부상-유도 노화 및 골격 근육에서 프로그래밍을 Vivo에서 의 평가

본 프로토콜의 전반적인 목적은 조직 손상 시 골격근에서 발생하는 생체 내 노화와 리프로그래밍을 모두 평가하는 것입니다. 이 방법은 근육 재생을 촉진하기 위해 세포 가소성을 어떻게 강화할 것인가와 같은 재생 의학 분야의 핵심 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 상주 환경 내의 노화 세포를 검출하고 정량화할 수 있는 신뢰할 수 있는 방법을 제공한다는 점입니다.

최근 세포 노화가 조직 수복 및 재생에 관여하는 것으로 밝혀졌습니다. 노화가 조직 수복과 재생에 어떻게 기여하는지에 대한 메커니즘을 이해하는 것은 재생 의학 분야에 분명히 큰 영향을 미칠 것입니다. 저희는 골격근 내 생체 내 리프로그래밍(in vivo reprogramming)에 조직 손상이 미칠 수 있는 잠재적 영향을 연구하던 중 처음으로 이 방법 아이디어를 얻게 되었습니다.

이 절차를 시작하려면, 근육 샘플 슬라이드를 PBS에 녹인 1% paraformaldehyde와 0.2% glutaraldehyde로 4분 동안 고정합니다. 그다음, 슬라이드를 PBS로 10분씩 2회 세척합니다. 이어서, pH 5.5의 PBS로 슬라이드를 30분 동안 세척합니다.

다음으로, 절편을 X-gal 용액과 함께 암실에서 37 °C로 최소 24시간 동안 배양합니다. 그 후, 슬라이드를 PBS로 3회 세척하며, 각 세척 시간은 10분으로 합니다. 그런 다음 1% paraformaldehyde가 함유된 PBS로 슬라이드를 30분 동안 후고정합니다.

마지막으로, 슬라이드를 PBS로 3회 세척합니다. 그 후, 슬라이드를 0.2% eosin 용액에 1분 동안 담가 대조 염색합니다. 그런 다음, 증류수로 짧게 헹굽니다.

수성 비형광 봉입제를 사용하여 슬라이드를 봉입합니다. 4%paraformaldehyde가 포함된 PBS로 10분 동안 슬라이드를 고정합니다. PBS로 2회 세척하며, 각 세척 시간은 10분으로 합니다.

그 후, 투과화 용액을 첨가하고 5분 동안 배양합니다. 이어서 슬라이드를 PBS로 5분씩 2회 세척합니다. 마지막 세척 단계에서는 0.25% BSA가 포함된 PBS 200 µL를 슬라이드 위에 직접 첨가하여 5분 동안 둡니다.

5% FBS가 포함된 PBS 내에서 1.25 µg/mL 농도의 1차 anti-Nanog 항체로 슬라이드를 4°C에서 하룻밤 동안 반응시킵니다. PBS로 슬라이드를 2회 세척하며, 각 세척 시간은 10분으로 합니다. 마지막 세척 시에는 0.25% BSA가 포함된 PBS 200 µL를 사용하여 5분 동안 세척합니다.

그 후, 즉시 사용 가능한 키트의 RAB-HRP 2차 항체 100 µL를 슬라이드에 처리하여 45분 동안 인큐베이션합니다. 이어서 2차 항체를 제거하기 위해 PBS로 슬라이드를 5분씩 3회 세척합니다. 그 다음, 즉시 사용 가능한 키트에 포함된 기질 완충액에 DAB를 희석합니다.

강하게 볼텍싱합니다. DAB 용액 100 µL를 각 슬라이드 위에 직접 첨가하고, 실온에서 최대 10분 동안 반응시킵니다. 다음으로, 슬라이드를 물로 헹구어 DAB 용액을 제거합니다.

슬라이드를 fast red 용액으로 2분 동안 대비염색합니다. 그다지 짧게 물로 다시 세척합니다. 이어서 95% ethanol로 5분 동안 탈수시킨 후, 100% ethanol로 5분씩 두 번 처리합니다.

