August 9th, 2017
레이저 스캐닝 현미경 검사 법 긴 파장 다중 광자 형광 여기의 고급 광학 기술의 조합 안내 (sox10:EGFP)에 안내 (foxd3:GFP) zebrafish 태아 신경 크레스트 마이그레이션의 고해상도, 3 차원, 실시간 영상 캡처 구현 되었습니다.
다광자 타임 랩스 이미징의 전반적인 목표는 철새 세포 집단의 고해상도 3차원 실시간 이미지를 캡처하는 것입니다. 이 방법은 다양한 세포 집단의 이동 경로 매핑과 같은 발달 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 기존 컨포칼 현미경 검사에 비해 이 기술의 주요 장점은 다광자 레이저가 조직 침투가 더 깊고 광독성이 감소한다는 것입니다.
이렇게 하면 두꺼운 조직에서 유용성이 향상되고 이미지 획득 기간이 더 길어집니다. 오후 3:00에서 9:00 사이에 배아 채취를 준비하려면 번식 탱크를 조립하고 역삼투압 또는 RO 물로 채웁니다.
최대 3명의 암컷과 3명의 수컷을 분할된 수조의 반대편으로 이동시킵니다. 다음날 아침, 사육장에서 불을 켠 직후 칸막이를 제거하십시오. 20분 동안 또는 충분한 수의 배아가 생성될 때까지 방해받지 않고 짝짓기를 허용합니다.
배아는 번식 탱크의 바닥에 있을 것입니다. 알이 관찰되면 물고기와 함께 홈이 있는 내부 탱크를 들어 올려 RO 물로 채워진 깨끗하고 단단한 외부 탱크에 빠르게 넣습니다. 난자 채취 스크린을 사용하여 외부 수조에서 난자를 수집하고 난자를 30mL의 1X 배아 배지가 들어 있는 페트리 접시로 옮깁니다.
수집된 알은 섭씨 28.5도에서 부화합니다. 형질전환 배아의 경우, 수정 후 24시간 또는 HPF에서 죽은 난자를 제거하고 배아의 발달 단계를 평가합니다. 겸자를 사용하여 GFP를 발현하는 3-4개의 배아에서 융모막을 제거합니다.
표준 460 - 490 나노미터 대역 통과 여기 필터가 있는 절제 형광 실체 현미경에서 GFP 양성 배아를 스크리닝합니다. 이 배아를 30ml의 신선한 1X 배아 배지가 들어 있는 별도의 페트리 접시로 옮깁니다. 20 HPF 후, 색소 침착을 억제하기 위해 스크리닝 및 디코리온된 GFP 양성 배아를 0.003% PTU 용액에 놓습니다.
신경능선과 신경 상피 발달에 악영향을 미칠 수 있으므로 조기에 치료를 시작하지 마십시오. 0.4g의 LowMelt 아가로스 분말을 1x 배아 배지 20mL에 첨가합니다. 혼합물을 1-2분 동안 또는 용액이 투명해지고 모든 입자가 용해될 때까지 가열합니다.
보관을 위해 약 1mL의 Agarose 용액을 새 1.5mL 원심분리 튜브에 분취합니다. 개방형 수조 챔버를 설치하려면 개방형 수조 챔버 바닥에 소량의 고진공 그리스를 바르십시오. 원형 유리 덮개 슬립을 베이스에 놓고 꽉 조일 때까지 개방형 욕실의 상단을 베이스에 나사로 고정합니다.
바닥이 약 500/700초 채워질 때까지 약 500-700마이크로리터의 2% 아가로스 용액을 개방형 목욕 챔버에 피펫팅합니다. 아가로스가 완전히 중합되지 않고 약간 냉각될 때까지 30초 동안 기다린 다음 단일 배아를 염기 중앙으로 이식합니다. 형광 실체 현미경 아래에서 10마이크로리터 마이크로 피펫 팁을 사용하여 배아의 방향을 잡고 배아 배지가 추가될 때 배아가 떠다니지 않도록 아가로스 바닥 근처에 배치합니다.
중요한 단계는 배아가 아가로스에 올바르게 배치되었는지 확인하는 것입니다. 이 실험에서는 배아를 측면으로 배치하지만 배아를 등쪽과 복부 부위에 초점을 맞추도록 배치할 수도 있습니다. 아가로스가 굳을 때까지 배아를 모니터링하고 위치를 변경합니다.
그런 다음 전사 피펫을 사용하여 조립된 개방형 챔버를 타임 랩스 배아 배지로 완전히 채웁니다. 전체 설정을 현미경 스테이지에 배치한 후 텍스트 프로토콜에 따라 Five times objective를 사용하여 배아를 찾습니다. 그런 다음 수동으로 스테이지를 가장 높은 위치로 올리고 미세 초점을 사용하여 배아를 현미경 범위의 중간에 배치합니다.
수동으로 스테이지를 낮추고 5시간 목표를 25시간 침수 목표로 변경합니다. 배아의 초점을 다시 맞추기 위해 스테이지를 조심스럽게 들어 올립니다. 소프트웨어에서 XYTZ 모드를 클릭하여 Z의 깊이에 걸쳐 XY 평면에서 시간 또는 T 간격으로 여러 이미지를 얻을 수 있습니다.에피 형광 또는 명시야 보기를 사용하여 z-스택을 구분할 관심 영역에서 초점 깊이를 찾습니다.
