Name: AFM와 Microrheology Zebrafish 태아 노른자위 셀에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 배우세요 제브라피시 태아의 기계적 특성을 측정하는 AFM 및 미세점성측정 기법을 활용한 방법론입니다. 이 기술은 최소한의 조작으로 발달 생물학에서 중요한 역할을 하는 노른자 세포의 메커노바이올로지 연구에 필수적인 정보를 제공합니다.

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우리가 이러한 프로토콜에 대 한 기준 설정에 대 한 Amayra 에르난데스-베가 필립 알렉산더 Pouille 감사 합니다. 우리는 또한 IBMB-PCB, 자비에 르 스 및 지속적인 지원에 대 한 실험실의 구성원에서 분자 이미징 플랫폼을 감사합니다. 통합 그룹 프로그램 Generalitat 드 Catalunya와 DGI EMB 및 DN에 경제와 스페인의 Competitivity Consolider 보조금의 지원이 작품.

아래 설명 하는 모든 프로토콜 단계 우리 기관의 동물 관리 지침을 따르십시오.
1. 제 브라 문화
<ol><li>번 식 하 고 성인 zebrafish 표준 조건 하에서 유지 합니다. 참고: AB와 TL 야생 타입 배아가이 연구를 위해 사용 되었다.</li>
	<li>배아를 수집 하 고 E3 배아 중간2428.5 ° C에서 그들을 성장. 앞에서 설명한19로 형태에 따라 그들을 무대.</li>
</ol>2. 원자 힘 현미경 검사 법
<ol><li>수동으로 dechorionate zebrafish 태아 (개별 관심에 따라 다른 연령대)의 무대. ( 재료의 표참조) 두 개의 얇고 날카로운 집게와 chorions를 제거 합니다.<ol>
<li>Chorion 한 집게를 사용 하 여 그립 고 눈물에 다른 집게와. 그런 다음, 눈물의 반대 지역에는 chorion를 들고, 개방을 통해 부드럽게 배아 밀어.</li>
		<li>8 X 50 X 사이 확대의 조정 가능한 범위 해 stereomicroscope에서 dechorionation를 수행 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>AFM에 대 한 배아를 탑재
	<ol>
<li>배아 중간에 2 %agarose 솔루션을 준비 하 고이 35 mm 페 트리 접시를 채우십시오. 공고히 하자. Agarose 침대에서 얇은 집게와 1.5 m m 직경 (태아 크기의 두 배)의 고 약 350 µ m 깊이 (반 태아 크기)의 작은 구멍을 확인 합니다.</li>
		<li>Agarose 계층에서 만든 넘나들며에 배아를 놓고 그들은 0.5% 낮은 솔루션 주위 확산에 의해 장소에서 녹는 agarose 배아 매체에 보장 합니다. 그냥 구멍에 그들을 확보 하 여 배아를 중심으로이 솔루션을 붓는 다.</li>
		<li>전에 낮은 융 점 agarose는 실 온에서 고형화, AFM에 의해 찾는 것에 관심 영역 것입니다 얼굴을 위쪽으로 (그림 1A) 그런 방법으로 배아를 회전 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>AFM에 의해 태아 검사
	<ol>
<li>거꾸로 원자 힘 현미경 20 X 목표를 채용 하는 페 트리 접시에 배아 이미지를 찾아서 ( 재료의 표25참조) 상 온 (23-24 ° C). 참고: 배아는 유지 배아 중간에 몰입 하 고 agarose 침대에 부착 된.</li>
		<li>0.01 N/m. 5 µ m 및 1 Hz의 주파수에 외팔보 진동의 피크-피크 진폭을 설정의 공칭 스프링 상수와 캔틸레버에 연결 된 지름에서 4.5 µ m의 구형 폴리스 티 렌 구슬 채용 casted 배아의 노 른 자 세포 표면 프로브.</li>
		<li>데이터 평균에 대 한 루틴으로 다른 위치에 및 여러 배아에서 테스트할 각 지역에 대 한 데이터를 수집 합니다. 참고: 좋은 시작 포인트는 5 위치에에서 위치한 중간 10 µ m x 10 µ m 사각형의 모서리에 AFM 현미경의 캔틸레버 위치 XY 압 전 액추에이터를 제어 하 여 이다. 영상 및 데이터 수집 태아 당 약 20 분 했다. 배아 노른자위 세포 표면의 다른 지역에 데이터를 기록, 예를 들어, 식물성 극 또는 EVL 셀 여백 (그림 1B 및 1 C), 거의 다른 지구만 수행할 수 있습니다 고유한 표본 다르게 지향을 채용 하 여.</li>
	</ol></li>
	<li>힘을 계산
	<ol>
<li>압 전 액츄에이터 및 사분면 포토 다이오드를 사용 하 여 그것의 편향 (d)에 광학 레버 메서드에서 현미경 제어 소프트웨어와 결합 하는 스트레인 게이지 센서와 AFM 캔틸레버 (z)의 수직 변위를 측정 ( 재료의 표 참조 25)입니다.</li>
		<li>유리 coverslip 맨 영역에서 수집 된 데이터 로부터 얻은 d-z 곡선의 기울기를 사용 하 여 포토 다이오드 신호와 외팔보 편향 (d) 사이의 상관 관계를 보정 하. 참고: 측정 된 수직 변위 외팔보 편향 이며 경사는 광학 레버26의 편향 감도 나타냅니다입니다.</li>
		<li>외팔보 스프링 상수 (k) 열 요동에서 앞에서 설명한27추론.</li>
		<li>샘플 (h)의 들여쓰기로 계산: h = (z-zc) -(d 조-d에서)          (1) 참고: 여기 zc 접점의 위치 이며 d에서 광다이오드의 오프셋입니다.</li>
		<li>로 캔틸레버에 힘 (F)을 계산: F = k · d (2)</li>
	</ol></li>
	<li>점성 액체를 포함 하는 대뇌 피 질의 긴장 Tc 의 탄성 층의 구성 된 액체 풍선 모델 피 긴장을 계산 합니다. 이 모델에서 (태아의 크기에)에 비해 작은 들여쓰기에 힘 증가 비례로4,28 : F = 4π Tc[(Rb / Re) + 1)] h (3) 참고: 여기는 구슬의 반지름 Rb Re 이며 태아의 반지름. Zebrafish 태아, 태아 (400 µ m)의 반지름은 두 배나 구슬 (2.25 µ m)의 그것 보다 더 큰으로이 방정식을 접근 수 있습니다. F = 4π Tc h (4)<ol>
<li>계산 하는 긴장 힘-들여쓰기 (F-h) 다섯 가지에 대 한 각 배아 노른자위 셀 영역에 곡선 측정 지점.</li>
		<li>각 F-h 커브 피팅 비 선형 최소 제곱법에 의해 Tc 를 계산 합니다. 위한 통계 분석, 대뇌 피 질의 긴장 Tc 계산 다른 F-h 곡선에서에서 평균 한다.</li>
