Name: 전송 전자 현미경 검사 법에서 미생물의 직렬 Ultrathin 섹션을 얻기위한 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-17T10:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: 학습하세요 미생물의 직렬 초박형 섹션 제작법을 전자현미경에서 비용 효율적으로 적용하는 방법을. 이 기술은 고해상도 이미지를 얻어 세포 생물학 연구에 필수적인 삼차원 구조 정보를 제공합니다.

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우리는 진심으 그의 귀중 한 제안 및 토론을 위한 시게오 기타 감사합니다. 우리 또한 그들의 중요 한 독서의 원고에 대 한 존과 스미 레 크 스 테 인을 감사합니다.

참고:이 연구에 사용 된 표본은 미생물, 액체 질소, 프로 판으로 급속 하 게 냉동 동결 2% 오스뮴 tetroxide, 포함 된 아세톤에 대체 및 에폭시 수 지1,2,3,에에서 포함 된 4,5,6,7,,89,10,11,12,13 ,,1415,,1617,18.
1. 지원 영화 (그림 1-3)의 준비
참고: 은색 Formvar 지원 영화 캐스팅에 유리 방법19를 사용 하 여 준비가 되어 있습니다.
<ol><li>100 mL 1.5%의 추가 Formvar Formvar 만드는 장치 (그림 1)을 에틸렌 dichloride에. 공기 고무 공19를 사용 하 여 'a'를 통해 솔루션을 눌러 유리 슬라이드 (76 m m 26 m m x 1.3 m m x) 기구의 상단 열에서 Formvar 솔루션에서의 절반을 찍어.<ol>
<li>3-방법으로 자 지를 열고 공기 압력을 줄이기 위해 'b'를 발표 하 여 열에서 솔루션을 배출. 유리 슬라이드 표면에 필름 형태의 유리 슬라이드와 공기에서 건조 장치에서 꺼내 주세요. 백열 램프를 사용 하 여 Formvar 영화의 건조를 가속.</li>
	</ol>
</li>
	<li>영화 (그림 2a), 면도날으로 유리 슬라이드에 4 개의 가장자리에서 근 근이, 슬라이드20에서 영화의 분리를 촉진 하기 위해 슬라이드에 호흡으로 유리 슬라이드를 immersing 하 여 물에 영화에서 부동 하는 후에 물이 천천히 낮은 수평 각도 (약 10 °, 그림 2b).</li>
	<li>구멍 (지름 4 mm) 알루미늄 랙 (25 m m x 3 m m x 30)를 사용 하 여 물에서 Formvar 영화 올리다 (그림 3a). 사용 (그림 3b)까지 한 desiccator Formvar 영화와 함께 랙 유지.</li>
</ol>2. 초음파 트리밍 블레이드와 면도날 21 stereomicroscope (그림 4)에서 표본 블록 트리밍
<ol><li>셀 블록의 표면에는 블록의 끝 (그림 4a) 가벼운 현미경으로 관찰 하 여 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>척 (블록 홀더), 표본 블록을 탑재 하 고 트리밍 단계21 (그림 4b)에 물림 쇠를 탑재. 이 트리밍 단계는 표본 뒤쪽에서 조명 메커니즘이 있습니다.</li>
	<li>0.7 m m x 1.0 m m (그림 4, 5)의 크기에 블록을 잘라. 에폭시 수 지 매우 하드 이기 때문에, 먼저 초음파 트리밍 블레이드를 사용 하 여 블록을 잘라. 초음파 트리밍 블레이드는 새로 도입된 된 기계 이며 블록 쉽게 잘립니다. 다음에 면도날으로 더 블록 트림. (참조 그림 5 d, 그림 8) 절단의 방향을 표시 한 어깨를 잘라.</li>
</ol>3. 톰 (그림 5)를 사용 하 여 다이아몬드 칼으로 표본 블록 트리밍
<ol><li>ultramicrotome의 견본 홀더 척 견본 블록 설정 합니다. 장소는 표본 90도 시계 반대 방향으로 직렬 ultrathin 단면 때 실제 위치에 대 한 수행 (참조 그림 5 d).</li>
	<li>다이아몬드 트리밍 나이프 (참조 그림 5 d)와 블록의 표면을 잘라. 다이아몬드 칼 날 견본 블록 얼굴에 평행 하 게 설정 하 고 어떤 견본 (그림 5 d)을 잃을 수 없습니다 견본 표면의 최소 금액을 잘라. 참고:이 단계 표본 표면을 매끄럽게 수행 됩니다. 슬림 부분의 견본 표면의 일부는 그대로 (따라서이 부분은 아니라 처럼 빛나는 거울, 그림 5 d), 직렬 단면에 대 한 표본의 일부를 잃을 수 없습니다. 이것은 표본 블록의 표면에 노출 되어 있기 때문 에입니다.</li>
	<li>표본 블록 (그림 5c)의 절단을 모니터링 하는 데 칼 스테이지의 거울 (메사 컷, M)를 배치 합니다.</li>
