Name: 시각화 및 Adeno 관련 바이러스 및 Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 Organotypic 뇌 조각에서 Oligodendrocyte 세포의 라이브 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 배우세요 아데노 관련 바이러스를 이용한 올리고덴드로사이트 특이적 형광 단백질 발현 및 공초점 현미경을 활용한 오가노타이픽 뇌 조각의 실시간 영상 기법. 이 방법은 미토콘드리아 동역학과 세포 반응을 연구하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 린다 Hildegard Bergersen 및 액세스 Magnar Bjørås 세포 실험실 및 장비, 플라스 미드와 바이러스 생산 Janelia 분자 생물학 공유 리소스 직원 및 공원 Vervaeke 레이저 파워 측정에 대해 감사 합니다. 이 작품은 노르웨이 건강 협회, 노르웨이 연구 위원회와 현미경 장비 Norbrain에 의해 투자 되었다.

<ol><li>Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+organization+of+oligodendrocyte+processes+during+development+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neursosci%22%5BJournal%5D)">Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo.</a> Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).</li>
<li>Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+density+distribution+of+endoplasmic+reticulum+proteins+and+mitochondria+at+specialized+Ca2%2B+release+sites+in+oligodendrocyte+processes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes.</a> J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).</li>
<li>Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+mitochondrial+transport+and+Parkin-independent+degeneration+of+respiratory+chain-deficient+dopamine+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1080, 12937-12942 (2011).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>De Simoni, A., Yu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures%3A+interface+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method.</a> Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).</li>
<li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+Schwann+cell+myelination+by+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).</li>
<li>Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+myelin+in+the+vertebrate+central+nervous+system+using+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy.</a> Biophys. J. 100, 1362-1371 (2011).</li>
<li>Fu, Y., Wang, H., Huff, T. B., Shi, R., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+imaging+of+myelin+degradation+reveals+a+calcium-dependent+pathway+in+lyso-PtdCho-induced+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of myelin degradation reveals a calcium-dependent pathway in lyso-PtdCho-induced demyelination.</a> J. Neurosci. Res. 85, 2870-2881 (2007).</li>
<li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nat. Med. 20, 443-449 (2014).</li>
<li>Shin, J. H., Yue, Y., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+adeno-associated+viral+vector+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recombinant adeno-associated viral vector production and purification.</a> Methods Mol. Biol. 798, 267-284 (2012).</li>
<li>Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide-directed+mutagenesis+without+phenotypic+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Prot.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection.</a> Curr. Prot. Neurosci. , 4.10.1-4.10.6 (2001).</li>
<li>Gow, A., Friedrich, V. L. Jr, Lazzarini, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+basic+protein+gene+contains+separate+enhancers+for+oligodendrocyte+and+Schwann+cell+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Myelin basic protein gene contains separate enhancers for oligodendrocyte and Schwann cell expression.</a> J. Cell Biol. 119, 605-616 (1992).</li>
<li>Rinholm, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+and+structure+of+mitochondria+in+oligodendrocytes+and+their+myelin+sheaths%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths.</a> Glia. 64, 810-825 (2016).</li>
<li>Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+decreases+mitochondrial+size+and+movement+in+primary+forebrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons.</a> J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).</li>
<li>Jackson, J. G., O'Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+and+glutamate+uptake+decrease+mitochondrial+mobility+in+astrocytes+and+position+mitochondria+near+glutamate+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters.</a> J. Neurosci. 34, 1613-1624 (2014).</li>
<li>Macaskill, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miro1+is+a+calcium+sensor+for+glutamate+receptor-dependent+localization+of+mitochondria+at+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses.</a> Neuron. 61, 541-555 (2009).</li>
<li>Karadottir, R., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+patch-clamping+of+cells+in+brain+slices+with+immunocytochemical+labeling+to+define+cell+type+and+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage.</a> Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).</li>
<li>Rinholm, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+oligodendrocyte+development+and+myelination+by+glucose+and+lactate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate.</a> J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).</li>
<li>Davison, A. N., Dobbing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+as+a+vulnerable+period+in+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Med.+Bull%22%5BJournal%5D)">Myelination as a vulnerable period in brain development.</a> Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+for+neuronal+degeneration+in+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures.</a> Brain Res. Protoc. 3, 278-290 (1999).</li>
<li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+for+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).</li>
<li>Pignataro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-Associated+Viral+Vectors+Serotype+8+for+Cell-Specific+Delivery+of+Therapeutic+Genes+in+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Adeno-Associated Viral Vectors Serotype 8 for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Genes in the Central Nervous System.</a> Front. Neuroanat. 11 (2), (2017).</li>
<li>Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yanez-Munoz, R. J., Moon, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticospinal+tract+transduction%3A+a+comparison+of+seven+adeno-associated+viral+vector+serotypes+and+a+non-integrating+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector.</a> Gene Ther. 19, 49-60 (2012).</li>
<li>Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+composition+of+molecular+motors+on+moving+axonal+cargo+using+cargo+mapping+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis.</a> J. Vis. Exp. (92), e52029(2014).</li>
</ol>

