Name: 실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 배우세요 다중 광자 시간 경과 영상을 이용하여 제브라피시 태아의 신경 크레스트 세포 이동을 실시간으로 관찰하는 방법을. 이 기술은 발달 생물학 연구에서 세포 이동 경로를 고해상도로 시각화하여 유전자 기능을 연구하는 데 활용됩니다.

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저자는 토마스 실링 친절 하 게 선물 안내 (sox10:eGFP) 물고기와 메리 Halloran 친절 하 게 안내(foxd3:GFP) 물고기 gifting에 대 한 감사 합니다.

여기에 설명된 프로토콜은 미시간 대학교 동물 사용 및 관리 위원회(UCUCA)에서 제정한 실험실 동물의 인도적 대우를 위한 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 타임랩스 이미징을 위한 배아 수집
<ol>
	<li>오후 3시에서 9시 사이에 수컷과 암컷 성체 Tg(sox10:EGFP) 또는 Tg(foxd3:GFP) 형질전환 제브라피시를 쌍별 짝짓기를 위해 분할된 번식 탱크에 설정합니다. 
	참고: 토마스 실링(Thomas Schilling)과 메리 할로란(Mary Halloran)이 각각 선물한 Tg(sox10:EGFP)와 Tg(foxd3:GFP) 물고기를 캐스퍼(roy -/-, 진주층 -/-) 배경으로 교배하여 자동 형광과 색소 침착 간섭을 줄였습니다.
	<ol>
		<li>사육 탱크(슬롯형 내부 탱크 + 단단한 외부 탱크)를 조립하고 역삼투(RO) 시스템 물로 채웁니다.</li>
		<li>최대 3 마리의 암컷과 3 마리의 수컷을 칸막이로 분리 된 수조의 반대쪽으로 옮깁니다. 최대 6 마리의 물고기를 단일 번식 탱크에서 쌍으로 사육 할 수 있습니다.</li>
		<li>다음날 아침, vivarium. 에서 불을 켠 직후 칸막이를 제거하십시오.
		참고: 본 연구에서 조명은 14시간 조명(오전 9시 켜짐) 및 10시간 암흑(오후 11시 꺼짐) 주기로 켜져 있습니다.</li>
		<li>20분 동안 또는 충분한 수의 배아가 생성될 때까지 방해받지 않고 짝짓기를 허용하십시오. 배아는 번식 탱크의 바닥에 있을 것입니다. 알이 관찰되면 물고기와 함께 홈이 있는 내부 탱크를 들어 올려 RO 물로 채워진 깨끗하고 단단한 외부 탱크에 계란(물고기 및 내부 탱크)을 빠르게 놓습니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RO 물 1L당 다음을 첨가하여 표준 1X 배아 배지를 준비합니다: 0.287g(4.9mM) NaCl, 0.127g(0.17mM) KCl, 0.048g(0.33mM) CaCl2.2H 2O, 0.04g(0.33mM) MgSO4(무수). 소금이 완전히 용해될 때까지 용액을 저어줍니다.
	<ol>
		<li>살균제로 100μL의 0.1% 메틸렌 블루를 첨가합니다. pH를 7.75로 조정하기 위해 0.25g의 중탄산나트륨을 추가합니다. 매체는 실온에서 보관하십시오.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>난자 채취 스크린을 사용하여 외부 탱크에서 난자를 채취하고 난자를 30mL의 1X 배아 배지가 포함된 페트리 접시(접시당 ~50개의 배아)로 옮깁니다. 수집된 알을 28.5°C에서 부화시킵니다.</li>
	<li>배아 준비
	<ol>
		<li>Tg(sox10:EGFP) 배아.
		<ol>
			<li>Tg(sox10:EGFP) 배아의 경우 수정 후 12시간(hpf)에 죽은 난자를 제거하고 배아의 발달 단계를 평가합니다. 표준 460-490nm 대역 통과 여기 필터가 있는 해부 형광 실체 현미경을 사용하여 GFP 양성 배아를 스크리닝합니다. 겸자를 사용하여 GFP를 발현하는 3-4개의 배아에서 맥락막을 제거하고 이 배아를 30mL의 신선한 1X 배아 배지가 들어 있는 별도의 페트리 접시로 옮깁니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Tg(foxd3:GFP) 배아.
		<ol>
			<li>Tg(foxd3:GFP) 배아의 경우 22-24hpf에서 죽은 난자를 제거하고 배아의 발달 단계를 평가합니다. 표준 460-490nm 대역 통과 여기 필터가 있는 절제 형광 실체 현미경을 사용하여 양성 배아를 스크리닝합니다. 겸자를 사용하여 GFP를 발현하는 3-4개의 배아에서 맥락막을 제거합니다.</li>
			<li>0.75g(3%)의 PTU를 25mL의 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해시켜 1000X Phenylthiourea(PTU) 원액을 준비합니다. 원액을 분취하여 4°C에서 보관합니다. 30μL의 1000X PTU(3%) 원액을 30mL의 1X 배아 배지에 첨가하여 0.003% PTU 용액을 생성합니다.</li>
			<li>색소 침착을 억제하기 위해 스크리닝 및 디코리온된 GFP 양성 배아를 0.003% PTU 용액에 배치합니다. 조기 치료(<20hpf)는 신경능선과 신경 상피 발달에 악영향을 미칠 수 있으므로 20hpf 이전에 PTU로 배아 치료를 시작하지 마십시오. 28</li>
		</ol>
		</li>
