Name: 부상-유도 노화 및 골격 근육에서 프로그래밍을 Vivo에서 의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 배우세요 골격 근육에서 부상 후 세포 노화와 재프로그래밍을 평가하는 방법을. 이 기술은 재생 의학 연구에서 세포 가소성을 향상시키고 조직 재생을 촉진하는 데 중요한 통찰을 제공합니다.

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우리는 Clemire Cimper에 그녀의 우수한 기술 지원에 대 한 빚을입니다. H.L.의 연구실에서 작업 파스퇴르, 검색 과학 센터 국가 부 라와 직원 회 드 라 검색 (응용 d'Excellence, 소생 Investissement d'Avenir;에 의해 투자 되었다 ANR-10-LABX-73), 직원 회 드 라 검색 (ANR-16-CE13-0017-01) 및 Fondation 호 (PJA 20161205028). 참조 및 교류는 박사에 의해 부활 컨소시엄에서 박사 장학 자금을.

동물 인 파스퇴르 (CETEA) 승인 프로토콜의 윤리 위원회와 유럽 공동체 지침에 의하여 처리 했다.
 1. 재고 솔루션의 준비 <ol><li>근육 샘플 고정을 위한 자료 준비. 20 mL 물 근육 고정을 위한 동결 포함 매체 수 있도록 RT에서 tragacanth 껌의 0.5 g을 녹.</li>
	<li>SA-β-Gal 얼룩에 대 한 솔루션을 준비.
	<ol><li>재고의 솔루션 K 3 Fe(CN) 6 (100 m m), K 4 Fe(CN) 6 (100 m m), MgCl 2 (1m) 증류수에 각각 분말을 용 해 하 여 준비.</li>
		<li>물에 희석 하 여 0.2% C 20 H 6 Br 4 나 2 O 5 (오신)의 재고 솔루션을 준비.</li>
		<li>없음 (dimethylformamide, DMF) C 3 H 7에서 X-여자 분말을 용 해 하 여 C 14 H 15 BrClNO 6의 재고 솔루션 (X-gal) (50 mg/mL)를 준비.</li>
		<li>저장소 K 3 Fe(CN) 6 및 4 ° C에서 K 4 Fe(CN) 6 솔루션 및 MgCl 2 실시간 
		참고: X 걸 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 약 수에 최대 6 개월. 오신 솔루션 RT에서 보관 하 고 필요한 경우 필터링 후 다시 사용할 수 있습니다. K 3 Fe(CN) 6 및 K 4 Fe(CN) 6 솔루션 protectedfromthe 빛을 있습니다. X gal 솔루션 물에서 불안정과 빛 으로부터 보호 되어야 했다.</li>
	</ol></li> <li>Nanog 얼룩에 대 한 솔루션의 준비: permeabilization 솔루션 포함 0.1% 나 3 C 6 H 5 O 7 (trisodium 시트르산), 0.1% C 14 H 22 O (C 2 H 4 O) n (n = 9-10) (Triton X-100) 증류수에 4에 저장 한다 ° c. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 실시간에 저장 한다 5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)에 포함 된 차단 솔루션 준비</li>
</ol> 2. 냉동 따 근육 섹션에 SA-β-Gal 얼룩 <ol><li>껌 코르크의 조각에는 tragacanth의 작은 금액을 삽입 하 여 타 근육에 대 한 고정 재료 준비.</li>
	<li>부 상자는 쥐 (2 달 오래 된, C57/B6) 남녀의 13 위에서 설명한 cardiotoxin (CDX)와 10 일 전에 부상을 했다. 동일한 마우스에서 아닌 부상 (PBS 주입) TA를 사용 하 여 부정적인 제어. Vivo에서 프로그래밍을 원하는 경우 치료 Dox (1 mg/mL)와 각 마우스 식 수에서 (빛에서 보호), 같은 날에 CTX 부상 직후. 
	참고: Dox 솔루션 7 일의 총 치료 기간 동안 3 일 마다 변경 될 필요가 있다.
	<ol><li>쥐 앞에서 설명한 ( 그림 1A) 13에서 두 따 근육 (부상 및 제어)를 분리. 가로 섹션을 확인, tragacanth 껌 따 근육의 원심 힘 줄을 삽입 하 고 ( 그림 1B) 밖에 서 근육의 약 ¾ 부분 두고 액체 질소에 직접 고정을 위한 isopentane 냉각 &#60; 1 분 
		참고: TA 근육은 코르크의 센터에 수직 위치에 다는 것을 확인 하십시오. 샘플-80 ° C 또는 직접 10 µ m 섹션에서 cryosectioned에 저장 될 수 있다.</li>
	</ol></li> <li>따 근육 그림 1B에 설명 된 대로 처리.
