Name: 간단 하 고 복잡 한 DNA 손상에 세포질 응답 Vivo에서 공부 레이저 Microirradiation (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 배우세요 레이저 미세조사를 이용한 DNA 손상 유도 및 세포질 응답 분석 방법입니다. 실시간 고해상도 단세포 분석으로 손상 인식, 신호 전달, 복구 인자 동원 과정을 연구할 수 있습니다.

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우리는 GFP NTH1 식 플라스 미드에 대 한 토 호 쿠 대학, 일본에서 야 스도 아키라 박사 및 박사 에로스 Lazzerini Denchi 스 크립 스 연구소, 라 Jolla, 캘리포니아 TRF2 YFP EGFP 53BP11220-1711 식 플라스 미드에 대 한 감사합니다. 이 작품은 공군 사무실의 과학적 연구 (FA9550-04-1-0101)와 베크만 레이저 연구소 Inc. 재단 (M.W.B), 과학 (B.A.S), 하 고 NSF MCB 1615701 CRCC 국립 아카데미에서 포드 기초 장학금에 의해 지원 되었다 음악원-17-426665 (K. Y.)에.

저자는 공개 없다.

레이저 microirradiation DDR 연구에 대 한 사용의 장점은 다음과 같습니다.
1. 그것은 가능한 다양 한 종류를 유도 하 고 양의 DNA가 복잡 한 DNA 손상, 간단한 가닥 나누기에서 손상 감지 다른 수리 DNA에서 파손 사이트 레이저 조사 매개 변수를 조정 하 여. ( 그림 3)에서 트랜스 효과 평가 하기 위해 여러 번 같은 셀 핵에에서 피해를 입힐 수 이기도 합니다.
2. 중요 한 것은, 피해 사이트와 다른 핵에서 발생 하는 2 차 이벤트에 이벤트 쉽게 구분할 수 있습니다.
3. 그것은 포함 하 여, 단일 세포 수준에서 손상에 대 한 응답에 붙일 태그가 단백질 역동성의 고해상도 실시간 측정 수행 가능 하지만에 국한 되지 않음: 포스터 공명 에너지 전송 (무서 워), 형광 일생 화상 진 찰 ( ...