		<li>타임 랩스 실험을 수행하기 전에 온도 변동을 제어하기 위해 연령 일치 비교에서 12-24시간 간격으로 표준 실체 현미경을 사용하여 라이브 이미징을 통해 배아를 모니터링합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 타임랩스 이미징을 위한 배아 장착
<ol>
	<li>타임랩스 배아 배지 준비
	<ol>
		<li>RO 물 100mL에 트리카인 0.004g을 첨가하여 표준 0.4% 트리카인 원액을 준비합니다. 원액을 새 1.5mL 원심분리 튜브에 분취량(~1mL)하고 -20°C에서 보관합니다.</li>
		<li>1X 배아 배지 48mL에 0.4% 트리카인 용액 2mL를 첨가하여 타임랩스 배아 배지(1X 배아 배지 50mL, 0.016% 트리카인)를 준비합니다. 배아 >22 hpf를 사용하는 경우 배아 배지에 50μL의 3% PTU 원액(최종 농도 .003% PTU)도 추가합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2% 저용융 아가로스의 제조
	<ol>
		<li>0.4g의 저용융 아가로스 분말을 1X 배아 배지 20mL에 추가합니다. 1-2분 동안 또는 용액이 맑아지고 모든 입자가 용해될 때까지 가열합니다. 
		참고: 아가로스 겔의 비율을 높이면 기질의 다공성이 감소하여 배아의 성장과 발달을 물리적으로 방해할 수 있습니다. 따라서, 아가로스 용액은 이러한 효과를 최소화하기 위해 1.5%로 낮출 수 있습니다. 그러나 레이저 스캐닝 현미경 검사 중에 여기 빔이 정지 상태로 유지되면 더 큰 가열이 발생할 수 있으며 시간에 따른 로그 관계에서 빠르게 증가할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 형광단 흡수로 인한 가열은 초점 영역에 매우 국한되어 있습니다. 따라서, 관심 영역에서, 온도는 1.5 미만의 비율로 만들어진 아가로스 용액을 녹일 수 있을 만큼 충분히 높은 값(≥ 30°C)으로 증가할 수 있으며, 이에 따라 배아를 레이저에 직접 노출시키거나 배아가 초점면 밖으로 떠오르는 조건을 가능하게 할 수 있습니다. 이러한 이유로 1.5% 미만의 아가로스 용액은 사용하지 않는 것이 좋습니다.</li>
		<li>보관을 위해 아가로스 용액을 새로운 1.5mL 원심분리 튜브에 분취(~1mL)합니다. 여분의 아가로스 용액을 액체 형태로 가열 블록(60-70 °C)에 2-3주 동안 보관하십시오.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>배아 장착
	<ol>
		<li>개방형 수조 챔버를 설치하려면 개방형 수조 챔버 바닥에 소량의 고진공 그리스를 바르십시오. 원형 유리 커버 슬립을 바닥에 놓고 단단히 조여질 때까지 개방형 목욕 챔버의 상단을 바닥에 나사로 고정합니다( 그림 1A, B).</li>
		<li>베이스가 ~3/4가 채워질 때까지 2% 아가로스 용액(60-700°C)의 피펫(~500-700 μL)을 개방형 수조실에 넣습니다( 그림 1C). 일단 아가로스 용액이 실험실 벤치의 개방형 수조실에 들어가면 용액의 온도가 약 1°C/s 감소합니다.</li>
		<li>아가로스가 완전히 중합되지 않고 약간(~30-40 °C) 냉각될 때까지 30초 동안 기다린 다음 단일 배아를 염기 중앙으로 이식합니다( 그림 1D, E).</li>
		<li>형광 실체 현미경 아래에서 1-10 μL 마이크로피펫 팁을 사용하여 배아를 배치하고, 배아가 아가로스 표면에 너무 가까이 놓이면 배아 배지로 덮였을 때 배아가 떠다닐 수 있으므로 배아가 아가로스 바닥 근처에 놓였는지 확인합니다. 
		참고: 제시된 비디오(비디오 1-3)에서 배아는 측면 방향이지만 관심 영역에 따라 배아는 복부 또는 배측 방향일 수 있습니다.</li>
		<li>아가로스가 굳을 때까지 배아를 모니터링하고 위치를 변경합니다. 아가로스가 굳으면 이송 피펫을 사용하여 조립된 열린 챔버를 타임 랩스 배아 배지( 그림 1F)로 완전히 채웁니다.</li>
		<li>스테이지 어댑터에 맞는 퀵 익스체인지 플랫폼에 개방형 수조실을 놓습니다( 그림 1G). 전체 설정(배아, 개방형 수조실, 빠른 교환 플랫폼 및 스테이지 어댑터)을 s에 배치합니다.tag콘덴서 바로 위의 현미경 ( 그림 1H).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 타임랩스 이미징을 위한 현미경 설정
<ol>
	<li>레이저 설정 결정
	<ol>
		<li>사용할 레이저 파장을 결정합니다. 관심 형광단의 여기 파장의 두 배인 파장을 사용합니다(예: GFP의 경우 880 및 940nm 사이의 파장). 
		참고: 본 연구에서 GFP의 파장 설정은 880nm에서 940nm 사이였습니다. 파장이 높을수록 레이저의 출력 전력이 낮아집니다.</li>
		<li>레이저 투과율을 결정합니다. 높은 비율의 레이저 투과는 배아를 죽이므로 가장 낮은 수준의 투과율을 사용합니다(권장). 여기에 제시된 바와 같이 24-48시간 타임랩스 연구의 경우 투과율을 5% 미만으로 유지하십시오.</li>
		<li>현미경 검출 시스템을 결정하고 형광단에 대한 올바른 필터가 장착되어 있는지 확인합니다. 
		참고: 다광자 현미경의 경우 방출된 형광에 대한 다양한 감도를 가진 여러 검출 시스템이 있습니다. 일반적으로 내부 감지 시스템은 외부 감지 시스템보다 민감도가 낮습니다. 높은 수준의 GFP 발현을 가진 형질전환 라인의 경우 내부 검출 시스템이 적합합니다. GFP 발현 수준이 낮거나 다른 형광단(예: 적색 형광 단백질)이 있는 형질전환 라인의 경우, 레이저 투과 비율을 합리적인 수준으로 유지하기 위해 외부 검출 시스템이 필요할 수 있습니다. 사용되는 검출 시스템에 관계없이 형광단에 대한 올바른 필터가 설치되어 있어야 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>다광자 현미경의 소프트웨어 설정 조정