	각 슬라이드의 상단 왼쪽된 위치에 10 다른 슬라이드에 올바른 순서로 <ol><li>분포는 1 st-10 번째 섹션입니다. 첫 번째 슬라이드;에 11 번째 섹션 1 세인트 섹션에 인접 한 장소 12 번째 섹션 외에 두 번째 슬라이드에 2 nd 섹션 오른쪽 배치 순서를 따를 것 이다. 10 섹션/슬라이드 10 슬라이드 (총 100 섹션)에 대 한 첫 번째 섹션 및 마지막 섹션 사이의 최소 1 m m 거리를 보장 하기 위해 가져온 때까지이 프로세스를 반복 합니다.</li>
	</ol></li> <li>1 %paraformaldehyde 및 0.2%도 포함 하는 PBS에 4 분에 대 한 섹션을 수정. PBS, 2 x 10 분 씻어. 다음, PBS에 섹션을 품 어 (pH = 5.5) 30 분에 대 한 실시간에 모든 단계를 수행 
	참고: 고정 효소 활동을 유지 하기 위해 가벼운 수 있다. 후드 아래이 단계를 수행 합니다. PBS의 pH 중요 하 고 X-여자 솔루션 빛 으로부터 보호 되어야 합니다.</li>
	<li>X gal 솔루션 포함 하 품 섹션: 4 m m K3Fe(CN) 6, 4 m m K4Fe(CN) 6, 2 m MgCl2, m 및 400 µ g/mL X Gal에서 PBS, pH = 5.5. 3 x 10 분, 실시간에 PBS 가진 슬라이드 24 h. 세척의 최소 37 ° C에서 어둠 속에서 품 어 
	참고:는 인큐베이션 최소 24 시간을 필요 하며 SA-β-Gal 신호를 최대화 하기 위해 48 시간 동안 지속 될 수 있다. 솔루션 24 시간의 외피 후 변경 될 필요가 있다. 슬라이드는 빛 으로부터 보호 되어야 한다. SA-β-Gal 얼룩을 원하는 경우에 2.5 단계로 진행 합니다. 공동 Nanog와 얼룩을 원하는 하시기 바랍니다 앞으로 단계로 건너뜁니다 3.1.</li>
	<li>수정 슬라이드 1% paraformaldehyde PBS에서 30 분 세척에 대 한 슬라이드와 함께 PBS, 0.2% 오신와 3 x 10 분 Counterstain. 1 분 오신 솔루션에 슬라이드를 담가 그리고 증류수로 간단히 씻. 마지막으로, 수성 비 fluorescing 장착 매체와 슬라이드 마운트 (재료의 표 참조). 
	참고: 후 고정을 수행 하기 위해 필수적 이다. 후드 아래이 단계를 수행 합니다. 모든 단계를 실시간에 수행</li>
</ol> 3. Immunohistochemistry 안티 Nanog 항 체 <ol><li>PBS PBS, 슬라이드에 직접 permeabilization 솔루션의 2 x 10 분 추가 200 µ L 10 분 세척에 대 한 4 %paraformaldehyde 포함 된 슬라이드를 수정 하 고 5 분 동안 품 어. <ol><li>세척 PBS, 2 x 5 분와 마지막 세척, 사용 200 µ L PBS 포함 하는 슬라이드에 직접 0.25 %BSA에서 슬라이드. 실시간에서 이러한 모든 단계를 수행 
		주의: 후드 고정 단계 수행.</li>
	</ol></li> <li>기본 안티-Nanog 항 체와 품 슬라이드 (최종 농도: 1.25 ug/mL) 5%를 포함 하는 PBS에 4 ° C에서 하룻밤 FBS. PBS, 2 x 10 분와 슬라이드를 세척 하 고 마지막 세척에 사용 200 µ L PBS 0.25% BSA 5 분 수행에 대 한 포함 된 모든 세척 단계에서 실시간 
	참고: 증발을 방지 하기 위해 젖은 종이 타월로 상자에서 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>품 슬라이드 랩 HRP 이차 항 체의 100 µ L 사용 하 여 준비 키트 (재료의 표 참조) 45 분 세척에 PBS, 3 x 5 분와 슬라이드에 대 한 2 차 항 체를 제거. 빛에서 보호와 RT에서 모든 단계를 수행 하십시오.</li>
	<li>시각화 <ol><li>먼저는 3, 3을 희석 &#39;-diaminobenzidine (C 12 H 14 N 4 C 12 H 18 Cl 4 N 4 (4 HCl), 소량) 기판 버퍼에 키트 (20 µ L DAB의 기판 버퍼 솔루션의 1 ml)을 사용 하 여 준비에 의해 제공. 각 슬라이드에 직접 소량 솔루션의 100 µ L을 추가 하 고 실시간에 10 분의 최대 품 어 
		참고: 희석된 DAB 솔루션 갓 준비 한다 및 4 ° c.에 1 주까지 동안 저장 될 수 있다 보육 시간 배경 신호를 최소화 하기 위해 조정할 수 있지만 모든 슬라이드에 대 한 동일을 유지 합니다.</li>
		<li>물으로 rinsing 하 여 DAB 솔루션을 제거 합니다. Counterstain 빠른 빨간 솔루션 (준비가 사용 테이블의 자료를 참조 하십시오) 슬라이드 20 분 세척에 대 한 물 슬라이드 다시 짧게.</li>
		<li>5 m 95% 에탄올과 그들을 탈수합니다100% 에탄올, 2 x 5 분 뒤에. 마지막으로, 빠른 경화 설치 매체와 슬라이드 마운트 (재료의 표 참조).</li>
		<li>관찰 20 X 피하기 위해 배경에서 밝은 분야에서 현미경 슬라이드. 
		참고: 빠른 빨간 솔루션 RT에서 보관 및 다시 사용할 수 필터링 후.</li>