	</ol></li>
	<li>낮은 진폭을 적용 하 여 피 질의 점 탄성 특성 (유동성)을 측정 (100 nm) AFM 동안 여 진동25다른 주파수 정현파 파도의 구성.
	<ol>
<li>로 강제 들여쓰기 곡선에서 주파수 영역에서 효과적인 복잡 한 계수 g*(ƒ) 계산: g * (f) = [F(f) / h(f)]- ifb (5) 여기 내가 허수 단위 이며 F(f)와 h(f)는 힘과 들여쓰기의 주파수 (f) 스펙트럼. b 는 표면에 적용 하는 진동에서 추출 하는 캔틸레버에 점성 드래그에 대 한 보정 이다.</li>
		<li>별도 g*(ƒ) 으로 실수와 허수 부분으로: g * (Ƒ) = g' (f) + ig' (f)          (6) 전각 > g'(f)는 탄성 계수와 탄성 에너지의 측정값 저장 및 진동의 주기 당 복구. g' (f) 방탕된 에너지 차지 점성 계수 이다.</li>
		<li>솔리드 형의 인덱스를 제공 하는 손실 탄젠트를 계산 (< 1) 또는 액체 같은 (> 1), 물자의 행동으로: g' (f) / g' (f)          (7) 참고:이 유형의 측정 수는 매개 변수를 추출 얼마나 점성을 나타내는 이며 어떻게 탄성 시험된 자료. B 는 약간 표면에 캔틸레버의 끝의 거리에 따라, 비록 주어진 g의 매우 낮은 값 ´´는 노 른 자에 의해 전시 ( 2D 그림 아래 참조) 셀, b 에서 작은 변화 영향을 무시할 수 있다 측정29</li>
	</ol></li>
</ol>3. 입자 추적 Microrheology
<ol><li>
노 른 자 셀에 입자 microinjection 수행
	<ol>
<li>맞춤형된 백신 수평 micropipette 끌어당기는 사람 및 모 세관 글라스 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 조작.<ol>
<li>1.00 m m, 0.58 m m 내경 및 끌어당기는 설정을 사용 하 여 10 cm의 길이의 외부 직경 바늘 준비: 압력: 500; 열: 510; 풀: 65; 속도: 25; 시간: 50.</li>
		</ol>
</li>
		<li>사용자 정의 만든된 금형 ( 재료의 표참조)를 사용 하는 배아 중간 침대에 똑바로 들여쓰기 레인 1 %agarose 만들어서 주입 페 트리 접시 접시를 준비 합니다.<ol>
<li>금형의 밑면이 고 그들 액체 agarose 젤 위에 놓고 젤 경화는 일단 금형을 제거 합니다. 1.2 X 확대 해 stereomicroscope 아래 agarose에서 금형에 의해 홈에 배아를 플라스틱. 참고: 너비와 금형의 디자인 자체 정렬 배아를 사용 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>주입 하기 전에 거의 완전히 주입 (주입 후 그것을 제거할 때 바늘에 집착 표면 장력 방지 태아/chorion)를 촉진 하기 위하여 매체를 제거 합니다.</li>
		<li>Microinject 형광 나노 입자 (radius는 = 100 nm, 재료의 표참조) 배아 노른자위 셀 (그림 3A)의 식물에 물 (1:1, 000)에 희석.</li>
		<li>정밀 micromanipulators와 micropipette 조정 하 고 시간과 압력 컨트롤 ( 재료의 표참조)는 자동 microinjector 구슬 주입. 10과 20 psi 사이 압력을 설정 합니다.</li>
		<li>비드 솔루션을 주입 하기 전에 주사를 볼륨 보정 (0.5 nL) 작은 물방울 크기를 측정 하 여 함께 제공 되는 microinjector에 의해 1 x 0.01 m m 단계 마이크로미터 ( 재료의 표참조).</li>
		<li>주사, 상 온에서 수행 되는 동안 배아를 시각화 해 stereomicroscope에 1.6 X 확대를 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
노른자위의 점 탄성 행동 열 요동을 기록 하 여 평가
	<ol>
<li>Dechorionate에서 microinjected 배아 2.1 단계 및 0.5% 낮은 포인트 agarose 배아 중간 솔루션 30 ° c.에 녹는에 그들을 포함 이후에, 유리 하단 번호판 ( 재료의 표참조) 그들을 전송 하 고 오리엔트는 agarose는 여전히 액체 때는 coverslip 쪽으로 그들을 밀어. 참고:는 agarose는 실 온에서 고형화 한다 때 배아 준비가 될 몇 군데입니다.</li>
		<li>Microinjection 후 거꾸로 confocal 현미경 2 h의 무대에 유리 하단 플레이트에 마운트 하는 배아를 놓습니다. 26 나노 입자의 이미지를 캡처 실내 온도 표준 상업 현미경 소프트웨어를 채용 하는 거꾸로 confocal 현미경에 63 X 목표 25 Hz의 샘플링 레이트에서 s (픽셀 크기 = 166 nm, 이미지 캡처 모든 40 ms).</li>
		<li>입자의 중심의 위치를 계산 하 고 오픈 소스 ImageJ 소프트웨어 (그림 3B)의 TrackMate 플러그인과 함께 시간이 지남에 그들의 궤도 정의 합니다.</li>
		<li>맞춤 소프트웨어6,30 로 각 입자의 2 차원 제곱 변위 (MSD) 계산. < Δr2 (τ) > = < [x(t + τ)- x(t)]2 + [y(t + τ)- y(t)]2>           (8) 참고: 여기 t 는 경과 시간 및 지연 시간입니다. 순수 점성 액체에는 MSD 스톡-아인슈타인 관계에 따라 점도 (ν)와 반대로 증가: < Δr2 (τ) > = 4kB Tτ/ 6πνa,          (9) 여기서 T 는 절대 온도입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Johansen, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+micromanipulation+of+nanoparticles+and+cells+inside+living+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish.</a> Nat Commun. 7, 10974(2016).</li>
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저자 아무 경쟁 금융 관심사 또는 다른 충돌을 선언합니다.

