Name: 밀도 Transposon 삽입 라이브러리를 사용 하 여 세균성 활용 Enterobacterial 종자와 같은 대장균 또는 Shigella flexneri 의 창조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: 배우세요 밀도 높은 transposon 삽입 라이브러리를 세균 접합을 통해 Escherichia coli 또는 Shigella flexneri에 생성하는 방법입니다. 이 기술은 수십만 개의 고유한 돌연변이체를 효율적으로 만들어 기능 유전체학 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PJA1 플라스 미드의 종류 선물에 대 한 조지 교회 연구소 감사합니다. 난 감사 합니다 Fabienne 햄버거와 Urs Jenal 연구소에서 알렉스 Boehm 바젤에서 Biozentrum에 세균성 활용에 대 한 BW20767 긴장을 제공. 나는 또한 도움이 편집에 대 한 올린 Silander 감사합니다. 이 연구에 대 한 자금 스위스 바젤 대학에서 뉴질랜드에서 메시 대학교 시스템 생물학 (프로젝트 "전투 X" 더크 Bumann에 게 수 여) 스위스 이니셔티브에서 기금에 의해 제공 했다.

주의: S. flexneri 받는 사람 부담, 사용 하는 경우는 참고 하시기 바랍니다 S. flexneri 위장 질환을 일으킬 수 있는 인간 병원 체. 적절 한 biosafety 주의 (유럽 및 미국에서 BSL-2 또는 뉴질랜드에서 PC2 지정)와 S. flexneri 관련 실험을 수행 되어야 합니다. 이 프로토콜와 관련 된 비디오에서 수행 하는 모든 실험 끝났다 비 병원 성 대장균의 특징이 잘 받는 사람 긴장을 사용 하 여 p c 1에 MG1655. 6에 설명 된 대로 Shigella flexneri 작업 이전 바젤, Biozentrum에 BSL 2 lab에서 수행 되었다.
 참고: 다음 실험은 두 번 수행 하 고 효과적으로. 첫 번째 부분 (4.5 단계 1.1-단계)는 라이브러리, 목표 잔디 양식을 주는 접시, 당 많은 개별 식민지 하지만 그리 많은 그 활용의 희석을 찾기 위해 도금에 대 한 최고의 희석을 수행 됩니다. 이 크게 감소 피트 니스와 함께 돌연변이 더 강력한 피트 니스와 그 간의 경쟁을 줄이는 것입니다. 두 번째 부분 (단계 5.1-7.4) 최종 라이브러리, 많은 접시는 라이브러리의 적절 한 희석의 확산은의 창조 이다.
 1.를 준비 1 일 이전에 실험 <ol><li>Inoculate, 냉동된 재고, 파운드 국물의 2 개 mL에 기증자 스트레인에서 밀러 레시피 (10 g/l NaCl) 미디어에서 100 µ g/mL 암 피 실린 포함. 여기 사용 기증자 스트레인은 대장균 스트레인 BW20767 15 pJA1 플라스 미드 11 은닉. 암 피 실린의 사용 유지 pJA1 플라스 미드에 대 한 선택.</li>
	<li>단일 식민지 또는 냉동된 주식, 암 피 실린 또는 대 저항 표시와 함께 파운드 미디어의 2 mL에 받는 사람 긴장에서 Inoculate. 여기에 사용 되는 받는 사람 긴장은 대장균 &#34; 야생 타입 &#34; MG1655 17 , 18 nalidixic 산에 자연 저항 돌연변이와 스트레인. 30 µ g/mL nalidixic 산에서 재배.</li>
	<li>준비 20 Luria 국물 1.5 %agar 포함 하는 (에서 90 mM 페 트리 접시, 약 12.5 mL) 접시. 항생제를 부족 한 천 배지는 4 ° C에서 사용까지 몇 달 동안 저장 될 수.</li>
	<li>20 Luria 국물 준비 포함 1.5% 한 천 배지 (90 mM 페 트리 접시, 약 12.5 mL)에 포함 된 두 nalidixic 산 30 µ g/mL에서 50 µ g/mL (LBA Nal30 Kan50)에 대. 항생제를 포함 한 천 배지 사용까지 몇 달 동안 4 ° C에서 어둠 속에 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>살 균 파운드 미디어의 200ml를 준비합니다. LB 미디어는 몇 달 동안 실내 온도에 저장 될 수.</li>
	<li>제조 업체에 따라 100 m m의 1 mL IPTG, 살 균 재고 준비 &#39; s 지침.</li>
</ol> 2. 세균성 Mating 또는 활용 실 온에서 <ol><li>14000 x에서 1 분간 기증자 스트레인의 숙박 문화의 원심 분리기 1 mL g. 성장 매체를 버리십시오. 이 단계는 항생제를 포함 하는 모든 성장 매체를 제거 이루어집니다.</li>
	<li>110 µ L의 파운드 (항생제를 포함 하지 않는), 따라서 문화 집중으로 셀 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 살 균, 살 균 nitrocellulose 필터 위치 (또는 살 균 압 종이 조각을 사용할 수 있습니다 참조 하십시오 자료 목록)는 LBA 플레이트 (항생제를 포함 하지 않는)의 중간에. 접시를 라벨 &#34; 부정적인 제어: 기증자 &#34;.</li>
	<li>는 피 펫을 사용 하 여 드롭 필터에 집중된 기증자 문화 50 µ L.</li>
	<li>반복 단계 2.1-4 받는 사람 긴장을 위한 접시를 라벨 &#34; 부정적인 제어: 받는 사람. &#34;</li>
	<li>라이브러리, 드롭 (이 번호판 없어야 항생제)는 LBA에 단일 살 균 필터에 (2.5 단계)에서 받는 사람 긴장의 (2.2 단계)에서 기증자 및 50 µ L의 50 µ L. 이 접시를 레이블 &#34; 라이브러리. &#34; Mating 기증자와 받는 사람 필터에 가까운 신체 접촉에서 때문에 발생 합니다.</li>
	<li>장소 6 h. 위해 37 ° C에서 필터를 포함 하는 한 천 배지</li>
</ol> 3. PJA1는 Transposase의 IPTG 유도 함으로써 Transposon의 활성화 <ol><li>준비 3 15 mL 원뿔 튜브 1mm (즉, IPTG의 100 m m 재고 20 µ L)의 최종 농도에 IPTG와 파운드의 2 개 mL를 포함 하. 각 레이블: 기증자 제어 받는 사람 컨트롤 및 라이브러리.</li>