	</ol></li></ol> 4. 분석 및 정량화 <ol><li>SA-β-Gal 정량화 <ol><li>슬라이드를 검사 하 고 인수 이미지에 따라 각 슬라이드에 최고의 섹션을 선택 하십시오. 2 섹션/TA를 사용 하 여는 정량화에 대 한. 판사는 섹션 &#39; s 품질 조직 무결성, 얼룩, 및 counterstaining의 품질에 따라. 정량화에 대 한 전체 타 근육에 걸쳐 SA-β-Gal 정량화의 더 나은 표현 수 있는 샘플, 사이 최대 가능한 거리와 두 개의 최고 품질 섹션 선택.</li>
		<li>SA-β-Gal 긍정적인 세포 ( 그림 2)의 부 량.
		<li>확인 수동으로 작고 큰 긍정적인 SA-β-Gal 셀을 선택 하 여 픽셀 크기의 순위 <ol>.
			<ol><li>ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 스캔 한 슬라이드의 디지털 이미지를 엽니다.</li>
				<li>인터페이스에서 클릭 &#39; 분석 &#39; &#62; &#39; 도구 &#39; &#62; &#39; ROI 관리자 &#39; &#62; &#39; 분석 &#39; &#62; &#39; 측정을 설정 &#39; &#62; &#39; 선택 영역 &#39;. 선택 도구를 사용 하 고 작은 서라운드 및 큰 긍정적인 SA-β-Gal 셀을 클릭 하 여 ROI 관리자에 추가 &#39; 추가 &#39;. 측정 하는 사용 하 여 크기는 &#39; 측정 &#39; 버튼 하 고 나중에 사용에 대 한 값을 저장.</li>
			</ol></li> <li>모든 보이는 긍정적인 셀 선택 되도록 임계값 매개 변수를 조정.
			<li>변환을 클릭 하 여 그레이 스케일 이미지 <ol>&#39; 이미지 &#39; &#62; &#39; 유형 &#39; &#62; &#39; 8 비트 &#39; ( 그림 2A). 다음에 서 &#39; 이미지 &#39; &#62; &#39; 조정 &#39; &#62; &#39; 임계값 &#39;, 모든 긍정적인 SA-β-Gal 셀 레드 ( 그림 2B)에 덮여 때까지 두 번째 커서를 이동한 다음 클릭 합니다 &#39; 적용 &#39;.</li>
				<li>클릭 하 여 분석 입자 &#39; 분석 &#39; &#62; &#39; 분석 입자 &#39; &#62; &#39; 크기 (픽셀 ^2) &#39;, 그리고 단계 4.1.2.1에에서 정의 된 값을 적용, 입력 &#39; 순환 &#39;: &#39; 0.00-1.00 &#39;, 클릭 &#39; 확인 &#39;; 모든 요약 한는 계산된 입자 ROI 관리자 ( 그림 2D)에 표시 됩니다.</li>
			</ol></li> <li>원본 이미지에 모든 선택 된 입자를 전송. 정확한 부 량을 수동으로 선택 영역을 조정 합니다. 긍정적인 세포 (녹색 화살표, 그림 2E)를 추가 및/또는 거짓 긍정적인 세포 (빨간 화살표, 그림 2E) 제거. 마지막으로, 사용 하 여 섹션 ( 그림 2D)으로 표시 하 여 영역을 측정에서 &#39; 선택 도구 &#39;. 클릭 &#39; ROI 관리자 &#39; &#62; &#39; 추가 &#39; &#62; &#39; 측정 &#39;.</li>
			<li>섹션의 영역에 의해 긍정적인 셀의 수를 중요 한 것은, 정상화.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Nanog 정량화 <ol><li>20 배 확대에 수동으로 밝은 분야에서 현미경 Nanog 긍정적인 셀. 
		참고: 빠른 빨간 counterstaining TA 근육의 형태학의 좋은 평가 수 있습니다. 그러나, 얼룩이 지는 아주 가벼운 이며 명확한 개요 섹션의 부족. 스캐너는 종종 섹션의 경계를 식별 하 실패 하 고 제대로 초점을 수 없습니다. 스캔 하기 전에 섹션의 가장자리를 원 하거나 더 민감한 스캐너 섹션을 사용 하 여 마커를 사용 하 여 가능 하다. 현재 프로토콜에 대 한 그것은 가장 효율적 Nanog 긍정적인 세포를 수동으로 계산.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Munoz-Espin, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence%3A+from+physiology+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence: from physiology to pathology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).</li>
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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

