Name: 포유류 세포에 있는 바닥 상태 고갈 슈퍼 해상도 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-05T08:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 배우세요 포유류 세포에서 바닥 상태 고갈 초고해상도 현미경을 이용하여 세포막 단백질을 시각화하고 정량화하는 방법입니다. 이 기술은 기존 형광 현미경보다 약 10배 높은 해상도로 세포 생물학 및 막 생물물리학 연구에 필수적인 도구입니다.

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이 작업은 R.E.D. (15SDG25560035)에 AHA에서 교부 금에 의해 지원 되었다. 저자 박사 페르난도 산타나 그의 Leica SR GSD 3D 현미경의 사용을 위해 친절 하 게 제공 FP1 항 체에 대 한 박사 요하네스 지옥 인정 하 고 싶습니다.

<ol><li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).</li>
<li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+structured-illumination+microscopy%3A+wide-field+fluorescence+imaging+with+theoretically+unlimited+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).</li>
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<li>Hell, S. W., Kroug, M. <a target="_blank" href="http://www3.mpibpc.mpg.de/groups/hell/publications/pdf/Appl._Phys._B._60_495_497.pdf">Ground-state-depletion fluorscence microscopy: A concept for breaking the diffraction resolution limit.</a> JAppl Phys B. 60 (5), 495-497 (1995).</li>
<li>Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+barrier+in+fluorescence+microscopy+by+optical+shelving%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving.</a> Phys Rev Lett. 98 (21), 218103(2007).</li>
<li>Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptional+profiling+of+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes.</a> J Vis Exp. (58), e3302(2011).</li>
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<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li>
<li>Chozinski, T. J., Gagnon, L. A., Vaughan, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twinkle%2C+twinkle+little+star%3A+photoswitchable+fluorophores+for+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Twinkle, twinkle little star: photoswitchable fluorophores for super-resolution imaging.</a> FEBS Lett. 588 (19), 3603-3612 (2014).</li>
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<li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Imaging+Conditions+for+Demanding+Multi-Color+Super+Resolution+Localization+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), e0158884(2016).</li>
<li>Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ThunderSTORM%3A+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li>
<li>Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+optical+reconstruction+microscopy-based+relative+localization+analysis+%28STORM-RLA%29+for+quantitative+nanoscale+assessment+of+spatial+protein+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).</li>
<li>Ries, J., Kaplan, C., Platonova, E., Eghlidi, H., Ewers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+versatile+method+for+GFP-based+super-resolution+microscopy+via+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple, versatile method for GFP-based super-resolution microscopy via nanobodies.</a> Nat Methods. 9 (6), 582-584 (2012).</li>
<li>Dixon, R. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4360655/">Graded Ca2+/calmodulin-dependent coupling of voltage-gated CaV1.2 channels.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).</li>
<li>Nan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+superresolution+imaging+allows+quantitative+analysis+of+RAF+multimer+formation+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18519-18524 (2013).</li>
<li>Fricke, F., Beaudouin, J., Eils, R., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One%2C+two+or+three%3F+Probing+the+stoichiometry+of+membrane+proteins+by+single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">One, two or three? Probing the stoichiometry of membrane proteins by single-molecule localization microscopy.</a> Sci Rep. 5, 14072(2015).</li>
</ol>

저자는 공개 없습니다 경쟁 관심사 있다.

회절 한계를 넘어 이미지를 허용 하는 기술의 최근 폭발 공간과 시간에서 신호 하는 포유류 세포의 복잡성에 새로운 윈도우를 제공 했다. 이러한 기술에는 폭풍, 호텔 위치, 팜, GSD, 시뮬레이션, 및 그들의 이체 (예를 들어, dSTORM, FPALM) 포함 됩니다. 이러한 기술 뒤에 과학자의 독창성 빛의 회절을 경 세 하는 물리학의 법칙에 의해 부과 된 한계를 우회 하 것을 허용 했다. 이 거 대 한 성취에도 불구 하 고 이러한 기술 각각을 슈퍼 해상도 달성 하기 위해 타협의 어떤 종류 하 게 있으며, 따라서, 한계가 있습니다. 세포 생물학과 biophysicists 노력에 대 한 이상적인 상황 최적의 감도, 높은 해상도 빠른 인수, 아니 photobleaching입니다. 또한, 하나는 동물에서 세포를 제거 하 여 우리가 본질적으로 그들을 변경 하 고 잠재적으로 분자 역학을 변경 인식 하 고 있어야 합니다. 따라서, 수 동적, 수퍼 해상도 기술 개발 퀘스트 라이브 셀, 생활, 동물 호흡에서 단일 분자 이미징에 ...