Vivo에서 DNA 손상 신호는 잘 이해 되지 Vivo에서, DNA는 히스톤과 양식 chromatin 섬유에 다른 요인 complexed. Chromatin 구조의 규정은 DNA 물질 대사에 대 한 파라마운트의 중요성입니다. 예를 들어 히스톤 변형 H2AX 증-오점이 돌연변이 (ATM)와 다음 이중 가닥 (DSB) 유도, 휴식과 DSB 손상 신호 증폭으로 다른 도킹 사이트를 제공 하는 것이 중요 하다 다른 kinases phosphorylated은 요인입니다. 손상 신호 및 복구 통로 선택의 확산 비판적으로 피해 사이트1에서 로컬 chromatin 구조에 의해 영향을 받을 것으로 보인다. 다양 한 요인, 히스톤 보호자 및 히스톤 수정 효소를 개장 하는 chromatin 실제로 사이트 손상 모집 DDR에서 chromatin 규제의 중요성을 강조 하는 효율적인 DNA 수리를 위해 중요 한 및 복구2 , 3 , 4. 또한, 피해 사이트 클러스터링 또는 재배치 효 모와 초파리5,6,7,8, relocalization에 유전자 loci의 연상에서 관찰 되었다는 subnuclear 구획 연관 유전자 규칙9,10. 마우스와 인간 세포에 있는 최근 연구는 또한 DSB 사이트, 어느 영향 복구 충실도 및 통로 선택11,12의 동원을 공개 했다. 이 DDR/수리도 연결 될 수 있습니다 속속들이 핵 건축, 더 높은 순서 chromatin 조직과 염색체를 세포 핵에 역학 가능성 제기. 따라서, DDR을 연구 하 고 DNA 손상의 단기 및 장기 결과 이해 하기 위해서는 살아있는 세포에서 핵 생 환경에 프로세스를 복구 고해상도 방법을 개발 하기 위해 중요 하다.
파 중 합 효소 (PARP) 손상의 유형과 정도 측정 하 고 규제 피해 사이트에 단백질 조립에의 중요 한 역할 PARP1는 DNA 수리13에서 중요 한 역할을 담당 하는 DNA 손상에 의해 빠르게 활성화 DNA 닉 센서입니다. PARP1 원래 x 선 수리 크로스 보완 1 (XRCC1) 기본 절단 수 선 (BER)를 촉진 하기 위하여 함께 작동 생각 하지만 최근 연구 결과 공개 DSB 수리14를 포함 하 여 다른 DNA 복구 경로에서 역할. 자신을 포함 한 여러 대상 단백질, ADP ribosylate는 기판으로 PARP1 사용 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD+)을 활성화. 이 효소와 다른 가족 구성원 있다 관심을 끌었다 많은 최근 몇 년 동안에서 PARP 억제제는 암에 대 한 유망 치료 약물 등장 했습니다. PARP 억제제 처음 유 방 암 유전자 (BRCA)에 효과가 있어야 발견 했다 비록-유 방 암 세포를 돌연변이 지금 에이전트/조사에 대 한 손상 DNA와 함께 모노-및 조합 치료에 그들의 효과 대 한 증거의 과다 한입니다 BRCA15,,1617,18,19,20을 돌연변이와 암의 광범위 한 스펙트럼.
분자 수준에서 PARP 활성화 조직 손상 사이트에서 로컬 chromatin 구조에 중요 한 역할을 표시 했다. Chromatin 변경 효소의 파 종속 모집 DSB 수리를 용이 하 게 하 고 지시 복구 경로 선택, 파 수정 피해 사이트에서의 중요 한 발판 역할을 제안 합니다. 13,21,22,23,,2425,26,27,28,29, 30,31 우리는 최근 손상에서 p53 바인딩 단백질 1 (53BP1)의 배제를 시연 파 32, 비 동종 endjoining (53BP1-종속 hyperactivation에 대 한 대체 설명을 제공 하 여 사이트 NHEJ) 의해 PARP 억제제 및 DSB에 PARP의 중요성을 강조 복구 통로 선택33,34. PARP1 또한 PARylates 및 활동의 여러 DNA 복구 직접 요인14.
DDR/수리에서 Vivo에서 공부 하는 도구로 서 레이저 Microirradiation를 사용 하 여 개별 염색체에 서브 미크론 변경 생산 레이저 microirradiation 196935 에 설명 된 처음 이었고 198136에 자세히 검토. 몇 십년 후, 레이저 microirradiation 세포 핵에 정의 된 submicrometer 지역에서 DNA 손상 유도 표시 했다 고 모집 또는 수정 다양 한 요인의 DNA 병 변 비보 를 연구 하는 귀중 한 기술 입증 되었다 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41.이 메서드는 손상 사이트39,42에서 뚜렷한 방사선-유도 포커스 (IRIF)를 형성 하지 않습니다 그 요인의 탐지를 수 있습니다. 그것은 또한 손상 사이트에서 고 핵의 나머지에서 chromatin 구조 변화 spatiotemporal 역학 검사 가능. 우리는 신중 하 게 다른 레이저 시스템에 의해 유도 된 Ddr에 비해 DNA 손상의 유형 및 microirradiation 조건32,,4344, 사이의 관계를 평가 하는 능력을 입력 하 고 45. 53BP1 및 telomeric 탈 채용 패턴 반복 바인딩 요소 2 (TRF2) 레이저 유도 손상46의 "비 생리" 자연에 대 한 되풀이 우려에 대 한 기초를 제공 하는 이전 레이저 손상 연구에서 관찰 되었다 ,47,,4849. 우리는 양과 복잡성 유발된 손상32의 계기 신호 이러한 명백한 불일치 이제 차동 PARP에 의해 설명 될 수 있는 발견. 우리 확인: 1) (높은 입력 전력 조사) 후에 레이저 microirradiated 세포 손상 검사점 제어 종속 방식에서 interphase에 체포와 유지 가능한 (적어도 48 h까지)32,50; 그리고 2) 수리 계수 모집/수정 충실 하 게 그 endonucleases32,,3942에 의해 기존의 DNA 파괴적인 대리인을 가진 처리와 DSB 유도 관찰 정리 44,50,,5152. 이러한 결과 강하게 레이저 손상 유발 세포 응답의 생리 적인 관련성을 지원 합니다.