저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.

여기서 설명 하는 organotypic 문화를 만들기 위한 프로토콜 드 Simoni와 유 (2006 년)5설명 하는 프로토콜의 수정된 버전18 이다. 가장 중요 한 변화는 아래 설명 된 했습니다. Tris 버퍼 문화 매체, 바이러스 성 변환 동안 인큐베이터 밖 때 조각의 생존과 셀 매체의 변화를 향상에 추가 됩니다. 색종이 대 한 살 균 절차 또한 변경 됩니다. 다른 프로토콜 압력가 마로 소독 하 여 색종이 소독 하는 동안 우리 권장 하지 않습니다이 때문에 그것은 여러 컬 색종이. 이러한 성장 조각 덜 건강 한 경향이 컬된 색종이 사용 하지 마십시오. 우리의 프로토콜 마우스를 사용 하 여, 아니 쥐, 그리고 해 마, 대신 피 문화 수정 우리는 얇은 조각 (230 µ m 대 300 µ m)에서 잘 작동. 출생 후 하루 10-20 쥐 및 쥐19, 문화에서 만든 myelination 봉우리로 쥐 p7-9 (...

뇌의 백색 질은 신경 세포 축 삭은 수 초, oligodendrocytes에 의해 형성 된 특수 확장된 원형질 막에에서 싸여 구성 되어있습니다. Myelin는 신속 하 고 안정적인 활동 전위 전파 및 myelinated 축 삭의 장기 생존을 위한 필요 그리고 myelin의 손실 신경 장애를 일으킬 수 있습니다. 그들의 중요성에도 불구 하 고 oligodendrocytes의 속성은 덜 알려진 비교 신경와 이다. 따라서, 적은 도구 oligodendrocytes 공부에 대 한 개발 되었습니다.
라이브 셀 세포의 영상 같은 미토 콘 드리 아, endoplasmatic 그물 (응급실) 또는 다른 기공을 구조 유용할 수 있습니다 시간이 지남에 세포에서 동적인 변화를 공부 하. 전통적으로, 생활 oligodendrocytes의 이미징 monocultures1,2에서 수행 되었습니다. 그러나, 단에 oligodendrocytes 소형 myelin, 표시 되지 않습니다 그리고 organotypic 또는 급성 뇌 조각 있을 수 있습니다, 따라서, 더 나은 옵션 지역화 및 세포의 움직임을 공부 하는 경우. 작은 세포 myelin 칼 집에 있는 단백질의 지역화는 myelinated 축 삭과 주변 myelin 칼 집 사이 짧은 거리 때문에 전하실 수 있습니다. 따라서, 가벼운 현미경 immunostaining 절차 혼자 myelinated 축 삭에 myelin 칼 집에 세포 사이 차별을 공간 해상도 있지 않습니다. 이 셀 형식 관련 발기인에 의해 구동 세포 기관이 대상 형광 단백질을 위한 유전자와 바이러스 성 변환에 의해 해결 될 수 있습니다. 이점은 셀 및 스파스 식 세포 기관이 현지화 및 역학의 정확한 평가 가능 하 게 있다. 유전자 변형 동물 같은 한 세포 기관이 대상 셀 특정 식3을 달성 하기 위해 사용할 수 있습니다. 그러나, 생산 및 유전자 변형 동물의 유지 보수 비용이 이며 일반적으로 바이러스 성 방법으로 얻을 수 있는 스파스 식 제공 하지 않습니다.
설명 하는 방법을 여기 미토 콘 드 리아-타겟 형광 성 단백질 (dsred 또는 녹색 형광 단백질, GFP)와 oligodendrocytes (MBP-미토-dsred 또는 MBP-미토-GFP) 시각화를 myelin 기본적인 단백질 발기인에 의해 구동의 바이러스 성 변환 사용 organotypic에 있는 oligodendrocyte 미토 콘 드리 아 두뇌 조각. 또한, 다른 형광 단백질 (GFP 미토-dsred 함께 사용 또는 tdtomato 미토 GFP를 사용한) 세포질에서의 표현 myelin 칼 집의 세포질 구획을 포함 하 여 세포 형태학의 시각화를 가능 하 게 하는 데 사용 됩니다. 프로토콜은 organotypic 뇌 조각 (드 Simoni와 유, 20064,5설명 하는 프로토콜의 수정된 버전)를 만들기 위한 절차를 포함 됩니다. 우리는 다음 미토 콘 드 리아 운동 공부 시간 경과 이미징 절차를 설명 합니다. 이 절차는 영상 매체, 영상 중 마약 또는 다른 중간 변경의 쉬운 응용 프로그램을 가능 하 게 설정의 지속적인 교류와 직 립 confocal 현미경을 사용 합니다. 시간 경과 화상 진 찰 절차는 아래에 설명 된 살아있는 조각을 유지 하기 위한 몇 가지 여분의 장비와 함께 어떤 confocal 현미경에 수행할 수 있습니다. 프로토콜에는 이미지를 최적화 하 고 phototoxicity를 줄일 여러 팁을 포함 되어 있습니다.
마지막으로, 반사율 Confocal 현미경 검사 법 (코어)으로 흠 없는 수 초를 시각화 하는 빠르고 간단한 방법을 설명 합니다. 이 라이브 이미징 동안 myelin 칼 집을 식별 하려면 유용할 수 있습니다. 최근 몇 년 동안, 여러 기술을 어떤 얼룩 필요 없이 이미지 myelin를 개발 되었습니다 하지만 대부분의 필요 특정 장비 및 전문6,,78. 여기에 설명 된 절차 myelin 칼 집의 반사 속성을 사용 하 여 고 스펙트럼 Confocal 반사율 현미경의 단순화 된 단일 여기 파장 버전 (점수, 있는 몇몇 파장 레이저 결합 되어 수 초를 시각화) 9. 