전송 전자 현미경 검사 법에서 미생물의 직렬 Ultrathin 섹션을 얻기위한 방법

이 절차의 전반적인 목표는 연속 초박절편을 안전하고 쉽게 제작하는 것입니다. 이 방법은 세포 생물학 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있으며, 전자 현미경 수준에서 전체 세포의 정량적 및 3차원 구조 정보를 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 고가의 장비 없이도 연속 초박절편 제작이 가능하다는 것이며, 이 방법을 통해 고해상도 이미지를 얻을 수 있다는 점입니다.

이 절차를 시작하려면 유리 슬라이드의 표면을 세척하십시오. 그런 다음 고무 공을 사용하여 3방향 스톱콕을 통해 공기로 용액을 가압하여, Formvar 지지 필름 제작 장치의 상단 컬럼에 있는 1.5% Formvar 용액에 유리 슬라이드의 절반을 담그십시오. 3방향 스톱콕을 열고 공기를 배출하여 압력을 낮춤으로써 컬럼에서 용액을 배출하십시오.

그 다음 장치에서 유리 슬라이드를 꺼내어 공기 중에서 건조시켜 유리 슬라이드 표면에 필름을 형성합니다. 면도날을 사용하여 유리 슬라이드 위 필름의 네 가장자리를 긁어냅니다. 슬라이드에 입김을 불어 필름이 슬라이드에서 잘 분리되도록 한 후, 유리 슬라이드를 낮은 수평 각도로 천천히 물속에 담가 필름을 띄워 분리합니다.

그 다음 구멍이 뚫린 알루미늄 랙을 사용하여 물에서 Formvar 필름을 건져냅니다. 실체 현미경 하에서 초음파 트리밍 블레이드와 면도날로 시편 블록을 트리밍하기 전, 먼저 광학 현미경으로 블록의 끝부분을 관찰하여 블록 표면에 세포가 있는지 확인하십시오. 그런 다음 시편 블록을 척에 장착하고, 척을 트리밍 스테이지에 장착합니다.

블록을 0.7 by 1.0 mm 크기로 트리밍합니다. 에폭시 수지가 매우 단단한 경우, 먼저 초음파 트리밍 블레이드를 사용하여 블록을 트리밍한 다음, 면도날로 블록을 더 세밀하게 트리밍하십시오. 절단 방향을 표시하기 위해 한쪽 어깨 부분을 절단합니다.

마이크로톰의 다이아몬드 나이프를 사용하여 시편 블록을 트리밍하려면, 울트라 마이크로톰의 시편 홀더에 시편 블록 척을 고정하십시오. 다이아몬드 트리밍 나이프로 블록의 표면을 절단합니다. 다이아몬드 나이프의 날을 시편 블록 면과 평행하게 설정하고, 시편의 손실이 없도록 표면을 최소량만 절단하십시오.

나이프 스테이지를 왼쪽으로 30도 회전시켜 트리밍 나이프로 블록의 왼쪽 가장자리를 절단합니다. 이 가장자리는 연속 절편 제작 시 시료의 상단면이 됩니다. 그런 다음, 나이프 스테이지를 오른쪽으로 30도 회전시켜 시료의 왼쪽 가장자리로부터 약 100 microns 떨어진 지점에서 블록 표면을 절단합니다.

이 가장자리는 연속 절편 제작 시 시료의 하단면이 됩니다. 트리밍 나이프를 제거하고, 시료 블록을 시계 방향으로 90도 회전시키십시오. 초박절편용 나이프를 나이프 스테이지에 설치하십시오.

시편 표면의 넓은 부분을 이용하여 시편 표면과 칼날의 모서리가 서로 평행하게 마주 보도록 조정합니다. 다음으로, 마이크로톰의 척과 척 홀더에 테이프를 부착하고 경계 부분에서 테이프를 자릅니다. 시편 척을 마이크로톰에서 꺼내어 실체 현미경 아래에 놓습니다.

면도날을 사용하여 표본의 큰 부분을 잘라내고, 연속 절편을 얻을 얇은 부분만 남깁니다. 연속 절편 제작에 사용할 표본 위에 파스퇴르 피펫으로 0.5% Neoprene 용액 약 1µL를 떨어뜨려 절편 측면을 접착성 있게 만듭니다. 그다음 표본 전체를 Neoprene 용액으로 덮습니다. 표본 근처에 거름종이를 배치하여 과량의 Neoprene 용액을 즉시 흡수시킵니다.