<table><tbody><tr><td>Ti:사파이어 NIR 펄스 펨토초 레이저 Mira-900</td><td>Coherent Inc.</td><td>Mira 900</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>63X/1.4 NA 대물</td><td>렌즈 Zeiss</td><td>APOCHROMAT Ph3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>컴팩트 회전 스테이지&nbsp;</td><td>Newport Corp</td><td>PR50PP</td><td></td></tr><tr><td>온도 컨트롤러</td><td>Warner</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>난방 시스템</td><td>Ibidi&nbsp;</td><td>10918</td><td></td></tr><tr><td>가스 배양 시스템</td><td>Ibidi&nbsp;</td><td>11920</td><td></td></tr><tr><td>레이저 출력 및 에너지 미터 (RoHS)</td><td>Coherent</td><td>FieldMaxII-TOP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-R2 디지털 CCD 카메라</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>LSM 510 META 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100X/1.3 NA Zeiss Plan APO</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35mm 그리드 접시&nbsp;</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-CGRD-D</td><td></td></tr><tr><td>PtK2 신장 상피 세포</td><td>ATCC</td><td>CCL 56&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HeLa 세포</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>CO2-독립 매체&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>고급 MEM&nbsp;</td>L<td>-글루타민, 4% FBS</td>페니실린/스트렙토마이신이 보충된 <td>Life Technologies</td><td>12492-013</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-02</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine&nbsp;</td><td>&nbsp; SIGMA</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>무 세럼 미디어&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Opti-MEM I 저감 혈청 배지)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse)</td><td>Kamiya Biomedical Company</td><td>MC-062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-XRCC1 (mouse)</td><td>Gene Tex Inc</td><td>GTX72311</td><td></td></tr><tr><td>Anti-53BP1 (rabbit)</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-22760</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CtIP (rabbit)</td><td>Abcam</td><td>ab70163</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PAR polymers (mouse)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-SA216-0100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PAR (토끼)</td><td>Trevigen</td><td>4336-BPC-100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRF2 (마우스)</td><td>Novus Biological&nbsp;</td><td>NB100-56506</td><td></td></tr><tr><td>안티 6-4PP (마우스)</td><td>Kamiya Biomedical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rad21 (토끼)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (응집체 검출용)</td><td>Yokomori (KY) 실험실</td><td></td><td></td>에서 생성</tr><tr><td>Anti-Rad51 (토끼)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-8349</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ku70 (마우스)</td><td>&nbsp; Novus Biologicals</td><td>NB100-102</td><td></td></tr><tr><td>8-옥시구아닌&nbsp;</td><td>트레비젠, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>안티-PARP1&nbsp; (토끼)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>KY lab</td><td></td><td>ref 43</td></tr><tr><td>&nbsp에서 생성됨; 안티-hCAPG(토끼)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (응축 감지용)</td><td>KY 연구소</td><td></td>에서 생성 <td>ref 42</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>&nbsp; Jackson ImmunoResearch Inc</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티-마우스 Alexa Fluor 488</td><td>IgG Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>HiPerFect siRNA 형질주입 시약</td><td>Qiagen</td><td>301705</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 형질주입 시약</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>GFP-SMC1 안정 세포주&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>KY lab</td><td></td><td>ref 49&nbsp에서 생성됨;</td></tr><tr>KY lab <td>ref 54</td><td>에서 생성된</td> <td>GFP-NEIL2 안정 세포주</td> KY lab <td></td></tr><tr><td></td><td>ref 32</td><td>에서 생성된</td><td>GFP-NTH1 안정 세포주</td></tr><tr><td>KY lab</td><td></td><td></td>에서 생성된<td>GFP-SMC1 플라스미드</td></tr><tr><td>KY lab</td><td></td><td></td>에서 생성된<td>GFP-Ku 플라스미드</td></tr><tr><td>Anti-MDC1 (토끼)</td><td>&nbsp; Novus Biologicals</td><td>NB100&ndash; 395</td><td></td></tr><tr><td>Anti-gH2AX (토끼)</td><td>&nbsp; 밀리포어</td><td>07&ndash; 164</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 안정 세포주</td>가 <td>Berns 연구실</td><td></td>에서 생성됨 <td>ref 32</td></tr><tr><td>TRF2-YFP PtK2 안정 세포주</td><td>가 Berns 연구실</td><td></td>에서 생성됨 <td>ref 32</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>PARG 억제제</td><td>Trevigen</td><td>4680-096-03</td><td></td></tr><tr><td>DNA&ndash; PKcs 억제제&nbsp; NU7026&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>N1537</td><td></td></tr><tr><td>ATM 억제제 KU55933</td><td>&nbsp; Calbiochem</td><td>118500</td><td></td></tr><tr><td>올라파립&nbsp;</td><td>Apexbio Technology</td><td>A4154</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드&nbsp;</td><td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS</td><td>100503-916 (EA)</td><td></td></tr><tr><td>Quantity One 1-D 분석 소프트웨어 버전 4.6.9</td><td>Bio-Rad</td><td>SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC&nbsp;</td><td>이미지 분석 프로그램</td></tr><tr><td>엑셀</td><td>마이크로소프트</td><td></td><td>스프레드시트 프로그램</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>세제</td></tr><tr><td>칼슘과 마그네슘이 없는 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 10X</td><td>Fisher Scientific</td><td>14200166</td><td>1X로 희석&nbsp;</td></tr></tbody></table>

