 소독. </li><li> 폴리 - D - 라이신과 코트 조직 문화 요리 또는 유리 coverslips. </li></ul> 폴리 - D - 라이신 코팅 : 무균 조건 하에서 culturing 전에 하루를 준비합니다. <ul><li> 얼음 10X PDL 장소의 해동의 나누어지는. </li><li> PDL 1 ML 9 ML 살균 울트라 필터 물을 추가하고 (1X) 잘 섞는다. </li><li> 다음과 같이 실온에서 하룻밤 1X PDL로 코트 표면 : <ul><li> 유리 coverslips (Bellco 유리 주식 회사 캣 # 1943-00012.) : 75 μl / coverslip 또는 </li><li> 24 잘 문화 플레이트 : 잘 300 μl / 또는 </li><li> 35mm 문화 요리 : 1ml/dish </li></ul></li><li> 멸균 물 (액체를 대기음으로 살균 파스퇴르 pipettes를 사용)으로 5 배 헹굼. </li><li> 표면이 완전히 건조 될 때까지 물을 제거합니다. </li></ul> Culturing 절차 (무균 조건 하에서 층류 후드에서 수행) <ol><li> 슈퍼 접착제를 사용하여 마이크로톰 Vibraslicer (캠덴 인 스트 루먼트 (주))의 지원 블록에 한천과 접착제 그것 블록을 잘라 버릴거야. </li><li> 늦은 배아 단계 (E17 - 18) 마우스 fetuses, euthanise ​​댐을 사용하는 경우, 배아 자루에서 자궁 무료 개인 fetuses를 제​​거합니다. 플레이스 멸균 페트리 접시에 fetuses 계속은 아래에 설명했다. </li><li> 참살 마우스 태아 또는 펍 (귀하의 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 승인에 따라 지침). </li><li> 감기 DS 가득한 60mm 배양 접시에있는 왓먼 필터 종이 디스크에 피부와 두개골과 장소의 두뇌를 제거합니다. </li><li> 멸균 면도날을 사용하여 소뇌를 잘라. </li><li> 주걱을 사용하여 두뇌를 들고 필터 종이에 여분의 액체를 배수, 다음 장소에서 Vibraslicer 지원 블록과 접착제의 뇌 (꼬리 쪽 위쪽 및 한천에 직면하고 복부 부분)에 머리를 전송할 수 있습니다. </li><li> 감기 DS와 챔버를 입력합니다. 8-9로 속도 선택을 설정합니다. </li><li> 후각 망울에서 시작, 200-400 μm의 섹션을 잘라 버릴거야. Vibraslicer의 날개가 피질를 입력하면, 600μm 코로나 섹션을 절단 시작합니다. P0 마우스 두뇌 4-5 사용 가능한 조각 산출 동안 E17 - 18 마우스 두뇌는 일반적으로 3-4 사용 가능한 조각 산출. </li><li> 10 ML 유리 파스퇴르 pipet을 취소 - 연결의 리버스 엔드를 사용하여 DS 2 분류 35mm 페트리 접시에 뇌 조각을 전송합니다. </li><li> 피질을 절개하다 및 모세관 튜브에서 나온 유리 바늘을 사용하여 meninges를 제​​거합니다. </li><li> 작은 조각, 길이 0.5-1 mm로 대뇌 피질의 rinds 컷. </li><li> 0.2 μm의를 통해 필터 ES는 35mm 페트리 접시에 5 CC 주사기에 부착된 필터. </li><li> 필터 ES를 포함하는 페트리 접시에 대뇌 피질의 조직 조각을 전송합니다. </li><li> 37 ° C 30 분 알을 품다. </li></ol> 그 동안에 : <ol><li> 후드, Vibraslicer 및 해부 도구를 청소하십시오. </li><li> 60mm 페트리 접시에 따뜻한 NBM/B27 5 ML을 추가합니다. </li></ol> 30 분 후. 부화 : <ol><li> 10 ML의 DS에 조직을 전송합니다. 1 분에 대한 청산하자. </li><li> 첫째 안녕 튜브 소용돌이 모양으로 조직을 전송 후 2-3 분 쉬라 구. </li><li> 초 하이로 전송합니다. 위에서 반복합니다. </li><li> 첫째 리로 전송합니다. 위에서 반복합니다. </li><li> 둘째 리로 전송합니다. 위에서 반복합니다. </li><li> 셋째 리로 전송합니다. 