여기 우리가 소재 속성 및 epiboly 동안 zebrafish 노른자위 셀의 일부 biomechanical 매개 변수 수 AFM 및 나노 입자 microrheology에 의해 쉽게 예상할 수 보여줍니다.
AFM 세포와 조직 생리 조건4,5,,2528의 유 변 학적 기능 검색 고용 되었다, 그러나 여기 우리는 AFM 그대로 개발에 적용 하기 위한 프로토콜 개발 우리 epiboly 동안 zebrafish 태아의 노 른 자 세포 표면을 테스트 하려면 고용 배아
우리의 AFM 측정에 대 한 배아의 방향은 낮은 녹는 agarose에서 그들을 포함 하는 절반에 의해 확보 되었다. 그러나, agarose 포함 미치...

전체적 프로세스의 biomechanical 제어 기본 원리는 크게 정의 되지 않습니다. Biomechanical 연구 분자 및 세포 수준에서 상당한 기세, 수집 하는 동안 biomechanical 매개 변수는 조직/유기 체 수준에서의 탐사 초기 단계에 있다. 유체역학 회귀1 또는 비디오 강제로 현미경2 레이저 미세3, 또는 덜 침입적 인 원자 힘 현미경 (AFM) 천연된 셀4 의 능동 및 수동 세력을 구별 하는 연구를 허용 또는 vivo에서 5 또는 나노 microrheology6 조직의 기계적 특성 및 응답의 기대를 수 있습니다.
AFM는 표면 거칠기 및 시험된 표면7접촉 시 캔틸레버 팁의 편향에서 준수 해결 원자 고해상도 3 차원 지형 기술입니다. AFM을 사용 하는 다른 방법론 마찰, 접착 힘, 및 다양 한 재료의 점 탄성 특성 측정을 포함 하 여 표면 특성을 조사 하기 위해 개발 되었습니다. 최근, AFM은 생물 학적 샘플의 기계적 특성에 대 한 정보를 검색 하는 강력한 도구로 떠오르고 있다. 특히, AFM 비 접촉 추출할 수 복잡 한 전단 계수 단일 셀에서 알려진된 벤딩 일정8의 캔틸레버에 연결 된 마이크로 팁과 진동 들여쓰기를 적용 하 여. 우리 결과 세력을 유추할 수 있습니다. 그러나, AFM은 고유 하 고 다른 방법론 개별 셀에서 데이터를 유 변 학적 및 기계적 특성을 추출 허용 (예: Micropipette 포부9, 자석 cytometry (MTC)10, 왜곡 또는 단축 인장 테스트11).
그러나, 복잡 한 전체적 프로세스에 이러한 새로운 방법론의 응용 프로그램은 간단 합니다. 미 발달 직물의 기계적 특성을 결정할 때 직면 하는 주요 과제는 작은 m m (µ m), 소프트 (10에2 -104 Pa 범위) 및 소재12의 탄성 (시간에 따른 현상 주는 상승) 자연. 그것은 따라서 배아와 개발 생물의 특정 경우에 기계적 성질 (강성, 점도, 접착)의 결정에 대 한 고용 하는 방법에 적응 하는 것이 중요. 두 가지 중요 한 문제는 고려해 분석 유 변 학적 접근 연구 개발 필요가: 간섭 방해를 방지 하 고 쉽게 액세스를 제공. 이 시나리오에서는 micropipette 포부, MTC와 인장 테스트 한계 전시. 첫 번째 경우, 셀 앓고 높은 변형의 생리 적 및 기계적 특성9변경할 수 있습니다. 두 번째의 경우, 단단히 준수 적용 스트레스 로컬로 골격 변형 되도록 기판에 실험 조직 필요 수 또한 효과 세포의 활성화 상태에서 그리고, 따라서, 그들의 기계적 기능10 소개 . 마지막으로, 단축 인장 접근 유기 체 및 접근성11개발의 형상에 의해 제한 됩니다.
AFM는 어떤 성가신 샘플 준비 없이 그들의 자연 환경에서 직접 수 생물 샘플의 연구 개발 프로세스의 연구에 대 한 더 나은 적합 것으로 보인다. 또한, 미 발달 직물의 분리는 일반적으로 어려운, AFM 프로브의 감소 된 크기 중간 (수성 또는 비 수성), 샘플 온도, 또는 화학 제품의 종류의 선택에서 제한 된 다양성의 높은 학위를 제공 샘플의 구성입니다. AFM는 큰 도메인에 적용 하 여 비늘 시간 충분히 다양 하 고 발달 단계로 또는 생리 적 조건에 조직의 소재 속성을 검색 하 고용 되었습니다. 전체 기본 조직 지형 관점에서 그리고 sclera, 같은 일부 경우에 동맥13 또는 뼈14 연구와 같은 기계적 성질도 검색된15있다. 