여기, 선물이 모두 노화를 검출 하는 방법 및 pluripotent 줄기 세포 재프로그래밍 쥐의 골격 근육. 이 방법은 평가 척도 모두 노화 세포가 소성에 vivo에서, 유도 그리고 조직 수리 및 재생에 노화의 역할을 검토 사용 될 수 있습니다.
현재 프로토콜 골격 근육에 노화 세포 vivo에서 감지 하 노화 관련 된 β-galactosidase (SA-β-Gal) 분석 결과 사용 합니다. 이 분석 결과 중형 pH 6.0 (5.5), 연관 특히 노화 세포,이 효소의이 활동은 일반적으로 산 성 pH 4.516,17에서 측정 하는 동안에 증가 lysosomal β-galactosidase 활동을 감지 합니다. 따라서, 그것은 pH를 조정 하는 것이 중요 (pH = 6 또는 5.5) 노화 관련 활동의 특정 한 탐지를 위해. 또한, 카운터 오신와 얼룩...

세포 노화 스트레스 응답 안정적인 세포 주기 검거가 특징의 한 형태입니다. 지난 10 년간에서 연구는 단단히 설립 노화 배아 개발, 섬유 증, 및1,2노화 하는 유기 체를 포함 하 여 다양 한 생물 학적 및 병 적인 프로세스와 연결 된. 세포 노화는 그들의 일차 수명 telomere 단축3에 의해 실행의 끝에 인간의 섬유 아 세포에서 처음 확인 되었다. 일차 스트레스, 노화, DNA 손상, 산화 스트레스, 종양 신호는의 결국에 p53/p21 또는 pRB 통로 활성화 하는 게놈/epigenomic 변경 등을 일으킬 수 있는 다른 많은 자극 있습니다. 설정 하 고 영구 성장 체포1강화. 노화 세포의 중요 한 특성 중 하나는 그들은 metabolically 활성 상태로 유지 하 고 견고 하 게 표현 하는 노화에 관련 된 분 비 형 (SASP): 많은 염증 성 cytokines, 성장 인자, 세포 외 매트릭스의 분 비 요인4. SASP 요소를 중재 하 고 면역 세포를 유치 하 고 지역 및 조직의 조직 milieus1변경에 그들의 강력한 효과 인해 노화 효과 증폭에 중요 한 역할을 제안 되었습니다. 흥미롭게도, 노화 최근 제안 되었습니다 조직 수리 및 재생5,6에 대 한 중요 한 것. 또한, 우리를 포함 한 여러 연구소에서 데이터 조직 손상-유도 노화 세포가 소성, SASPs, 재생7-9홍보를 통해 강화 수 있습니다 제안 했다. 따라서, 모든 신흥 데이터 노화 비보의 중요성을 강조 표시 합니다.
게시물 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 시대에 세포가 소성은 새로운 정체성을 획득 하 고 두 문화 그리고 vivo에서10에 다른 자극에 노출 되 면 대체 운명 채택 셀의 능력 이다. 그것은 알려져 그 전체 프로그래밍 하 달성 vivo에서11,12, 수 어디의 표현은 4 야 마나카 요소를 포함 하는 카세트: Oct4, Sox2, Klf4및 c-Myc (OSKM) 유도 수 비보에 여러 장기에 teratomas 형성을 촉진. 따라서, 중요 한 레 귤 레이 터와 셀룰러 소성11에 대 한 중요 한 경로 식별 하는 강력한 시스템으로 재프로그래밍 마우스 모델 (i4F)를 사용할 수 있습니다.
적합 하 고 민감한 vivo에서 시스템은 어떻게 세포 노화를 이해에 필수적인 조직 재생의 맥락에서 세포가 소성을 조절. 여기, 우리는 강력한 시스템 및 노화와 조직 재생의 맥락에서 셀룰러 소성 사이의 링크를 평가 하는 상세한 프로토콜 제시. 유도 하는 cardiotoxin (CTX)의 조합 근육 손상 Tibialis 앞쪽 (TA) 근육 그룹, 조직 재생, i4F 마우스 모델을 공부 하 고 잘 설립 시스템에에서 수 세포 노화와 생체 내에서 의 검색 근육 재생성 하는 동안 프로그래밍.
세포가 소성 및 노화 사이의 링크를 평가 하려면 i4F 마우스 급성 근육 손상을 유발 하는 CTX 부상 되며 doxycycline (0.2 mg/mL) 7 일 이상 vivo에서 재프로그래밍을 유도 하는 것으로 치료. CTX 급성 근육 손상을 유발 하는 동안 재생 프로토콜 윤리적인 이유를 위해 최근에 출판 된13되었습니다 현재 프로토콜에이 절차를 생략 됩니다. 노화 세포의 피크 이전 관찰 되었습니다14때 따 근육 샘플 10 일 게시물 부상13, 수집 됩니다. 여기,이 상세한 프로토콜 (SA-β-Gal)를 통해 노화의 수준 및 재활 (IHC Nanog의 얼룩)를 통해 평가 하는 데 필요한 모든 단계를 설명 합니다.
노화 관련 베타-galactosidase (SA-β-Gal) 분석 결과 문화 그리고 vivo에서15에 노화 세포 모두를 감지 하는 가장 일반적으로 사용 되 분석 결과가 이다. 다른 분석 실험에 비해, SA-β-Gal 분석 결과 그대로 조직 아키텍처, vivo에서 학문에 대 한 특히 중요 한 그들의 네이티브 환경에서 노화 세포의 식별 수 있습니다. 또한, IHC를 사용 하 여 다른 표식으로 SA-β-Gal 분석 결과 하 가능 하다. 그러나, SA-β-Gal 분석 결과 주요 제한 남아 있는 신선 또는 냉동 샘플 필요지 않습니다. 신선 또는 냉동 조직 냉동된 따 근육 샘플 같은 정기적으로 사용할 수 있을 때, SA-β-Gal은 명백히 노화 세포를 감지 하는 가장 적합 한 분석 결과 이다. Nanog는 두 가지 이유로 reprogramed 셀을 검출 하는 데 사용 하는 마커: 1) 그것은 pluripotency;에 대 한 필수적인 마커 2) 더 중요 한 것은, 그 표현 doxycycline (dox)에 의해 구동 하지 않으면, 따라서 유도 pluripotency 보다는 야 마나카 카세트의 강제 식 감지.