그 후, 급결 마운팅 매질을 사용하여 슬라이드를 마운팅합니다. 배경 노이즈를 방지하기 위해 명시야 현미경의 20배 배율로 슬라이드를 관찰하십시오. 이 과정에서 슬라이드를 스캔하고, 조직의 무결성, 염색 및 대조 염색의 품질을 기준으로 각 슬라이드에서 가능한 한 최대 거리를 둔 최상의 품질을 가진 단면 두 개를 선택합니다.

이 두 단면에서 SA-Beta-Gal 양성 세포의 수를 세고 평균값을 계산하십시오. 그 다음, 가장 작은 양성 SA-Beta-Gal 세포와 가장 큰 양성 SA-Beta-Gal 세포를 수동으로 선택하여 픽셀 크기의 순위를 결정하십시오. ImageJ 인터페이스에서 Analyze, Tools, ROI Manager, Analyze, Set Measurement를 순서대로 클릭하십시오.

그 다음, Area를 선택합니다. 선택 도구를 사용하여 가장 작고 가장 큰 양성 SA-Beta-Gal 세포를 둘러싸고, Add를 클릭하여 ROI Manager에 추가합니다. 그 후, Measure 버튼을 사용하여 크기를 측정하고 나중에 사용할 수 있도록 해당 값을 저장합니다.

다음으로, 모든 가시적인 양성 세포가 선택되도록 임계값(threshold) 파라미터를 조정합니다. Image, Type를 클릭한 후 8-bit를 선택하여 이미지를 그레이스케일로 변환합니다. 그 후, Image, Adjust로 가서 Threshold를 선택합니다.

모든 양성 SA-Beta-Gal 세포가 빨간색으로 덮일 때까지 두 번째 커서를 이동한 후, Apply를 클릭합니다. Analyze, Analyze Particles를 차례로 클릭하고, Size를 선택하여 앞서 정의한 값을 적용함으로써 입자를 분석합니다. Circularity에 0.00-1.00을 입력하고 OK를 클릭합니다. 계수된 모든 입자의 요약 정보가 ROI Manager에 표시됩니다.

이제 선택한 모든 입자를 원본 이미지로 전송하십시오. 정확한 정량을 위해 선택 영역을 수동으로 조정하십시오. 양성 세포를 추가하거나 위양성 세포를 제거하십시오.

마지막으로, 선택 도구를 사용하여 해당 구역의 외곽선을 그려 면적을 측정합니다. ROI Manager에서 Add를 클릭한 다음 Measure를 클릭하십시오. 현미경 하에서 20배 배율의 명시야(brightfield) 이미지를 통해 Nanog 양성 세포의 수를 수동으로 측정합니다.

근육 손상 후 생체 내(in vivo) 리프로그래밍 및 노화 수준을 평가하기 위한 도식적 표현이 여기에 제시되어 있습니다. 여기에는 손상된 골격근의 동결 절편에서 SA-Beta-Gal 및 Nanog 염색의 대표적인 사진이 나와 있습니다. 이 이미지들은 에오신으로 대조 염색한 SA-Beta-Gal 염색과 fast red로 대조 염색한 Nanog 염색을 보여줍니다.

상단에는 손상되지 않은 근육이, 하단에는 손상된 근육이 표시되어 있습니다. 이 그래프는 부상 후 10일째의 연속 절편에서 SA-Beta-Gal 양성 세포와 Nanog 양성 세포의 정량 및 상관관계를 보여줍니다. 이 절차를 수행할 때는 염색의 특이성을 보장하기 위해 항상 음성 대조군을 포함하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 면역형광법이나 다양한 노화 마커의 선택과 같은 모든 방법을 모든 세포 유형에 적용함으로써, 노화 세포의 세포 정체성과 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 이러한 발전 이후, 이 기술은 노화 또는 조직 복구 및 재생 분야의 연구자들이 포유류에서 세포 노화가 어떻게 세포 가소성을 촉진하여 조직 복구 및 재생을 용이하게 하는지 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 따라서 이 영상을 시청한 후에는 생체 내(in vivo)에서 노화 세포와 리프로그래밍된 세포를 모두 식별하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.