지 세는 Xenopus16morphogenesis 동안 예를 들어, 셀 재배치의 시각화를 허용 하는 라이브 배아에서 탐구 했다. 마지막으로, 포괄적인 샘플 준비 프로토콜 다른 발달 과정 동안 기계 매개 변수를 확인 하기 위해 개발 되었습니다. 나노 지도 병아리 배아 소화 관11;에 대 한 네이티브 떼어낸된 조직 섹션에 생성 된 접착성 및 기계적 속성 개별 ectoderm, mesoderm, 및 endoderm 조상 셀 gastrulating zebrafish 태아4;에서 격리에 대 한 검색 강성 측정 epiblast 및 조류 배아17; explants에 원시 조 흔에 대 한 수행 그리고 강성 그라디언트 Xenopus5의 배아 뇌에 직접 정의 된의 뚜렷한 패턴.
배아 발달을 탐험에 대 한 AFM을 적용 하기 위한 상당한 질적 도약 접근 하는 간단한 접근 전체적 프로세스에서 올 수 있습니다. 제 브라 epiboly는 다른 조직을 직접 몇 시간에는 blastoderm의 확장을 제한 된 구체의 공간에 조정 하는 필수 및 보존 이벤트입니다. 제 브라 epiboly (구형 단계)의 발병에 표면 층의 세포, 무기력 레이어 (EVL), blastomeres 대규모 노른자위 syncytial 셀에 배아의 동물 극에 중심의 반 둥근 모자를 다루고 있습니다. Epiboly는 EVL의 외피 식물 구 확장 blastoderm, 및 노른자위의 주위 syncytial 노른자위 셀 (E-YSL)의 외부 층의 깊은 세포 (DCs)으로 구성 됩니다. Epiboly는 EVL 및 식물성 극18,,1920에 Dc의 폐쇄와 함께 끝납니다. 어떻게 그리고 어디 힘 epiboly 동안 생성 되 고 아직1,21을 명확 되지 않습니다 어떻게 그들은 세계적으로 결합 하는.
여기 우리가 자세히 AFM zebrafish 노른자위에서 epiboly 진행 하는 동안 수동 기계 조직 속성 vivo에서세포 유추 적용 하는 방법을 설명 합니다. 이렇게 하려면, 우리는 AFM 캔틸레버로 프로브에 연결 하는 작은 스피어 고용. 균일 하지 않은 노 른 자 세포 표면 및 시간이 지남에 정지와 그라디언트 및 그들의 역학을 공부 정확한 지역 정보를 검색할 수 있습니다. 대체 AFM 등 쐐기 캔틸레버22를 사용 하 여 접근, 하지 렌더링 로컬 데이터를 충분히 정확한 것입니다. 캔틸레버 끝에 샘플 크기 보다 큰 쐐기 하기 매우 조심 조작 기술이 필요 합니다, 쐐기 기법은 배아를 검색 하는 데 적합 (~ 2-fold 캔틸레버의 길이 보다 큰) 역학.
모델링 및 질적, 양적 방법으로 셀의 점 탄성 특성 그들의 역학에 대 한 향상 된 이해에 대 한 수 있습니다. Biomechanical 관점에서 epiboly, 그리고 대뇌 피 질의 긴장 측정 및 역학, AFM;에 의해 추출 될 수 있다 수요 지식 뿐 아니라 이해 하는 것이 필수적입니다. 따라서 조직의 생물 속성에 대 한 내용은 필요가 있다. 이 정보를 추출 하 셀 유동성 기법의 다양 한 다른 생리 적인 조건23에서 다른 세포 유형 성격을 나타내기 위하여 수 년에 걸쳐 개발 되었다. 그들은 AFM, MTC, 및 광학 핀셋 (OT)이 포함 됩니다. 그러나 이러한 방법에는,, 입증 되었습니다 배아 또는 장기의 규모에서 생체 분석에 대 한 부적 절 한. 대신, 우리가 성공적으로 나노 추적 microrheology6 유 변 학적 측정 비보에 적응 했습니다. 이 기술은 개별 입자의 브라운 변위를 분석 하 고 로컬 micromechanical 속성을 유추.
함께 AFM와 나노 microrheology epiboly 동안 대뇌 피 질의 정지와 역학의 정 및 노른자위의 내부 기계적 특성을 수 있습니다. 이 정보는 완전히 있는 이방성 스트레스는 EVL의 변형 응답에 있는 다름 결과로 개발 하 고 전자-YSL 피 등방성 actomyosin 수축 노른자위 세포질 레이어 (YCL)은 필수적인 모델 지지 EVL와 epiboly 진행1의 방향 순 이동.