그것은 중요 한 것,이 연구에서 제시 하는 얼룩 프로토콜 정량화 절차를 단순화 하기 위해 별도로 실시 될 수 있지만 모두 노화를 시각화 하는 공동 얼룩 절차 및 pluripotent 줄기 세포 동일한 섹션에서 수행할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>K3Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>13746-66-2</td><td>SA-&beta용; Gal 염색 용액</td></tr><tr><td>K4Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>14459-95-1</td><td>SA-&beta용; Gal 염색 용액</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>7786-30-3</td><td>SA-&beta용; Gal 염색 용액</td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Sigma</td><td>B4252</td><td>SA-&beta용; Gal 염색 용액</td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Sigma</td><td>D3447</td><td>생체 내 재 프로그래밍 유도</td></tr><tr><td>용 Cardiotoxin</td><td>Lotaxan Valence, France</td><td>L8102</td><td>근육 부상</td></tr><tr><td>용 글루 타르 알데히드</td><td>시그마</td><td>111-30-8</td><td>고정 용액</td></tr><tr><td>파라 포름 알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>50-980-487</td><td>고정 용액</td></tr><tr><td>NaCitrate : Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre</td><td>Sigma</td><td>18996-35-5</td><td>투과화 용액</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td>투과화 용액</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A3608</td><td>세척 용액</td></tr><tr><td>항체 항나노</td><td>세포 신호 8822S</td><td></td><td>Rabbit monoclonal 항체</td></tr><tr><td>EnVision+ Kits (HRP. 토끼. DAB+)</td><td>Dako</td><td>K4010</td><td>나노그 계시</td></tr><tr><td>Eosin 1%</td><td>Leica</td><td>380159EOF</td><td>카운터 스테인닝</td></tr><tr><td>빠른 빨간색</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-3403</td><td>카운터 스테인닝</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Immu-Mount</td><td>Fisher 과학</td><td>9990402</td><td>마운팅 솔루션</td></tr><tr><td>빠른 경화 마운팅 매체 현미경 검사용 : Eukitt&reg;</td><td>Sigma</td><td>25608-33-7</td><td>마운팅 솔루션</td></tr><tr><td>현미경 위상차 명시야 CKX41: 10X-20X-40X 대물렌즈</td><td>나노 정량화를 위한</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td> 현미경</tr><tr><td>마우스: i4F-A</td><td>Abad et al., 2013</td><td>N/A</td><td>재프로그래밍 가능한 마우스 모델</td></tr><tr><td>골격근, 경골 전방</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 스캐너</td><td>Zeiss</td><td>Axio Scan Z1</td><td>슬라이드 스캔</td></tr></tbody></table>