위에서 반복합니다. </li><li> 미디어와 60mm 요리에 조직을 전송합니다. </li></ol> 해부 현미경 아래에서 : <ol><li> 깨끗한 조직의 파편과 부드럽게 조직을 느슨하게하기 위해 가져온 유리 pipet (구멍 크기를 감소 사용)을 통과하여 각 조각을 씹다. </li><li> NBM + B27의 나머지 부분을 (. - 35mm 요리 부드럽게 믹스 및 정착에 조직의 대형 조각 기다리는 5 24 잘 접시 또는 11 ML 13 ML 총 만들기)이있는 15 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. </li><li> 전송 세포 현탁액 (24 잘 접시 또는 2 ML / 35mm 문화 요리 / 음 0.5 ML). </li><li> 유리 coverslips를 사용하는 경우, coverslip 당 80 μl 세포 현탁액을 추가하고 세포가 더 많은 NBM​​/B27 미디어 챔버 홍수 전에 준수하는 조직 문화 인큐베이터에서 1 시간을 허용합니다. </li><li> 37 ° C와 5% CO 2의 문화를 유지합니다. </li></ol> 내일 24 잘 플레이트 (cNBM/B27; cNBM/B27 매체의 준비 프로토콜 아래에 나타납니다) NBM/B27 매체를 갖추 0.5 ML 이외의 연결을 세포와 각 잘 피드 35mm 요리 : cNBM/B27 매체 0.5 ML를 교체하십시오. 신선한 cNBM/B27 모든 2~3일과 매체의 0.5ml을 대체하여 문화를 유지합니다. 문화 미디어가 glia 세포의 증식을 촉진하지는 않지만, 문화가 필요한 경우 추가로 glial 세포의 수를 줄이기 위해 문화의 일 3-5에서 5μM FDU (5 - 플루오로 - 2&#39; - deoxyuridine, 시그마 F0503)로 치료하실 수 있습니다. SET<html> - UP 해부 문화 70 % EtOH에서 해부 도구를 소독하거나 압력솥 : <ul><li> 가위 (med. 작은) Spatulas (med. 작은) </li><li> 핀셋 (med. 작은) 면도날 </li><li> vibraslicer 버퍼 목욕 블레이드 </li><li> 두뇌를위한 블레이드 지원 작은 금속 웨지 </li></ul> 기타 자료 : <ul><li> 페트리 요리 (60 ㎜) </li><li> 페트리 요리 (35 ㎜) </li><li> 필터 용지 </li><li> 유리 pipet 10 ML </li><li> 멸균 일회용 pipets, 5,10, 25 ML </li><li> 주사기 필터, 0.2 μm의 </li><li> 주사기 5 CC </li><li> 원심 분리기 튜브 15 ML </li><li> 무균 파스퇴르 유리 pipets </li><li> PDL 코팅 문화 요리 또는 유리 coverslips </li></ul> 라벨 육 15 ML의 원심 분리기 튜브와 준비를 따르십시오 : 지하철 # 1 : 효소 솔루션 : 포함 5 ML의 DS에 papain (워싱턴 LS 03,126) 50 U를 추가합니다 <ul><li> L - cystein의 100μl (0.8mg) </li><li> 7 μl 0.1N NaOH </li><li> 50 μl APV (5mM) </li></ul> 취소하고 실온에서 솔루션을 둡니다. 그 효소 솔루션은 처음에는 &#39;흐리고&#39;표시 및 사용하기 전에 명확해야합니다합니다. 튜브 # 2 &amp; # 3 : 히 효소 억제제 : 3 ML DS + 300 μl BSA / 티 + 30 μl APV (5mM). 거품을 피하기 위해 부드럽게 믹스 살다가 두 1.5ml aliquots로 나눕니다. 튜브 # 4 - # 6 : 낮음 효소 억제제 : 8 ML DS + 80 μl BSA / 티 + 80 μl APV (5mM). 거품을 피하기 위해 부드럽게 믹스 세 2.6 ML aliquots로 나눕니다. 플레이스 튜브 얼음이 # 6을 통해 # 2 번호. 튜브 # 1 (효소 솔루션) 실온에서 둡니다. 솔루션과 ALIQUOTS <ul><li> 솔루션 A (살린 버퍼) 시그마 공식 WT 500 ML [CONC.] </li><li> 염화나트륨 (소금) NaCl S - 9625 58.45 80.0g 137mM </li><li> 염화칼륨 KCl P - 4504 74.56 4.0g 5.4mM </li><li> 나트륨 인산 이염 무수 나 2 HPO 4 S - 0876 142.0 0.24g 0.17mM </li><li> 인산 칼륨 일염기의 무수 KH 2 PO 4 P - 5379 136.09 0.3g 0.22mM </li></ul> 400 ML 울트라 필터링 물에 용해까지 모든 재료와 혼합을 나가는거야. 500 ML에 마지막으로 볼륨을 가져와. 깨끗한 병에과 압력솥에 넣습니다. 4 ° C 보관 및 레이블 &quot;DS 솔루션&quot;. <ul><li> 솔루션 B (Hepes) 시그마 공식 WT 250 ML [CONC.] </li><li> Hepes Hepes H - 3375 283.3 20.97g 9.9mM </li></ul> 200 ML에 울트라 필터 물을 추가합니다. 해산까지 믹스 250 ML에 최종 볼륨을 가지고. 