	<ol>
		<li>5X 대물렌즈를 사용하여 배아를 찾습니다. 수동으로 스테이지를 가장 높은 위치로 올리고 미세 초점을 사용하여 배아를 현미경 범위의 중간에 배치합니다.</li>
		<li>수동으로 스테이지를 낮추고 5X 대물렌즈를 25X 침수 대물렌즈(개구수 NA, 0.95)로 변경합니다. 배아의 초점을 다시 맞추기 위해 스테이지를 조심스럽게 들어 올립니다.</li>
		<li>소프트웨어에서 "xyzt" 모드를 클릭하여 "z" 깊이에 걸쳐 x-y 평면에서 시간 간격(t)으로 여러 이미지를 얻습니다. epifluorescence 또는 brightfield view를 사용하여 Z 스택의 경계를 설정하는 관심 영역의 초점 심도를 찾습니다.
		<ol>
			<li>소프트웨어에서 "시작" 버튼을 클릭하십시오; 이 실험에서 눈의 측면 가장자리는 Z-스택의 시작이었습니다. "종료" 버튼을 클릭하십시오. 배아의 정중선은 Z-stack. 의 끝이었습니다.
			참고: 스텝 크기는 0.3-0.6 μm였으며 60 - 120 μm의 z-스택 크기에 대해 총 ~200 스텝이 있었습니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>수집 시간과 이미징 주파수를 조정하기 위한 메뉴를 클릭합니다. 현재 시스템의 경우 ~200단계를 수행하는 데 각 z-stack 획득에 약 5분이 필요합니다. 형광단의 적절한 회수와 배아의 생존을 위해 z-stack 획득(레이저 전원 켜기)과 복구 시간(레이저 전원 끄기) 사이에 최소 1:3의 비율을 허용하십시오. 
		참고: 예를 들어, z-스택은 20분마다 획득되며 5분의 z-스택 획득 및 15분의 복구가 가능합니다. 이 프로토콜의 경우 더 큰 z-스택을 얻을 수 있지만 z-stack 획득 사이의 시간을 적절하게 증가시켜 타임랩스 과정에서 더 적은 이미지를 얻을 수 있습니다.
		<ol>
			<li>배아 회복을 위한 적절한 시간이 있으면 지정된 창에서 z-stack 사이의 시간을 설정합니다. 적절한 창에서 실험의 총 시간을 설정합니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>최종 소프트웨어, 레이저 및 배아 조정.
		<ol>
			<li>라이브 이미지 설정을 켜서 레이저 설정을 최종적으로 조정합니다. 소프트웨어 내에서 레이저 투과율(3.1.2 참조), 게인 및 오프셋 슬라이더 막대를 조정하여 형광 이미지를 최적화합니다. 또한 실험 길이, 배아의 예상 성장 등에 따라 필요에 따라 배아의 방향을 조정합니다. 실험 기간 동안 관심 영역이 프레임 내에 남아 있는지 확인합니다.</li>
			<li>타임랩스 획득 중에 더 이상 필요하지 않은 에피형광등 광원을 끕니다. 무대를 레이저 안전 상자( 그림 1I)로 덮으십시오. 내부 감지 시스템을 사용할 때 레이저 안전 상자는 배경 조명으로부터 보호하기에 적합합니다. "시작"을 누릅니다. 
			참고: 그러나 더 민감한 외부 감지 시스템의 경우 레이저 안전 상자가 충분한 배경 조명을 차단하지 못하며 이미지 획득 중단을 방지하기 위해 추가 덮개가 필요합니다.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 타임랩스 획득 중
<ol>
	<li>레이저 안전 상자의 슬라이딩 도어를 통해 타임랩스를 획득하는 동안 8-12시간마다(하루에 최소 2회) 개방형 목욕 챔버에 타임랩스 배아 배지를 다시 채웁니다( 그림 1I).</li>
	<li>레이저 안전 상자의 문을 열기 전에 현미경이 이미지를 적극적으로 획득하고 있지 않은지 확인하십시오. 
	알림: 24시간에서 48시간 동안 지속되는 타임랩스 이미징 실험에는 히터 및 순환 매체 시스템의 사용이 필요하지 않습니다. 실제로, 스테이지 히터와 인라인 히터의 온도는 모두 제어하기 어려우며, 이미지 획득 중에 배아는 25-28°C의 온도 범위에서 적절한 발달 속도를 나타냅니다. 또한 순환 미디어 시스템은 오버플로되어 잠재적으로 장비를 손상시키는 경향이 있습니다. 따라서 모든 배아는 일상적으로 획득 후 단계화됩니다.</li>
</ol>
5. 획득 후 처리
<ol>
	<li>소프트웨어에서 "파일" 메뉴를 클릭하고 "저장"을 선택합니다.</li>
	<li>이미지 처리 소프트웨어에서 파일을 엽니다(재료 표 참조). 올바른 이미지 시리즈를 강조 표시합니다. 소프트웨어에서 "프로세스" 메뉴를 선택합니다. 3D 디콘볼루션을 클릭하고 "적용"을 클릭하여 각 z-stack. 를 디컨볼루션합니다.
	참고: 파일이 큽니다. 따라서 이 단계에는 몇 시간이 걸릴 수 있습니다.</li>
	<li>소프트웨어의 "프로세스" 메뉴에서 "최대 프로젝션"을 클릭합니다. "적용"을 클릭하여 최대 프로젝션을 시작하여 z-스택당 1개의 이미지를 생성합니다. 각 최대 투영 파일(z 스택당 1개 이미지)을 tiff로 내보냅니다.</li>
	<li>개별 tiff 파일을 비디오 처리 소프트웨어로 가져옵니다. 모든 tiff 파일을 선택하고 비디오 편집기로 드래그합니다. 동영상 내 각 이미지의 길이를 0.1초로 조정합니다. 비디오를 mov 또는 mp4 파일로 내보냅니다.</li>
</ol>