<table><tbody><tr><td>도립 광학 현미경</td><td>Nikon</td><td>TE2000</td><td>샘플 및 AFM 캔틸레버</td></tr><tr><td>시각화 원자력 현미경(AFM)</td><td>맞춤형</td> <td>-</td> <td>모든 상용화된 AFM을 사용할 수 있음</td></tr><tr><td>도립 컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td>LSM780</td><td>나노 유변학 데이터 수집</td></tr><tr><td>Agarose D1 Low EEO</td><td>Conda</td><td>8016.00</td><td>주조 배아</td></tr><tr><td>초순수 LMP 아가로스(저융)</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td>배아 확보</td></tr><tr><td>, 제브라피시 미세 사출 및 이식 금형,</td><td>세계 정밀 기기</td>, <td>Z-MOLDS</td><td>, 주조 배아. 원래 치수로 맞춤 제작한</td></tr><tr><td>Dumont 5 Forceps</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td>1.5mm 직경</td></tr><tr><td>Si3N4 캔틸레버</td><td>Novascan</td> PT도 사용할 수 있습니다<td>. GS</td>: <td>AFM에 의한 배아 측정. 구형 팁: 4.5 &마이크로; m 직경 및 k = 0.01 N / m</td></tr><tr><td>형광 나노 입자</td><td>Life</td><td>Technologies FluoSpheres F8811,</td> <td>나노 유변학</td></tr><tr><td>추적 용 마이크로 피펫 풀러</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-2000</td><td>맞춤형 마이크로 니들</td></tr><tr><td>붕규산 모세관 유리</td><td>제작 Warner Instruments</td><td>G100TF-4</td><td>맞춤형 마이크로 니</td></tr><tr><td>들 미세 조작기</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td>마이크로피펫 조작</td></tr><tr><td>마이크로인젝터</td><td>Eppendorf</td><td>FemtoJet Express</td><td>주입 시간 및 압력 제어</td></tr><tr><td>실체현미경</td><td>Leica</td><td>DFC365FX</td><td>주입 중 배아 시각화</td></tr><tr><td>분석 소프트웨어</td><td>MathWorks</td><td>Matlab</td><td>AFM 및 입자 추적 데이터 분석</td></tr><tr><td>Zebrafish</td><td>AB 및 TL 와일드 타입</td><td>- </td><td>배아 채취에 사용되는 균주</td></tr><tr><td>유리 바닥 플레이트</td><td>Mat Tek</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td>나노 유변학 데이터 수집을 위한 배아 장착</td></tr><tr><td>스테이지 마이크로미터</td><td>FST</td><td>29025-02</td><td>주입량 측정</td></tr></tbody></table>