간단 하 고 복잡 한 dna 손상에 세포질 응답 vivo에서 공부 레이저 microirradiation

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA 손상 유도 게놈 무결성의 보호에 대 한 중요 한 셀에 특정 신호 및 복구 응답 합니다. 레이저 microirradiation 귀중 한 실험 도구는 DNA 손상 응답 (DDR) vivo에서조사 되었다. 레이저 유도 손상 세포 핵에 있는 submicrometer 지역에 대 한 응답에서 고분자 역학의 실시간 고해상도 단일 세포 분석을 수 있습니다. 그러나, 다양 한 레이저 조건 유도 된 손상의 종류에 있는 다름의 감사 없이 사용 되었습니다. 그 결과, 피해의 특성은 종종 잘 특징 또는 제어, 채용 또는 수정 프로필에 명백한 불일치를 일으키는. 우리는 다른 방사선 조건 (즉, 다른 파장으로 펨 (fs) 근처-적외선 (NIR) 레이저의 다른 입력된 파워 (irradiances)) 고유 DDR 및 복구 단백질 어셈블리 유도 시연 했다. 이 생산 하는 DNA 손상의 종류를 반영 한다. 이 프로토콜에 설명 합니다 어떻게 레이저 입력된 전력의 적정 수 다른 금액의 유도 및 자료 및 가교 손해, 신호 처리, 차동 폴 리 (ADP-ribose) (파)의 탐지에 의해 쉽게 모니터링할 수 있습니다, DNA 손상의 복잡 하 고 피해 사이트에서 경로 특정 복구 요소 어셈블리입니다. 손상을 조건 결정, 일단 관심의 어떤 요소에 업스트림 factor(s)의 고갈 뿐만 아니라 다른 손상 복잡성과 차동 손상 신호 전달의 효과 조사 가능 하다.

안정적으로 표현 EGFP 53BP11220-1711 또는 TRF2 YFP PtK2 셀을 사용 하 여, 레이저 입력된 전원 적정 실시 되었다 그들의 모집 (그림 1)32에 대 한 최적의 상태를 확인 하려면.
높은 입력 파워 레이저 피해 사이트에서 구체적으로 인식 하는 베이스 손상 GFP NTH1 DNA glycosylase 뿐만 아니라 일일 (가교 손상 자외선 (UV) 손상에 의해 일반적으로 생성 된)의 중요 한 클러스터링 관찰 되었다. 또한, 높은 XRCC1 및 CtIP 신호 스트랜드 나누기의 증가 수를 반영 하 고이 조건 (그림 2A) 복잡 한 DNA 손상 유도 된다 시연, 관찰 되었다. 다른 DNA glycosylases 형광 단백질을 융합 (예를 들어, GFP nei endonuclease ...