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</ol>

이 작품은 국립 눈 연구소 건강의 국가 학회 (K08EY022912-01) 및 비전 연구 코어 (P30 EY007003)의 보조금을 통해 재정적으로 지원 되었다.

다중 광자 시간 경과 영상 과도 하 고 철새 세포 인구의 비보에 추적을 수 있습니다. 이 강력한 기술은 실시간으로 미 발달 과정을 공부 하 사용할 수 있습니다 그리고 현재 연구에이 방법의 결과 신경 크레스트 셀 마이그레이션 및 개발의 현재 지식 향상. 이전 시간 경과 이미징 연구는 일반적으로 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법을 이용 한다. 29 , 30 , 31 , 32 여기, 우리는 전통적인 confocal 현미경 검사 법에 비해 많은 장점이 있는 다중 광자 기술의 사용을 제시. 다중 광자 현미경 검사 법의 기초가 이다 긴 적외선 파장의 두 광자 fluorophore는 흥분 하는 데 사용 됩니다. 그 결과, 더 적은 산란 및 따라서 감소 배경, 깊은 조직 침투를 사용 하도...

선 천 성 눈 질환 아동 실명을 일으킬 수 있으며 종종 두개골 신경 크레스트의 이상 때문. 신경 크레스트 세포는 신경 관에서 발생 하 고 몸 통하여 수많은 직물을 형성 하는 일시적인 줄기 세포. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 신경 크레스트 셀, prosencephalon 및 mesencephalon에서 파생 된 게 상승 뼈와 연골은 midface 정면 지역, 그리고 홍 채, 각 막, 배수 채널 및 sclera 눈의 앞쪽 세그먼트에서. 4 , 6 , 7 , Rhombencephalon 형태는 인 두 아치, 턱, 그리고 심장 유출 관에서 8 신경 크레스트 셀. 1 , 3 , 4 , 9 , 10 연구 강조 했습니다 눈을 신경 크레스트의 기여 및 periocular 개발, 척 추가 있는 눈 개발에 이러한 세포의 중요성을 강조. 실제로, Axenfeld Rieger 증후군과 피터 스 플러스 증후군에서 관찰 신경 크레스트 셀 마이그레이션 및 분화의 방해는 craniofacial 눈 변칙와 이어질. 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 따라서, 마이그레이션, 확산 및이 신경 크레스트 세포의 분화에 대 한 포괄적인 이해 선 천 성 눈 질환을 기본 복잡성에 대 한 통찰력을 제공할 것입니다.
Zebrafish는 zebrafish 눈의 구조는과 유사 하 포유류 들 그리고 많은 유전자는 제 브라와 포유류 사이의 보존 진화론으로 눈 개발 공부에 대 한 강력한 모델 생물 이다. 18 , 19 , 20 또한, zebrafish 태아는 투명 하 고 oviparous, 실시간으로 눈 개발의 시각화를 촉진.
이전에 게시 작업에 확대,6,,720 신경 크레스트 셀의 철새 패턴 사용 하 여 다중 광자 형광 이미징 SRY (섹스 결정 지역 Y)의 transcriptional 통제 녹색 형광 단백질 (GFP)으로 표시 하는 유전자 변형 zebrafish 선에 시간 경과 설명 했다-상자 10 (sox10) 또는 Forkhead 상자 D3 (foxd3) 유전자 규제 지역. 21 , 22 , 23 , 24. 다중 광자 형광 시간 경과 영상 레이저 스캐닝 현미경 표본 fluorophores 태그로의 고해상도, 3 차원 이미지를 긴 파장 다중 광자 형광 여기의 고급 광학 기술을 결합 하는 강력한 기술입니다. 25 , 26 , 27 다중 광자 레이저를 사용 하 여 표준 confocal 현미경 검사 법, 증가 조직의 침투 및 감소 fluorophore 표백 등 뚜렷한 장점이 있다.
이 메서드를 사용 하 여 마이그레이션 및 철새 통로의 타이밍에 다양 한 신경 크레스트 세포의 두 가지 인구 periocular mesenchyme 개발 눈에 차별, 즉 foxd3 양성 신경 크레스트 세포와 craniofacial mesenchyme sox10 양성 신경 크레스트 셀을 했다. 이 방법으로 zebrafish에 눈와 craniofacial 신경 크레스트 마이그레이션 마이그레이션 시각화 하는 방법을 도입, 개발 하는 동안 실시간으로 레 귤 레이트 된 신경 크레스트 마이그레이션 관찰 하기 쉽게.
이 프로토콜 Tg (sox10:EGFP)에 안내 (foxd3:GFP) 유전자 변형 zebrafish, 예를 들어 초기 눈 개발 하는 동안 시간 경과 비디오를 생성 하기 위한 정보를 제공 합니다. 이 프로토콜 zebrafish에 신경 크레스트 셀에서 파생 된 어떤 눈와 craniofacial 구조의 초기 개발의 고해상도, 3 차원, 실시간 시각화를 위한 추가로 적용할 수 있습니다. 또한,이 방법은 다른 조직 및 장기 제 브라와 다른 동물 모델의 개발의 시각화에 대 한 추가 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>칸막이가 있는 사육 탱크</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td>Crossing Tank Set(1.0리터) 뚜껑 및 인서트가 있는 투명 폴리카보네이</td></tr>트 <tr><td>M205 FA Combi-Scope</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td>입체 형광 현미경 - FusionOptics 및 TripleBeam</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Millipore (EMD)</td><td>7760-5KG</td><td>이중 PE 자루. CAS 번호 7647-14-5, EC 번호 231-598-3</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>밀리포어(EMD)</td><td>1049380500</td><td>염화칼륨 99.999 Suprapur. CAS 번호 7447-40-7, EC 번호 231-211-8.