깨끗한 병에과 압력솥에 넣습니다. 4 ° C 보관 및 레이블 &quot;DS 솔루션 B&quot;. <ul><li> 워킹 솔루션 500 ML [CONC.] </li><li> 울트라 여과 물 400 ML </li><li> 증권 솔루션 25 ML </li><li> 증권 솔루션 B 14 ML </li><li> D (+) - 포도당 시그마 G - 8270 3.0 g 33.3mM </li><li> 자당 시그마 S - 0389 7.5 g 43.8 MM </li></ul> 1N NaOH와 7.4으로 산도를 조정합니다. 울트라 여과 물 500 ML에 마지막으로 볼륨을 가져와. 깨끗한 유리병과 압력솥에 가만히 따르다. 4 스토어 ° C. 라벨 &#39;분석 해 봅시다 솔루션 &quot;. 폴리 - D - 라이신 준비 : <ol><li> 1mg/ml에서 무균 H 2 O에서, 폴리 - D - 라이신의 10X 재고 솔루션 (시그마 P - 7280 PDL)를 준비합니다. </li><li> 1.0 ML의 aliquots을 만듭니다. 이 솔루션은 최대 3 개월까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 미디어 <ol><li> 의 10ml 추가 B - 27 보충 (Gibco 17504-044) 500 ML의 NBM 병 (Neurobasal 매체, Gibco 21103-049)에 적용됩니다. </li><li> 4 40 ML aliquots하고 저장하십시오 ° C. </li></ol> APV <ol><li> 10 MG APV의 유리병 10 ML 살균 H 2 O를 추가 (2 - 아미노 -5 - phosphonopentanoic 초산, 시그마 A - 5282)과 철저히 섞는다. </li><li> -20 ° C.에 180 μl aliquots 및 상점 준비 </li></ol> BSA / 티 <ol><li> 10 ML의 DS에 1g BSA (보빈 알부민. 시그마 A - 7030)과 1g 트립신 억제제 (시그마 T - 9253)을 디졸브. </li><li> 1N NaOH와 7.4으로 산도를 조정합니다. </li><li> 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 필터링하여 소독. </li><li> -20 ° C. 400 μl aliquots 및 저장소로 나눌 </li></ol> L - 시스테인 Eppendorf 튜브에 200 μl DS에 0.​​6 MG L - 시스테인 (시그마 C - 7755)를 해산. 한천 (4 %) <ol><li> 100 ML 멸균 물의 Bacto 아가르 4 G (Difco 0140-01)을 디졸브. 문화 필요한 ° C까지 4 계속. </li><li> 전자 아가르는 35mm 페트리 접시 녹으 입력합니다. 진정 및 중합에 앉아 보자. </li></ol> PAPAIN (워싱턴 LS 03,126) NUNC 문화 병에 e_title &quot;&gt; 비상의 연결을 문화 코팅 문화 병 (4 Nunc 병) <ol><li> 1X PDL를 만들기 위해 10X PDL 3 튜브에 각각 9 ML 멸균 물을 추가합니다. </li><li> 첫번째 병 30 ML 1X PDL을 전송합니다. </li><li> 모든 성장 표면이 덮여 때까지 약간 이동합니다. 1 분 앉아 보자. </li><li> 둘째 병 1X PDL을 전송합니다. 1 분 앉아 보자. </li><li> 포스 세번째 병 반복합니다. </li><li> 150 ML 무균 H 2 O.와 배 모두 네 병을 씻어 </li></ol> 효소 솔루션 (ES)를 준비 : <ol><li> 결정이 녹아 때까지 0.6 ML의 원심 분리기 튜브 무게 0.8 아웃 MG L - 시스테인 (시그마 C7755)은 150ml DS와 와동를 추가합니다. </li><li> 15 ML 원뿔 관 5 ML의 DS를 전송 후, L - 시스테인 150ml를 추가합니다. </li><li> 50 단위 Papain를 추가합니다. (워싱턴 LS 03,126) </li><li> 7ml 0.1N NaOH를 추가합니다. </li></ol> 준비 멤 (GIBCO # 11090-081) <ol><li> 500 ML의 멤 병에서 65 ML을 제거합니다. 포도당 준비 10 ML을 저장합니다. </li><li> 5 ML 펜 / Strep을 (Gibco # 15070-063) 추가합니다. </li><li> 10 ML 1M 포도당 (시그마 G - 8270) (1.8 g / 10 ML 멤)를 추가 </li><li> 50 ML 태아 소 혈청 (Gibco # 16140-071) 또는 보빈 카프 세럼 (오메가 BC - 04)를 추가합니다. </li><li> 4 잘 섞어서 나누어지는 및 저장 ° C. </li></ol> NEUROBASAL MEDIUM/B-27 보충 (NBM/B27) NBM 500 ML (Gibco # 21103-049), B - 27 (50X), 10 ML (Gibco # 17504-044) <ol><li> NBM 병 및 혼합에 B - 27 유리병의 전체 내용을 추가합니다. </li><li> 4 ° C.