조사 Trypanosoma cruzi 운동 비보 를 동물 모델로 서 애벌레 Zebrafish의 설립

이 절차의 전반적인 목표는 제브라피시를 트리파노소마 크루지 운동성을 연구하기 위한 생체 내 모델로 확립하는 것입니다. 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi)는 샤가스병을 일으키는 기생충입니다. 이 질병은 방치된 열대성 질병으로, 주로 라틴 아메리카와 미국의 일부 지역에서 매개체를 통해 전염됩니다.

기생충은 감염 부분을 포함하는 매개체 대변을 통해 인간에게 전염된 다음 숙주 세포에서 복제됩니다. 편모 운동은 기생충이 몸 속을 이동할 수 있도록 합니다. 그러나 그것은 또한 세포 침입에서 애착을 위해 필수

Trypanosoma cruzi에 의한 생체 내 감염 모델은 주로 설치류에서 발생합니다. 불투명도를 가르치는 것은 동물 내부의 기생충을 따라가는 것을 복잡하게 만듭니다. 지금까지 기생충 운동성은 체외(in vitro) 연구에서만 이루어졌기 때문에 생체 내 모델을 통해 유동 조건에서 기생충 이동의 주요 측면을 이해할 수 있습니다.

대안 모델을 찾고 있던 중, 우리는 제브라피시 유충을 발견했다. 제브라피시 유충은 생체 내에서 숙주 병원체 상호 작용을 연구할 수 있는 강력한 모델입니다. 그들은 쥐에 비해 작고 저렴하며 키우기가 매우 쉽습니다.

연구에서 매우 중요한 것은 그들의 면역 체계가 인간과 매우 유사하다는 것입니다. 그들의 적응 면역 체계는 수정 후 4일이 지나야 발달하기 시작하고 그 후 4주까지 성숙하기 때문에 면역 간섭 없이 일할 수 있는 매우 넓은 창을 제공합니다. 그러나 우리 연구에서 제브라피쉬의 가장 큰 장점은 광학적 투명성입니다.

따라서 현미경 스크리닝 및 이미징에 이상적인 모델입니다. 이것은 물고기를 유전적으로 조작하는 모든 기술과 사용 가능한 모든 형질전환 및 돌연변이 계통과 결합하여 실제로 연구할 수 있는 많은 가능성을 제공합니다. 이 비디오에서는 색소 침착이 없어 완전히 투명한 캐스퍼 계통의 돌연변이 유충을 사용하여 생체 내에서 T.cruzi 기생충을 시각화하는 방법을 보여줄 것입니다.

이 제브라피쉬의 내부를 시각화하기 위해 우리는 광시트 형광 현미경을 사용합니다. 광시트 형광 현미경 검사는 검출 대물렌즈의 초점면만 비추는 일련의 기술입니다. 그 결과 전경이나 배경에 빛이 없으며 이로 인해 배아 내부 깊숙한 곳에서도 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다.

관심 있는 샘플의 일부만 조명이 비춰지기 때문에 샘플의 사진 손상이 훨씬 적고 장시간 동영상을 촬영할 수 있습니다. 여기에서는 제브라피시 유충 내부의 살아있는 T.cruzi 기생충을 시각화합니다. 광시트의 특성으로 인해 컨포칼 현미경과 관련하여 멋진 공간 및 시간 해상도로 고속 비디오를 촬영할 수 있습니다.

우리가 아는 한, 살아있는 트리파노솜은 살아있는 유기체 내부에서 시각화된 적이 없습니다. 주사 3일 전에 건강한 수컷 물고기와 암컷 물고기 한 쌍 또는 수컷 한 마리와 암컷 두 마리를 번식 탱크에 넣어 총 알 생산량을 늘리십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 작은 여과기를 사용하여 생성된 알을 수집합니다.

여과기를 뒤집고 여과기를 통해 계란물을 페트리 접시에 부어 계란을 씻어냅니다. 배아를 건강하게 유지하려면 전사 플라스틱 피펫으로 찌꺼기나 수정되지 않은 난자를 제거하여 물을 청소하십시오. 다음으로, 배아를 섭씨 28도의 인큐베이터에 넣고 3시간마다 세척 절차를 반복하여 생존 불가능한 난자를 버리고 클러치를 건강하게 유지합니다.