이 프로토콜의 목표 레이저 microirradiation를 사용 하 여 다른 유형의 DNA 손상, 비교적 간단한 가닥 나누기 등 복잡 한 손상, DNA 손상 신호 및 복구 요소에서 어셈블리 피해 사이트 vivo에서 공부를 유도 하는 방법을 설명 하는 것입니다. .

간단 하 고 복잡 한 DNA 손상에 세포질 응답 Vivo에서 공부 레이저 Microirradiation

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 단순 가닥 절단을 포함한 다양한 유형의 DNA 손상과 복합 손상을 유도하기 위해 레이저 미세조사(laser microirradiation)를 사용하는 방법을 설명함으로써, 생체 내(in vivo) DNA 손상 신호 전달 및 복구 인자 조립을 연구하는 것입니다. 1960년대와 70년대에 저희는 제 뒤에 보이는 현미경을 통해 레이저 빔을 집중시켜 염색체의 좁은 영역에 손상을 입힐 수 있었습니다. 세포는 분열하고 생존했으며, 저희는 그 이유를 이해할 수 없었습니다.그로부터 40년이 지난 지금, 우리는 DNA 복구를 선택적으로 연구하기 위해 이 방법을 사용하고 있으며, 그것이 오늘 여러분이 보게 될 내용입니다. 이 방법은 DNA 손상이 어떻게 인식되고 처리되는지, 그리고 손상 신호가 세포 내에서 어떻게 전파되는지와 같은 DNA 복구 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 레이저 미세조사는 세포핵 내의 수 마이크로미터 영역으로 한정된 DNA 손상에 반응하는 거대분자 역학을 실시간, 고해상도, 단일 세포 수준에서 분석할 수 있게 해줍니다.하지만 유도되는 손상 유형의 차이를 고려하지 않은 채 다양한 레이저 조건이 사용되어 왔으며, 이는 세포 응답, 인자 모집 및 변형의 불일치를 초래했습니다. HeLa 세포에서 형광 표지 단백질을 발현시키려면, 첫째 날에 24-웰 플레이트의 한 웰에 0.5 mL의 배양 배지와 함께 6~8 × 10⁴개의 세포를 분주하십시오. 그 다음 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에 넣으십시오.둘째 날에, 형광 표지된 DNA 복구 인자를 인코딩하는 포유류 발현 플라스미드 DNA 0.3 micrograms를 25 microliters의 무혈청 배지에 희석하여 리포좀 매개 DNA transfection을 수행합니다. 여기서는 이중 가닥 절단 손상의 경우 GFP가 융합된 53BP1의 손상 부위 표적 도메인을 사용하거나, 염기 손상의 경우 GFP가 융합된 DNA glycosylase NTH1을 사용합니다. 별도의 1.5 milliliter 튜브에 리포좀 기반 DNA transfection 시약 1 microliter를 25 microliters의 무혈청 배지에 희석한 다음, 희석된 DNA와 transfection 시약이 담긴 두 튜브의 내용을 함께 섞고 실온에서 10분 동안 배양하여 DNA-지질 복합체를 형성시킵니다.세포를 0.5 milliliters의 배양액으로 한 번 헹군 다음, 배양액을 제거하고 0.5 milliliters의 신선한 배양액을 세포에 추가합니다. DNA-지질 복합체를 세포에 첨가하고 플레이트를 몇 번 가볍게 흔들어 부드럽게 섞어줍니다. 