밀도 Transposon 삽입 라이브러리를 사용 하 여 세균성 활용 Enterobacterial 종자와 같은 대장균 또는 Shigella flexneri 의 창조

이 실험 절차의 전반적인 목표는 박테리아 접합을 사용하여 Escherichia coli 또는 Shigella flexneri에서 고밀도 transposon 삽입 라이브러리를 만드는 것입니다. 이 기술을 사용하면 Tn10 트랜스포손의 무작위 게놈 삽입을 통해 수십만 개의 고유한 박테리아 돌연변이를 생성할 수 있습니다. 이 기술의 주요 이점은 transposon를 품기에 플라스마의 이동이 electroporation와 같은 다른 보다 적게 능률적인 방법 대신에 세균성 활용을 통해 행해진다 입니다.

또한, Tn10 트랜스포존 자체는 다른 트랜스포손보다 바이어스가 적은 상태로 게놈에 삽입됩니다. 멸균 기술을 사용하여 1ml의 공여 균주를 멸균 에펜도르프 튜브에 하룻밤 동안 배양합니다. 튜브에는 예를 들어 기증자에 대한 D로 표시되어야 합니다.

수용 균주에 대해서도 동일한 작업을 수행하여 수용 균주의 하룻밤 배양액 1ml를 멸균 에펜도르프 튜브로 제거합니다. 예를 들어 수신자에 대해 R로 레이블이 지정됩니다. 14, 실온에서 000 번 G에서 1 분 동안 두 튜브를 원심

이 작업은 탁상용 원심분리기에서 수행할 수 있습니다. 원심분리기가 작동하는 동안 접합을 위해 필터를 준비합니다. 멸균 집게를 사용하여 항생제가 들어 있지 않은 라벨이 부착된 LB 한천 플레이트에 니트로셀룰로오스 필터를 놓습니다.

또는 니트로셀룰로오스 필터 대신 멸균 블로팅 페이퍼를 사용할 수 있습니다. 오염을 최소화하기 위해 각 필터를 별도의 LB 한천 플레이트에 놓습니다. 각 필터가 적절하게 레이블이 지정된 LB 한천 플레이트에 배치되었는지 확인하십시오.

각각 필터가 포함된 세 개의 접시를 만듭니다. 하나는 기증자 균주, 다른 하나는 수용자 균주, 다른 하나는 도서관입니다. 원심분리기가 완료되면 하룻밤 배양물을 제거합니다.

Eppendorf tube에서 항생제가 함유된 모든 성장 배지를 제거하고 폐기합니다. 박테리아 세포 팔레트를 방해하거나 방해하지 않도록 주의하되 모든 성장 배지를 제거하십시오. 무균 상태로 작업하고 각 샘플 간에 팁을 변경하십시오.

각 eppendorf tube에 항생제와 피펫이 없는 110마이크로리터의 새 LB 배지를 위아래로 추가하여 배양물을 재현탁합니다. 무균 상태로 작업하십시오. 세포 덩어리가 남아 있지 않은지 확인하기 위해 여러 번 위아래로 피펫팅합니다.

이 단계는 박테리아 배양을 농축하고 야간 배양에서 남은 항생제를 제거하기 위해 수행됩니다. 피펫을 사용하여 농축된 donor 배양액 50마이크로리터를 Donor라고 표시된 필터에 놓습니다. 50마이크로리터를 필터에 천천히 떨어뜨리는 방식으로 추가합니다.

수용체 균주에 대해 50마이크로리터의 재현탁 배양액을 첨가하고, 농축된 재현탁 배양액을 적하 방식으로 수용체 필터에 추가합니다. 접합이 일어나기 위해서는 수용체 균주와 공여체 균주가 모두 동일한 여과지에 추가되어 밀접한 물리적 접촉을 하게 됩니다. 이렇게 하려면 donor strain과 recipient strain을 모두 50μlit를 library라고 표시된 플레이트의 동일한 필터에 추가합니다.

필터가 들어있는 한천 플레이트를 37도에서 6 시간 동안 놓습니다. 접합 과정은 섭씨 37도에서 6시간에 걸쳐 발생합니다. 접합 중에 pJA1 플라스민은 수용체 균주로 이동합니다.

접합 후 박테리아는 와류에 의해 필터에서 분리되고 1밀리몰 IPTG로 유도됩니다. IPTG는 transposase를 유도하고 Kanamycin 저항성 유전자를 포함하는 transposon을 수용 균주의 게놈에 무작위로 삽입합니다. 박테리아는 카나마이신(kanamycin)과 다른 항생제를 함유하는 LB 한천 플레이트에 플레이트를 생성하여 트랜스포존(transposon)을 포함하는 수용체 균주를 선택합니다.