	<li>잘라 칼 무대 왼쪽 (그림 5a)에 30 ° 회전 하 여 트리밍 나이프를 사용 하 여 블록의 왼쪽된 가장자리 (이것은 상단에, 그림 5 d, 직렬 단면에 샘플의 된다).</li>
	<li>칼 무대 오른쪽 (그림 5b)에 30 ° 회전 하 여 표본 (이 됩니다 직렬 단면, 그림 5 d에 견본의 더 낮은 측)의 왼쪽된 가장자리에서 약 100 µ m에서 블록 얼굴을 잘라. 참고: 직렬 섹션은 약 90의 견본의 슬림 부분에서 삭감 될 것 이다 nm 크기에서 약 1 m m x. 큰 부분은 평행 되도록 견본 표면 및 칼 날을 조정 하기 위해 사용 됩니다. 칼 날에 평행 되도록 견본 표면 조정 후 큰 부분 면도날으로 제거 됩니다. 톰을 사용 하 여 견본의 상단 및 하단 측면을 절단 하 여 표본 양쪽 모두 될 원활 하 고 정확 하 게 서로 평행 하 게 (그림 5 d)는 직선과 끊어지지 리본 섹션을 얻을 필요가 있다.</li>
</ol>4. 조정 견본 표면 및 칼 가장자리를 서로 21 병렬 마주
<ol><li>트리밍 나이프를 제거 하 고 표본 블록 시계 방향으로 90 ° 회전.</li>
	<li>칼 단계로 ultrathin 단면 나이프를 설정 합니다.</li>
	<li>서로 견본 표면의 큰 부분을 사용 하 여 병렬 마주 견본 표면 및 칼 날을 조정 합니다. 참고: 큰 표본 부분의 사용 됩니다 조정 직렬 단면 절단 얼굴 너무 작습니다, 어렵게 견본 표면 및 칼 지만,이 부분을 사용 하 여 수직 방향에 특히 조정 때문에. 따라서, 표본의 큰 부분을 사용 하 여 쉽게 조정 합니다.</li>
</ol>5. 견본 블록 (그림 6)에 네오프렌 솔루션 확산
<ol><li>원래 위치와 정확히 같은 위치에 견본 척을 배치 하는 척 척 홀더는 톰의에 테이프를 적용 하 고 경계 (그림 6a)에서 잘라.</li>
	<li>톰에서 표본 척 밖으로 하 고 stereomicroscope (그림 6b)에서 그것을 배치. 면도날으로 견본의 큰 부분을 잘라, 슬림 부분 직렬 섹션에서 떠나는 것입니다 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>파스퇴르 피 펫을 사용 하 여, 섹션 측 접착제 있도록 직렬 단면에 사용할 표본에 약 1 µ L 0.5 %neoprene 솔루션 (그림 6b) 드롭. 커버 neoprene 솔루션 전체 표본. 필터 종이 시료 근처에 배치와 함께 과잉 neoprene 솔루션을 즉시 흡수. 섹션의 리본을 얻기 직렬 셀 섹션의 사진 촬영을 위한 필수적 이며 neoprene 접착제 섹션을 함께 튀어나와 매우 유용.</li>
	<li>준비 3-슬릿 격자 (슬릿의 크기: 중간, 0.4 m m x 2.2 m m, 모두 양쪽 0.2 m m x 2.2 m m) (그림 6c) 60 ° 격자의 핸들 여 직렬 섹션을 따기 위한 치료 0.5 %neoprene 솔루션, 격자 및 격자에 의해 친수성 만들기 글로우 방전22.</li>
</ol>6. 직렬 섹션 (그림 7-9)
<ol><li>장소 견본 블록 녹화 부분을 정렬 하 여 5.1 (그림 6a)와 같은 위치에서 톰에 다시 척. 이 블록 얼굴과 칼 날 완벽 하 게 서로 평행 하 게 유지합니다. 다음에 견본에 가까운 칼가지고.</li>
	<li>물으로 칼 보트를 채우십시오.</li>
	<li>공기 (그림 7)를 방지 하기 위해 플라스틱 커버는 톰을 커버. 참고: 공기 ultrathin 단면화 및 섹션의 자주 검색 하는 동안 문제가 발생할. 플라스틱 덮개는 3 개의 구멍: 한 구멍 쌍 안 렌즈 이며 다른 두 구멍 덮개에 사용 하는 동안 작업을 허용 하도록 무기에 대 한. 나무 팔걸이 격자와 직렬 섹션을 검색 하는 등 섬세 한 작업을 하 고 있는 동안 무기를 배치 하는 데 사용 됩니다. 나무 팔걸이 톰 연산자의 손의 진동 전송 수 없습니다 톰 테이블 (그림 7, 화살표), 다른 테이블에 배치 됩니다.</li>
	<li>200 nm 섹션 두께 (그림 8)에 시료를 절단 시작 합니다. 200 nm 두께 시료의 표면에 칼을 데 려에 시간을 절약할 것 이다.</li>
	<li>첫 번째 섹션을 잘라 후 설정 섹션 두께 70 nm (그림 8).</li>