그런 다음 세포를 인큐베이터로 다시 옮깁니다.4~6시간 후, 세포에서 배양액을 제거하고 0.5% Trypsin-EDTA 300 µL를 첨가합니다. 해당 용액을 제거한 후, Trypsin-EDTA 200 µL를 추가하고 세포를 37 °C에서 3~4분 동안 배양합니다. 세포가 분리되었음을 확인한 후, 배양액 800 µL를 첨가하고 피펫팅을 부드럽게 하여 세포 덩어리를 풀어줌으로써 세포를 재부유시킵니다.세포 현탁액을 격자 무늬 커버슬립이 있는 35-millimeter 배양 접시에 옮기고, 최종 부피가 2 milliliters가 되도록 배양액을 추가합니다. 48시간 후, 세포는 30~60%의 합치도(confluency)에 도달하고 형광 단백질이 발현되어 레이저 손상 유도를 위한 준비가 완료됩니다. NIR 레이저를 켜고 사용 전 한 시간 동안 레이저 시스템을 예열합니다.이산화탄소와 습도 조절이 가능한 챔버 내의 37 °C 가열 스테이지 위에 세포가 담긴 디쉬를 놓습니다. 형광 표지 단백질의 살아있는 세포 분석을 위해서는, 고배율 오일 침강 대물렌즈와 태그에 맞는 적절한 형광 필터 조합을 사용하십시오. 형광 단백질 발현 수준이 비슷한 세포들을 찾습니다.형광 측정 시 세포 간 변동성을 줄이기 위해 발현 강도가 너무 약하거나 너무 강한 세포는 피하십시오. 공초점 현미경의 경우, 100x 1.3 수치 구경(numerical aperture) 오일 대물렌즈를 사용하고 소프트웨어의 bleach 기능을 사용하여 세포 핵 내부의 선형 트랙을 지정하십시오. 다른 설정은 변경하지 않고 레이저 투과율을 5%로 조정하십시오.그런 다음 시야 중앙에 세포를 배치합니다. 관심 영역을 클릭하고 마우스를 사용하여 핵 내부에 약 50 x 4 픽셀 크기의 선 또는 상자를 그립니다. 이때 핵막이나 인을 건드리지 않도록 주의하십시오.그런 다음 표백(bleach) 버튼을 클릭하여 DNA 손상을 유도합니다. 여기서 GFP-53BP1과 GFP-NTH1의 최대 보충(peak recruitment) 차이가 분명하게 나타납니다. 공초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 정량적 형광 분석을 수행하려면, 1배율 배율과 GFP FITC용 아르곤 레이저를 사용하십시오.해상도를 512 x 512 pixels로, 스캔 속도를 5로 설정하고, 퀵 스캔(quick scan)의 경우 1로, 신호 대 잡음비를 개선하기 위해 여러 번의 스캔을 평균화하는 경우에는 2 이상으로 설정하십시오. 그런 다음 이미지를 캡처하십시오. 손상 유도를 위해 bleach ROI를 그리고, 획득한 Time Series 하위 메뉴를 선택한 후, 횟수를 20으로, 사이클 지연 시간을 30 seconds로 설정하십시오.첫 번째 스캔 후 bleach를 한 번 선택한 다음, start B를 클릭하십시오. 이 경우, 손상 유도 직전에 첫 번째 이미지를 획득하고, 이후 30초 간격으로 19장의 이미지를 추가로 획득합니다. 여기서 GFP-NTH1은 손상 부위로 빠르게 일시적으로 모집되는 반면, GFP-53BP1은 느리게 축적되며 손상 부위에 지속적으로 머무르는 것을 확인할 수 있습니다. 일부 수선 인자들은 세포 주기 특이적 방식으로 손상 부위로 모집될 수 있습니다.