부상-유도 노화 및 골격 근육에서 프로그래밍을 vivo에서 의 평가

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

세포 노화는 안정적인 세포 성장 체포, 암과 노화 등 많은 생리와 병리학 과정에 대 한 중요 한 특징은 스트레스 반응이 다. 최근, 노화 또한 조직 수리 및 재생에 연루 되었습니다. 따라서, 그것은 점점 노화 세포에 vivo에서식별에 중요 한 되고있다. 노화 관련 된 β-galactosidase (SA-β-Gal) 분석 결과 노화 세포 모두 문화에 vivo에서감지 하는 가장 널리 사용 되 분석 결과가 이다. 이 분석 결과 기반 노화 세포에서 증가 lysosomal 내용을 lysosomal β-galactosidase 활동의 조직화 학적인 탐지 중형 pH 6 (5.5)에서 수 있습니다. 다른 분석 실험, cytometry, 같은 비교 관련 조직 구조, 형태, 위치와 같은 중요 한 정보를 제공 합니다 그들의 거주 환경에 노화 세포의 식별 수 있습니다 그리고 커플링 immunohistochemistry (IHC)를 통해 다른 마커와 가능성. SA-β-Gal 분석 결과의 주요 한계는 신선 또는 냉동 샘플의 요구 사항입니다.
여기, 우리가 어떻게 세포 노화를 이해 하는 상세한 프로토콜 현재 셀룰러 소성 및 조직 재생 비보를 촉진. SA-β-Gal 사용 하 여 조직 재생 연구에 기초가 튼튼한 시스템은 부상 시 골격 근육에 노화 세포를 감지. 또한, IHC 사용 하 여 유전자 변형 마우스 모델에서 Nanog, 만능 줄기 세포의 마커를 감지. 이 프로토콜 검사 하 고 세포 노화 유발된 세포가 소성 그리고 vivo에서 프로그래밍의 맥락에서 정할 수 있습니다.

