전송 전자 현미경 검사 법에서 미생물의 직렬 Ultrathin 섹션을 얻기위한 방법

이 절차의 전반적인 목표는 직렬 초박형 섹션을 안전하고 쉽게 만드는 것입니다. 이 방법은 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 전자 현미경 수준에서 전체 세포의 정량적 및 3차원 구조 정보를 제공합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 고가의 기계 없이 연속 초박형 절편을 수행할 수 있고 이 방법으로 고해상도 이미지를 얻을 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시작하려면 유리 슬라이드의 표면을 청소하십시오. 그런 다음 고무 볼을 사용하여 3방향 마개를 통해 공기로 용액을 눌러 Formvar 지원 영화 제작 장치의 상단 열에 있는 1.5% Formvar 용액에 유리 슬라이드의 절반을 담그십시오. 3방향 마개를 열고 공기를 방출하여 압력을 줄여 컬럼에서 용액을 배출합니다.

그런 다음 장치에서 유리 슬라이드를 꺼내고 공기 중에서 건조시켜 유리 슬라이드 표면에 필름을 형성합니다. 면도날로 유리 슬라이드에 있는 필름의 네 모서리를 긁어냅니다. 활주에서 필름의 별거를 촉진하기 위하여 활주에 숨을 쉬기 후에, 유리제 활주를 낮은 수평한 각으로 물로 천천히 가라앉혀서 필름을 떨어져 뜨십시오.

그런 다음 구멍이 있는 알루미늄 랙을 사용하여 물에서 Formvar 필름을 퍼냅니다. 실체 현미경으로 초음파 트리밍 블레이드와 면도날로 표본 블록을 트리밍하려면 먼저 광학 현미경으로 블록의 끝을 관찰하여 블록 표면에 세포가 있는지 확인하십시오. 그런 다음 시편 블록을 척에 장착하고 트리밍 스테이지에 척을 장착합니다.

블록을 0.7 x 1.0mm 크기로 자릅니다. 에폭시 수지가 매우 단단하면 먼저 초음파 트리밍 블레이드를 사용하여 상자를 다듬은 다음 면도날로 블록을 더 다듬습니다. 절단 방향을 표시하기 위해 한쪽 어깨를 자릅니다.

마이크로톰을 사용하여 다이아몬드 나이프로 표본 블록을 자르려면 초마이크로톰의 표본 홀더에 표본 블록 척을 설정합니다. 다이아몬드 트리밍 나이프로 블록 표면을 자릅니다. 다이아몬드 나이프 가장자리를 시편 블록 면과 평행하게 설정하고 시편을 잃지 않도록 시편 표면의 최소량을 자릅니다.

트리밍 나이프를 사용하여 나이프 스테이지를 왼쪽으로 30도 회전하여 블록의 왼쪽 가장자리를 자릅니다. 이 가장자리는 연속 절편에서 샘플의 윗면이 됩니다. 그런 다음 나이프 스테이지를 오른쪽으로 30도 회전시켜 시편의 왼쪽 가장자리에서 약 100미크론 떨어진 블록면을 자릅니다.

이 가장자리는 연속 절편에서 시편의 아래쪽이 됩니다. 트리밍 나이프를 제거하고 시편 블록을 시계 방향으로 90도 회전합니다. 초박형 절편 나이프를 나이프 스테이지에 놓습니다.

시편 표면과 나이프 엣지를 조정하여 시편 표면의 큰 부분을 사용하여 서로 평행을 향하도록 합니다. 그런 다음 척과 마이크로톰의 척 홀더에 테이프를 붙이고 경계에서 테이프를 자릅니다. 마이크로톰에서 표본 척을 꺼내 실체 현미경 아래에 놓습니다.

면도날로 표본의 많은 부분을 잘라내고, 연속적인 절편이 얻어질 슬림한 부분을 남겨두고, 파스퇴르 피펫을 사용하여 연속적인 절편에 사용될 표본에 0.5%의 네오프렌 용액 약 1마이크로리터를 떨어뜨려 단면면을 접착시키세요. 그런 다음 전체 표본을 네오프렌 용액으로 덮습니다. 표본 근처에 놓인 여과지 조각으로 과도한 네오프렌 용액을 즉시 흡수하십시오.