</td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td>폴리 병; 500 g. CAS No. 10035-04-8</td></tr><tr><td>마그네슘 설페이트 (무수)</td><td>Millipore (EMD)</td><td>MX0075-1</td><td>폴리 병; 500 g. CAS No. 7487-88-9, EC 번호 231-298-2</td></tr><tr><td>Methylene Blue</td><td>Millipore (EMD)</td><td>284-12</td><td>유리병; 25 g. 분말, 인증된 생물학적 염색제</td></tr><tr><td>중탄산</td>나트륨 <td>Millipore (EMD)</td><td>SX0320-1</td><td>폴리 병; 500g. 분말, GR ACS. CAS 번호 144-55-8, EC 번호 205-633-8</td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea</td><td>시그마</td><td>P7629-25G</td><td>>98%. CAS 번호 103-85-5, EC 번호 203-151-2</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>시그마</td><td>D8418-500ML</td><td>분자 생물학 등급. CAS 번호 67-68-5, EC 번호 200-664-3</td></tr><tr><td>트리카인 메탄설포네이</td>트 <td>웨스턴 케미컬 Inc.</td><td>MS222</td><td>트리카인-S</td></tr><tr><td>저용융 아가로스</td><td>ISC Bioexpress</td><td>E-3112-25</td><td>GeneMate Sieve GQA 저용융 아가로스, 25g</td></tr><tr><td>개방형 목욕 챔버</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>RC-40HP</td><td>하이 프로파일</td></tr><tr><td>유리 커버슬립</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102</td><td>원형 커버 유리. 직경 25mm</td></tr><tr><td>고진공 그리스</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-635-5C</td><td>2.0파운드 튜브. DOW CORNING CORPORATION 1658832</td></tr><tr><td>빠른 교환 플랫폼</td><td>Warner Instruments</td><td>QE-1</td><td>35mm</td></tr><tr><td>스테이지 어댑터</td><td>Warner Instruments</td><td>SA-20LZ-AL</td><td>16.5 x 10cm</td></tr><tr><td>TC SP5 MP 다광자 현미경</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser</td><td>SpectraPhysics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser Safety Box</td><td>라이카 마이크로시스템즈 CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>라이카 어플리케이션 스위트 X (LAS X)&nbsp; 소프트웨어</td>: <td>Leica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Photoshop, CS 6, 버전 13.0, x64, 소프트웨어</td><td>: Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iMovie 버전 10.1.4, 소프트웨어</td>, <td>Apple</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

선 천 성 눈 craniofacial 변칙 중단 신경 크레스트, 몸 전체에 수많은 세포 유형을 철새 줄기 세포의 일시적인 인구에에서 반영 합니다. 신경 크레스트의 생물학 이해 제한, 공부 vivo에서 될 수 있는 유전자 세공 모델의 부족과 실시간으로 반영 되었습니다. Zebrafish는 신경 크레스트 등 철새 세포 인구를 공부에 대 한 특히 중요 한 개발 모델입니다. 개발 눈에 신경 크레스트 마이그레이션 검사, 레이저 스캔 현미경 긴 파장 다중 광자 형광 여기의 고급 광학 기술의 조합 같이 sox10 와 foxd3 가 되어 초기 신경 크레스트 차별화 규제 가능성이 신경 크레스트 셀에 대 한 마커를 대표 하는 수많은 동물 모델에서 유전자 변형 zebrafish 태아, 즉 Tg (sox10:EGFP) 및 안내 (foxd3:GFP)에 개발 눈의 고해상도, 3 차원, 실시간 동영상 캡처 구현 되었습니다. 다중 광자 시간 경과 영상 동작 및 초기 눈 개발에 기여 두 신경 크레스트 세포 인구의 철새 패턴 분별 하 사용 되었다. 이 프로토콜 예를 들어, zebrafish 신경 크레스트 마이그레이션 중 시간 경과 비디오를 생성 하기 위한 정보를 제공 하 고 많은 구조는 제 브라와 다른 모델 유기 체에서의 초기 개발을 시각화에 추가 적용할 수 있습니다.