	<li>직렬 섹션의 수에 (정확 하 게 말하기, 약 1.8 m m; 섹션의 수에 따라 섹션의 폭의 리본에 도달 후) 20를 도달 하는 경우, 설정 섹션 두께 10 nm (그림 8)을 계속 하는 동안. 참고: 이후는 톰 10 nm 두꺼운 섹션을 잘라낼 수 없는, 아니 새로운 섹션 나타나고 이전 컷된 섹션에서 칼 날 분리 되. 그것은 머리 가닥의 쌍을 사용 하 여 수동으로 섹션 구분에 어려움을 피하기 위해 직렬 섹션을 따기 위한 분리 된 섹션 그룹 (그림 9)를 얻는 것이 중요. 전송 전자 현미경에서 시야 2.0 m m 이므로, 섹션에서 가장 긴 1.8 m m 이어야 한다.</li>
	<li>설정 섹션 두께 60 nm (그림 8). 이 기계는 이전 10 nm 두께 추가 합니다 때문에 70 nm 섹션 (그림 8)을 생산할 예정 이다.</li>
	<li>섹션 두께 70 다시 설정 nm (그림 8) 절단 1.8 m m 긴 섹션 얻을 때까지 계속.</li>
	<li>6.6-6.8를 반복 하 여 1.8 m m 긴 섹션 5 (그림 9) 얻을 수 있습니다. 우리가 일반적으로 이후 5 견본 홀더 전송 전자 현미경에서 우리의 실험실에서 사용할 수 있지만 5도 아니다 5 섹션 그룹을 확인 합니다.</li>
</ol>7. 직렬 섹션 (그림 10-12)를 따기
<ol><li>'루프 섹션 지주'23 장소 (루프의 내부 직경: 5.0 m m) (그림 10a)에 세 번째 섹션 그룹 (그림 10b). 참고: 그것은 적절 한 순서로 사진을 찍을 그들의 단면 순서 섹션을 검색 하는 데 필요한입니다. 그러나 칼 보트에 5 섹션 그룹 이후, 그것은 종종 되 면 혼동 그룹은. 세 번째 그룹에는 루프를 두어서, 그것은 분명해 연산자 가까이 두 그룹은 첫 번째 및 두 번째, 그리고 연산자에서 먼 2는 네 번째 및 다섯 번째 그룹 (그림 10b). 이 순서를 혼합 되지 것입니다.</li>
	<li>'물 표면 높이 루프'23 장소 (WSRL, 루프의 내부 직경: 4.0 m m) (그림 11a) 칼 스테이지 (그림 11b). WSRL 하단에 자석으로 되어 있기 때문에 칼 무대에 굳게 설 것 이다.<ol>
<li>그것의 축과 핸들을 이동 하 여 직렬 섹션 바로 위에 WSRL의 루프를 배치 합니다. 낮은 물 표면에 WSRL의 루프는 루프 encircles 섹션.</li>
		<li>물 표면 표면 장력 (그림 11 c-d)에 의해 발생 합니다 있도록 나사를 아래쪽으로 선회 하 여 루프를 아래로 누릅니다. 섹션 루프의 중심을 이동, 물의 꼭대기에 위치 하 고 머리 가닥21을 사용 하 여 섹션의 방향을 조정 합니다.</li>
		<li>벌 거 벗은 슬릿-그리드, 핀셋에 의해 개최 되 고 (그림 11 d) 물 표면에 평행 하 게 유지 하는 그것을 만져 섹션 그룹을 선택 합니다. 그것은 섹션 그리드를 먼저 터치 하는 물, 격자 (그림 11 d)의 중앙에 정확 하 게 섹션을 배치 하는 것이 중요.</li>
	</ol>
</li>
	<li>물 작은 방울과 함께 섹션 격자를 Formvar 지원 영화16 (그림 12)에 놓고 필터 종이 사용 하 여 초과 물을 제거 합니다. 참고: 지원 영화의 주름 때 종종 문제가 섹션 선택 사용 하 여 그리드 지원 영화 막 (섹션) 막 (지원 영화)를 직접 접촉 하기 때문에. 지원 영화에 주름을 지 고의 문제는 Formvar 지원 영화16에 물 작은 방울과 함께 섹션 베어링 그리드를 배치 하 여 크게 감소 된다.</li>
</ol>8. 얼룩 섹션16,24 (그림 13)
<ol><li>섹션은 완전히 건조 후 격자, 주위에서 Formvar 영화 눈물 고 섹션 베어링 격자를 제거 합니다.</li>
	<li>(그림 13), 적절 한 순서로 얼룩 튜브16 의 홈에 격자를 설정 하 고 얼룩 uranyl 아세테이트 및 리드 시트르산24섹션. 참고: 저기 홈 깊이 0.6 m m 튜브의 긴 축을 따라 면도날으로 잘라. 튜브는 격자의 직접 처리 얼룩 및 세탁기 과정16동안 필요 하지 않습니다 이후 핀셋를 사용 하는 경우 지원 영화의 실수로 파손을 방지 하기 위한 유용 합니다.</li>
</ol>9. 직렬 섹션 (그림 14)의 관찰
<ol><li>방향을 견본 홀더 축에 수직 그리드 슬릿의 긴 축에 적절 한 순서로 (그림 14a), 멀티 견본 홀더 5 격자를 설정 합니다. 격자의 핸들 (화살촉) 할 필요가 없습니다 수 컷, ' 그리드 설치 ' 핸들 건드리지 않을 때문에.</li>
	<li>' 그리드-설치 ' (그림 14b)와 격자를 해결 하 고 전송 전자 현미경 견본 홀더를 삽입. 참고: 그것은 종종 목표 셀의 사진을 복용 하기 전에 모든 셀 섹션 (그림 15) 좋은 조건 좋은 고정과 오염 없이 재미 있는 미생물 또는 세포를 찾을 수의 낮은 확대 이미지를 유용 합니다.</li>
	<li>높은 확대에 모든 셀 섹션에 대상 셀의 사진을 찍을.</li>
</ol>