손상 유도를 위한 G1기 세포를 식별하기 위해, 도립 현미경에서 10배 대물렌즈와 10배 접안렌즈를 사용하여 약간 떠 있고 둥근 형태를 띠는 중기 세포를 찾습니다. 그리드가 그려진 커버슬립 위에서 중기 세포의 위치를 기록하기 위해 이미지를 획득합니다. 3~4시간 후, 기록된 위치에서 세포 분열이 일어나 손상 유도가 가능한 두 개의 딸세포가 생성되었는지 확인합니다.SG2기 세포를 준비하려면 이중 티미딘 블록(double thymidine block) 프로토콜을 사용하십시오. DNA 프로파일링 및/또는 손상 부위의 Rad51 검출을 통해 동기화 효율을 확인하십시오. 고출력 레이저 손상 시, 저출력일 때보다 CPD UV 손상과 염기 손상을 특이적으로 인식하는 GFP-NTH1 DNA 글리코실레이스의 클러스터링이 더 명확하게 관찰되었습니다.또한, XRCC1 및 CtIP의 수준이 더 높게 관찰되었으며, 이는 단일 및 이중 가닥 절단의 수가 증가했음을 반영하며 결과적으로 복합적인 DNA 손상이 유도되었음을 나타냅니다. 여기서 입증된 바와 같이, 레이저 입력 전력의 변화는 손상 신호 전달의 변화를 초래합니다. PARP1은 손상 부위에서 표적 단백질의 poly ADP-ribosylation 또는 PAR을 매개하며, 이는 높은 입력 전력 레이저에 의해 현저하게 유도되지만 낮은 레이저 전력에서는 약하게만 유도됩니다.53BP1은 낮은 입력 전력의 손상 부위로는 모집되지만, 높은 입력 전력의 손상 부위로는 모집되지 않습니다. 흥미롭게도, 동일한 세포 핵 내에 두 번째의 높은 입력 전력 손상이 존재하면 낮은 입력 전력 손상 부위로의 모집이 억제되었습니다. 이러한 억제 현상은 PARP 억제제에 의해 완화되었습니다.반대로, PAR을 분해하는 PARP 억제제는 PAR 신호를 강화했으며, 낮은 입력 전력의 손상 부위에서도 53BP1 모집을 효과적으로 억제했습니다. 이는 손상 자체의 성격이 아니라 PARP 신호 전달이 53BP1 모집을 결정한다는 것을 나타냅니다. 이는 레이저 적정을 통해 DNA 손상의 양과 복잡성을 측정하고 손상 부위의 접근성을 조절하는 PARP1의 차등 활성화를 밝혀낸 사례입니다.이 기술을 숙달하면 세포 준비, 레이저 시스템 설정, DNA 손상 유도, 살아있는 세포 또는 면역 고정 세포의 이미징, 그리고 데이터 분석을 포함하여 약 5일 정도 소요됩니다. 세포 동기화나 시간 경과 분석이 필요한 경우에는 더 오랜 시간이 걸릴 수 있습니다. 이 실험 절차를 수행할 때, 동일한 레이저 시스템이라 하더라도 시간이 지남에 따라, 특히 시스템 재정렬 후에 레이저 입력 출력의 적정값이 변할 수 있음을 유념해야 하므로, 복구 인자의 모집 패턴을 주기적으로 확인하는 것이 중요합니다.본 절차에 따라 방사선 조사, 화학 물질 처리 또는 엔도뉴클레아제 발현 분석과 같은 다른 DNA 손상 유발 방법의 결과물을 도출하고 이를 비교함으로써, 결과가 레이저 특이적 아티팩트로 인한 것이 아님을 확인할 수 있습니다. 개발 이후, 이 기술은 DNA 복구 분야의 연구자들이 핵 염색질과 관련하여 DNA 손상 반응을 탐구하고, DNA 손상의 인식, 처리 및 신호 전달에 관여하는 새로운 인자와 경로를 규명할 수 있는 길을 열어주었습니다.