수정 후 48시간 또는 이틀이 지나면 대부분의 배아가 부화했는지 확인합니다. 그러나 필요한 경우 두 개의 날카로운 집게로 융모막의 반대쪽 끝을 잡고 한쪽 끝을 부드럽게 당겨 열어 입체경 아래의 배아를 제거한다. 전사 피펫을 사용하여 물에서 융모막을 제거합니다.

주사를 위해 먼저 얇은 벽 유리 모세관과 마이크로 피펫 극성 장치를 사용하여 1mm 바늘을 준비합니다. 밀봉된 바늘을 모델링 점토 스트립의 페트리 접시에 보관하십시오. 미세 사출 금형을 만들려면 증류수에 1.5% 아가로스 용액을 준비하고 페트리 접시에 붓습니다.

그런 다음 아가로스 위에 조립식 유충 미세사출 금형을 놓고 평평한 표면 위에 실온에서 완전히 응고되도록 합니다. 미세 사출 금형을 들어 올리고 물을 추가하여 섭씨 4도에서 보관하십시오. 이것은 아가로스가 마르는 것을 방지합니다.

양의 트리카인 스톡에 달걀 물을 첨가하여 최종 농도가 리터당 150mg이 되도록 마취액을 준비합니다. 용액을 섭씨 4도에서 보관하십시오. 마지막으로, 저융점 아가로스 분말을 달걀 물에 최종 농도 1%로 용해시켜 이미징을 위한 저융점 아가로스 스톡을 준비합니다.아가로스 용액이 균일하게 나타날 때까지 혼합물을 가열하고 1.5ml 반응 튜브에 4도의 분취액을 보관합니다.

기생충은 Trypanosoma cruzi 01/DA isolate에서 얻어지며 인간 성상세포종 세포주에서 배양되고 T25 플라스크를 사용하여 완전한 배지가 보충됩니다. 3-4일간의 배양 후 세포에서 기생충이 터져 나오고 상층액에서 트리포마스티고테를 수집할 수 있습니다. 이 상층액을 5분 동안 원심분리하고 펠릿을 태아 송아지 혈청과 함께 1X PBS에 부드럽게 재현탁합니다.

그런 다음 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버리고 PBS 1밀리리터에 재현탁합니다. Neubauer 챔버에서 자유롭게 수영하는 기생충을 세기 위해 10 마이크로 리터를 가져 가십시오. 나머지 부유 기생충을 취하고 1 마이크로 리터의 CFSE를 첨가하고 실온에서 10 분 동안 배양합니다.

다음으로 PBS를 추가하여 10밀리리터를 완성합니다. 5분 동안 원심분리기를 하고, 상층액을 버리고, 표지된 기생충이 포함된 펠릿을 100마이크로리터의 PBS에 재현탁합니다. 이 라벨링 절차 후에는 거꾸로 된 형광 현미경에서 기생충을 직접 시각화하여 기생충이 살아 있고 적절하게 라벨링되었는지 확인하는 것이 중요합니다.

투과광 모드에서 기생충이 움직이는지 확인하십시오. 형광 모드에서는 feet-see 필터를 사용하여 기생충 표지를 평가합니다. 먼저 마이크로로더 피펫 팁을 사용하여 밀봉된 유리 바늘에 기생충이 포함된 용액 10마이크로리터를 로드합니다.

그런 다음 유리 바늘을 마이크로 매니퓰레이터의 바늘 홀더에 삽입합니다. 입체경 아래에서 가는 집게를 사용하여 바늘 끝에서 약 5mm를 자릅니다. 다음으로, 수정 후 48시간 동안 트리카인 용액에서 유충이 접촉에 반응하지 않을 때까지 마취합니다.

아가로스 플레이트에 있는 유충을 입체경 아래 측면 위치에 놓습니다. 바늘 끝이 유충의 노른자 중앙에 오도록 미세 조작기를 조정합니다. 마이크로인젝터 매개변수를 설정합니다.

노른자의 혈액 순환 계곡에 물고기를 주입하십시오. 심장이 뛰고 있는지 확인하고 유충을 즉시 신선한 달걀 물로 옮겨 회복하십시오. 주입된 배아를 빈 페트리 접시에 옮기고 플라스틱 피펫과 흡수성 종이로 주변 물을 조심스럽게 제거합니다.

즉시 약 100마이크로리터의 예열된 1%낮은 융점 아가로스를 첨가하여 배아를 덮습니다. 아가로스가 섭씨 40도를 넘지 않는지 확인하십시오. 유리 모세관 내부에 직선 와이어를 삽입하고 배아를 수직 위치로 들어 올리는 플런저로 사용합니다.