코어 488 nm 레이저와 470-500 nm 대역 방출 필터 또는 가변 배기 필터 어떤 confocal 현미경에서 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>아가로스&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 19G</td><td>BD</td><td>301500</td><td>목욕</td></tr><tr><td>바이옥사이드 가스</td><td>AGA</td><td>105701</td><td></td></tr><tr><td>브랜드 피펫 전구</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z615927</td><td>피펫 전구</td></tr><tr><td>분젠 버너 (액체 프로판 버너)</td> <td>VWR</td><td>89038-530</td><td></td></tr><tr><td>히터 컨트롤러 용 케이블 어셈블리</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0106&nbsp;</td><td>온도 조절기 - 온도계 부분</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fluka</td><td>21100</td><td></td></tr><tr><td>CO2&nbsp;</td><td>AGA</td><td>100309</td><td>CO2 인큐베이터용</td></tr><tr><td>커버 유리, 사각형 Corning</td><td>Thermo&nbsp; Fischer Scientific</td><td>13206778</td><td>라이브 이미징을 위해 수조 아래에 부착합니다. 접착제 또는 바트롤륨 젤리로 밀봉하십시오.</td></tr><tr><td>D-(+)-글루코스</td><td>시그마</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>섬세한 집게</td><td>Finescience</td><td>11063-07</td><td>해부용</td></tr><tr><td>다이아몬드 스크라이버 펜</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>54463</td><td></td></tr><tr><td>일회용 유리 파스퇴르 피펫 230mm</td><td>VWR</td><td>612-1702</td><td>유리 피펫</td></tr><tr><td>양날 스테인리스 스틸 면도날</td><td>전자 현미경 과학</td> <td>#7200</td><td>비브라톰용 면도날</td></tr><tr><td>Earle's Balanced Salt Solution(EBSS)</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>24010-043</td><td></td></tr><tr><td>여과지 서클</td><td>Schleicher & Schuell</td><td>300,220</td><td>PFA Fun</td></tr><tr><td>tack</td><td>Loctite</td><td>1270884</td><td>욕조의 인도어 및 아웃렛 위치를 연결/조정하는 데 사용</td></tr><tr><td>핸드 타월 C-Fold 2</td><td>Katrin</td><td>344388</td><td></td></tr><tr><td>Harp, RC-41 챔버용 플랫,</td> <td>워너 인스트루먼트</td><td>&nbsp; 64-1418</td><td>목욕에서 색종이 조각을 누르는 하프. 유기형 슬라이스와 함께 사용하기 전에 현을 잘라냅니다. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15</td></tr><tr><td>HEPES, FW: 260.3</td><td>Sigma</td><td>H-7006</td><td></td></tr><tr><td>Holten LaminAir, 모델 1.2</td><td>Heto-Holten</td><td>96004000M</td><td>층류 후드</td></tr><tr><td>말 혈청, 열 비활성화</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>LCR 막, PTFE,&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>FHLC0130</td><td>색종이 조각&nbsp;</td></tr><tr><td>Leica VT1200</td><td>Leica</td><td>14048142065</td><td>Vibratome</td></tr><tr><td>MEM-Glutamax with HEPES</td><td>Thermo&nbsp; Fischer Scientific</td><td>42360024</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>R.P. Normapur</td><td>25 108.295</td><td></td></tr><tr><td>Micro Spoon Heyman Type B</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62411-B</td><td>해부를 위한 끝이 뾰족한 작고 둥근 주</td></tr>걱 <tr><td>Millex-GP 필터 장치 Millipore</td><td></td><td>SLGPM33RA</td><td>주사기 필터 장치</td></tr><tr><td>밀리셀 세포 배양 인서트, 30 mm</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td>세포 