	<li>성장 (단계 2.4)에서 37 ° C에서의 6 h 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. 일부 세균 성장 필터에 표시 되어야 합니다.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 살 균, 기증자 컨트롤에서 필터 종이 제거 하 고 기증자 제어 (3.1 단계)에서 라고 표시 된 15 mL 원뿔 유리병에 넣습니다. 받는 사람 컨트롤 및 라이브러리에 대 한 동일한 작업을 수행.</li>
	<li>15 mL 원뿔 유리병의 하단에 필터 종이 고 파운드에 완전히 빠져들 수 있도록 튜브를 누릅니다</li>
	<li>적어도 전체와 동 관을 nitrocellulose 필터에서 박테리아를 끊을 높은 분. LB 세균 세포 ( 그림 2)와 흐린 될 해야 합니다.</li>
	<li>LBA Nal30 Kan50 플레이트 표시에 기증자 컨트롤에서 vortexed 박테리아 서 스 펜 션의 200 µ L 플레이트 메 마른 유리 구슬 또는 살 균 분산기를 사용 하 여 &#34; 기증자 제어, 200 µ L &#34;.</li>
	<li>(3.6)의 위 단계를 반복 하 여 라벨 번호판 받는 사람 컨트롤에 대 한 &#34; 받는 사람 컨트롤, 200 µ L &#34;.</li>
	<li>(3.7) 위 단계를 반복 하 여 판 라벨 라이브러리에 대 한 &#34; 도서관, 200 µ L &#34;.</li>
	<li>확인 추가 희석 (즉, 1:5, 1시 10분과 1: 100 희석, 파운드는 희석제로 항생제를 포함 하지 않는 사용 하 여) 라이브러리의. 플레이트 200 µ l undiluted 라이브러리에 추가 희석의 적절 하 게 표시 LBA Nal30 Kan50 판.</li>
	<li>37 ° C에 장소 접시 인큐베이터 transposons 피트 니스의 큰 손실이 발생 하는 유전자에 삽입 된 함께 18 헤 클론에 대 한 성장과 플레이트에 표시 하는 시간이 오래 걸릴 수 있습니다. 다양 한 식민지 크기 ( 그림 3) 이어야 한다. 기증자와 받는 사람 부담 접시 그들에 아무 식민지 있어야.</li>
</ol> 4. 선택 하는 최종 돌연변이 라이브러리에 사용할 라이브러리의 적절 한 희석 <ol><li>다양 한 크기의 많은 식민지를 생성 하는 단계 3.9에서 라이브러리의 희석은 적절 하 게 간격을 확인. 목표는 식민지 서로로 병합 및 리소스에 대해 경쟁 한 접시에 가능 하지만 너무 많은 많은 식민지를 얻는 것입니다. 이 번호는 접시 당 약 500-2000 식민지 이어야 한다. 접시에 적절 한 서식 밀도의 예는 그림 3에 표시 됩니다.</li>
	<li>접시에 식민지의 수를 기록.</li>
	<li>활용 (conjugants 받는 사람 셀 당 수)의 주파수를 계산합니다. 이것을 1 x 10 -6 19 1 x 10 -4의 범위에 있어야 한다.</li>
	<li>다운스트림 응용 프로그램에 따라 마지막 라이브러리에서 원하는 돌연변이의 수를 결정 합니다. 많은 사용자는 단순히 가능한 많은 돌연변이와 라이브러리가 필요합니다. 많은 transposon 삽입 이론적으로 가능한 생성 하 (하나의 삽입 모든 기본적인 쌍), 대략적인 목표로ly (즉, 대장균에 대 한 ~4.5 x 10 6) 게놈에 있는 기본적인 쌍으로 식민지의 동일한 수 완전히 모든 가능한 transposon 삽입 된 게놈을 포화. 그것은, 많은 돌연변이 에센셜에 삽입을 은닉 또는 이러한 돌연변이 받는 사람에 게 치명적인 것으로 기능적으로 중요 한 유전자 복구할 수 없게 됩니다.</li>
	<li>얼마나 많은 양의 초기 라이브러리 원하는 크기의 라이브러리를 만드는 데 필요한 계산 합니다. 예를 들어 원하는 라이브러리 크기는 5 x 10 4 돌연변이입니다. 단계 3.9에서 식민지의 최고의 간격으로 희석은 1시 10분의 200 µ L 희석. 이 접시에 식민지의 수는 약 2000 식민지를 것으로 추정 됩니다. 5 x 10 4 돌연변이 필요 하 고 각 플레이트는 2000 식민지 경우 25 접시가이 희석에 필요 합니다.</li>
</ol> 5. 최종 돌연변이 도서관의 창조 <ol><li>반복 단계 1-3.8 (단계 4.4 참조)을 필요에 따라 단계 1.4에서 격판덮개의 수를 조정.</li>
	<li>단계에서 3.9, 접시 원하는 크기의 라이브러리를 작성 하는 데 필요한 만큼 접시에 4.1 단계에서 선택 하는 희석 (단계 4.4 참조).</li>
</ol> 6. 라이브러리 밀도 추정 <ol><li>거기 얼마나 많은 식민지는 접시 당 계산 하 고 그로 인하여 얼마나 밀도 도서관은의 대략적인 견적을 얻을. 예: 2 x 10 5 식민지의 총 도금. 대장균 MG1655 게놈은 약 4.5 x 10 6 기본적인 쌍. 따라서, 약 2 × 10 5 라이브러리 삽입 한 삽입 평균 이다 모든 22 기본적인 쌍 그리고 각 유전자 해야 변경 될 약 45 배, 주어진 그 한 유전자는 약 1 × 10 3 기본적인 쌍. 필수 유전자에 삽입이이 라이브러리에서 아주 underrepresented 될 것 이며 따라서 비필수 유전자 밀도 이것 보다 더 큰 될 가능성이 높습니다. 계산의이 종류는 transposon 밀도의 광범위 한 견적 하나를 제공 합니다.</li>
</ol> 7. Transposon 라이브러리 및 스토리지 풀링 <ol><li>식민지, 계산 후 라이브러리 플레이트에 파운드 (또는 더, 필요에 따라)의 1 mL을 추가 하 고 메 마른 분산기를 사용 하 여 접시에서 박테리아를 다쳤어요. 세균 현 탁 액을 제거 하 고 50 mL 또는 15 mL 원뿔 유리병에. 모든 플레이트에 대 한 반복.</li>
	<li>소용돌이 풀링된 박테리아 서 스 펜 션 전체 분에 대 한 현 탁 액을 균질 하.</li>
	<li>최종 농도 20%의 살 균 글리세롤 추가.
	<ol><li>100 x 20 µ L aliquots 0.25 mL 튜브에 쉽게 다시 성장에 대 한 준비.</li>
		<li>적어도 두 개 이상의 1 mL cryovials에서 aliquot 준비.</li>
	</ol></li> <li>-80 ° C에서 모든 aliquots 저장</li></ol>