셀룰러 신호 반응 번역 세포질 응답을 시작 하는 내부 및 외부 환경 변화. 그들은 인간의 생리, 호르몬 및 신경 전달 물질 방출, 심장 박동, 시각, 수정, 및 인지 기능에 대 한 기초로 제공의 모든 측면을 통제 한다. 이러한 신호 폭포의 병 태 생리 조건 암, 알 츠 하이 머 병, 파 킨 슨 병, 등의 형태로 심각한 결과 가질 수 있습니다. 수십 년 동안, 생물학과 의학 조사자 이용 형광 단백질, 프로브, 바이오 센서는 형광 현미경 기본 도구로 결합 세포 이들의 정확한 공간과 일시적인 조직 이해 하 신호입니다.
Epifluorescence, confocal, 또는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 등의 광학 기술의 힘은 그들의 감도, 속도, 및 라이브 셀 이미징, 주요 한계는 호환 그들의 회절 제한 된 해상도, 의미 구조 또는 200-250 nm 보다 작은 단백질 복합물은 확인할 수 없습니다. 결정적 슈퍼 해상도의 이론적이 고 실용적인 개발 (예를 들면, 자극된 방출 소모 현미경 (호텔 위치1), 구조화 조명 현미경 (SIM2) 또는 확률론 슈퍼 해상도 (예: , photoactivated 지역화 현미경 (팜3), 또는 바닥 상태 고갈 (GSD4,5)), 측면 및 축 해상도 형광 현미경 검사 법의 순서를 회절 방 벽을 넘어 확장 되었습니다 나노미터의 수 만입니다. 따라서, 조사자는 지금 시각화 하 고 단백질 역학과 조직 근처 분자 수준에서 기능을 변환 하는 방법을 이해 탁월한 기능이 있다.
바닥 상태 고갈 현미경 개별 분자 반환 뒤 (GSDIM), 또는 단순히 GSD로 알려져 있다 circumvents 회절 제한 fluorophores4,5를 동시에 방출의 수를 줄임으로써. 높은 에너지 레이저 빛 fluorophore 분류 샘플, 광자와 전자를 폭격 하 고 확률 그들은 ' 스핀 플립 '을 받게 되며4상태 삼중 항 또는 ' 어두운 상태 '를 입력 증가 자극 하는 데 사용 됩니다. 이 효과적으로 접지 상태를 고갈 시킨다, 그러므로 이름 '그라운드 상태 고갈'. Triplet 상태에 fluorophores 광자를 방출 하지 않는 하 고 샘플 주차 나타납니다. 그러나, 이러한 fluorophores 확률론 바닥 상태를 반환 하 고 triplet 상태에 반환 하기 전에 접지 흥분 상태 전환을 방출 하는 여러 광자를 통해 갈 수 있다. 적은 fluorophores 방출 어떤 주어진된 시간에, 함께 포 톤 버스트 fluorophores 이웃 공간 및 일시적으로 구분 되는 개별 fluorophores에서 방출. 광자의 버스트 가우스 기능, 렌즈, 사용 하는 빛의 파장의 수 가늠 구멍 (NA)에 종속 되는 지역화 정밀 fluorophore의 위치에 해당 하는 계산된 중심으로 들어갈 수 있는 여기 고 결정적인, fluorophore 당 방출 된 광자의 수. GSD에의 한 제한, fluorophores의 하위 집합만 적극적으로 언제 든 지 방출, 이후 이미지 수천을 수집 해야 합니다 완전 한 현지화 지도를 만들려고 몇 분 동안 이다. 높은 레이저 전원 요구와 함께 긴 수집 시간 GSD 라이브 샘플 보다 고정에 적합 한 더 나은 의미 합니다.
이 문서에서는 설명 합니다 막 및 바인딩과 그물 (ER)의 슈퍼 해상도 현미경 이미징에 대 한 고정된 샘플의 준비-상주 단백질 (필요한 소모품 및 시 약 참조 테이블의 재료의 목록)에 대 한. 어떻게이 프로토콜 쉽게 계량 크기와 L 유형 전압-문이 캘리포니아2 + 채널 (Cav1.2) 심장 myocytes의 sarcolemma에서의 클러스터링의 정도에 적응 하거나 수는 응급실의 세포 분포를 시각화 하는 데 사용의 예 시연 됩니다. 개시, 번역, 그리고 궁극적으로 많은 캘리포니아2 +의 기능 이해에 매우 중요 하다는 유통 및 이러한 세포 구성 성분의 이해-종속 신호 폭포. 예를 들어 Cav1.2 채널은 흥분 수축 연결, 수용 체-중재 Ca2 + 출시는 응급실에서 아마도 포유류 세포에서 가장 유비 쿼터 스 신호 폭포는 근본적으로 중요 합니다.