배양 인서트</td></tr><tr><td>Minipuls 3 속도 제어 모듈</td><td>GILSON</td><td>F155001</td><td>라이브 이미징용 연동 펌프 - 제어 모듈 부품(2-캐널 헤드에 연결)</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fluka</td><td>71628</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta 표면</td><td>열&nbsp; Fischer Scientific</td><td>140675</td><td>Culture plate</td></tr><tr><td>Nystatin Suspension</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1638</td><td></td></tr><tr><td>Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC&nbsp;</td><td>자이스</td><td>441452-9900-000&nbsp;</td><td>라이브 이미징에 사용되는 Water Immersion Objective. (WD=2.5mm), VIS-IR</td></tr><tr><td>파라필름</td><td>VWR</td><td>291-1211</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드, 과립</td><td>전자 현미경 과학</td><td>#19208</td><td></td></tr><tr><td>PC-R 관류 챔버</td><td>SiSkiYou</td><td>&nbsp; 15280000E</td><td>라이브 이미징용</td></tr><tr><td>욕조 페니실린-스트렙토마이신, 액체</td><td>인비트로젠</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>페트리 디쉬 140 mm&nbsp;</td><td>Heger</td><td>1075</td><td>대형 페트리 접시&nbsp;</td></tr><tr><td>페트리 접시 92x16 mm&nbsp;</td><td>사르스테트&nbsp;</td><td>82.1473</td><td>미디엄 페트리 접시&nbsp;</td></tr><tr><td>페트리디쉬 55x14,2 mm</td><td>VWR</td><td>391-0868</td><td>소형 페트리 디쉬</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td>PBS 정제</td></tr><tr><td>R2 투 채널 헤드&nbsp;</td><td>GILSON</td><td></td><td>F117800 라이브 이미징용 연동 펌프 - 두 채널 헤드 부분(제어 모듈 필요)</td></tr><tr><td>원형/평면 주걱, 스테인리스 스틸</td><td>VWR</td><td>82027-528</td><td>해부용 대형 주걱</td></tr><tr><td>모래종이</td><td>VWR</td><td></td><td>MMMA63119 선택 사항, 깨진 유리 피펫 매끄럽게 하기 위해</td></tr><tr><td>가위,&nbsp; 17,5 cm</td><td>Finescience</td><td>14130-17</td><td>해부용 대형 가위</td></tr><tr><td>가위, 8,5&nbsp;</td><td>Finescience</td><td>14084-08</td><td>작고 날카로운 가위, 해부용</td></tr><tr><td>단일 가장자리, 보석 블레이드</td><td>전자 현미경</td> <td>Sciences#71972</td><td>단일 가장자리 면도날</td></tr><tr><td>단일 인라인 솔루션 히터 SH-27B</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>64-0102</td><td>온도 컨트롤러 - 히터 부품</td></tr><tr><td>Steritop-GP 필터 유닛, 500 ml, 45mm</td><td>Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td>살균 필터 솔루션</td></tr>: <tr><td>슈퍼 접착제, 정밀</td><td>록타이트</td><td>, 1577386</td><td></td></tr><tr><td>외과용 메스 블레이드 번호 22</td>, <td>Swann Morton Ltd.</td><td>209</td><td>둥근 메스 블레이드</td></tr><tr><td>온도 컨트롤러 TC324B</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>64-0100</td><td>실시간 이미징을 위한 온도 컨트롤러 (솔루션 히터 및 케이블 어셈블리 필요)</td></tr> <tr><td>Trizma 베이스</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Trizma HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>워터 재킷 인큐베이터 시리즈 II</td><td>Forma Scientific</td><td>78653-2882</td><td>인큐베이터</td></tr></tbody></table>