<ol><li>Camacho, L. R., Ensergueix, D., Perez, E., Gicquel, B., Guilhot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+virulence+gene+cluster+of+Mycobacterium+tuberculosis+by+signature-tagged+transposon+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a virulence gene cluster of Mycobacterium tuberculosis by signature-tagged transposon mutagenesis.</a> Mol Microbiol. 34 (2), 257-267 (1999).</li>
<li>Hensel, M., Shea, J. E., Gleeson, C., Jones, M. D., Dalton, E., Holden, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+identification+of+bacterial+virulence+genes+by+negative+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Simultaneous identification of bacterial virulence genes by negative selection.</a> Science. 269 (5222), 400-403 (1995).</li>
<li>Glass, J. I., Assad-Garcia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+genes+of+a+minimal+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Essential genes of a minimal bacterium.</a> PNAS. 103 (2), 425-430 (2006).</li>
<li>Salama, N. R., Shepherd, B., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+transposon+mutagenesis+and+essential+gene+analysis+of+Helicobacter+pylori%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Global transposon mutagenesis and essential gene analysis of Helicobacter pylori.</a> J Bacteriol. 186 (23), 7926-7935 (2004).</li>
<li>Akerley, B. J., Rubin, E. J., Camilli, A., Lampe, D. J., Robertson, H. M., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+essential+genes+by+in+vitro+mariner+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of essential genes by in vitro mariner mutagenesis.</a> PNAS. 95 (15), 8927-8932 (1998).</li>
<li>Freed, N. E., Bumann, D., Silander, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+Shigella+Tn-seq+data+with+gold-standard+E.+coli+gene+deletion+data+suggests+rare+transitions+between+essential+and+non-essential+gene+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Combining Shigella Tn-seq data with gold-standard E. coli gene deletion data suggests rare transitions between essential and non-essential gene functionality.</a> BMC Microbiology. 16 (1), 1-14 (2016).</li>
<li>van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn-seq%3A+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nature Methods. 6 (10), 767-772 (2009).</li>
<li>Langridge, G. C., Phan, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+assay+of+every+Salmonella+Typhi+gene+using+one+million+transposon+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants.</a> Genome Research. 19 (12), 2308-2316 (2009).</li>
<li>Gawronski, J. D., Wong, S. M. S., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+insertion+mutants+within+libraries+by+deep+sequencing+and+a+genome-wide+screen+for+Haemophilus+genes+required+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung.</a> PNAS. 106 (38), 16422-16427 (2009).</li>
<li>Chan, K., Kim, C. C., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-based+detection+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+transposon+mutants+that+cannot+survive+in+macrophages+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+and+Immun%22%5BJournal%5D)">Microarray-based detection of Salmonella enterica serovar Typhimurium transposon mutants that cannot survive in macrophages and mice.</a> Infect and Immun. 73 (9), 5438-5449 (2005).</li>
<li>Badarinarayana, V., Estep, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+analyses+of+insertional+mutants+using+subgenic-resolution+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnol%22%5BJournal%5D)">Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays.</a> Nature biotechnol. 19 (11), 1060-1065 (2001).</li>
<li>Bender, J., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IS10+transposase+mutations+that+specifically+alter+target+site+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">IS10 transposase mutations that specifically alter target site recognition.</a> The EMBO Journal. 11 (2), 741-750 (1992).</li>
<li>Shafferman, A., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+properties+of+the+beta+origin+of+replication+of+plasmid+R6K%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K.</a> J Biol Chem. 258 (7), 4083-4090 (1983).</li>
<li>Langridge, G. C., Phan, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+assay+of+every+Salmonella+Typhi+gene+using+one+million+transposon+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants.</a> Genome Research. 19 (12), 2308-2316 (2009).</li>
<li>Metcalf, W. W., Jiang, W., Daniels, L. L., Kim, S. K., Haldimann, A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditionally+replicative+and+conjugative+plasmids+carrying+lacZ+alpha+for+cloning%2C+mutagenesis%2C+and+allele+replacement+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Conditionally replicative and conjugative plasmids carrying lacZ alpha for cloning, mutagenesis, and allele replacement in bacteria.</a> Plasmid. 35 (1), 1-13 (1996).</li>
<li>Badarinarayana, V., Estep, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+analyses+of+insertional+mutants+using+subgenic-resolution+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnol%22%5BJournal%5D)">Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays.</a> Nature biotechnol. 19 (11), 1060-1065 (2001).</li>
<li>Guyer, M. S., Reed, R. R., Steitz, J. A., Low, K. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6271456">Identification of a Sex-factor-affinity Site in E. coli as γδ.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 45 (0), 135-140 (1981).</li>
<li>Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Complete+Genome+Sequence+of+Escherichia+coli+K-12%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12.</a> Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).</li>
<li>Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-Tn10+transposon+derivatives+for+insertion+mutagenesis+and+gene+delivery+into+the+chromosome+of+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria.</a> Gene. 160 (1), 59-62 (1995).</li>
<li>Kvitko, B. H., Bruckbauer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+construction+of+pir%2B+Enterobacterial+hosts+for+maintenance+of+R6K+replicon+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">A simple method for construction of pir+ Enterobacterial hosts for maintenance of R6K replicon plasmids.</a> BMC Res Notes. 5 (1), 157(2012).</li>
<li>Barrick, J. E., Yu, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+evolution+and+adaptation+in+a+long-term+experiment+with+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli.</a> Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).</li>
<li>Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+transposon+mutant+library+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.</a> PNAS. 100 (24), 14339-14344 (2003).</li>
<li>van Opijnen, T., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+insertion+sequencing%3A+a+new+tool+for+systems-level+analysis+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms.</a> Nature Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).</li>
</ol>

저자는 공개 상관이 있다.