다중 광자 형광 시간 경과 영상 생성을 야기할 craniofacial 구조 및 안내 (sox10:EGFP)에 안내 (foxd3:GFP) 눈의 앞쪽 세그먼트 zebrafish 라인 두개골 신경 크레스트 셀의 마이그레이션 패턴을 공개 동영상 일련의. 예를 들어, sox10-긍정적인 신경 크레스트 셀 12와 30 hpf 사이 craniofacial 지역 (비디오 1, 그림 2)에 신경 튜브의 가장자리에서 마이그레이션합니다. Prosencephalon mesencephalon에서 셀 마이그레이션 등 및 periocular mesenchyme 채우는 개발 눈에 복 부. 또한,이 sox10-긍정적인 세포 frontonasal 프로세스를 형성합니다. rhombencephalon에서 신경 크레스트 세포 v...

레이저 스캐닝 현미경 검사 법 긴 파장 다중 광자 형광 여기의 고급 광학 기술의 조합 안내 (sox10:EGFP)에 안내 (foxd3:GFP) zebrafish 태아 신경 크레스트 마이그레이션의 고해상도, 3 차원, 실시간 영상 캡처 구현 되었습니다.

실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

다광자 타임랩스 이미징의 전반적인 목표는 이동하는 세포 군집의 고해상도 3차원 실시간 이미지를 캡처하는 것입니다. 이 방법은 서로 다른 세포 군집의 이동 경로를 매핑하는 것과 같이 발달 생물학의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 기존의 공초점 현미경에 비해 이 기술이 갖는 주요 장점은 다광자 레이저가 조직 투과 깊이가 더 깊고 광독성이 감소한다는 점입니다.이는 더 두꺼운 조직에서의 사용성을 높이며 더 긴 시간 동안 영상 획득을 가능하게 합니다. 오후 3시에서 9시 사이에 배아를 수집하려면, 번식 수조를 조립하고 역삼투압수(RO water)를 채우십시오.분리된 수조의 양측에 암컷 최대 3마리와 수컷 최대 3마리를 각각 옮겨 넣습니다. 다음 날 아침, 비바리움의 조명이 켜진 직후에 분리막을 제거합니다. 20분 동안 또는 충분한 수의 배아가 생성될 때까지 방해 없이 교배하도록 둡니다.배아는 사육 탱크 바닥에 위치하게 됩니다. 알이 관찰되면, 물고기와 함께 슬롯형 내부 탱크를 들어 올려 RO수로 채워진 깨끗한 고체 외부 탱크에 빠르게 옮깁니다. 알 수집용 스크린을 사용하여 외부 탱크에서 알을 수집하고, 30 milliliters의 1X 배아 배지가 담긴 페트리 접시로 알을 옮깁니다.수집한 알을 28.5 °C에서 배양합니다. 형질전환 배아의 경우, 수정 후 24시간(HPF)에 죽은 알을 제거하고 배아의 발달 단계를 평가합니다. 핀셋을 사용하여 GFP를 발현하는 배아 3~4개의 난막을 제거합니다.표준 460~490 nm 밴드패스 여기 필터가 장착된 해부용 형광 입체 현미경 하에서 GFP 양성 배아를 선별합니다. 이 배아들을 30 mL의 신선한 1X 배아 배지가 담긴 별도의 페트리 접시로 옮깁니다. 수정 후 20시간(20 HPF)이 지나면, 선별 및 난막 제거가 완료된 GFP 양성 배아를 색소 침착을 억제하기 위해 0.003% PTU 용액에 넣습니다.치료를 너무 일찍 시작하면 신경능선 및 신경상피 발달에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로 주의하십시오. 1x 배아 배지 20mL에 LowMelt Agarose 분말 0.4g을 첨가합니다. 혼합물을 1~2분 동안 또는 용액이 투명해지고 모든 입자가 녹을 때까지 가열합니다.보관을 위해 Agarose 용액 약 1mL를 새로운 1.5mL 원심분리 튜브에 분주합니다. 개방형 배스 챔버(open bath chamber)를 설정하려면, 개방형 배스 챔버의 바닥면에 고진공 그리스를 소량 도포합니다. 그 위에 원형 유리 커버 슬립을 놓고 개방형 배스 챔버의 상단을 바닥면에 밀착될 때까지 돌려 고정합니다.개방된 배스 챔버의 바닥이 약 3/4 정도 채워질 때까지 2% Agarose 용액 500-700 µL를 피펫으로 넣습니다. Agarose가 완전히 중합되지 않으면서 약간 식을 때까지 30초 동안 기다린 후, 배아 하나를 바닥 중앙으로 옮깁니다. 형광 입체 현미경 하에서 10 µL 마이크로 피펫 팁을 사용하여 배아의 방향을 잡고, 배아 배지를 추가했을 때 배아가 떠오르지 않도록 Agarose 바닥 근처에 위치시킵니다.중요한 단계는 배아가 아가로스(Agarose) 내에 올바르게 배치되었는지 확인하는 것입니다. 본 실험에서는 배아를 측면으로 향하게 배치하였으나, 배측 및 복측 영역에 집중하기 위해 배아의 위치를 조정할 수도 있습니다. 아가로스가 굳을 때까지 배아의 상태를 관찰하며 위치를 다시 조정하십시오.그런 다음 전이 피펫을 사용하여 조립된 개방 챔버를 타임랩스 배아 배지로 완전히 채웁니다. 