다음으로, 연속 절편을 수집하기 위해 3개의 슬릿 그리드를 준비합니다. 이를 위해 그리드의 핸들을 60도로 구부리고, 0.5% Neoprene 용액으로 그리드를 처리합니다. 그런 다음 글로우 방전을 통해 그리드를 친수성으로 만듭니다.

테이프로 표시된 부분을 맞추어 시료 블록 척을 마이크로톰의 원래 위치에 다시 배치합니다. 이렇게 하면 블록 면과 칼날 끝이 서로 완벽하게 평행을 유지하게 됩니다. 그런 다음 칼날을 시료 가까이 이동시킵니다.

나이프 보트에 물을 채운 후, 공기 흐름을 방지하기 위해 마이크로톰을 플라스틱 커버로 덮습니다. 200 nanometers의 절편 두께로 시편 절단을 시작하십시오. 첫 번째 절편이 절단되면, 절편 두께를 70 nanometers로 설정하십시오.

연속 절편의 수가 20개에 도달하면, 절편 두께를 10 nanometers로 설정하십시오. 마이크로톰은 10 nanometer 두께의 절편을 절단할 수 없으므로 새로운 절편이 생성되지 않으며, 이전에 절단된 절편들이 나이프 엣지로부터 분리됩니다. 그다음, 절편 두께를 60 nanometers로 설정하십시오.

기기가 이전의 10 nanometer 두께를 추가하기 때문에, 이를 통해 70 nanometer 두께의 절편이 생성됩니다. 마지막으로, 절편 두께를 다시 70 nanometers로 설정하고 1.8 millimeter 길이의 절편을 얻을 때까지 계속해서 절단합니다. 연속 절편을 수집하려면 먼저 절편 유지 루프를 세 번째 절편 그룹에 놓으십시오.

그런 다음 수면 상승 루프를 나이프 스테이지 위에 놓습니다. 샤프트와 핸들을 움직여 WSRL의 루프를 연속 절편 바로 위에 위치시킵니다. WSRL의 루프가 절편들을 에워쌀 수 있도록 루프를 수면 위로 내립니다.

나사를 아래로 돌려 루프를 밀어 내리면 표면 장력에 의해 수면이 올라갑니다. 절편을 루프의 중심으로 이동시킵니다. 절편을 수면의 정점에 위치시키고 머리카락 한 가닥을 사용하여 절편의 방향을 조절합니다.

핀셋을 사용하여 베어 슬릿 그리드(bare slit grid)를 수면과 평행하게 유지하며 접촉시켜 섹션 그룹을 집어 올립니다. 섹션이 붙은 그리드를 소량의 물방울과 함께 Formvar 지지 필름 위에 놓습니다. 여과지로 과잉의 물을 제거합니다.

절편이 완전히 건조되면, 그리드 주변의 Formvar 필름을 찢고 절편이 부착된 그리드를 제거하십시오. 그리드를 염색 튜브의 홈에 적절한 순서대로 배치하고, uranyl acetate와 lead citrate로 절편을 염색하십시오. 다섯 개의 그리드를 다중 시료 홀더에 적절한 순서대로 배치하되, 그리드 슬롯의 장축이 시료 홀더 축과 수직이 되도록 방향을 맞추십시오.

그리드 고정제를 사용하여 그리드를 고정하고, 투과 전자 현미경에 시료 홀더를 삽입합니다. 표적 세포와 모든 세포 단면을 고배율로 촬영하십시오. 여기에는 연속 절편이 포함된 5개의 그리드를 저배율로 관찰한 모습이 나와 있습니다.

18-25개의 절편을 하나의 그리드에 마운트했습니다. 절편들이 서로 붙어 있으며 두께가 동일함에 유의하십시오. 여기에는 주변세포질 근발생의 연속 절편들이 표시되어 있습니다.

그림은 67개의 전체 단면 중 12개를 보여줍니다. 이 세포는 단일 핵양체 막과 박테리아와 유사한 내공생체를 가지고 있으며, 나체 DNA 섬유로 구성된 거대한 핵양체를 보유하고 있는 것으로 나타났으나 미토콘드리아는 없었습니다. 따라서, 이 생물은 원핵생물에서 진핵생물로 진화하는 중간 단계의 생명체인 것으로 보입니다.

여기 Escherichia coli의 연속 절편이 제시되어 있습니다. 그림은 12개의 완전한 절편을 보여줍니다. 흥미롭게도, 이 세포에는 21,700개의 리보솜이 포함되어 있는 것으로 확인되었습니다.

이 영상을 시청하신 후, 연속 초박절편 제작 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. 숙달되면 적절한 절차에 따라 3시간 이내에 이 기술을 수행할 수 있습니다.