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<li>Hildebrand, D. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+serial-section+electron+microscopy+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Whole-brain serial-section electron microscopy in larval zebrafish.</a> Nature. 545, 345-349 (2017).</li>
<li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biol. 2, e329(2004).</li>
<li>Heymann, J. A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+3D+imaging+of+cells+and+tissues+with+a+dual+beam+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope.</a> J. Struct. Biol. 155, 63-73 (2006).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

여기에 제시 된 방법을 비싼 장비를 요구 한다. 그것은 필요로 한 알루미늄 랙 (그림 3), 3-슬릿 격자 (그림 6c), 섹션 지주 루프 (그림 10a), 루프 물 표면 높이 (그림 11a), 및 얼룩 튜브 (그림 13). 현재 방법의 많은 기능을 확인 하 고 있습니다. 시료의 큰 부분 그들은 얼굴을 서로 병렬 견본 표면 및 칼 가장자리를 조정 하는 데 사용 됩니다. 직렬 섹션을 슬릿 격자에 직렬 섹션의 그룹을 검색할 때 머리 가닥의 쌍을 사용 하 여 분리 섹션에서 어려움을 피하기 위해 그룹에서 잘립니다. '섹션 지주 루프' 섹션 그룹의 순서를 혼합 하지 않도록 하는 데 사용 됩니다. '물 표면 높이 루프' 섹션의 꼭대기에 위치 하 고는 그들은 터치 그리드 첫째,...

적절 한 직렬 ultrathin 단면 기술은 세포와 세포 구성 요소 전자 현미경 수준에서 3 차원으로 공부에 불가결 이다. 우리 효 모 세포의 세포 주기에서 스핀 들 극 본문의 역학을 공부 하 고 세포 주기 및 중복1,2,3, 의 시간 동안 그들의 열 대권 외의 형태학 변화 공개 4,5. 2006 년에, 우리는 '구조'를 결합해 새로운 단어 'structome'를 만들어낸와 '-오 ', '양적 및 3 차원 구조 정보 전자 현미경 수준에 전체 셀의 ' 6,7로 정의.
Structome 분석, 직렬 ultrathin 단면 기술을 요하는 그것 발견 Saccharomyces cerevisiae 와 Exophiala dermatitidis 효 모 세포 약 200000 리보솜7,8, 는 했다 대장균 셀 26000 리보솜9, 결핵균 셀 했다 1700 리보솜10 고 묘 진 나선형 박테리아만 300 리보솜11했다. 이 정보 뿐만 아니라 각 유기 체 뿐만 아니라 종9의 성장 율을 예측에 유용 합니다.
또한, 새로운 유기 체;의 발견에 지도 하는 structome 분석 Parakaryon myojinensis 는 누구의 셀 구조 원핵생물과 진핵생물12,13,,1415의 그들 사이 중간 했다 일본의 해안 떨어져 깊은 바다에서 발견 되었다. 현재, 직렬 ultrathin 단면 기술 너무 어려운 마스터 오랜 시간이 걸릴 것으로 간주 됩니다. 이 연구에서는 아무도 직렬 ultrathin 단면 어려움 없이 수행할 수 있는 신뢰할 수 있는 방법을 개발 했습니다.