근육 부상 유발 세포 노화를 감지
그것은 최근에 입증 되었습니다 근육 부상을 과도 세포 노화14유도. 10 일 후 부상 (DPI)에서 손상 된 myofibers의 대부분 위치 핵, myofibers, 재생의 품질 증명으로 재생을 겪고 있다 그리고 근육의 아키텍처는 다시 설립. 침투 염증 세포는 특정 지역에 표시 하면서 극적으로 감소 된다. 10 DPI 있기 때문에 적은 괴 사 성 및 염증 성 세포는 얼룩과 방해 하는 근육에 SA-β-Gal에 의해 노화 세포를 감지 하는 좋은 시간 점입니다. 얼룩의 특이성을 결정, TA 같은 마우스 (그림 1A)에서 PBS를 주입 중요 한 부정적인 통제로 사용 됩니다.
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여기 선물이 모두 노화를 감지 하는 상세한 프로토콜 및 만능 줄기 세포 유도 vivo에서 프로그래밍 하는 동안 부상에 골격 근육. 이 메서드는 조직 재생성 하는 동안 세포 노화의 역할을 평가 하 고 vivo에서프로그래밍에 적합 합니다.

부상-유도 노화 및 골격 근육에서 프로그래밍을 Vivo에서 의 평가

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

본 프로토콜의 전반적인 목적은 조직 손상 시 골격근에서 발생하는 생체 내 노화와 리프로그래밍을 모두 평가하는 것입니다. 이 방법은 근육 재생을 촉진하기 위해 세포 가소성을 어떻게 강화할 것인가와 같은 재생 의학 분야의 핵심 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 상주 환경 내의 노화 세포를 검출하고 정량화할 수 있는 신뢰할 수 있는 방법을 제공한다는 점입니다.최근 세포 노화가 조직 수복 및 재생에 관여하는 것으로 밝혀졌습니다. 노화가 조직 수복과 재생에 어떻게 기여하는지에 대한 메커니즘을 이해하는 것은 재생 의학 분야에 분명히 큰 영향을 미칠 것입니다. 저희는 골격근 내 생체 내 리프로그래밍(in vivo reprogramming)에 조직 손상이 미칠 수 있는 잠재적 영향을 연구하던 중 처음으로 이 방법 아이디어를 얻게 되었습니다.이 절차를 시작하려면, 근육 샘플 슬라이드를 PBS에 녹인 1% paraformaldehyde와 0.2% glutaraldehyde로 4분 동안 고정합니다. 그다음, 슬라이드를 PBS로 10분씩 2회 세척합니다. 이어서, pH 5.5의 PBS로 슬라이드를 30분 동안 세척합니다.다음으로, 절편을 X-gal 용액과 함께 암실에서 37 °C로 최소 24시간 동안 배양합니다. 그 후, 슬라이드를 PBS로 3회 세척하며, 각 세척 시간은 10분으로 합니다. 그런 다음 1% paraformaldehyde가 함유된 PBS로 슬라이드를 30분 동안 후고정합니다.마지막으로, 슬라이드를 PBS로 3회 세척합니다. 그 후, 슬라이드를 0.2% eosin 용액에 1분 동안 담가 대조 염색합니다. 그런 다음, 증류수로 짧게 헹굽니다.수성 비형광 봉입제를 사용하여 슬라이드를 봉입합니다. 4%paraformaldehyde가 포함된 PBS로 10분 동안 슬라이드를 고정합니다. PBS로 2회 세척하며, 각 세척 시간은 10분으로 합니다.그 후, 투과화 용액을 첨가하고 5분 동안 배양합니다. 이어서 슬라이드를 PBS로 5분씩 2회 세척합니다. 마지막 세척 단계에서는 0.25% BSA가 포함된 PBS 200 µL를 슬라이드 위에 직접 첨가하여 5분 동안 둡니다.5% FBS가 포함된 PBS 내에서 1.25 µg/mL 농도의 1차 anti-Nanog 항체로 슬라이드를 4°C에서 하룻밤 동안 반응시킵니다. PBS로 슬라이드를 2회 세척하며, 각 세척 시간은 10분으로 합니다. 마지막 세척 시에

evaluation-injury-induced-senescence-vivo-reprogramming-skeletal

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

마이크로 해부 explants 기술은 골격 근육 줄기 세포의 원천으로 청소년, 성인이나 배아 근육에서 proliferative 골격근 세포를 분리를위한 강력하고 안정적​​인 방법입니다. 유니 클리,이 세포는 clonally 생체내 이식에 사용되는 골격 근육 줄기 세포 라인을 생산하기 위해 파생되었습니다.