여기에 설명 된 프로토콜 밀도 삽입 라이브러리의 건설에 대 한 수 있습니다. 이 메서드는 아래 문화 볼륨6의 5 mL을 사용 하 여 2 x 10 이상의5 독특한 transposon 돌연변이와 transposon 도서관의 창조에 대 한 수 있습니다. 비교적 쉽게 수행 하는, 가장 기본적인 미생물학 실험실에서 사용할 수 있는 시 약을 사용 하 여, 확장 이며 고가의 장비 또는 소모품 electroporation 큐 벳 등의 방법으로 약간을 요구 한다.
이 방법의 중요 한 이점은, 이론적으로, 사용자가 넓은 위도 enterobacterial 받는 사람 종자의 선택에서입니다. 그러나이 종이, 다른 사람 뿐만 아니라11, pJA1 플라스 미드 Shigella flexneri6 와 살 모 넬 라 enterica 다른 enterobacterial 받는 사람 종으로 성공적으로 사용 된 받는 사람 부담으로 대장균 을 사용합니다 serovar Typhimurium 변형 SL134410. 이론적으로, 복제 (오 라R6Kγ) pJA1에서의 γ 기원이 플라스이 미드는 광범위 한 호스트 범위19, 수 있도록 받는 사람 긴장은 유지 될 수 pir +. 최근, 새로운 방법은 설명는 pir + enterobacterial 긴장20, 추가 융통성을 주는 범위에서의 건설을 허용 하는. 또한, pJA1에서 RP4 플라스 미드에서300 자료 쌍 폭도 지역 그램 부정적인 박테리아 긴장19의 광범위에이 플라스 미드의 conjugative 전송을 허용합니다. 간단히 말해서,이 방법은 이론적으로 사용 될 수 다양 한 받는 사람 긴장, 여러 조건으로: 긴장은 pir+, 기증자 스트레인 이외의 대 이외는 항생제 저항으로 표시 됩니다.
프로토콜에 중요 한 단계 단계 4.1에서에서 밖으로 접시를 셀의 적절 한 수를 추정에 놓여 있습니다. 식민지는 너무 밀접 하 게 간격을, 그들은 접시에 양분을 위한 경쟁 하 고 덜 맞는 돌연변이 outcompeted. 이 돌연변이의 총 수에서 감소 될 수 있습니다. 또는 경우 식민지 간격 너무 멀리 떨어져, 접시를 너무 식민지가 될 것입니다 하 고 한 천 배지는 큰 도서관을 달성 하는 데 필요한 총 수 부담이 된다. 따라서, 접시 당 식민지 숫자 측면에서 적절 한 균형을 달성 것이 중요 합니다.
그것은 단계 설명 된 대로 작동 하도록 프로토콜에 나열 된 컨트롤을 수행 해야 합니다. 특히, 기증자 스트레인에 대 한 카운터 선택으로 nalidixic 산을 사용할 때 부정적인 기증자 제어 격판덮개는 식민지의 무료 보장 하는 것이 중요 하다. 이 때문에 낮은 속도 (약 1 x 10-10)21 의 가양성을 생성 하는 nalidixic 산 자연 저항 될 수 있습니다. 일반적으로, 활용 및 전위의 속도가 약 2 x 10-4 19입니다. 따라서, 활용 및 전위의 속도가 몇 배나 nalidixic 산에 자연 저항 속도 보다 큰입니다. 따라서, 진정한 이항 이벤트에 비해 잘못 된 반응의 속도 매우 낮은 프로토콜 작동 될 때 무시할 수 간주. 그러나, 활용 또는 이항의 속도 크게 감소, (에서 낮은 짝짓기 효율 및 IPTG와 transposase 유전자의 감 응 작용의 부족) 및 프로토콜 최대 크기를 조정 하는 경우이 다음 잘못 된 반응의 수에 대 한 보상 (복제 하는 삽입 하는 transposon 하지 않아도) 늘릴 수 있습니다.
일부 수정 단계 3.2 및 3.10에서 보육 시간을 만들 수 있습니다. 3.2 상태 활용 6 h에 대 한 발생 해야 하는 단계 지만 우리의 경험에서는,이 시간 단계 수 (즉, 4-7 h) 결과 크게 변경 하지 않고 다양 한. 또한, 3.10 단계에서 식민지 한 천 배지에서 알을 품는 시간 또한 조정할 수 있습니다. 이 받는 사람 긴장의 시간이 나 성장 속도 두 배로 하는 평균에 따라 변화 될 수 있습니다. 또한, 우리의 경험에 18 h 나왔고 다양 한 식민지 크기, 다양 한 피트 니스의 라이브러리를 나타내는. 그러나, 크게 감소 피트 니스와 식민지 성장 하는 데 시간이 오래 걸릴 수 있습니다 및 따라서 보이지 않을 수 있습니다 후 18 h. 이 메서드는 매우 감소 피트 니스의 클론을 찾는 데 사용 되는 경우 더 이상 보육 시간과 적은 식민지 (즉, 48, 50-300 식민지) 크롤 링을 줄이기 위해 접시에 사용할 수 있습니다.
이 방법의 추가 함정 포함 하는 이미 대 한 받는 사람 부담을 사용할 수는 없습니다. PJA1 플라스 미드에이 장애물을 극복 하기 위해 페니 저항 등 대체 선택 가능한 마커 마커 저항 대에 밖으로 스왑 수 있습니다. 그것은 또한 이론적으로, 그것은 암 피 실린 저항 하는 받는 사람 긴장을 사용 하 여, 지적 가치가 있을 수 있습니다, 그리고는 pJA1로 포함 하는 암 피 실린 저항 감 적 플라스 미드 이항 후 손실 됩니다.
선택의 유전 배경에서 조밀한 transposon 도서관의 창조는 많은 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 잠재적으로 유리한. 예를 들어 auxotrophic 돌연변이 복제 도금22 를 사용 하 여 식별 하거나 감염1,2에서 결함이 있는 돌연변이 식별 밀도 transposon 라이브러리 사용할 수 있습니다. 더 최근에, DNA 시퀀싱 비용 떨어졌다 고 다음 세대 시퀀싱 등 새로운 기술 되 평범한 transposon 라이브러리 사용 되었습니다 깊은 DNA 시퀀싱과 진 본성, 유전자 기능에 대 한 통찰력을 얻을 수 및 유전 상호 작용입니다. 이러한 방법 중 일부 23 에서 검토 하 고 transposon 감독 삽입 사이트 시퀀싱 (TraDIS), transposon 시퀀싱 (테네시-seq), 높은 처리량 삽입 딥 시퀀싱 (안타), 그리고 삽입 시퀀싱 (추적 방법 포함 INSeq)입니다. 이러한 모든 다운스트림 메서드 밀도 transposon 삽입 라이브러리의 건설에 의존합니다. 다른 특정 다운스트림 방법을 사용 해야 할 수도 있습니다, 하는 동안 여기에 설명 된 프로토콜 따라 현저한 절차 포인트에 대 한 개요를 제공 합니다.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56216/creation-dense-transposon-insertion-library-using-bacterial">Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri</a>. The Discussion and References sections have been corrected.
The second paragraph in the Discussion section was updated from:
A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use&#160;E. coli&#160;as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as&#160;Shigella flexneri6&#160;and&#160;Salmonella enterica&#160;serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the &#947; origin of replication (oriR6K&#947;) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is&#160;pir+.&#160;Recently, new methods have been described that allow for construction of the&#160;pir+&#160;in a range of enterobacterial strains20, giving additional flexibility. Additionally, the300 base pair mob&#160;region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is&#160;pir+, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.
to:
A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use&#160;E. coli&#160;as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as&#160;Shigella flexneri6&#160;and&#160;Salmonella enterica&#160;serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the &#947; origin of replication (oriR6K&#947;) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is&#160;pir-.&#160;The&#160;300 base pair mob&#160;region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is&#160;pir-, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.
The References&#160;section was updated from:
<ol start="18">
	<li>Blattner, F. R., Plunkett, G.,&#160;et al.&#160;The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12.&#160;Science.&#160;277&#160;(5331), 1453-1462 (1997).</li>
	<li>Alexeyev, M. F., &#38; Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria.&#160;Gene.&#160;160&#160;(1), 59-62 (1995).</li>
	<li>Kvitko, B. H., Bruckbauer, S.,&#160;et al.&#160;A simple method for construction of pir+ Enterobacterial hosts for maintenance of R6K replicon plasmids.&#160;BMC Res Notes.&#160;5&#160;(1), 157 (2012).</li>
	<li>Barrick, J. E., Yu, D. S.,&#160;et al.&#160;Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli.&#160;Nature.&#160;461&#160;(7268), 1243-1247 (2009).</li>
	<li>Jacobs, M. A., Alwood, A.,&#160;et al.&#160;Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.&#160;PNAS.&#160;100&#160;(24), 14339-14344 (2003).</li>
	<li>van Opijnen, T., &#38; Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms.&#160;Nature Rev Microbiol.&#160;11&#160;(7), 435-442 (2013).</li>
</ol>
to:
<ol start="18">
	<li>Blattner, F. R., Plunkett, G.,&#160;et al.&#160;The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12.&#160;Science.&#160;277&#160;(5331), 1453-1462 (1997).</li>
	<li>Alexeyev, M. F., &#38; Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria.&#160;Gene.&#160;160&#160;(1), 59-62 (1995).</li>
	<li>Barrick, J. E., Yu, D. S.,&#160;et al.&#160;Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli.&#160;Nature.&#160;461&#160;(7268), 1243-1247 (2009).</li>
	<li>Jacobs, M. A., Alwood, A.,&#160;et al.&#160;Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.&#160;PNAS.&#160;100&#160;(24), 14339-14344 (2003).</li>
	<li>van Opijnen, T., &#38; Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms.&#160;Nature Rev Microbiol.&#160;11&#160;(7), 435-442 (2013).</li>
</ol>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56216/creation-dense-transposon-insertion-library-using-bacterial">Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri</a>.&#160;The Discussion and References sections have been corrected.