시각화 및 adeno 관련 바이러스 및 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 organotypic 뇌 조각에서 oligodendrocyte 세포의 라이브 영상

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

전기 절연 및 myelinating oligodendrocytes의 영양 지원에 의존 하는 신경. Oligodendrocytes의 중요성에도 불구 하 고 현재 뉴런, 공부 하는 데 사용 하는 고급 도구 oligodendrocyte 연구원 촬영 부분적으로 있다. 셀 형식-특정 바이러스 성 변환에 의해 얼룩 라이브 세포 기관이 역학을 공부 하는 유용한 접근 이다. 이 문서 변환 adeno 관련 바이러스 (AAV)의 transcriptional 통제 미토 콘 드 리아 타겟된 형광 단백질을 위한 유전자를 나르는 여 organotypic 뇌 조각에서 oligodendrocyte 미토 콘 드리 아를 시각화에 대 한 프로토콜 설명 myelin 기본적인 단백질 발기인입니다. Organotypic 코로나 마우스 뇌 조각을 만들기 위한 프로토콜을 포함 합니다. 다음에 미토 콘 드리 아의 시간 경과 영상에 대 한 절차는 다음과 같습니다. 이러한 메서드는 다른 세포로 옮겨질 수 있다 그리고 세포 myelin 칼 집에서 공부 하는 데 특히 유용 수 있습니다. 마지막으로, 반사율 Confocal 현미경 검사 법 (코어)에 의해 생활 조각에 흠 없는 myelin의 시각화에 대 한 쉽게 사용할 수 있는 기술을 설명합니다. 코어 불필요 한 장비를 필요 하며 라이브 이미징 동안 myelin 칼 집을 식별 하려면 유용할 수 있습니다.

경작 하 고 위에서 설명한 대로 불리고 Organotypic 뇌 조각 대뇌 피 질의 oligodendrocytes mito_dsred와 GFP의 스파스 배포를 보였다. Olig2와 MBP에 대하여 항 체와 Immunostaining 확인 식 oligodendrocytes (그림 1)를 특정 했다.
라이브 이미징, 불리고 oligodendrocytes 병렬 (그림 1 및 그림 2A)에서 실행 되는 여러 myelin 칼 집의 그들의 독특한 형태에 의해 인식 되었다. Transduced oligodendrocytes에 영상 시간 경과 수행 하 여 기본 프로세스 및 myelin 덮개 (<strong class="...