<table><tbody><tr><td>Formvar 제조 장치</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>652</td><td>W 180 x D 180 x H 300 mm</td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>Matsunami Co. Ltd.,</td> <td>Osaka-76</td> <td>x 26 x 1.3 mm</td></tr><tr><td>알루미늄 랙 4mm 구멍</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>658</td><td>W 30 x D 25 x H 3 mm, 이 논문을 참조</td></tr><tr><td>Nikon</td><td>Co. Ltd., 도쿄</td> <td>-</td> <td>SMZ 645</td></tr><tr><td>LED 조명 실체 현미경</td><td>니콘 (주), 도쿄</td> <td>-</td> <td>SM-LW 61 지</td></tr><tr><td>트리밍 스테이지</td><td>Sunmag Co.Ltd., 도쿄</td> <td>-</td> <td>틸팅 메커니즘 장착,</td></tr><tr><td>트리밍 스테이지 용 LED 조명</td><td>Sunmag Co.Ltd., 도쿄</td> <td>-</td> <td>초음파</td></tr><tr><td>트리밍 블레이드</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>5240</td><td>EM-240,</td></tr><tr><td>Diatome Co. Ltd.,</td> <td>Switzerland-45</td><td>&deg</td><td>를 트리밍하기 위해 이 종이 다이아몬드 나이프</td></tr>를 참조하십시오.<tr><td>초박형 절편용 다이아몬드 나이프</td><td>Diatome Co. Ltd.,</td> <td>Switzerland-45</td><td>&deg;</td></tr><tr><td>초박박극</td><td>Leica Microsystems,</td> <td>Vienna-Ultracut</td> <td>S</td></tr><tr><td>Mesa cut</td><td>Leica Microsystems,</td> <td>Vienna-Mirror</td><td></td></tr> <tr><td>0.5% 네오프렌 W 솔루션</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>605</td><td></td></tr><tr><td>Special 3-slit nickel grid</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>2458</td> Refer to this <td>paper</td></tr><tr><td>Special 3-slit copper grid</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>2459</td> Refer <td>to this paper</td></tr> 단면 <tr><td>유지 루프</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>526</td><td>Refer to</td></tr><tr><td>this paper Water-surface-raising loop</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>527</td><td></td></tr><tr><td>Refer to this paper staining tube</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>463</td><td>Refer</td></tr> to <tr><td>this paper Multi-specimen holder</td><td>JEOL Co. Ltd., Tokyo-EM-11170</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JEM-1400</td><td>JEOL Co. Ltd., 도쿄</td><td>-</td><td>투과 전자 현미경</td></tr></tbody></table>

전송 전자 현미경 검사 법에서 미생물의 직렬 ultrathin 섹션을 얻기위한 방법

A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

셀 및 전송 전자 현미경 검사 법에서 고배율에서 3 차원 구성 요소 셀을 관찰 표본의 직렬 ultrathin 섹션을 준비 해야 합니다. 직렬 ultrathin 섹션 준비는 매우 어려운 것으로 간주 됩니다, 하지만 그것은 오히려 쉬운 경우 적절 한 메서드를 사용 하입니다. 이 종이에 우리는 안전 하 게 미생물의 직렬 ultrathin 섹션을 얻기 위한 단계별 절차를 보여줍니다. 이 방법의 핵심 포인트는: 1)는 시료의 큰 부분을 사용 하 여 견본 표면 및 칼 가장자리; 서로 평행 하 게 되도록 조정 하 2)을 그룹에서 직렬 섹션을 잘라내어 슬릿 격자;에 직렬 섹션의 그룹을 검색할 때 머리 가닥의 쌍을 사용 하 여 섹션 구분에 어려움을 피하기 위해 3) '섹션 지주 루프'를 사용 하 여 섹션 그룹;의 순서를 혼합 하지 마십시오 4) 사용 하 여 '물 표면 높이 루프' 확인 섹션의 꼭대기에 위치 하는 그들은 터치 그리드 첫째, 격자;에 원하는 위치에 배치 하려면 5) 사용 하 여 지원 영화는 알루미늄 선반에 쉽게 격자에 섹션을 복구 하 고 지원 영화;의 주름을 방지 하 그리고 6) 얼룩 튜브를 사용 하 여 실수로 핀셋으로 지원 영화를 위반을 피하기 위해. 이 새로운 메서드는 어려움 없이 직렬 ultrathin 섹션을 취득 수 있습니다. 메서드를 사용 하면 3d, 집중 된 이온 빔 전자 현미경 검사 및 직렬 블록-얼굴 또는 자동 테이프 수집 ultramicrotome 메서드를 사용 하 여 얻을 수 없는 높은 해상도에서 미생물의 세포 구조를 분석 가능 하 게.

이 프로토콜에서는 3-슬릿 격자 직렬 섹션을 따기 위해 사용 되었다. 격자는 니켈 이나 구리의 만들어집니다. 직렬 섹션 중간 슬릿에 배치 됩니다. 양쪽에 슬릿 그리드와 그들을 따기 때 섹션을 볼 필요가 있습니다. 핀셋 (그림 11 d)으로 그들을 따기 때 격자를 직렬 섹션으로 병렬 계속 핸들 굽습니다 (그림 6 c, 오른쪽). 작은 핸들은 섹션을 따기에 심각한 문제가 발생, 그리드의 주요 부분의 굽 힘을 방지 하 고 얼룩 동안 섹션을 삭제 방지 하기 위해 유리 하다. 이 그리드는 기존의 2.0 m m x 1.0 m m 단일 구멍 격자에 이점이 있다. 즉, 섹션 2 개의 금속 바 0.4 m m 간격에 의해 직접 지원 됩니다 (1.0 m m 보다 좁은)와 섹션 지원 영화 기존의 단일 구멍에 의해서만 지원 됩니다 3-슬릿 격자에서 Formvar 지원 영화. 표본 드리프트...