afm와 microrheology zebrafish 태아 노른자위 셀에

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Spatio 시간적 조직 조직 진화의 직접적인 요인 elucidating 연구 개발의 주요 목적 중 하나입니다. 다양 한 제안 다른 발달 및 전체적 프로세스에서 spatiotemporal 조직의 조직과 세포의 기계적 특성의 이해에 중요 한 기여 되었다고 주장 한다. 그러나, 소재 속성 및 비보에긴장 매개 변수 측정을 안정적이 고 접근 가능한 도구의 부족으로이 가설을 검증 어려운 되었습니다. 여기 우리는 원자 힘 현미경 (AFM) 및 입자 epiboly 동안 그대로 zebrafish 태아 노른자위 셀의 기계적 특성을 측정 하는 것을 목적으로 추적 하는 방법 제시. Epiboly는 그의 연구는 태아의 투명도 의해 촉진 된 초기 보존된 개발 프로세스입니다. 이 메서드는 구현 하기 간단 하 고 신뢰할 수 있는, 널리 적용 이후 그들은 조직 역학에 영향을 미칠 수 있는 방해 개입을 극복. 간단한 전략 표본, AFM, 기록과 나노 주사의 장착 및 추적에 대 한 적용 했다. 이 접근에 게 이러한 방법을 쉽게 적응할 수 있는 다른 발달 시간 또는 유기 체.