텍스트 프로토콜에 따라 전체 장치를 현미경 스테이지 위에 놓은 후, 5배율 대물렌즈를 사용하여 배아의 위치를 찾습니다. 그다음 스테이지를 수동으로 가장 높은 위치까지 올리고 미동 조절 나사를 사용하여 배아가 현미경 관찰 범위의 중앙에 오도록 조정합니다.수동으로 스테이지를 내린 후, 5배율 대물렌즈를 25배율 수침 대물렌즈로 교체하십시오. 스테이지를 조심스럽게 올려 배아의 초점을 다시 맞춥니다. 소프트웨어에서 XYTZ 모드를 클릭하여 Z 깊이에 걸쳐 XY 평면에서 시간 또는 T 간격으로 여러 이미지를 획득합니다. 형광 또는 명시야 뷰를 사용하여 관심 영역의 초점 깊이를 찾아 Z-스택 범위를 설정하십시오.이 실험들에서 눈의 외측 가장자리는 z-스택의 시작점입니다. 이곳에 초점을 맞춘 후, 소프트웨어에서 begin 버튼을 클릭하십시오. 배아의 중앙선까지 초점을 낮춘 후(z-스택의 끝점), end 버튼을 클릭하십시오.중요한 단계는 Z축 단계(Z step)가 관심 영역을 모두 포함하도록 확인하는 것입니다. 본 실험에서는 가측 가장자리부터 내측 가장자리까지 눈의 너비를 포착하고자 합니다. 획득 시간과 이미징 빈도를 조정하는 메뉴를 클릭하십시오.fluor4의 충분한 회복과 배아의 생존을 위해, 레이저 전원이 켜진 상태의 z-stack 획득 시간과 레이저 전원이 꺼진 상태의 회복 시간 사이의 비율을 최소 1:3으로 유지하십시오. 배아 회복에 적절한 시간을 고려하여, 지정된 창에 z-stack 간의 간격을 설정하십시오. 그런 다음 적절한 창에 실험의 총 소요 시간을 설정하십시오.이제 실시간 이미지 설정을 켜서 레이저 설정의 최종 조정 단계를 진행합니다. 소프트웨어 내의 레이저 투과도, 게인(gain) 및 오프셋 슬라이더 바를 조절하여 형광 이미지를 최적화하십시오. 또한, 실험 기간, 배아의 예상 성장 정도 등을 고려하여 필요에 따라 배아의 방향을 조정하십시오.실험이 진행되는 동안 관심 영역이 프레임 내에 계속 유지되는지 확인하십시오. 타임랩스 획득 중에는 에피형광 광원을 끄고, 배경광 차단에 적합한 레이저 안전 박스로 스테이지를 덮은 다음 시작 버튼을 누르십시오. 레이저 안전 박스의 슬라이딩 도어를 통해 오픈 배스 챔버(open bath chamber)에 접근하여 8-12시간마다 타임랩스 배아 배지를 보충하십시오.이미지 획득 후, 이미지 프로세싱 소프트웨어에서 파일을 열고 해당 이미지 시리즈를 강조 표시합니다. 소프트웨어의 프로세스 메뉴에서 3D 디콘볼루션(deconvolution)을 선택하고 적용하여 각 z-stack을 디콘볼루션합니다. 개별 tif 파일을 비디오 프로세싱 소프트웨어로 가져온 다음, 모든 tif 파일을 선택하여 비디오 에디터로 드래그합니다.비디오 내 각 이미지의 길이를 0.1초로 조정하십시오. 마지막으로 비디오를 mov 또는 mp4 파일로 내보냅니다. 여기 다광자 형광 이미징을 통해, 두개안면 구조와 눈의 앞부분을 형성하는 두개 신경능 세포의 이동 패턴이 transgenic sox10:EGFP 및 foxd3:GFP 제브라피쉬 라인에서 관찰됩니다.12에서 30 hpf 사이의 Sox 10 양성 신경능 세포는 신경관 가장자리에서 두개안면 부위로 이동합니다. 전뇌와 중뇌에서 유래한 세포들은 발달 중인 눈의 등쪽과 배쪽으로 이동하여 안와 주변 중배엽을 형성합니다. 여기서 나타난 바와 같이, sox10 양성 세포들은 전비돌기를 형성합니다.후뇌에서 유래한 신경능세포는 복측으로 이동하여 인두궁을 형성합니다. 30~60 hpf 사이의 foxd3 양성 신경능세포를 시차 촬영한 영상은 이 세포들이 optic cup과 표면 외배엽 사이 및 화살표로 표시된 안구 틈새를 통해 이동하여, 별표로 표시된 수정체 주변으로 모여 홍채 기질을 형성하는 것을 보여줍니다. 이 기술을 완전히 익히면, 적절히 수행될 경우 시작부터 끝까지 4일 만에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때는 형광 강도가 높은 배아를 선택하는 것이 중요합니다. 초기 소프트웨어 설정은 어려울 수 있으나, 일단 매개변수가 결정되면 추가적인 변경 사항은 일반적으로 최소화됩니다. 이 영상을 시청한 후에는 다광자 시간 경과 현미경(multi-photon time-lapse microscopy)을 사용하여 배아 내에서 이동하는 세포를 촬영하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

multi-photon-time-lapse-imaging-to-visualize-development-real-time

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 프로토콜은 zebrafish 배아를 생활에서 개별 뉴런 또는 신경 능선 세포의 이미징을 설명합니다. 이 방법은 형광 공촛점 시간 경과 현미경을 사용하여 셀룰러 행동과 굴지의 현지화을 검사하는 데 사용됩니다.