이 연구는 전송 전자 현미경 검사 법에서 고가의 장비 없이 미생물의 직렬 ultrathin 섹션을 얻기 위한 안정적이 고 쉽게 절차를 선물 한다.

전송 전자 현미경 검사 법에서 미생물의 직렬 Ultrathin 섹션을 얻기위한 방법

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

이 절차의 전반적인 목표는 연속 초박절편을 안전하고 쉽게 제작하는 것입니다. 이 방법은 세포 생물학 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있으며, 전자 현미경 수준에서 전체 세포의 정량적 및 3차원 구조 정보를 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 고가의 장비 없이도 연속 초박절편 제작이 가능하다는 것이며, 이 방법을 통해 고해상도 이미지를 얻을 수 있다는 점입니다.이 절차를 시작하려면 유리 슬라이드의 표면을 세척하십시오. 그런 다음 고무 공을 사용하여 3방향 스톱콕을 통해 공기로 용액을 가압하여, Formvar 지지 필름 제작 장치의 상단 컬럼에 있는 1.5% Formvar 용액에 유리 슬라이드의 절반을 담그십시오. 3방향 스톱콕을 열고 공기를 배출하여 압력을 낮춤으로써 컬럼에서 용액을 배출하십시오.그 다음 장치에서 유리 슬라이드를 꺼내어 공기 중에서 건조시켜 유리 슬라이드 표면에 필름을 형성합니다. 면도날을 사용하여 유리 슬라이드 위 필름의 네 가장자리를 긁어냅니다. 슬라이드에 입김을 불어 필름이 슬라이드에서 잘 분리되도록 한 후, 유리 슬라이드를 낮은 수평 각도로 천천히 물속에 담가 필름을 띄워 분리합니다.그 다음 구멍이 뚫린 알루미늄 랙을 사용하여 물에서 Formvar 필름을 건져냅니다. 실체 현미경 하에서 초음파 트리밍 블레이드와 면도날로 시편 블록을 트리밍하기 전, 먼저 광학 현미경으로 블록의 끝부분을 관찰하여 블록 표면에 세포가 있는지 확인하십시오. 그런 다음 시편 블록을 척에 장착하고, 척을 트리밍 스테이지에 장착합니다.블록을 0.7 by 1.0 mm 크기로 트리밍합니다. 에폭시 수지가 매우 단단한 경우, 먼저 초음파 트리밍 블레이드를 사용하여 블록을 트리밍한 다음, 면도날로 블록을 더 세밀하게 트리밍하십시오. 절단 방향을 표시하기 위해 한쪽 어깨 부분을 절단합니다.마이크로톰의 다이아몬드 나이프를 사용하여 시편 블록을 트리밍하려면, 울트라 마이크로톰의 시편 홀더에 시편 블록 척을 고정하십시오. 다이아몬드 트리밍 나이프로 블록의 표면을 절단합니다. 다이아몬드 나이프의 날을 시편 블록 면과 평행하게 설정하고, 시편의 손실이 없도록 표면을 최소량만 절단하십시오.나이프 스테이지를 왼쪽으로 30도 회전시켜 트리밍 나이프로 블록의 왼쪽 가장자리를 절단합니다. 이 가장자리는 연속 절편 제작 시 시료의 상단면이 됩니다. 그런 다음, 나이프 스테이지를 오른쪽으로 30도 회전시켜 시료의 왼쪽 가장자리로부터 약 100 microns 떨어진 지점에서 블록 표면을 절단합니다.이 가장자리는 연속 절편 제작 시 시료의 하단면이 됩니다. 트리밍 나이프를 제거하고, 시료 블록을 시계 방향으로 90도 회전시키십시오. 초박절편용 나이프를 나이프 스테이지에 설치하십시오.시편 표면의 넓은 부분을 이용하여 시편 표면과 칼날의 모서리가 서로 평행하게 마주 보도록 조정합니다. 다음으로, 마이크로톰의 척과 척 홀더에 테이프를 부착하고 경계 부분에서 테이프를 자릅니다. 시편 척을 마이크로톰에서 꺼내어 실체 현미경 아래에 놓습니다.면도날을 사용하여 표본의 큰 부분을 잘라내고, 연속 절편을 얻을 얇은 부분만 남깁니다. 연속 절편 제작에 사용할 표본 위에 파스퇴르 피펫으로 0.5% Neoprene 용액 약 1µL를 떨어뜨려 절편 측면을 접착성 있게 만듭니다. 그다음 표본 전체를 Neoprene 용액으로 덮습니다. 표본 근처에 거름종이를 배치하여 과량의 Neoprene 용액을 즉시 흡수시킵니다.다음으로, 연속 절편을 수집하기 위해 3개의 슬릿 그리드를 준비합니다. 이를 위해 그리드의 핸들을 60도로 구부리고, 0.5% Neoprene 용액으로 그리드를 처리합니다. 그런 다음 글로우 방전을 통해 그리드를 친수성으로 만듭니다.테이프로 표시된 부분을 맞추어 시료 블록 척을 마이크로톰의 원래 위치에 다시 배치합니다. 