대뇌 피 질의 긴장 측정 각 측정 지점에 대 한 5 (F-z) 힘-변위 곡선 5 µ m의 피크-피크 진폭 1 Hz에서 캔틸레버 램프에 의해 AFM에 의해 취득 되었다 (속도 = 10 µ m/s)까지 ~ 2 µ m의 최대 들여쓰기. 이 이렇게 20 분 미만 복용 했다 고 했다 epiboly 진행에 의해 영향을 받지 않습니다. 각 실험 조건 적어도 5 배아에서 시험 되었다.
배아 노른자위 셀에 기록 하는 힘-변위 곡선 반대로 그에 해당 하는 소프트 주변 agarose, 전시 비례 선형 관계 (R2 > 0.999) (그림 2A). 우리는 F z 3 µ m/s와 30 µ m/s 커브와 캔틸레버의 속도에 대뇌 피 질의 긴장 Tc 의 잠재적인 의존...

물성 및 비보에 긴장 매개 변수 측정 도구의 부족 방지 개발 하는 동안 그들의 역할을 확인 합니다. 우리는 원자 힘 현미경 (AFM) 및 나노-추적 epiboly 동안 그대로 zebrafish 태아 노른자위 셀에 기계적 기능 척도를 고용. 이 메서드는 안정적이 고 광범위 하 게 적용 관입 개입을 피하.

AFM와 Microrheology Zebrafish 태아 노른자위 셀에

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

이 절차들의 전반적인 목표는 강성, 점성 및 접착력과 같은 기계적 특성을 결정하기 위한 특정 방법론을 배아 및 발달 중인 생물체라는 특수한 사례에 맞게 조정하는 것입니다. 본 논문에서 소개하는 방법들은 발달 과정 중 기계적 특성이 유전적 또는 물리적 입력에 어떻게 반응하는지, 혹은 세포 활동 조절의 변화에 어떻게 반응하는지와 같은 기계생물학 분야의 질문들에 답할 수 있습니다. 이 기술의 많은 장점은 최소한의 조작으로 결정적인 정보를 얻을 수 있게 하여, 다른 절차로는 수행 불가능한 질문들을 해결할 수 있다는 점입니다.이 방법들은 난황 세포의 역할을 이해하는 데 통찰력을 제공하며, 이후 배아의 서로 다른 영역, 다양한 발달 단계, 그리고 심지어 다른 모델 생물에도 적용할 수 있습니다. 배아의 마운팅과 핸들링은 습득하기 어렵기 때문에 이 방법들에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 우선, 제브라피시 배아를 수집하여 E3 배아 배지에서 28 °C로 배양하십시오.형태학적 특성에 따라 배아의 단계를 구분합니다. 8배에서 50배까지 배율 조절이 가능한 실체 현미경 하에서, 개별 연구 목적에 맞는 다양한 연령대의 제브라피쉬 배아의 난막을 수동으로 제거합니다. 두 개의 가늘고 날카로운 핀셋을 사용하여 난막을 제거합니다.한 쌍의 핀셋으로 막(chorion)을 잡고 다른 핀셋으로 막에 찢어낸 후, 찢어진 부위의 반대편 막을 잡은 상태에서 배아를 구멍을 통해 조심스럽게 밀어냅니다. AFM 분석을 위해 배아를 고정하려면, 먼저 35 mm 페트리 접시에 2% agarose와 배아 배지를 채우고 응고시킵니다. 그런 다음, 얇은 핀셋을 사용하여 agarose 층에 직경 약 1.5 mm, 깊이 약 350 µm의 작은 구멍들을 만듭니다.배아를 아가로스 층에 만든 구멍에 배치합니다. 그다음, 배아를 구멍 속에 고정시키기 위해 배아 주변에 0.5% 저융점 아가로스와 배아 배양액 혼합액을 붓습니다. 저융점 아가로스가 실온에서 응고되기 전에, AFM으로 탐색할 관심 영역이 위를 향하도록 배아를 회전시킵니다.배아를 관찰합니다. 실온에서 원자 힘 현미경과 결합된 도립 광학 현미경의 20배 대물렌즈를 사용하여 페트리 접시 내의 배아 위치를 찾고 이미지를 획득합니다. 해당 데이터를 수집하기 위해서는 적절한 각도와 진폭 및 주파수로 난황 세포 표면을 프로빙하는 것이 필수적입니다.이러한 파라미터들을 최적화하기 위해 다양한 테스트를 수행해야 합니다. 직경이