Myelinating oligodendrocytes는 급속 한 활동 전위 전파 및 신경 생존을 촉진합니다. 여기에 설명 된은 organotypic에 형광 단백질의 oligodendrocyte 특정 식에 대 한 프로토콜 후속 시간 경과 화상 진 찰과 뇌 조각입니다. 또한, 흠 없는 수 초를 시각화에 대 한 간단한 절차 제공 됩니다.

시각화 및 Adeno 관련 바이러스 및 Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 Organotypic 뇌 조각에서 Oligodendrocyte 세포의 라이브 영상

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

본 바이러스 형질전환 및 타임랩스 기록의 전체적인 목표는 기관 배양 뇌 절편 내 희소돌기아교세포 미토콘드리아의 이동을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 희소돌기아교세포와 그 소기관들이 국소 환경의 변화에 어떻게 반응하는지와 같은 희소돌기아교세포 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 모든 다양한 뇌 세포가 존재하고 희소돌기아교세포가 조밀한 수초를 형성하는 표본 내에서 희소돌기아교세포의 구조와 소기관 역학에 대한 상세한 정보를 제공한다는 점입니다. in vitro 7일 차의 절편 배양물 내 희소돌기아교세포를 형질전환하십시오. 먼저 절편당 1.3 µL의 희석된 AAV를 흡입합니다. 피펫 팁 외부는 건조한 상태인지 확인하고, 피펫 팁이 절편에 닿지 않도록 최대한 가깝게 피질 위에 유지하면서 용액을 천천히 밀어냅니다. 용액이 절편에 닿으면, 피펫 팁을 피질 위로 이동시켜 용액이 전체 피질 영역에 퍼지도록 합니다. 한 접시 내의 모든 절편이 형질전환되면 접시를 배양기에 넣고 다른 접시들에 대해서도 이 과정을 반복합니다. 형광 마커의 발현 여부를 확인하고, 형광 마커의 발현 수준이 충분하며 절편이 건강해 보일 때 절편을 촬영합니다. 45도 각도로 구부러진 주사바늘을 고정하기 위해 모델링 클레이를 사용하여 이미징 배스(imaging bath) 설정을 시작하십시오.

visualization-live-imaging-oligodendrocyte-organelles-organotypic

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기서 우리는 시각 피질의 뉴런과 glia의 형광 라벨에 대한 AAV 벡터의 intracranial 주사를 제시한다.

Adeno - 관련 바이러스성 벡터의 Intracranial 분사

이 프로토콜은 주동이의 철새 스트림에서 출생 후의 두뇌와 neuroblast 마이 그 레이션의 고해상도 시간 저속 영상에 최적화된 organotypic 슬라이스 분석을 설명합니다.

출생 후의 두뇌에의 연결을 마이 그 레이션의 고해상도 시간 경과 이미징을위한 Organotypic 슬라이스 분석

출처: Kennedy, L. H., et. al. 아데노 관련 바이러스 및 컨포칼 현미경을 사용한 유기형 뇌 절편에서 희소돌기아교세포 소기관의 시각화 및 라이브 이미징. J. Vis. Exp. (2017)이 비디오는 유기형 마우스 뇌 절편에서 희소돌기아교세포 미토콘드리아의 이미징을 보여줍니다. 슬라이스는 지속적인 유체 순환과 온도 조절이 가능한 수조 챔버 내부에 배치됩니다. 컨포칼 현미경의 다양한 매개변수를 설정한 후 적색 형광을 가진 미토콘드리아의 타임 랩스 이미지를 캡처한 다음 녹색 형광을 가진 희소돌기아교세포의 Z 스택 이미지를 캡처합니다.

Organotypic Brain Slice Cultures에서 희소돌기아교세포 내 미토콘드리아 운동의 공초점 이미징

출처: Moye, S. L., et.al.  Lucifer Yellow Iontophoresis를 사용한 성상세포 형태 시각화. J. Vis. Exp. (2019).  이 비디오는 고정된 뇌 절편에서 성상세포 형태를 연구하기 위해 형광 염료 이온 영동을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 연구는 저전압 전류 하에서 음이온성, 친수성 염료를 세포질로 전달하기 위해 전극으로 성상세포체(astrocyte soma)를 뚫는 방법을 자세히 설명하여 염료가 체세포(soma)와 가지를 확산시키고 표지할 수 있도록 합니다. 그런 다음 컨포칼 현미경을 사용하여 표지된 성상세포를 시각화하여 형태학적 통찰력을 제공합니다.