이렇게 하면 블록 면과 칼날 끝이 서로 완벽하게 평행을 유지하게 됩니다. 그런 다음 칼날을 시료 가까이 이동시킵니다.나이프 보트에 물을 채운 후, 공기 흐름을 방지하기 위해 마이크로톰을 플라스틱 커버로 덮습니다. 200 nanometers의 절편 두께로 시편 절단을 시작하십시오. 첫 번째 절편이 절단되면, 절편 두께를 70 nanometers로 설정하십시오.연속 절편의 수가 20개에 도달하면, 절편 두께를 10 nanometers로 설정하십시오. 마이크로톰은 10 nanometer 두께의 절편을 절단할 수 없으므로 새로운 절편이 생성되지 않으며, 이전에 절단된 절편들이 나이프 엣지로부터 분리됩니다. 그다음, 절편 두께를 60 nanometers로 설정하십시오.기기가 이전의 10 nanometer 두께를 추가하기 때문에, 이를 통해 70 nanometer 두께의 절편이 생성됩니다. 마지막으로, 절편 두께를 다시 70 nanometers로 설정하고 1.8 millimeter 길이의 절편을 얻을 때까지 계속해서 절단합니다. 연속 절편을 수집하려면 먼저 절편 유지 루프를 세 번째 절편 그룹에 놓으십시오.그런 다음 수면 상승 루프를 나이프 스테이지 위에 놓습니다. 샤프트와 핸들을 움직여 WSRL의 루프를 연속 절편 바로 위에 위치시킵니다. WSRL의 루프가 절편들을 에워쌀 수 있도록 루프를 수면 위로 내립니다.나사를 아래로 돌려 루프를 밀어 내리면 표면 장력에 의해 수면이 올라갑니다. 절편을 루프의 중심으로 이동시킵니다. 절편을 수면의 정점에 위치시키고 머리카락 한 가닥을 사용하여 절편의 방향을 조절합니다.핀셋을 사용하여 베어 슬릿 그리드(bare slit grid)를 수면과 평행하게 유지하며 접촉시켜 섹션 그룹을 집어 올립니다. 섹션이 붙은 그리드를 소량의 물방울과 함께 Formvar 지지 필름 위에 놓습니다. 여과지로 과잉의 물을 제거합니다.절편이 완전히 건조되면, 그리드 주변의 Formvar 필름을 찢고 절편이 부착된 그리드를 제거하십시오. 그리드를 염색 튜브의 홈에 적절한 순서대로 배치하고, uranyl acetate와 lead citrate로 절편을 염색하십시오. 다섯 개의 그리드를 다중 시료 홀더에 적절한 순서대로 배치하되, 그리드 슬롯의 장축이 시료 홀더 축과 수직이 되도록 방향을 맞추십시오.그리드 고정제를 사용하여 그리드를 고정하고, 투과 전자 현미경에 시료 홀더를 삽입합니다. 표적 세포와 모든 세포 단면을 고배율로 촬영하십시오. 여기에는 연속 절편이 포함된 5개의 그리드를 저배율로 관찰한 모습이 나와 있습니다.18-25개의 절편을 하나의 그리드에 마운트했습니다. 절편들이 서로 붙어 있으며 두께가 동일함에 유의하십시오. 여기에는 주변세포질 근발생의 연속 절편들이 표시되어 있습니다.그림은 67개의 전체 단면 중 12개를 보여줍니다. 이 세포는 단일 핵양체 막과 박테리아와 유사한 내공생체를 가지고 있으며, 나체 DNA 섬유로 구성된 거대한 핵양체를 보유하고 있는 것으로 나타났으나 미토콘드리아는 없었습니다. 따라서, 이 생물은 원핵생물에서 진핵생물로 진화하는 중간 단계의 생명체인 것으로 보입니다.여기 Escherichia coli의 연속 절편이 제시되어 있습니다. 그림은 12개의 완전한 절편을 보여줍니다. 흥미롭게도, 이 세포에는 21,700개의 리보솜이 포함되어 있는 것으로 확인되었습니다.이 영상을 시청하신 후, 연속 초박절편 제작 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. 숙달되면 적절한 절차에 따라 3시간 이내에 이 기술을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Engineering

공학

출처: Lutz, D., et.al.  발달 중인 마우스 뇌 및 척수의 자궁 내 전달 후 초구조적 신경 가소성 매개변수의 평가. J. Vis. 특급 (2019). 이 비디오는 새끼 쥐의 뇌 절편에 대한 준비 및 투과 전자 현미경(TEM) 분석을 보여줍니다. 이 프로토콜은 수지에 내장된 오스뮴 테트록사이드 고정 조직으로 시작하여 관심 영역을 분리하기 위한 정밀한 트리밍과 초박형 절개술을 통해 각각 광학 현미경 및 TEM을 사용하여 시각화된 반박형 및 초박형 절편을 생성합니다.