수용체 균주는 Lambda pir 음성이므로 pJA1 플라스민이 손실됩니다. 섭씨 37도에서 6시간 동안 성장하면 접합이 완료됩니다. 인큐베이터에서 필터가 들어 있는 플레이트를 제거합니다.

멸균 집게를 사용하여 LB 한천 플레이트에서 음성 기증자 대조군이 포함된 필터를 제거합니다. 튜브를 두드려 여과지를 원뿔형 바이알 바닥으로 가져오고 필터가 LB 매체에 완전히 잠겼는지 확인합니다. 이 튜브에는 IPTG가 포함된 2밀리리터의 LB 매체와 1밀리몰의 최종 농도가 포함되어 있습니다.

니트로셀룰로오스 필터에서 박테리아를 분리하기 위해 1분 동안 튜브를 소용돌이치십시오. LB 매체는 박테리아 세포로 인해 흐려져야 합니다. 받는 사람 컨트롤과 라이브러리에 대해서도 이 작업을 반복합니다.

박테리아 세포를 포함하는 필터를 완전히 와류화하여 필터에서 박테리아를 분리한 후 박테리아 세포를 선택한 배지에 도금합니다. 이 단계에서 박테리아는 카나마이신과 날리딕산과 같은 다른 항생제를 포함하는 LB 한천 플레이트에 도말됩니다. Kanamycin은 게놈에 성공적으로 통합된 kanamycin resistance marker를 포함하는 transposon이 있는 수용 세포를 선택하는 데 사용됩니다.

마커가 게놈에 통합되지 않은 수용 세포가 선택됩니다. 날리딕산(nalidixic acid)과 같은 다른 항생제는 공여자 균주에 대해 선택하기 위해 사용됩니다. 여기에 사용된 공여 균주는 날리딕산에 민감하고, 수용체 균주는 날리딕산에 내성이 있습니다.

이 두 번째 항생제를 사용하면 공여자 균주를 제거할 수 있습니다. 이 단계에서는 적절한 간격의 많은 콜로니를 생성하는 라이브러리의 희석을 결정하기 위해 여러 희석액을 도금해야 합니다. transposon 라이브러리를 포함하는 모든 플레이트의 콜로니 수를 계산하고 기록한 후 일부 사용자는 라이브러리를 하나의 튜브로 풀링하거나 결합하기를 원할 수 있습니다.

이것은 멸균 스프레더를 사용하여 수행할 수 있습니다. 트랜스포존 라이브러리가 들어 있는 LB 한천 플레이트에 1밀리리터의 LB 배지를 추가합니다. 미디어가 플레이트에 추가되면 멸균 스프레더를 사용하여 플레이트에서 박테리아를 긁어내고 분리합니다.

접시에서 모든 박테리아를 제거하는 것은 종종 불가능합니다. 박테리아 현탁액을 제거하고 50mil 또는 15mil 원뿔형 악에 놓습니다. 모든 플레이트에 대해 이 작업을 반복합니다.

모든 플레이트를 긁어내고 나면 고인 박테리아 현탁액을 1분 동안 소용돌이쳐 세포 덩어리를 분해합니다. 이것이 이제 풀링된 라이브러리를 구성합니다. 37도에서 18시간 동안 성장한 후에는 기증자 또는 수혜자 대조판에 성장이 없어야 합니다.

돌연변이 라이브러리를 포함하는 플레이트는 이상적으로 다양한 크기의 많은 콜로니를 포함합니다. 다른 군체 크기는 다양한 적합성을 가진 클론을 나타내며 프로토콜이 효과가 있었다는 좋은 신호입니다. 박테리아에서 조밀한 transposon mutagenesis 라이브러리를 생성하면 독성 유전자 및 박테리아 병원체의 발견에서 필수 유전자 연구, 유전적 상호 작용 네트워크 식별에 이르기까지 많은 다운스트림 응용 분야에 잠재적으로 유리합니다.

이러한 모든 다운스트림 응용 분야는 조밀한 transposon 삽입 라이브러리의 구성에 의존합니다. 여기에 제시된 방법은 E coli 또는 Shigella flexneri와 같은 장내 세균 균주에서 매우 조밀한 transposon 라이브러리를 만들기 위한 간단하고 빠르며 저렴한 절차를 제공합니다.