Visualizing Astrocyte Morphology Using Fluorescent Dye Iontophoresis in a Fixed Mouse Brain Slice

전뇌와 소뇌의 슬라이스 배양 시스템을 사용하여 NG2 세포와 희소돌기아교세포를 연구하는 기술에 대해 설명합니다.  이 방법을 사용하면 조직 세포 구조를 유지하면서 세포 외 환경을 쉽게 조작할 수 있는 희소돌기아교세포 계통 내에서 세포의 증식 및 분화 역학을 조사할 수 있습니다.

Organotypic 슬라이스는 문화 희소 돌기 아교 세포 역학 및 수초화을 공부하기

염증성 탈수초성 질환의 피질 병변에서 탈수초화 및 신경 세포 사멸의 메커니즘을 다루기 위해 다양한 동물 모델이 사용됩니다. 여기에서는 뇌 절편에 희소돌기아교세포 특이적 CD8+ T 세포를 사용하여 희소돌기아교세포 및 신경세포 사멸을 초래하는 생체 외 접근법을 설명합니다. 모델의 잠재적인 응용 프로그램 및 제한 사항에 대해 설명합니다.

생체 내 급성 뇌 조각의 희소 돌기 아교 세포 지시 T 세포 공격의 모델

제시 여기 경작 하는 수정 된 롤러 튜브 방법 이며 photoetched coverslips에 정확한 위치와 많은 주 동안 설치류 두뇌의 간헐적인 고해상도 이미징 조각. 신경 생존 및 슬라이스 형태로 잘 유지 됩니다. 셀 형 특정 식에 대 한 바이러스를 사용 하 여이 완전히 동봉 된 시스템의 응용 프로그램에 제공 됩니다.

정확 하 게 지역화 하 고 반복적인 뇌 조각 동봉 된 시스템에서의 장기적인 문화 중 간헐적인 이미징 수정된 롤러 튜브 메서드

우리는 마우스 전뇌의 오르노티픽 슬라이스 배양에서 유전자 로 코딩된 FRET 기반 센서 ATeam1.03YEMK의 세포 형 특이적 발현에 대한 프로토콜을 기술한다. 또한, 우리는 뉴런과 성상 세포에서 세포 ATP 수준의 동적 이미징을 위해이 센서를 사용하는 방법을 보여줍니다.

FRET 기반 센서 ATeam1.03YEMK를 사용하여 마우스 뇌의 오르가노티픽 조직 슬라이스에서 세포 내 ATP 이미징

여기에서, 우리는 시간 경과 공초점 현미경에 의해 산후 마우스 망막 외식편에서 신경돌기 형태 형성을 조사하는 방법을 제시한다. 우리는 Cre 의존성 방식으로 막 표적화된 형광 단백질을 발현하는 재조합 아데노-관련 바이러스 벡터를 사용하는 망막 세포 유형의 희소 표지 및 획득 및 이들의 미세 공정에 대한 접근법을 기술한다.

유전자 표적화된 망막 세포 집단의 희소 아데노-연관 바이러스 표지를 이용한 뉴런 수목화의 타임랩스 이미징

여기에서 우리는 깨어 있는 마우스에서 소교세포 역학과 신경 활동의 동시 이미징을 위해 아데노 관련 바이러스 주입과 두개골 창 이식을 결합한 프로토콜을 설명합니다.

깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

배우세요 아데노 관련 바이러스를 이용한 올리고덴드로사이트 특이적 형광 단백질 발현 및 공초점 현미경을 활용한 오가노타이픽 뇌 조각의 실시간 영상 기법. 이 방법은 미토콘드리아 동역학과 세포 반응을 연구하는 데 활용됩니다.

시각화 및 Adeno 관련 바이러스 및 Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 Organotypic 뇌 조각에서 Oligodendrocyte 세포의 라이브 영상

더 많은 동영상 탐색