에서 나누어지는 및 저장 </li></ol> 뇌 조직의 해부 <ol><li> 드라이 해부하기 전에 70 % EtOH에서 도구를 해부. </li><li> 3-15 ML 튜브의 각 10 ML의 DS를 전송합니다. </li><li> 마우스 새끼를 (P0 - P3)을 선택, 당신은 4 병 세 두뇌가 필요합니다. </li><li> 35mm 페트리 접시에 차가운 DS를 추가합니다. </li><li> 마우스 강아지 참살하고 머리를 절개하다. </li><li> 감기에 DS를 포함하는 페트리 접시에 플레이스 두뇌. </li><li> 유리 피펫을 통과하기 위해 충분히 작은 조각으로 조직을 잘라. </li></ol> 효소 분리 <ol><li> 파스퇴르 피펫으로 접시에서 가능한 한 많은 DS로 제거합니다. </li><li> 0.2 μm의 필터와 5cc 주사기를 통해 필터 ES. </li><li> 조직과 함께 접시에 ES를 배치합니다. </li><li> 37 조직을 품어 30 분 ° C 배양기 (CO 2 무료). </li></ol> 조직 워싱 <ol><li> 가능한 작은 ES로 받아보실하는 최초의 DS 튜브에 유리 피펫로 전송 조직. </li><li> 1,500 rpm으로 30 초위한 원심 분리기. </li><li> 조직 및 반복 절차를 두 번 더 전송합니다. </li></ol> 가루약 <ol><li> 50ml 원심 튜브에 멤 / FBS 38 ML을 플레이스 </li><li> 이 배양 접시에 35mm 요리 및 전송 조직에 멤 / FBS 3 ML을 추가합니다. </li><li> 부드럽게 1000μl eppendorf의 pipet 팁 통해 triturating하여 조직을 떼어 놓다. </li><li> 멤 / FBS의 38ml를 포함하는 튜브에 세포 현탁액을 전송하고 잘 섞는다. </li></ol> 도금 <ol><li> 각 병의 세포 현탁액 및 미디어 동등한 금액을 얻기 위해서는 수직으로 문화 병 스탠드. </li><li> 각각의 문화 병에 멤 / FBS 90 ML 놔. </li><li> 각 병의 세포 현탁액의 10 ML을 추가합니다. </li><li> 레이블 : 비의 연결, 이니셜 및 날짜. 37 ° C와 5% CO 2 알을 품다. </li></ol> 수유 <ol><li> 에서 3 일 또는 4, 따뜻한 멤 / FBS (가만히 따르다 모든 미디어 및 멤 / FBS 100 ML로 대체)로 피드 세포. 문화 합류 될 70-10일 걸릴 수 있습니다. </li><li> 일 7-10에 NBM/B27에 대한 미디어를 변경합니다. </li><li> 다음날, 미디어를 수집합니다. 0.22μm로 필터 </li><li> 40 ML의 aliquots을 만들어 멤 / FBS와 문화를 피드. </li><li> 2 삼일 다음 NBM/B27 미디어를 변경 </li><li> 다음날, 수집 및 절차를 반복합니다. </li><li> 약 미디어를 수집 보관. 이주. </li></ol>

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

<table><tbody><tr><td>5-Fluoro-2&amp;rsquo;-deoxyuridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Vibraslicer</td><td>Campden Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>인산이나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>인산일칼륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D (+)-포도당</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>B27 보충제</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 배지 (NBM)</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>2-Amino-5-phosphonopentanoic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td></td></tr><tr><td>우혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>트립신 