laser-microirradiation-to-study-vivo-cellular-responses-to-simple

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

레이저는 자주 DNA 손상에 대한 세포 반응의 연구에 사용된다. 그러나, 이들은 그 공간, 주파수 및 복제 충돌 포크 거의없는 것을 특징으로 병변을 생성한다. 여기서, 우리는 레이저의 국소 interstrand 가교 이러한 매개 변수의 결정을 가능하게하는 방법을 설명한다.

레이저 지역화 소라렌 부가 물의 단일 분자 분석

레이저 microirradiation는 살아있는 세포에서 DNA 수리의 연구에 대 한 유용한 도구입니다. 다양 한 DNA 병 변 유발 하 UVA 레이저의 사용에 대 한 방법론 접근 표시 됩니다. 우리 지역 microirradiation; 정상적인 세포 주기를 유지 하는 방법을 최적화합니다 따라서, 비친된 세포 유사 분열을 통해 진행합니다.

고급 단백질 단백질 상호 작용 및 DNA 병 변에서 속도 론 연구에 Confocal 현미경 검사 법 기술

공초점 형광 현미경 검사 법 및 레이저 마이크로 조사 제공 도구 DNA 손상 유도 및 선택한 하위 핵 분야에서 DNA 수 선 단백질의 응답을 모니터링. 이 기술은 크게 손상 감지, 신호, 및 채용의 우리의 지식의 전진 했다. 이 원고에서는 단일 및 이중 가닥 브레이크 수리 검사 이러한 기술을 보여 줍니다.

단일의 검사 및 포유류 세포에서 이중 가닥 브레이크 수리에 대 한 레이저 마이크로-방사선의 응용

DNA 손상 복구 속도 론을 공부 하 고 정의 된 하위 핵 지역에서 병 변 유발 하는 시스템이 필요 합니다. 레이저 검사 confocal 현미경 405 nm 레이저 장비를 사용 하 여 지역화 된 이중 가닥 나누기를 만들고 이러한 병 변에서 수리 요인의 역학을 계량 하는 자동화 된 절차를 제공 하는 방법을 설명 합니다.

단백질 DNA 장애 405 Nm 레이저 마이크로 방사선 조사를 사용 하 여 채용의 조사

이 프로토콜은 레이저 미세 조사에 의한 DNA 수리 단백질 모집 측정과 같은 하류 현미경 연구를 위한 S상 세포를 효율적으로 식별하는 비침습적 방법을 설명합니다.

S 단계 동안 DNA 모집을 연구하는 레이저 미세 조사

유전자 Ustilago이 maydis 검댕 곰팡이 조작에 우리는 강력한 유전자 교체 전략을 설명합니다. 이 프로토콜은 감염 표현형을 조사하기 위해 삭제 돌연변이를 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 형광 표지 단백질을 코딩하는 서열을 추가하여, 예를 들어, 임의의 방법으로 유전자를 수정하도록 확장 될 수있다.

플랜트 병원체의 유전자 조작<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; 곰팡이 생물과 식물 미생물 상호 작용을 연구하는

표적 DNA 손상은 DNA 손상제를 삼중 형성 올리고뉴클레오티드(TFO)에 묶음으로써 달성할 수 있습니다. 변형된 TFO를 사용하여, DNA 손상 특이적 단백질 결합, 및 DNA 토폴로지 변형은 본원에 기술된 변형된 염색질 면역침전 분석 및 DNA 슈퍼코일링 분석의 활용에 의해 인간 세포에서 연구될 수 있다.

도구 나선 왜곡, 사이트 별 DNA Interstrand 가교의 처리에 건축 단백질 HMGB1의 역할을 연구하는

식물 수정을 위한 기존 방법은 적용 가능성이 제한적입니다. 여기에서 제안된 새로운 펩타이드 유래 기술은 온전한 식물의 원하는 세포 내 구획에 외인성 단백질 또는 유전자를 도입하는 데 있어 단순성과 효율성을 모두 약속합니다.

펩타이드 유래의 방법은 식물의 유전자와 단백질 세포 간 및 Organellar 장벽을 수송하는

여기에서는 생리학적 산소 상태에서 mRNA의 5' 캡을 결합하는 번역 시작 인자를 분석하기 위한 인간 세포 배양 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 아가로스 연결 m7GTP 캡 아날로그를 사용하며 캡 결합 인자 및 이들의 상호 작용 파트너를 조사하는 데 적합합니다.

생리 산소 조건에 노출 된 인간 세포의 캡 결합 단백질의 분석

여기, 우리는 chromatin immunoprecipitation (칩) 및 칩 seq 라이브러리 준비 프로토콜 낮은 풍부한 닭 배아 샘플에서 글로벌 epigenomic 프로 파일 생성을 설명 합니다.

낮은 풍부 배아 샘플 chromatin Immunoprecipitation (칩) 프로토콜

배우세요 레이저 미세조사를 이용한 DNA 손상 유도 및 세포질 응답 분석 방법입니다. 실시간 고해상도 단세포 분석으로 손상 인식, 신호 전달, 복구 인자 동원 과정을 연구할 수 있습니다.

간단 하 고 복잡 한 DNA 손상에 세포질 응답 Vivo에서 공부 레이저 Microirradiation

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