이러한 실험에서 눈의 측면 가장자리는 z 스택의 시작입니다. 여기에 집중하면 소프트웨어에서 시작 버튼을 클릭합니다. z-stack의 끝인 배아의 정중선까지 초점을 맞춘 후 end 버튼을 클릭합니다.
중요한 단계는 Z 단계가 관심 영역을 포함하는지 확인하는 것입니다. 우리의 경우 측면에서 내측 가장자리까지 눈의 너비를 캡처하고 싶습니다. 수집 시간과 이미징 주파수를 조정하기 위한 메뉴를 클릭합니다.
fluor4의 적절한 회수와 배아의 생존을 위해 레이저 전원이 켜져 있을 때의 z-stack 획득과 레이저 전원이 꺼졌을 때의 회복 시간 사이에 적어도 1:3의 비율을 허용하십시오. 배아 회복을 위한 적절한 시간이 있으면 지정된 창에서 z-stack 사이의 시간을 설정합니다. 그런 다음 적절한 창에서 실험의 총 시간을 설정합니다.
이제 라이브 이미지 설정을 켜서 레이저 설정을 최종 조정합니다. 소프트웨어 내에서 레이저 투과율, 게인 및 오프셋 슬라이더 막대를 조정하여 형광 이미지를 최적화할 수 있습니다. 또한 실험의 길이, 배아의 예상 성장 등에 따라 필요에 따라 배아의 방향을 조정합니다.
실험 기간 동안 관심 영역이 프레임 내에 남아 있는지 확인합니다. 타임랩스 획득 중에는 에피 형광 광원을 끄고 무대를 배경광에 대한 보호에 적합한 레이저 안전 상자로 덮은 다음 시작을 누릅니다. 레이저 안전 상자의 슬라이딩 도어를 통해 개방형 욕실에 접근하여 8-12시간마다 타임 랩스 배아 배지를 다시 채웁니다.
이미징 획득 후 이미지 처리 소프트웨어에서 파일을 열고 올바른 이미지 시리즈를 강조 표시합니다. 소프트웨어에서 프로세스 메뉴를 선택하고 3D 디콘볼루션을 클릭한 다음 적용하여 각 z-스택을 디컨볼루션합니다. 개별 tif 파일을 비디오 처리 소프트웨어로 가져온 다음 모든 tif 파일을 선택하고 비디오 편집기로 드래그합니다.
동영상 내 각 이미지의 길이를 0.1초로 조정합니다. 마지막으로 비디오를 mov 또는 mp4 파일로 내보냅니다. 여기에서 다광자 형광 이미징으로 볼 수 있는 것은 형질전환 sox10:EGFP 및 foxd3:GFP 제브라피시 계통에서 두개골 얼굴 구조와 눈의 앞쪽 부분을 생성하는 두개골 신경 능선 세포의 이동 패턴입니다.
12에서 30 hpf 사이의 Sox 10 양성 신경 능선 세포는 신경관 가장자리에서 두개골 안면 영역으로 이동합니다. 전뇌(prosencephalon)와 중뇌(mesencephalon)의 세포는 등쪽과 배쪽으로 발달 중인 눈으로 이동하여 안구 주위 중간체(periocular mesencine)를 채웁니다. 여기에서 지적한 바와 같이, sox10 양성 세포는 전두엽 비강 돌기를 형성합니다.
능능선(rhombencephalon)의 신경능선세포(neural crest cell)는 복부로 이동하여 인두궁(pharyngeal arches)을 일으킵니다. 30에서 60 hpf 사이의 foxd3 양성 신경능선 세포의 타임 랩스 이미징은 이러한 세포가 시신경 컵과 표면 외배엽 사이를 이동했으며, 화살표로 표시된 안구 균열이 렌즈 주위로 합쳐져 홍채 기질을 형성하는 별표로 표시되었음을 보여줍니다. 이 기술을 한 번 숙달하면 처음부터 끝까지 제대로 수행한다면 4일 안에 완료할 수 있습니다.
이 절차를 시도할 때 형광량이 많은 배아를 선택해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 초기에 소프트웨어를 설정하는 것은 어려울 수 있지만 매개변수가 결정되면 일반적으로 추가 변경은 최소화됩니다. 이 동영상을 시청한 후에는 다광자 타임랩스 현미경을 사용하여 배아에서 이동하는 세포를 이미지화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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이 연구는 고급 광학 기술, 특히 다중 광자 형광 발광을 활용하여 제브라피쉬 배아의 신경 능선 이동에 대한 고해상도, 3차원 이미지를 얻습니다. 이 방법은 이동하는 세포 집단을 실시간으로 관찰할 수 있게 해주어 발달 생물학에 대한 이해를 향상시킵니다.
Multi-photon time-lapse imaging in zebrafish embryos enables real-time, high-resolution visualization of migratory neural crest cells, directly addressing the challenge of mapping dynamic cell behaviors in complex developmental systems. This capability enhances predictive confidence in early discovery by clarifying cell lineage trajectories and supporting mechanistic de-risking for developmental targets. The approach is strategically positioned to inform target validation and translational continuity in disease-relevant models.
This imaging method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, pathway clarification, and quantitative analysis of cell migration in live vertebrate models.