억제제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9253</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨, 1N 용액</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>L-시스테인</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7755</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco Laboratories</td><td>0140-01</td><td></td></tr><tr><td>파파인</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS 03126</td><td></td></tr><tr><td>멸균 0.2 &amp;mu;m 시린지 필터</td><td>Fisher Scientific</td><td>DDA02025S0</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버슬립, No1, 12mm</td><td>Bellco Glass</td><td>1943-00012</td><td></td></tr><tr><td>최소 필수 배지 (MEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11090-081</td><td>Earle&amp;rsquo; 염을 포함하고 L-글루타민이 제외된 배지로, 비신경세포 배양에 필요함</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td>비신경세포 배양용</td></tr><tr><td>소태아혈청</td><td>Invitrogen</td><td>16140-071</td><td>비신경세포 배양에 필요함</td></tr><tr><td>Nunclon &quot;Triple Flask&quot; 조직 배양 병</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-25</td><td>비신경세포 배양에 사용함. 이 플라스크는 &quot;조건화 Neurobasal 배지/B27&quot;를 제조할 때 매우 편리하지만, 다른 조직 배양 플라스크나 디쉬로 대체 가능함.</td></tr><tr><td>유리 바닥 &quot;이미징 디쉬&quot;</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td>유리 바닥의 35mm 배양 디쉬로, 도립 이미징 설정을 사용할 때 칼슘 또는 나트륨 이미징에 이상적임. 단, 가격이 비쌈!</td></tr></tbody></table>

dissociated 마우스 두피 신경 세포 배양의 준비

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

이 비디오는 후반 배아와 초기 출생 후의 마우스 두뇌의 대뇌 피질의 연결을 문화를 생성하는 과정을 통해 여러분을 안내할 것입니다. 이러한 문화가 immunocytochemistry, 생화학, 전기 생리학, 칼슘, 나트륨 이미징, 단백질 및 / 또는 RNA 격리를 포함하여 다양한 어플 리케이션에 사용될 수 있습니다. 이 문화는 또한 늦은 배아 또는 출생 후의 치명적인 유전자 변이를 가지고 유전자 변형 동물의 개발의 연결을 연구하는 플랫폼을 제공합니다. 절차는 상대적으로 바로 전달됩니다 조직 문화 기술의 경험을 필요로하고 당신이 제대로 준비가되어있다면 더 이상보다 두세 시간 걸릴 안됩니다. thalamo - 피질 섬유 트랙트에서 대뇌 피질의 껍질주의 분리 원치 않는 비의 연결을 세포의 수를 줄일 수 있습니다. 의 연결을 세포의 수율은 효소 인큐베이션 단계 뒤에 부드럽게 피질 조직의 조각을 씹다 증가합니다. 그것이 세포 상조의 연결을 세포 죽음에 불필요한 부상을 방지 등이 필수적입니다. 이러한 문화가 glia 피더 세포의 부재로 유지되므로, 그들은 또한 뉴런에서 풍부한 성장 문화의 추가 혜택을 제공합니다.

이 비디오는 후반 배아와 초기 출생 후의 마우스 피질에서 문화의 연결을 생성하는 절차를 보여줍니다. 이러한 문화가 immunocytochemistry, 생화학, 전기 생리학, 칼슘, 나트륨 이미징에 사용되며 출생 후의 치명적인 유전자 변이를 가지고 유전자 변형 동물의 개발의 연결을 연구하는 플랫폼을 제공하실 수 있습니다.

Dissociated 마우스 두피 신경 세포 배양의 준비

이 영상에서는 후기 배아 및 초기 출생 후 마우스 뇌로부터 피질 신경세포 배양물을 생성하는 과정을 안내합니다. 이 배양물은...