Erratum: Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

박테리아에서 transposon mutagenesis 라이브러리의 창조는 세균성 병원 체1,2, 독성 유전자의 발견에서 필수 유전자3, 의 연구에 이르기까지 응용 프로그램의 다양 한 유용 4 , 5 , 6, 유전자 상호 작용의 id에7,,89네트워크. 이러한 연구에 중요 한 돌연변이의 큰 도서관을 만드는 기능이입니다. Transposons (짧은 조각 DNA의 게놈에 무작위로 삽입)의 사용은 유전자 기능을 방해 하는 간단한 수단으로 열려있는 독서 프레임 또는 유전자의 규제 지역 내의 transposon의 삽입 함수 또는 식에 자주 중단 됩니다. 유전자.
여기에 설명 된 플라스 미드 pJA110를 사용 하 여 세균성 활용 하 여 대장균 또는 S. flexneri transposon 도서관의 창조를 위한 방법이입니다. 이 플라스 미드를 사용 하 여 두 가지 주요 이점이 있다. 첫 번째 장점은 pJA1 플라스 미드에서 표현 Tn10 transposase의 변종 유도할 수 있는 이며 낮은 삽입 바이어스11,12는 transposon 게놈에 무작위로 통합할 것입니다 의미 했다 때 이소프로필 Β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)는 미디어에 추가 됩니다. transposon 대 저항 마커를, 받는 사람 긴장의 염색체에 돌연변이 transposon 삽입과 선택에 대 한 수 있도록 포함 되어 있습니다. PJA1 플라스 미드의 두 번째 장점은 그것 포함 하는 복제의 R6K 돌연변이 기원입니다. 복제의 R6K 돌연변이 출처 람다 pir 유전자를 플라스 미드13의 유지 보수에 대 한 순서 대로 필요합니다. 플라스 미드는 pir- 긴장에 복제할 수 없습니다로 받는 사람 부담 (그림 1)에서 손실 될 것입니다. 이렇게 하면 Tn10 transposase 셀에서 제거 되 고 더 이상 활성 상태 인지, 초기 전위 이벤트 후 추가 변이 감소 시키기.
받는 사람 부담을 기증자 긴장에서 pJA1 플라스 미드 이동 세균성 활용을 사용 하 여 여러 가지 이유로 유리 하다. 활용은 간단 하 고 저렴 한 수행 하 고는 electroporator와 같은 특별 한 장비를 필요 하지 않습니다. 또한, 세균성 활용의 고효율 대용량 라이브러리에 대 한 허용 (&#62; 2 x 105 독특한 삽입) 하룻밤 세균성 문화6의 단지 몇 밀리 리터 (mL)와 함께 달성. 프로세스는 약 두 시간의 실습 보육에 대 한 시간 함께 하 고 박테리아의 성장을 걸립니다. Langridge 외. 14 라이브러리를 만드는 transposon mutagenesis는 크기의 것과 유사한 130 electroporations 수행을 보고 설명 여기8, 단일 활용으로 이루어집니다. 130 electroporations 사용 하 여 electrocompetent 세포의 노동 집중 하 고 시간이 걸리는 준비와 많은 비싼 물질 (예, electroporation 큐 벳), 비용의 이상의 $1000 달러 혼자 소모품에 사용 해야합니다. 다른 연구10 사용 유사한 방법, 그러나 다른 세균성 긴장, 및 달성된까지 작은 라이브러리 크기 (5 x 104 콜로 니 형성 단위) 보다 여기에서 보고 된.
기증자 스트레인에 노트: 여기 사용 기증자 변형 대장균 스트레인 BW2076715 pJA1 transposon 플라스 미드16를 포함 하는. 스트레인 BW20767 pJA1 플라스 미드의 양도 매우 효율적인 다른 긴장을 단백 결합 수 있습니다. 또한, 중요 한 것은, BW20767는 람다 pir +. 앞에서 설명 했 듯이, 플라스 미드 pJA1는만 람다 pir 유전자 포함 된 긴장에 유지 될 수 있다. 이 긴장 대 이며 암 피 실린 내성입니다. PJA1 플라스 미드 암 피 실린 저항 마커를 포함 하 고 대 저항 마커는 transposon 포함. 이 긴장에서 100 µ g/mL 암 피 실린을 사용 하 여 플라스 미드에 선택과 성장 이다. 그것은 또한 constitutively 표현 transposase 유전자를 품고 다른 긴장을 안정, 알려져 있다 지적 가치가 및 transposase 사용 하는 동안 여기에서 유도할 수 있는 제어, 새 식의 낮은 위험이 남아 있다. 이러한 이유로, 그것은 좋습니다이 긴장의 통과 최소화 해야 하 고 신선한 행진 각 새로운 라이브러리 준비에 대 한 고정 된 문화에서가지고 야 한다. 여기에 사용 되는 기증자 스트레인 요청 시 우리 연구소에서 제공 됩니다.
받는 사람 스트레인에 대 한 정보: 받는 사람 부담 선택, S.flexneri (또한, 토론 참조)의 변종 대장균 의 K12 파생 실험실 긴장 등의 변형 수. 기증자 스트레인에 대 한 선택할 수 있도록 받는 사람 긴장 대 저항, 그는 추가 항생제 저항 표식이 있어야 합니다. 받는 사람 스트레인에 대 한 대장균 MG1655 긴장 여기 소개 자연 nalidixic 산 돌연변이 함께 사용 됩니다. 자발적인 nalidixic 산 돌연변이 30 µ g/mL에서 nalidixic 산을 포함 하는 접시에 200 µ L aliquots에서 하룻밤 문화의 2 mL에 밖으로 도금에 의해 선정 되었다. MG1655의 단일 복제 받는 사람 긴장 되기 nalidixic 산에 저항 했다 선정 됐다. 또한, 위에서 설명한 대로 받는 사람 부담 람다 pir 부정 되어야 합니다.
개요: 세균성 활용 자리를 차지 하 고 pJA1 플라스 미드는 받는 사람 긴장으로 기증자 스트레인에서 이동, 미디어 IPTG의 추가 것의 표현을 유도 IPTG-유도할 수 있는의 통제, tnp 유전자 lacIq/Ptac 발기인 (그림 1). PJA1에 tnp 유전자 돌연변이 transposase 핫스팟6,,1011에 삽입의 낮은 주파수를가지고 이다. 추가와 IPTG와 유도 transposon는 활성화 하 고 게놈에 무작위로 삽입. 플라스 미드는 람다 pir 받는 긴장에 유지 될 수 없습니다 하 고 손실 됩니다.