성인 및 배아 골격근의 Microexplant 문화 및 골격 근육 줄기 세포의 분리

유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)유래 한 근생 선조는 근 이영양증을 치료하는 세포 치료 전략에 대한 유망한 후보입니다. 이 프로토콜은 급성 및 만성 근육 재생의 마우스 모델에서 iPSC 유래 메소포아세포(근육 선조의 일종)의 이식 및 분화를 평가하는 데 필요한 이식 및 기능측정을 설명합니다.

근육 재생의 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 유래 메소안지오블라스트 와 같은 근생 성 전구의 이식

골격 근육은 운동을 위해 필수적이며, 몸의 주요 단백질 저장소입니다. C. elegans의 내 근육 건강 측정이 설명되어 있습니다. 근육의 구조와 기능에 대한 전향 적 변화는 지역화 된 GFP 및 양이온 성 염료를 사용하여 평가됩니다.

방법은 근육의 세포 내 구획을 평가하기 위해 C. 엘레

이 프로토콜은 성인과 노인의 골격 근육에서 분리 및 근원 세포의 전구 세포의 문화의 강력한 재현하고 간단한 방법을 설명합니다. 여기에 사용되는 근육은 발과 다리 근육을 포함한다. 이 방법은 기능 연구를위한 주요 근육 아세포의 풍부한 인구의 분리를 할 수 있습니다.

성인 및 노인 인간의 골격 근육에서 근육 조직 전구체 세포 / 차 근육 아세포의 준비 및 문화

우리는 우리가 전화 최소한 침략 적 근육 포함 (MIME), 골격 근육 조직 기증자 세포 중재 하는 myogenesis로 이식 때 용이 하 게 수 있는 가능한 조직적 셀을 포함 하는 증거에 근거 하는 소설 실험 기법을 설명 호스트 근육입니다.

최소한 침략 적 근육 (MIME) 포함-기증자 세포 중재 하는 Myogenesis를 촉진 하기 위하여 새로운 실험 기법

쥐 골격 근육 수축 기능의 측정 치료 개입의 효능 뿐만 아니라 질병의 진행을 추적 하는 데 사용할 수 있는 유용한 도구입니다. 여기 같은 마우스에서 시간이 지남에 따라 반복 될 수 dorsiflexor 근육의 비-침략 적, vivo에서 평가 설명 합니다.

비-침략 적 쥐에서 Dorsiflexor 근육 기능 평가

골격 근 재생 조직 상주 근육 줄기 세포에 의해 구동, 근육 이영양증 등 많은 근육 질환에서 손상 되는, 그리고이 재생 하는 근육의 무능력 결과. 여기서는 근육 질환의 제브라피시 모델에서 근육 재생을 검사할 수 있는 프로토콜을 설명합니다.

근육 질환의 제브라피시 모델에서 근육 재생 검토

이 프로토콜에서 근육 줄기 세포에 대한 체외 배양 및 기능 분석 방법이 설명되어 있어 내인성 틈새 시장을 통해 대부분의 상호 작용을 보존합니다.

성인 근육 줄기 세포 기능 전 비보의 평가를위한 단일 근섬유 배양 분석

골격근은 상주 줄기세포를 포함한 여러 세포 유형으로 구성되어 있으며, 각 세포 유형은 근육 항상성과 재생에 특별한 기여를 합니다. 여기에서는 근육 줄기 세포의 2D 배양과 생리학적, in vivo 및 환경적 특성의 많은 부분을 보존하는 ex vivo 환경에서의 근육 세포 틈새에 대해 설명합니다.

틈새 및 줄기 세포 정지를 재현하기 위한 쥐 골격근의 분획되지 않은 대량 배양

이 프로토콜의 목표는 구강 안면 근육 섬유증 모델을 확립하는 것입니다. 생쥐 교근과 경골 전방 근육 간의 조직학을 비교한 결과, 동결 손상 후 교근 섬유화가 확인되었습니다. 이 모델은 구강 안면 근육 섬유증의 기저에 있는 메커니즘에 대한 추가 연구를 용이하게 할 것입니다.

구강 안면 근육 섬유증 모델을 확립하기 위해 마우스 교근의 동결 손상

배우세요 골격 근육에서 부상 후 세포 노화와 재프로그래밍을 평가하는 방법을. 이 기술은 재생 의학 연구에서 세포 가소성을 향상시키고 조직 재생을 촉진하는 데 중요한 통찰을 제공합니다.

부상-유도 노화 및 골격 근육에서 프로그래밍을 Vivo에서 의 평가

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