안녕하세요, 제 이름은 Hilgenberg입니다. 저는 캘리포니아 대학교 어바인(University of California at Irvine)의 해부학 및 신경생물학(Department of Anatomy Neurobiology) 과에서 근무하고 있습니다. 오늘은 생쥐를 이용한 피질 배양액 준비 방법에 대해 말씀드리겠습니다.이들은 뉴런을 분리하기 위해 준비한 생후 일수의 마우스들입니다. 일반적으로 이러한 배양 세포를 전기생리학적 분석이나 단백질 또는 RNA 준비에 사용합니다. 동일한 배양 준비물을 칼슘 이미징이나 나트륨 이미징에도 사용합니다.이 배양법의 장점은 실제로는 banker 프로토콜을 응용한 것이지만, 글리아 피더 세포 없이 배양한다는 점입니다. 덕분에 훨씬 편리하며, 배양물에는 보통 글리아 세포보다 뉴런이 더 풍부하게 포함됩니다. 그럼 이제 뉴런을 어떻게 준비하는지 보여드리겠습니다. 이제 뇌를 적출하여 실제 해부를 시작할 단계입니다.하지만 그전에, 이 세포들을 플레이팅하려는 커버슬립은 코팅되어 있어야 한다는 점을 언급하는 것이 중요합니다. 저희는 보통 실온에서 0.1 mg/mL 농도의 polylysine으로 하룻밤 동안 코팅을 진행했습니다. 그리고 다음 날 polylysine을 제거하고 커버슬립을 3회 연속으로 세척합니다.응용 분야에 따라 큰 접시나 작은 접시를 사용하거나, 유리 커버슬립을 사용할 수 있습니다. 이것이 후드의 일반적인 설정이며, 준비해야 할 솔루션과 뇌의 분리 또는 해부, 그리고 실제 뇌 절편 제작에 유용한 기구들에 대해 간략히 설명해 드렸습니다. 여기에 준비된 것은 냉각된 해부 용액입니다.보통은 얼음 위에 둡니다. 뇌를 절편화하는 데 필요한 진동 절편기(Vibratome slicer)가 있습니다. 뇌를 고정하고 절단하기 위해 해부 용액이 담긴 보트가 준비되어 있습니다.그리고 뇌 적출에 필요한 다양한 도구들이 있습니다. 뇌를 고정하는 데 사용하는 오거 플레이트(auger plate)가 있으며, 저는 4%auger를 사용합니다.주사기, 멸균 필터 몇 개, Rotman 종이 접시, 다양한 크기의 페트리 접시가 필요합니다. 그리고 이것은 마우스 파이프 히팅 툴입니다. 여기에는 풀드 글라스 피펫도 준비되어 있습니다.이것들은 해부 도구로 사용할 뿐만 아니라 뇌 조각을 집어 옮기며 반복적으로 작업하는 데 사용하는 유리 모세관입니다. 저희의 효소 용액에는 해부 용액이 포함되어 있습니다. 여기에는 papain을 활성화하기 위한 L cysteine과 pH를 조절하기 위한 0.1 normal sodium hydroxide가 들어 있습니다.pepane를 첨가하면 용액이 약간 불투명해지며, 조직을 효소적으로 분해하는 데 실제로 사용하기 전에 투명해져야 합니다. 이제 기본적으로 실험 절차를 시작할 준비가 되었습니다. fibro Slicer 준비가 완료되었습니다.뇌를 절단할 칼날을 삽입하였으며, 버퍼가 들어있어 뇌를 지지해 주는 용기를 아래에 받쳤습니다. 이제 뇌를 함께 지지하게 될 지지 플레이트에 AGA 블록을 장착할 준비가 되었습니다. 이 AGA는 경화된 상태이며, 4% AGA입니다. 이제 이와 같은 영역을 따라 그대로 절단하겠습니다.그리고 측면에는 기본적으로 직사각형의 오거(auger) 모양으로 컷아웃을 만듭니다. 그런 다음 스패튤라를 사용하여 오거 블록에서 이 조각을 떼어냅니다. 이제 오거의 평평한 면이 앞을 향하도록 하여 서포트 플레이트에 이 오거를 접착하겠습니다.이것이 뇌를 접착제로 고정하는 지지대이며, 이후 오거(auger)를 통해 제자리에 유지됩니다. 이런 방식으로 섹셔닝을 수행하면 뇌가 뒤로 밀리지 않습니다. 이제 뇌를 제거할 준비가 되었습니다.보통 P0 또는 P1 마우스를 사용합니다. 자, 이것이 머리가 분리된 마우스의 머리이며, 이제 빠르게 두피를 제거하겠습니다. 먼저 여기와 반대편에 있는 근육대를 절개하겠습니다.그런 다음 가위로 절개합니다. 가위의 안쪽 면이 뇌를 손상시키지 않도록 매우 주의하며, 양쪽 두개골 주변을 절개합니다.이제 연골을 집어 올릴 수 있습니다. 작은 ULA를 사용하여 이런 식으로 뇌를 제거합니다. 