<table><tbody><tr><td>0.45 미크론 니트로 셀룰로오스 필터 (멸균)</td> <td>Millipore</td><td>HAWP02500</td><td>대안적으로 압지를 사용할 수 있습니다 (아래 나열)</td></tr> <tr><td>~ 1 인치 원으로 자른 블로팅 페이퍼, 그런 다음 호일로 오토 클레이브 / 멸균. 니트로셀룰로오스 필터와 블로팅 페이퍼 사이의 효율성에는 차이가 없습니다</td>. <td>GE 생명 과학: 제품 등급 3MM Chr 블로팅 페이퍼, 시트, 46 &times; 57 cm</td><td>3030-917</td><td>대안적으로 니트로셀로스 필터를 사용할 수 있습니다(위에 나열되어 있음)</td></tr><tr><td>메탈 펜치, 멸균</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>MURRE009/01</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시, 멸균, 90 mm 직경, 68 mL 용량, &nbsp; 12.5mL 용량.</td><td>Interlab New Zealand</td><td>2303-1090</td><td></td></tr><tr><td>멸균 유리 스프레더</td><td>VWR/Global Science New</td><td>Zealand NZNZSPREADER</td><td>또는 멸균 유리 구슬을 사용하여 플레이트에 배양을 퍼뜨릴 수 있습니다(아래 나열)멸</td></tr><tr><td>균 유리 구슬</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>HERE1080603</td><td>또는 멸균 유리 스프레더를 사용하여 플레이트에 배양을 퍼뜨릴 수 있습니다(위에 나열됨).</td></tr><tr><td>Nalidixic acid (선택 사항)</td><td>GoldBio.com</td><td>N-015-250</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin sodium salt BioChemica</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>APLIA0839.0025</td><td>제조사 추천에 따라 준비</td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate BioChemica</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>APLIA1493.0010</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranoside)&nbsp;</td><td>Thermofisher 뉴질랜드</td><td>FMTR0393</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar 과립</td><td>Fort Richard Laboratries/Interlab 뉴질랜드</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth Base (Miller's LB Broth Base)</td><td>Thermofisher</td><td>12795-084</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol bidistilled 99,5 %</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>VWRC24388.320</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 폴리프로펠렌 멸균 원뿔형 바이알&nbsp;</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>CORN430791</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브, 플랫 캡, 1.7ml, 초투명 PP, 눈금, 오토클레이브 및 냉동 가능</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>AXYGMCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>50ml 원심분리기 튜브, 팔콘, PP, 원추형, 인쇄 눈금, 플랫 스크류 캡 포함, 멸균</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>BDAA352070</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</strong</td></tr><tr><td>>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator at 37C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoclave for sterilizing media&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

밀도 transposon 삽입 라이브러리를 사용 하 여 세균성 활용 enterobacterial 종자와 같은 대장균 또는 shigella flexneri 의 창조

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis는 transposon 라는 DNA의 조각의 무작위 게놈 삽입을 통해 유전자 중단을 허용 하는 방법입니다. 프로토콜 아래 대 저항 마커를 포함 하는 transposon 은닉 하는 플라스 미드의 세균 변종 사이의 높은 효율 전송 하는 방법을 설명 합니다. 플라스 미드 부담 transposase 변형 tnp 유전자는 transposon 매우 낮은 insertional 바이어스 받는 사람 긴장의 게놈으로 삽입 하 여 인코딩됩니다. 이 메서드는 따라서 있는 transposons 대장균 또는 Shigella flexneri 박테리아의 받는 사람 부담에 독특한 게놈 위치에 삽입 된 큰 돌연변이 라이브러리의 생성을 수 있습니다. 세균성 활용, electroporation 또는 화학 변환 같은 다른 방법에 반대를 사용 하 여 독특한 클론의 수천의 수백을 가진 큰 라이브러리를 만들 수 있습니다. 이 비 필수적인 유전자에 있는 모든 4-6 기본 쌍으로 자주 발생 하는 삽입 된 고밀도 삽입 라이브러리를 생성 합니다. 이 메서드는 다른 방법에 우수한 조밀한 transposon 삽입 도서관의 창조에 대 한 저렴 한, 사용 하기 쉬운 고 능률 방법에 대 한 수 있습니다. 유전 상호 작용 네트워크, 유추 (Tn-Seq), 연속 transposon 같은 다운스트림 응용 프로그램 또는 더 간단 하 게, mutational transposon 라이브러리를 사용할 수 있습니다 (앞으로 유전) 화면.

18 시간 후 성장, 번호판 식민지 크기의 다양 한 많은 식민지를 포함 한다 (그림 3). 다른 식민지 크기 다양 한 피트 니스의 클론을 나타냅니다 그리고 프로토콜 왔다 좋은 징조. 기증자와 받는 사람 컨트롤 플레이트에 성장이 있어야 합니다. 위의 프로토콜을 사용 하 여 이상의 2 x 105 콜로 니 형성 단위 (CFU) 항복 한다. 한 번에 5 복제 활용형을 프로토콜 확장 약 1 x 106 CFU 항복 한다. 이전 작업에서 다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 분석을 확장된 라이브러리 양보 해야 표시 &#62; 2 x 105 독특한 삽입6. 매우 높은 CFU (즉, 1 x 106 CFU)에서 독특한 삽입의 속도으로 예상 된다 고원, 모든 사용 가능한 (사소한) 삽입 표시 될.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56216/56216fig1.jpg"> 
그림 1 : 세균성 활용 및 염색체로 transposon의 삽입의 도식. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56216/56216fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56216/56216fig2.jpg"> 
그림 2 : Vortexing 전후 파운드 미디어에서 submersed 필터의 이미지. Vortexing, 전에 셀 필터에 붙어있는 고 언론은 분명 하다. Vortexing, 후 미디어 셀 필터 떨어져와 서 하 고 미디어에 흐린 된다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56216/56216fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56216/56216fig3.jpg"> 
그림 3 : (A) 후 성장의 18 h transposon 라이브러리의 대표적인 접시. (B) 가까이 식민지 크기의. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56216/56216fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기에 제시 된 대장균 또는 Shigella flexneri 세균성 활용을 사용 하 여 고밀도 transposon 삽입 라이브러리를 만들기 위한 간단한 방법이입니다. 이 의정서는 transposon의 임의의 게놈 삽입 하 여 독특한 돌연변이 박테리아에 수천의 수백의 컬렉션의 창조를 허용 한다.