이것은 아가로스가 응고되기 전에 빨리 수행해야 합니다. 아가로스를 흡수하는 동안 배아 위에 아가로스를 약간 남겨두고 굳을 때까지 기다립니다. 필요한 경우 배아 아래에 있는 여분의 아가로스를 밀어내고 잘라냅니다.

시료 챔버를 트리카인 용액으로 채우고 시료 챔버 온도를 섭씨 28도로 설정합니다. 다음으로, 현미경 샘플 홀더에 배아가 포함된 모세관을 삽입하고 micromanipulator 스테이지에 놓습니다. 배아가 들어 있는 끝을 자유롭게 매달릴 때까지 밀어냅니다.

투과광 모드에서는 XYZ micromanipulator 시스템과 회전 스테이지를 사용하여 감지 대물렌즈의 동공 앞에 샘플을 배치하여 수직 축을 중심으로 회전합니다. 먼저 모세 혈관의 경계에 초점을 맞춘 다음 배아와 심장 또는 혈관 구조와 같은 관심 구조를 찾기 위해 이동하는 것이 유용합니다. 이제 488 나노미터 또는 이와 유사한 파장의 레이저를 사용하여 형광 모드로 변경하고 조명 강도와 노출 시간을 조정하여 광 표백을 줄이고 시간 해상도를 최적화합니다.

이를 위해서는 개구수가 좋은 대물렌즈를 선택해야 합니다. 관심 영역의 비디오 획득을 시작합니다. 우리의 경우 기생충이 판막에 부착되어 심장 부위를 자유롭게 이동하는 것이 관찰됩니다.

시간이 지남에 따라 단일 평면의 비디오를 촬영하거나 마이크로 매니퓰레이터 또는 Piezo 및 galvo 시스템을 사용하여 다른 평면에 초점을 맞추고 기생충의 움직임을 추적하는 것이 좋습니다. 획득이 완료되면 가는 집게와 모발 고리 도구를 사용하여 아가로스에서 배아를 조심스럽게 제거합니다. 생선을 깨끗한 달걀 물에 다시 옮기고 15분 동안 회복을 확인합니다.

그런 다음 기관의 표준 프로토콜에 따라 폐기하십시오. 여기에 제시된 모든 절차에는 수정 후 48시간 배아가 사용되었습니다. 기생충을 접종하기 위해 다양한 해부학적 부위를 사용할 수 있지만, 큐비에의 난황낭 또는 관의 혈액 순환 계곡은 심혈관계에 주사하고 접근하는 가장 빠르고 쉬운 부위입니다.

트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi)를 큐비에관에 주입한 후 8분에서 10분 이내에 발달 중인 심혈관계에서 기생충이 관찰됩니다. 일부 기생충은 배아 난황낭의 벽이나 방실 판막과 같은 심장 구조에 붙어 있습니다. 기생충은 심장 수축과 함께 진동하는 것으로 보이며, 이는 효과적인 순응 메커니즘을 보여줍니다.

또한 기생충은 심낭 공간과 혈관에서 적혈구와 같은 방향으로 혈류와 함께 떠다니는 것을 볼 수 있습니다. 우리가 개발한 방법은 투명한 제브라피시 유충 내에서 T.cruzi 기생충의 생체 내 관찰을 가능하게 합니다. 이는 살아있는 척추 동물 유기체의 혈액 및 심장 구조를 통한 운동성과 같은 병원체의 역학을 시각화하고 분석하는 데 매우 유용할 수 있습니다.

자유 수영 기생충을 보기 위해 주입과 시각화 사이의 시간을 짧게 유지하는 것이 중요합니다. 또한 광시트 현미경을 사용하는 동안 획득 매개변수를 최적화하여 사진 손상을 줄이면서 여전히 우수한 품질의 이미지를 얻는 것이 중요합니다. 제브라피시 유충에 T.cruzi microinjection은 혈류에 기생충을 접종하는 효과적인 기술입니다.

이 방법에서는 기생충의 CFC 라벨링이 물고기 내부의 기생충을 명확하게 시각화할 수 있는 실용적인 절차임을 확인했습니다. 큐비에 관에 주입하는 것은 기생충이 순환을 거치도록 하는 부드러운 방법입니다. T.cruzi는 심장의 판막과 물고기의 큰 혈관에 달라붙는 경향이 있습니다.

그러나 우리의 실험에 따르면 세포 감염은 없습니다. tro-pez-ee를 밝히기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.