그런 다음, 이 뇌를 섹션 용액(section solution)을 채우고 바닥에 왓만(watman) 여과지를 깐 페트리 접시에 넣습니다. 이제 뇌의 기저부를 잘라내어, 숄더(shoulder)에 뇌를 고정할 수 있는 매끄럽고 평평한 면을 만들고자 합니다.이제 지지판 위에 순간접착제를 아주 소량 도포하겠습니다. 스패튤러를 사용하여 뇌를 들어 올릴 것이며, 이때 곡선 핀셋을 함께 사용하겠습니다. 우선 해부 용액으로 인해 남아 있는 과잉 액체를 제거한 다음, 뇌를 오거 지지대에 고정하겠습니다.이제 뇌를 완충액 조(buffer bath)로 옮길 준비가 되었습니다. 작은 용기에 해부 용액을 넣고, 뇌를 지지하는 지지대를 추가하겠습니다. 뇌가 칼날을 향하도록 고정되었습니다.이제 뇌가 고정되었으므로 fibro slicer를 사용하여 뇌의 시작 부분을 찾고, 뇌를 칼날 쪽으로 이동시키겠습니다. 후구(olfactory bulb)의 일부를 약간 절단했습니다. 이제 칼날을 약 600 µm 아래로 이동시켜 다시 한번 절단하며, 이 절단면은 피질(cortex)을 정확히 통과하게 됩니다.피질 부분이 날 위로 올라옵니다. 그리고 날을 600 µm 더 아래로 이동시켜 두 번째 섹션을 절단합니다. 이 과정은 중단 없이 연속적으로, 그리고 부드럽게 진행하는 것이 중요합니다.날을 뺄 때 파이버 슬라이서를 멈춥니다. 이제 유리 피펫을 사용할 것인데, 거꾸로 사용하겠습니다. 실제로 뒷부분을 이용하여 이 피질 절편을 위로 들어 올려 깨끗한 페트리 접시로 옮깁니다.P0 또는 P1 마우스의 경우, 약 5~6개의 절편을 수집할 때까지 600 µm 간격으로 뇌 조직을 계속 절단합니다. 그리고 피질의 맨 끝부분에 도달할 때까지 진행합니다. 이제 뇌의 나머지 부분에서 피질을 분리할 준비가 되었습니다.이제 해부 도구만큼 날카로운 연마된 유리 피펫을 사용하겠습니다. 보통 가장 작고 제거해야 할 후각 신경이 포함된 첫 번째 섹션부터 시작합니다. 또한 이 준비물에서 뇌수막을 제거하려고 합니다.다시 한번, 이 조각의 후각구(olfactory bulb)를 제거하며, 뇌수막에서 이를 벗겨냅니다. 때로는 쉽게 분리되지 않는 조각들이 있을 수 있는데, 그럴 때는 무리하지 말고 다음 단계로 넘어가 양호한 조각들만 남기십시오. 저는 항상 한쪽 끝에서 시작하여 한 구역씩 순차적으로 작업을 진행합니다.뇌수막을 제거하는 것이 중요합니다. 또한, 이러한 절편들을 살펴볼 때, 본 준비 과정에서 가급적 제외하고자 하는 비신경세포가 대부분 포함된 섬유 다발의 위치를 더 잘 확인하기 위해 절편을 뒤집어 볼 필요가 있습니다. 자, 이 절편에서는 피질층 아래에 있는 이 섬유 다발을 명확하게 확인할 수 있습니다. 따라서 저는 피질층이 끝나는 지점과 제가 가리키고 있는, 본 준비 과정에서 피하고자 하는 비신경세포가 밀집된 섬유 다발 사이를 정확히 찌릅니다.이제 섬유 다발을 남겨두기 위해 이 선을 따라 절단하겠습니다. 이 단계에서는 조직을 작은 정육면체 모양으로 잘게 다집니다. 좋습니다, 이제 주사기에 연결된 0.2 micron 필터를 통해 효소 용액을 멸균하겠습니다.그리고 제가 하는 것처럼 이를 피질 조각들에 바로 추가합니다. 모든 피질 조각들이 충분한 액체에 잠겨 있는지 확인하십시오. 그다음 이 피질 조각들을 37°C 인큐베이터에서 30분 동안 배양하는데, 이렇게 하면 조직이 상당히 느슨해질 것입니다. 이제 피질 조각들을 인큐베이터에서 배양한 지 30분이 지났습니다.그동안 저는 이 세포들이 최종적으로 들어갈 B 27 보충제가 포함된 neuro basal media를 데워 두었습니다. 또한 여기에 몇 가지 용액도 준비했습니다. 첫 번째는 박리액(dissection solution)입니다.따라서 이는 일반적인 박리 용액입니다. 그 후, BSA를 스캐벤저로 하고 NMDA 수용체 성분을 차단하기 위한 PV가 포함된 고농도 트립신 억제제 용액으로 옮깁니다. 그런 다음 저농도 트립신 억제제, BSA 및 PV가 포함된 용액으로 세 번 세척합니다. 이제 프로판 용액에서 이 조각들을 꺼내 DS 박리 용액이 들어 있는 원추형 튜브로 옮기겠습니다.이 덩어리들은 중력에 의해 아래로 내려가며, 튜브의 원뿔형 부분에 모두 가라앉을 때까지 1~2분 정도 걸릴 수 있습니다. 