밀도 Transposon 삽입 라이브러리를 사용 하 여 세균성 활용 Enterobacterial 종자와 같은 대장균 또는 Shigella flexneri 의 창조

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 박테리아 접합(bacterial conjugation)을 이용하여 Escherichia coli 또는 Shigella flexneri에서 고밀도 트랜스포존 삽입 라이브러리를 구축하는 것입니다. 이 기술은 Tn10 트랜스포존의 무작위 게놈 삽입을 통해 수십만 개의 고유한 박테리아 돌연변이체를 생성할 수 있게 합니다. 이 기술의 주된 장점은 트랜스포존을 보유한 플라스미드의 전달이 전기천공법(electroporation)과 같이 효율이 낮은 다른 방법 대신 박테리아 접합을 통해 이루어진다는 점입니다.또한, Tn10 트랜스포존 자체는 다른 트랜스포존보다 게놈에 삽입될 때 편향성이 적습니다. 무균 조작법을 사용하여, 공여 균주의 하룻밤 배양액 1 mL를 멸균된 에펜도르프 튜브에 넣습니다. 튜브에는 예를 들어 공여자를 의미하는 D라고 표시해야 합니다.수용균주에 대해서도 동일하게 수행하여, 수용균주의 하룻밤 배양액 1 mL를 멸균된 에펜도르프 튜브에 옮깁니다. 예를 들어, 수용균주를 의미하는 R로 라벨을 붙입니다. 두 튜브를 모두 실온에서 14,000 ×g로 1분 동안 원심분리합니다.이 작업은 벤치탑 원심분리기를 사용하여 수행할 수 있습니다. 원심분리기가 작동하는 동안 결합을 위한 필터를 준비하십시오. 멸균 집게를 사용하여 항생제가 포함되지 않은 표시된 LB agar 플레이트 위에 니트로셀룰로오스 필터를 놓으십시오.또는 니트로셀룰로오스 필터 대신 멸균 블로팅 페이퍼를 사용할 수 있습니다. 오염을 최소화하기 위해 각 필터를 별도의 LB agar 플레이트에 배치하십시오. 각 필터가 적절하게 라벨링된 LB agar 플레이트에 놓였는지 확인하십시오.필터가 포함된 플레이트를 3개 준비합니다. 각각 공여 균주용, 수용 균주용, 그리고 라이브러리용으로 사용합니다. 원심분리가 완료되면, 하룻밤 동안 배양한 배양액을 꺼냅니다.에펜도르프 튜브에서 항생제가 포함된 배양액을 모두 제거하여 폐기하십시오. 박테리아 세포 펠렛이 손상되거나 흐트러지지 않도록 주의하되, 배양액은 최대한 모두 제거하십시오. 반드시 무균 상태에서 작업하고 샘플마다 팁을 교체하십시오.각 에펜도르프 튜브에 항생제가 없는 신선한 LB 배지 110 µL를 첨가하고, 피펫팅하여 배양액을 재현탁합니다. 이때 반드시 무균적으로 작업하십시오. 세포 덩어리가 남지 않도록 여러 번 피펫팅하여 충분히 섞어줍니다.이 단계는 박테리아 배양액을 농축하고 하룻밤 동안의 배양 과정에서 남은 항생제를 제거하기 위해 수행합니다. 피펫을 사용하여 농축된 공여자 배양액 50 µL를 Donor라고 표시된 필터 위에 올립니다. 50 µL의 배양액을 필터에 천천히 한 방울씩 떨어뜨려 추가합니다.수용균주에 대해서도 동일하게 수행하되, 재현탁된 배양액 50 µL를 수용균주 필터 위에 방울 형태로 떨어뜨려 농축된 재현탁 배양액을 추가합니다. 접합이 일어나기 위해서는 수용균주와 공여균주가 모두 동일한 필터 페이퍼에 추가되어 물리적으로 밀접하게 접촉해야 합니다. 이를 위해 'library'라고 표시된 플레이트의 동일한 필터에 공여균주와 수용균주를 각각 50 µL씩 추가합니다.필터가 포함된 이 한천 배지들을 37 °C에서 6시간 동안 배양합니다. 접합 과정은 37 °C에서 6시간 동안 진행됩니다. 접합 과정 중에 pJA1 플라스미드가 수용 균주로 이동합니다.접합 후, 보텍싱(vortexing)을 통해 박테리아를 필터에서 분리하고 1 mM IPTG로 유도합니다. IPTG는 트랜스포세이스(transposase)를 유도하며, 카나마이신(Kanamycin) 내성 유전자를 포함하는 트랜스포존이 수용 균주의 게놈에 무작위로 삽입됩니다. 박테리아를 카나마이신과 또 다른 항생제가 포함된 LB 한천 배지에 도말하여 트랜스포존을 보유한 수용 균주를 선택합니다.수용 균주는 Lambda pir 음성이므로 pJA1 플라스미드가 소실됩니다. 37°C에서 6시간 동안 배양하면 접합이 완료됩니다. 인큐베이터에서 필터가 포함된 플레이트를 꺼내십시오.멸균된 핀셋을 사용하여 LB agar 플레이트에서 음성 공여자 대조군(negative donor control)이 포함된 필터를 제거합니다. 튜브를 가볍게 두드려 필터 페이퍼를 원추형 바이알 바닥으로 내려가게 하고, 필터가 LB 배지에 완전히 잠겼는지 확인합니다. 이 튜브에는 최종 농도 1 mM의 IPTG가 포함된 2 mL의 LB 배지가 들어있습니다.니트로셀룰로오스 필터에서 박테리아를 분리하기 위해 튜브를 1분 동안 볼텍싱합니다. LB 배지가 박테리아 세포로 인해 탁해져야 합니다. 수용자 대조군과 라이브러리에 대해서도 이 과정을 반복합니다.박테리아 세포가 포함된 필터를 충분히 볼텍싱하여 필터에서 박테리아를 분리시킨 후, 박테리아 세포를 선택 배지에 도말합니다. 이 단계에서 박테리아는 kanamycin과 nalidixic acid와 같은 또 다른 항생제가 포함된 LB agar 플레이트에 도말됩니다. Kanamycin은 kanamycin 내성 마커를 포함하는 트랜스포존이 게놈에 성공적으로 삽입된 수용 세포를 선택하는 데 사용됩니다.게놈에 마커가 통합되지 않은 수용 세포는 음성 선택(select against)됩니다. 공여 균주를 음성 선택하기 위해 nalidixic acid와 같은 또 다른 항생제가 사용됩니다. 여기서 사용된 공여 균주는 nalidixic acid에 민감한 반면, 수용 균주는 nalidixic acid에 내성이 있습니다.이 두 번째 항생제를 사용하여 공여 균주를 제거할 수 있습니다. 이 단계에서는 여러 희석 배수를 도말하여, 콜로니들이 적절한 간격으로 많이 형성되는 라이브러리 희석 배수를 결정해야 합니다. 트랜스포존 라이브러리가 포함된 모든 플레이트의 콜로니 수를 세고 기록한 후, 일부 사용자는 라이브러리를 하나의 튜브에 풀링하거나 결합하고자 할 수 있습니다.이는 멸균된 도말기로 수행할 수 있습니다. 트랜스포존 라이브러리가 포함된 LB 한천 배지 플레이트에 LB 배지 1 mL를 첨가합니다. 플레이트에 배지를 첨가한 후, 멸균된 도말기를 사용하여 플레이트에서 박테리아를 긁어내어 분리합니다.플레이트에서 모든 박테리아를 제거하는 것은 종종 불가능합니다. 박테리아 현탁액을 제거하여 50 mL 또는 15 mL 원뿔형 튜브에 담으십시오. 모든 플레이트에 대해 이 과정을 반복하십시오.모든 플레이트를 긁어낸 후, 세포 덩어리를 분해하기 위해 모아진 박테리아 현탁액을 1분 동안 충분히 볼텍싱합니다. 이것이 최종적으로 모아진 라이브러리가 됩니다. 37°C에서 18시간 동안 배양한 후, 공여체 또는 수용체 대조군 플레이트에서는 성장이 관찰되지 않아야 합니다.돌연변이 라이브러리가 포함된 플레이트에는 이상적으로 다양한 크기의 콜로니가 많이 포함되어 있어야 합니다. 서로 다른 콜로니 크기는 적응도(fitness)가 다양한 클론들이 있음을 나타내며, 이는 프로토콜이 성공적으로 수행되었음을 보여주는 좋은 징후입니다. 박테리아에서 고밀도 트랜스포존 돌연변이 유발 라이브러리를 구축하는 것은 독성 유전자 및 박테리아 병원체 발견부터 필수 유전자 연구, 유전적 상호작용 네트워크 식별에 이르기까지 많은 후속 응용 분야에 잠재적인 이점이 있습니다.이러한 모든 하위 응용 분야는 고밀도 트랜스포존 삽입 라이브러리의 구축에 의존합니다. 본 연구에서 제시하는 방법은 E coli 또는 Shigella flexneri와 같은 장내세균 균주에서 매우 고밀도의 트랜스포존 라이브러리를 제작할 수 있는 간단하고 빠르며 저렴한 절차를 제공합니다.