세포 운동성 및 Zebrafish 태아의 개별 뉴런과 신경 크레스트 세포의 굴지의 Cytoskeleton의 라이브 영상

이 비디오에서는 여러 가지 빛깔의 공촛점 시간 저속 이미징 및 타겟 세포 절제에 대한 기술이 제공됩니다. 시간 저속 영상은 관심의 여러 세포 유형의 동작을 모니터하는 데...

트렌스 제닉 Zebrafish의 여러 가지 빛깔의 시간 저속 영상 : 타겟의 연결을 세포 절제에 의해 활성화 떠올리 망막 줄기 세포

현재 비디오는 개발 zebrafish의 forebrain에서 개별 신경 전구 세포에 대한 라이브 영상을 수행할 수 electroporation과 공촛점 현미경의 조합을 활용하는 방법을 보여줍니다.

개발 Zebrafish Forebrain에 Clonally 관련 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상

출처: Williams, A. L., et al. 실시간 발달을 시각화하기 위한 다광자 타임랩스 이미징: 제브라피시 배아에서 이동하는 신경 능선 세포의 시각화. J. Vis. Exp. (2017)이 비디오는 제브라피시 배아의 신경능선 세포의 이동을 고해상도로 실시간으로 시각화하기 위한 다광자 타임 랩스 이미징 프로토콜을 보여줍니다.

다광자 타임랩스 이미징을 사용한 제브라피시 배아의 신경능선세포 이동 시각화

실험 데이터의 시각화는 과학계에 결과를 제시하는 핵심 요소가되고있다. 성장하는 배아의 살아있는 시간 경과 기록의 생성은 복잡한 발달 과정의 더 나은 표현과 이해에 기여한다. 이 프로토콜은 제브라 피쉬의 단풍 나무 단백질의 광 변환을 통해 셀 라벨에 대한 단계별 가이드입니다.

sox10의 두개 안면 개발의 시각화 : 단풍 나무 형질 전환 제브라 피쉬의 선은 시간 경과 공 초점 현미경을 사용하여

시간 경과 공 촛점 이미징은 배아 발달의 특성에 유용한 강력한 기술이다. 여기에서, 우리는 방법을 설명하고 두개 안면 야생 형에서 형태 형성뿐만 아니라 PDGFRA, smad5 및 SMO 돌연변이 배아를 특징.

4D 공 초점 현미경을 사용하여 제브라 피쉬의 두개 안면 형태 형성 분석

여기에서는 정상적인 발달을 방해하지 않고 살아있는 제브라피시 배아의 후체 발달을 장기간 타임 랩스 이미징할 수 있는 다목적 장착 방법을 제시합니다.

Zebrafish의 개발의 장기 이미징을위한 다목적 장착 방법

생체 내 이미징은 신경계 발달의 근본적인 세포 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기에서 우리는 개발 제브라피시 신경계 내의 다중 색깔 Brainbow 표지세포의 다수를 구상하기 위하여 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 이용하기 위한 기술을 기술합니다.

무지개와 타임랩스 공초점 이미징을 사용하여 살아있는 제브라피시의 뇌 발달 시각화

이 프로토콜은 제브라피시의 토토 라벨링 및 다차원 이미징의 접근 방식을 초기 눈 발달에 설명합니다. 당사는 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 이용한 라벨링, 임베딩 및 4차원(4D) 이미징을 설명하고, 광학컵 형태발생의 해부 메커니즘을 위한 데이터 집합의 획득을 최적화하기 위한 고려 사항을 설명합니다.

제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징

여기서, 결과 데이터를 분석하기 위해 상용화된 라이트시트 현미경 및 이미지 프로세싱 워크스테이션을 이용한 안구 형태형성의 타임랩스 이미징을 위한 프로토콜이 제공된다. 이 프로토콜은 배아 마취, 낮은 용융 온도 아가로스에 매립, 이미징 챔버에 서스펜션, 이미징 매개 변수 설정, 마지막으로 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미징 데이터를 분석하는 절차를 자세히 설명합니다.

rx3:GFP 형질전환 제브라피쉬를 이용한 라이트시트 현미경으로 안구 형태생성 시각화

우리는 빠른 스캐닝 컨포칼 현미경을 활용하여 개발 중인 제브라피시 시신경 구조에서 미세아교세포의 실시간 이미징을 수행하는 방법을 시연하여 생체 내에서 이러한 세포의 역학을 분석할 수 있습니다.

Zebrafish 배아에서 Microglia Dynamics의 실시간 이미징 및 특성 분석

배우세요 다중 광자 시간 경과 영상을 이용하여 제브라피시 태아의 신경 크레스트 세포 이동을 실시간으로 관찰하는 방법을. 이 기술은 발달 생물학 연구에서 세포 이동 경로를 고해상도로 시각화하여 유전자 기능을 연구하는 데 활용됩니다.

실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

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