그 후 다시 덩어리들을 집어 올려 고농도 트립신 억제제가 포함된 용액으로 옮깁니다. 마찬가지로, 이 덩어리들이 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 기다려야 합니다.고농도 트립신 억제제 용액으로 한 번 더 세척한 후, 이 덩어리들을 저농도 트립신 억제제로 세척합니다. 마지막 세척과 저농도 효소 억제제 처리가 끝나면, 세포들을 미리 데워둔 신경 기저 배지로 옮기고 구경이 점차 작아지는 유리 모세관을 이용해 세포를 위아래로 통과시켜 기계적으로 분리하기 시작합니다. 이제 세포와 조직 덩어리들을 분리하겠습니다.하지만 그렇게 하기 전에, 여기서 보이는 모든 잔해물을 먼저 제거하겠습니다. 예를 들어, 세포에서 흘러나온 단백질과 DNA가 조직 덩어리에 달라붙어 솜뭉치 같은 물질을 형성합니다. 이러한 물질은 피펫 팁을 막아 조직이 더 좁은 직경을 통해 강제로 밀려 들어가게 하므로, 먼저 제거해야 합니다.그런 다음, 세포를 개구부 안팎으로 이동시키기에 적절한 크기의 입구를 만들기 위해 이 유리 모세관들 중 일부를 부러뜨릴 것입니다. 이것은 좋은 피펫입니다. 보시다시피 끝이 둥글고 날카로운 모서리가 없습니다.이것을 마우스 파이프 히터에 삽입하겠습니다. 그 사이에 0.2 micron 필터가 있으며, 이제 조직을 유리 모세관 안팎으로 이동시키겠습니다. 조직 덩어리들이 피펫 입구보다 그리 크지 않기 때문에 첫 번째 과정은 상당히 원활하게 진행될 것입니다.수행해야 할 모든 작업은 조직을 느슨하게 만드는 것입니다. 그런 다음 약간 더 작은 파이펫 팁을 사용하여 진입합니다. 이때 깨끗하고 둥근 형태의 파이펫 팁을 사용하는 것이 좋습니다.상태가 좋아 보입니다. 다시 한번 말씀드리자면, 모든 덩어리들은 한 번에 파이프 안팎으로 이동하게 됩니다. 이제 조직이 매우 부드러워지고 느슨해졌기 때문에, 이 덩어리들을 배지에 다시 현탁하면 세포들이 기본적으로 떨어져 나오게 됩니다.이제 분리된 모든 세포를 새로운 15 mL 원뿔형 튜브로 옮긴 후, 여전히 큰 덩어리로 뭉쳐 있는 세포들을 풀어주기 위해 위아래로 2~3회 정도 부드럽게 흔들어 줍니다. 그 다음, 아직 남아 있는 큰 조각들이 가라앉을 때까지 1~2분 정도 기다립니다. 또한, 파손된 유리 모세관에서 나온 유리 파편들이 있을 수 있으며, 이 역시 바닥으로 가라앉게 됩니다.그런 다음, 이를 분주하여 폴리리신(polylysine)이 완전히 코팅된 커버슬립이나 디시에 도말할 수 있습니다. 이전에 폴리리신으로 코팅된 유리 커버슬립에 80 µL를 도말하면 적절한 액적(bubble)이 형성됩니다. 세포는 시간이 지나면서 가라앉아 유리 커버슬립에 부착될 것입니다.약 1시간 후, 세포들이 가라앉으면 디시 전체에 배지를 아주 조심스럽게 추가하겠습니다. 이렇게 가볍게 흔들어 섞어 줍니다. 그런 다음 세포들을 37°C 인큐베이터에 넣고, 내일 조건화 배지를 공급하겠습니다.자, 여기 있는 것들이 피질 세포들입니다. 배양한 지 하루가 조금 안 되었습니다. 어제 플레이팅을 마쳤으며, 보시는 바와 같이 뉴런이 충분히 있고, 많은 수의 폐 뉴런들이 존재하며, 일부 세포 잔해들도 섞여 있습니다.이것들은 생존하지 못한 세포들입니다. 그리고 이들은 다음 몇 번의 배지 교체 과정에서 씻겨 나갈 것입니다. 죽은 세포들은 막이 쭈글쭈글한 매우 작은 원형 세포들입니다.지금까지 해리된 피질 배양물을 준비하는 방법을 보여드렸습니다. 뇌 절편에서 피질 껍질을 제거할 때, 비신경 세포가 많이 포함되어 있는 thumb sala 피질 섬유 통로로부터 분리하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 또한, 세포를 처리할 때 과도하게 처리하지 마십시오. 이는 그때까지 생성된 분리 세포의 대부분을 사멸시키기 때문입니다.따라서 조직 절편을 조심스럽게 다루면 훌륭한 배양 결과를 얻을 수 있을 것입니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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