creation-dense-transposon-insertion-library-using-bacterial

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

미리 만든 수용체의 직전 되나 상륙 패드 종자에 관심있는 외국의 DNA를 통합하는 신속하고 효율적인 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 ΦC31 integrase의 활용과 표현을 통해 주어진 변형율의 공학 상륙 패드 현장에 DNA 카세트의 특정 사이트 통합을 허용합니다.

사이트 특정 박테리아 염색체 공학 : ΦC31 Integrase 중재 카세트 거래소 (IMCE)

출처: Kazi, M. I., et. al., 고처리량 시퀀싱을 위한 그람 음성 박테리아에서 트랜스포존 삽입 라이브러리 생성. J. Vis. Exp. (2020년)이 비디오는 카나마이신 내성을 기반으로 트랜스포존 삽입을 운반하는 그람 음성 수용자 박테리아의 선택, 정량화 및 보존을 보여줍니다.

게놈 트랜스포존 삽입을 통한 그람 음성 박테리아의 분리

출처: Erdogan, F.,et al., 박테리아 접합에 관여하는 전달 단백질의 서열 특이적 분석을 위한 접합 짝짓기 분석. J. Vis. 경험. (2017년)이 비디오는 구조 플라스미드를 사용하여 기증자에서 수혜자 대 장균 세포로 F 플라스미드를 전달하고 이중 항생제 내성을 통해 형질전환체를 선택하는 절차를 보여줍니다. 이 과정에는 박테리아 배양 혼합, 흔들림 없이 배양, 짝짓기 쌍 방해, 성공적인 플라스미드 전달을 확인하기 위한 선택적 배지에 도금하는 작업이 포함됩니다.

대장균의 F 플라스미드 전달 및 이중 항생제 선택

엔테로 박터 SP. YSU는 포도당 최소 염 배지에서 성장한다. 영양 요구 임의로 숙주 게놈 내로 그 자체를 삽입 transposome로 변환함으로써 생성된다. 돌연변이는 최소 배지에 복잡한 매체로부터 복제 도금에 의해 발견된다. 중단 된 유전자는 유전자 구조 및 시퀀싱에 의해 식별됩니다.

생성 엔테로 박터 SP. YSU 영양 요구는 트랜스포존 돌연변이 유발을 사용하여

여기에서는 플라스미드 접합에 관여하는 관심 유전자를 knockout하고 나중에 짝짓기 분석을 사용하여 그 부재의 영향을 분석하는 프로토콜을 제시합니다. 유전자의 기능은 결실 또는 점 돌연변이를 사용하여 염기서열의 특정 영역까지 더 탐구됩니다.

접합에 참여 전송 단백질의 서열 별 분석을위한 공역 결합 분석 실험

여기, 비 코딩 DNA 요소의 transposon 중재 무작위 삽입의 힘의 최적의 염색체 위치를 해결 하기 위해 사용 되었다.

소설 Transposon 중재 방식을 사용 하 여 대장균 의 DNA 요소에 대 한 최적의 염색체 위치 결정

여기를 식별 하 여 조직에서 transposon leptospiral 돌연변이 햄스터의 도전 후 계량 높은 처리량 시퀀싱 transposon mutagenesis 결합 기술을 설명 합니다. 이 프로토콜 생존 및 동물에 보급에 대 한 화면 돌연변이를 사용할 수 있습니다 하 고 생체 외에서 연구에도 적용 될 수 있습니다.

높은 처리량 측정 적합성 Leptospira interrogans Transposon 삽입 돌연변이 중 황금 시리아 햄스터 감염의 병렬 시퀀싱

PBIBAC-GW 이진 벡터를 사용 하 여 생성 유전자 변형 식물을 그대로 단일 복사본 삽입, 쉬운 과정을 만든다. 여기, 프로토콜의 시리즈는 유전자 변형 애기 식물을 생성 하 고 intactness에 대 한 식물을 테스트 과정을 통해 독자를 안내 하 고 삽입의 수를 복사 하 여.

BIBAC-GW 이진 벡터를 사용 하 여 단일 복사본 삽입을 가진 유전자 변형 식물 생성

당사는 그람 음성 박테리아에 있는 포화 트랜스포슨 돌연변이 라이브러리를 생성하고 고처리량 시퀀싱을 위한 DNA 증폭기 라이브러리의 후속 준비를 생성하는 방법을 설명합니다. 예를 들어, 우리는 ESKAPE 병원체, 아신토박터 baumannii에초점을 맞추고 있지만,이 프로토콜은 그람 음성 유기체의 넓은 범위에 순종.

고처리량 시퀀싱을 위한 그람 음성 박테리아에 트랜스포슨 삽입 라이브러리 생성

이것은 버크 홀더리아 유익한 공생에서 후보 곤충 식민지 요인을 식별하기위한 적응 된 방법입니다. 딱정벌레 숙주는 트랜스포슨 돌연변이 발생을 통해 생성된 무작위 돌연변이 라이브러리에 감염되며, 식민지 화 후 라이브러리 복잡성은 시험관내에서자란 대조군과 비교된다.

라그리아 빌로사 딱정벌레의 부르크홀더리아 글래디올리 공생에서 세균 식민지 요인을 해명하는 도구로 트랜스포슨 삽입 시퀀싱

배우세요 밀도 높은 transposon 삽입 라이브러리를 세균 접합을 통해 Escherichia coli 또는 Shigella flexneri에 생성하는 방법입니다. 이 기술은 수십만 개의 고유한 돌연변이체를 효율적으로 만들어 기능 유전체학 연구에 활용됩니다.

밀도 Transposon 삽입 라이브러리를 사용 하 여 세균성 활용 Enterobacterial 종자와 같은 대장균 또는 Shigella flexneri 의 창조

더 많은 동영상 탐색