다음으로, 연속 섹션을 선택하기 위해 3개의 슬릿 그리드를 준비합니다. 이렇게하려면 그리드의 핸들을 60도로 구부리고 그리드를 0.5 % 네오프렌 용액으로 처리하십시오. 그런 다음 글로우 방전에 의해 그리드를 친수성으로 만듭니다.

테이핑된 부품을 정렬하여 시편 블록 척을 마이크로톰의 동일한 위치에 다시 놓습니다. 이렇게 하면 블록 면과 나이프 엣지가 서로 완벽하게 평행하게 유지됩니다. 그런 다음 칼을 표본에 가까이 가져갑니다.

나이프 보트에 물을 채운 후 마이크로톰을 플라스틱 덮개로 덮어 공기 흐름을 방지합니다. 200나노미터의 단면 두께에서 시편 절단을 시작합니다. 첫 번째 단면을 절단한 후 단면 두께를 70나노미터로 설정합니다.

연속 절편 수가 20개에 도달하면 단면 두께를 10나노미터로 설정합니다. 마이크로톰은 10나노미터 두께의 절편을 절단할 수 없기 때문에 새로운 절편이 나타나지 않으며 이전에 절단된 절편이 칼날에서 분리됩니다. 그런 다음 단면 두께를 60나노미터로 설정합니다.

이것은 기계가 이전의 10 나노미터 두께를 추가하기 때문에 70 나노미터 섹션을 생성합니다. 마지막으로 단면 두께를 다시 70나노미터로 설정하고 1.8mm 길이의 단면이 얻어질 때까지 절단을 계속합니다. 직렬 섹션을 선택하려면 먼저 세 번째 섹션 그룹에 섹션 고정 루프를 배치합니다.

그런 다음 나이프 스테이지에 물 표면 올리기 루프를 놓습니다. 샤프트와 핸들을 움직여 WSRL의 루프를 직렬 섹션 바로 위에 놓습니다. 루프가 섹션을 둘러싸도록 WSRL의 루프를 수면 위로 내립니다.

표면 장력에 의해 물 표면이 올라오도록 나사를 아래쪽으로 돌려 루프를 아래로 누릅니다. 단면을 루프의 중앙으로 이동합니다. 물의 정점에 놓고 머리카락을 사용하여 섹션의 방향을 조정하십시오.

벌거벗은 슬릿 그리드로 건드려 단면 그룹을 집어 올리는데, 이는 핀셋의 도움을 받아 물 표면과 평행하게 유지됩니다. 작은 물방울과 함께 섹션이 있는 그리드를 Formvar 지지 필름에 놓습니다. 여과지를 사용하여 과도한 물을 제거하십시오.

섹션이 완전히 건조된 후 그리드 주위의 Formvar 필름을 찢습니다. 섹션을 지지하는 그리드를 제거합니다. 염색 튜브의 홈에 있는 그리드를 적절한 순서로 설정하고 우라닐 아세테이트와 구연산납으로 섹션을 염색합니다. 다중 시편 홀더에 있는 5개의 그리드를 적절한 순서로 설정하고 그리드 슬릿의 긴 축을 시편 홀더 축에 수직으로 향하게 합니다.

그리드 고정 장치로 그리드를 고정하고 표본 홀더를 투과 전자 현미경에 삽입합니다. 표적 세포와 모든 세포 절편의 사진을 고배율로 촬영합니다. 여기에 표시된 것은 직렬 단면을 운반하는 5개의 그리드에 대한 저배율 보기입니다.

18-25개의 섹션이 하나의 그리드에 장착되었습니다. 섹션은 함께 부착되고 두께가 같습니다. pericarion myogenesis의 연속 절편이 여기에 나와 있습니다.

그림에는 67개의 전체 섹션 중 12개가 표시됩니다. 이 세포는 단일 뉴클레오이드 막이 있는 벌거벗은 DNA 섬유와 박테리아와 비슷하지만 미토콘드리아는 없는 내공생체로 구성된 큰 뉴클레오이드를 가지고 있는 것으로 밝혀졌습니다. 따라서 이 유기체는 원핵생물에서 진핵생물로 진화하는 중간 생명체로 보입니다.

여기에 표시된 것은 Escherichia coli의 연속 절편입니다. 그림에는 12개의 완전한 섹션이 나와 있습니다. 흥미롭게도, 이 세포는 21,700개의 리보솜을 함유하고 있는 것으로 밝혀졌습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 직렬 초박형 섹션을 만드는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 3시간 안에 완료할 수 있습니다.