투과 전자 현미경을 사용한 마우스 뇌 절편의 초구조 분석

여기에서는 투과전자현미경(TEM) 분석을 위해 세포 수가 적은 샘플을 준비하는 프로토콜을 제시합니다.

TEM 분석을위한 낮은 셀 번호와 샘플 준비를위한 다른 방법

이 보고서는 두꺼운 생물학적 표본의 주사 투과 전자 단층 촬영을 수행하기 위한 샘플 준비 프로토콜과 특정 이미징 조건을 설명합니다.

주사 투과 전자 단층 촬영에 의해 준비 및 두꺼운 생물 샘플의 관측

여기, 우리는 쉽게, 낮은 비용을 제공하고, 시간 효율적인 프로토콜은 화학적으로 투과 전자 현미경에 대한 면역 조직 화학 염색을 미리 내장과 호환되는 장기 보존을 허용, 아크롤레인 정착액와 영장류 뇌 조직을 고정 할 수 있습니다.

면역 조직 화학 및 전자 현미경을 사전은 임베딩에 대한 비 인간 영장류 뇌 조직의 준비

이 프로토콜 이미징 나노 해상도 스캐닝 전자 현미경 (SEM)을 사용 하 여 조직에서 특정 셀을 대상. 가벼운 현미경 목표를 식별 하 고는 SEM.에서 계층적 방식으로 다 수 생물학 물자 수 지 포함에서 직렬 섹션의 처음 몇...

큰 볼륨 내에서 특정 세포 목표를 찾아내기를 위한 직렬 섹션의 복합 계층적 이미징

우리는 고정, 파라핀 포함, 및 미생물 식민지 biofilms 얇은 단면 기술을 설명 합니다. 준비 샘플, biofilm 구조 및 기자 식 패턴 현미경 검사 법에 의해 구상 될 수 있다.

파라핀 포함 및 현미경 분석에 대 한 미생물 식민지 Biofilms의 얇은 단면

우리는 아스코르바테 과산화수역 2 및 고추냉이 과산화증 염색을 포함하는 상관경 및 부피 전자 현미경을 사용하여 유전자 변형 후 전체 세포에서 미토콘드리아 및 호반 망상염식의 분포를 연구하는 프로토콜을 제시하고, 동일한 섹션에 있는 표적 유전자의 유무에 관계없이 세포의 직렬 단면도, 및 전자 현미경 검사법을 통해 직렬 화상 진찰.

미토콘드리아 및 코피포지티컬 라이트 및 부피 전자 현미경에 의한 산후성 망상 이미징

여기서 우리는 박테리아, 효모, 배양 세포, 분리 된 세포, 동물 및 인간 조직 및 바이러스를 포함한 생물학적 표본의 신속한 동결을 위해 샌드위치 동결 장치를 사용하는 방법을 보여줍니다. 우리는 또한 급속한 동결 후에 초박단면도를 위한 견본을 준비하는 방법을 보여줍니다.

전자 현미경 검사에서 생물학적 표본의 좋은 초구조 보존을 위한 샌드위치 동결 장치를 사용하여 급속한 동결

간세포의 소기관 또는 다른 조직의 세포 사이의 막 접촉 부위의 입체 세부 사항을 획득하는 간단하고 포괄적 인 프로토콜.

직렬 섹션 전자 현미경을 사용하여 간세포에서 소기관 간 접촉 부위의 입체 특성화

이 프로토콜은 균근 진균으로 발아된 식물 조직 및 종자에서 진균 집락을 연구하기 위해 주사 및 투과 전자 현미경, 빛, 공초점 및 형광 현미경과 같은 다양한 현미경 기술을 적용하여 진균종속영양 식물 샘플을 수집, 고정 및 유지하기 위한 자세한 절차를 제공하는 것을 목표로 합니다.

균종속영양 식물 조직의 곰팡이 집락화 및 종자의 공생 발아를 해석하기 위한 현미경 기술

이 비디오 프로토콜은 바이러스 표본의 주사 투과 전자 현미경 단층 촬영을 수행하는 방법을 보여줍니다. 최적의 결과를 위해 샘플은 고압 냉동 및 후속 동결 대체를 통해 준비됩니다.

바이러스학의 주사 투과 전자 현미경 단층 촬영: 고압 냉동, 동결 치환 샘플의 3D 이미징

학습하세요 미생물의 직렬 초박형 섹션 제작법을 전자현미경에서 비용 효율적으로 적용하는 방법을. 이 기술은 고해상도 이미지를 얻어 세포 생물학 연구에 필수적인 삼차원 구조 정보를 제공합니다.

전송 전자 현미경 검사 법에서 미생물의 직렬 Ultrathin 섹션을 얻기위한 방법

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