afm-and-microrheology-in-the-zebrafish-embryo-yolk-cell

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

Microinjection은 수정된 zebrafish의 배아에 이물질을 소개하는 잘 설립하고 효과적인 방법입니다. 여기, 우리는 강력한 mRNA의 overexpression을 수행하기위한 microinjection 기술 및 zebrafish에서 morpholino의 oligonucleotide 유전자 최저 연구를 보여줍니다.

Zebrafish 태아의 mRNA와 Morpholino의 안티 센스 Oligonucleotides의 Microinjection.

이 비디오에서는, 우리는 공촛점 현미경으로 단세포 해상도 라이브 zebrafish의 배아에서 개발 척추 두뇌를 분석하는 방법을 보여줍니다. 이것은 우리가 단일 셀 zebrafish 배아를 주입하고 이후 개발 두뇌를 마운트와 이미지하는 방법을 포함합니다.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

이 비디오는 제브라피시 난황낭에 화합물을 전달하는 배아 미세주입 기술에 대해 설명합니다.

배아 미세주입: 제브라피시 노른자에 화합물을 전달하는 기술

이러한 확산, 패턴, 차별화, 그리고 축삭지도 등의 발달 과정은 쉽게 제브라 피쉬의 척수에서 모델링 할 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 이러한 이벤트의 시각화를 최적화하는 제브라 피쉬 배아에 대한 설치 절차를 설명합니다.

해부 및 제브라 피쉬 배아의 측면 장착 : 척수 개발의 분석

생체 내에서 세포 기관 및 기타 세포 내 구조의 동적 거동을 이미징하면 생리학적 및 질병 조건에서 그 기능을 밝힐 수 있습니다. 여기에서는 중심체와 미토콘드리아의 두 소기관을 유전적으로 태그하고 광시야 및 컨포칼 현미경을 사용하여 살아있는 제브라피시 배아에서 이들의 역학을 이미징하는 방법을 제시합니다.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

유사분열은 모든 살아있는 유기체에 매우 중요하며 결함은 종종 암과 발달 장애로 이어집니다. 이 이미징 프로토콜과 제브라피시를 모델 시스템으로 사용하여 연구원들은 살아있는 척추 동물 유기체의 유사 분열과 유사 분열 과정에 결함이 있을 때 발생하는 수많은 결함을 시각화할 수 있습니다.

라이브 Zebrafish의 배아에서 유사 분열 부문 및 역학을 관찰

속눈썹 개발 적절 한 organogenesis에 생명 이다입니다. 이 프로토콜 레이블을 하 고는 제 브라의 ciliated 셀을 시각화 하는 최적화 된 방법을 설명 합니다.

Multiciliated 셀 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 및 면역 형광의 결합 된 프로토콜을 통해 Zebrafish에 시각화

여기서, 우리는 광학 트랩에 의한 직접 힘 측정을 통해 3차원 감금에서 격리된 배아 제브라피쉬 세포의 세포내 기계적 특성을 조사하는 프로토콜을 제시한다.

광학 핀셋을 사용하여 감금된 세포 전 역학의 직접 힘 측정

우리는 빠른 스캐닝 컨포칼 현미경을 활용하여 개발 중인 제브라피시 시신경 구조에서 미세아교세포의 실시간 이미징을 수행하는 방법을 시연하여 생체 내에서 이러한 세포의 역학을 분석할 수 있습니다.

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Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

배우세요 제브라피시 태아의 기계적 특성을 측정하는 AFM 및 미세점성측정 기법을 활용한 방법론입니다. 이 기술은 최소한의 조작으로 발달 생물학에서 중요한 역할을 하는 노른자 세포의 메커노바이올로지 연구에 필수적인 정보를 제공합니다.

AFM와 Microrheology Zebrafish 태아 노른자위 셀에

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