<table><tbody><tr><td>KOH</td><td>Thermo Scientific</td><td>P250-500</td><td>커버 글라스</td></tr>#<tr><td>1.5 커버 글라스 18 x 18 mm</td><td>Marienfeld Superior</td><td>0107032)</td><td>세포 성장/가공/이미징</td></tr><tr><td>10x</td><td>PBS Thermo Scientific</td><td>BP3994</td><td>탈이온수로 1배로 희석</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P4832</td> 유리 라미닌<td></td></tr><tr><td></td><td>을 커버하기 위한 세포 접착 보조Sigma</td><td>114956-81-9</td><td>유리를 덮는 세포 접착 보조</td></tr>제 <tr><td>Medium 199</td><td>Thermo Scientific</td><td>11150-059</td><td>심실 근세포 배양 배지</td></tr><tr><td>DMEM 11995</td><td>Gibco</td><td>11995</td><td>Cell culture media</td></tr><tr><td>Fetal bovine Serum (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>10437028</td><td>배지 보충제</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>배지 보충제</td></tr><tr><td>: 0.05 % 트립신 -EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-CL</td><td>세포 배양 용액</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Transient transfection 시약</td></tr><tr><td>Ca2 + - free PBS</td><td>Gibco</td><td>1419-144</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>100 % 메탄올</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A414-4</td><td>세포 고정</td></tr><tr><td>파라 포름 알데히드</td><td>전자 Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Cell Fixation</td></tr><tr><td>글루타르알데히드</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SLBR6504V</td><td>Cell Fixation</td></tr><tr><td>SEAblock</td><td>Thermo Scientific</td><td>37527</td><td>BSA 또는 기타 차단 솔루션 대안</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>세포 투과를 위한 세제</td></tr><tr><td>Rabbit anti-CaV1.2 (FP1)</td><td>선물</td><td>N/A</td><td>Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003)</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-RFP</td><td>Rockland Inc.</td>와 같은 상용 항-CaV1.2 항체가 존재합니다.<td>200-301-379</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L)</td><td>Invitrogen (Thermo Scientific)</td><td>A31573</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 염소 anti-mouse IgG (H+L)</td><td>Invitrogen (Thermo Scientific)</td><td>A11031</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>시료 장기 보관을 위한 미생물 성장 방지</td></tr><tr><td>카탈라아제</td><td>시그마</td><td>C40</td><td>광스위칭 완충액 성분</td></tr><tr><td>포도당 산화효소</td><td>시그마</td><td>G2133</td><td>광스위칭 완충액 성분</td></tr><tr><td>트리스</td><td>시그마</td><td>T6066</td><td>광스위칭 완충액</td></tr><tr><td>성분 베타-메르캅토에틸아민 염산염</td><td>피셔</td><td>BP2664100</td><td>광스위칭 완충액 성분</td></tr><tr><td>&베타;-메르캅토에탄올</td><td>시그마</td><td>63689</td><td>광스위칭 버퍼 성분</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td>광스위칭 완충 성분</td></tr><tr><td>덱스트로스</td><td>피셔</td><td>D14-212</td><td>광스위칭 완충 성분</td></tr><tr><td>유리 우울증 슬라이드</td><td>Neolab</td><td>1 &ndash; 6293</td><td>샘플 마운트</td></tr><tr><td>Twinsil</td><td>Picodent</td><td>13001000</td><td>커버 유리</td></tr><tr><td>밀봉 sec61&beta;- mCherry 플라스미드</td><td>Addgene</td><td>49155</td><td></td></tr><tr><td>Leica SR GSD 3D 현미경</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>세척 블록 용액</td><td></td><td></td><td>PBS의 20 % SEA 블록</td></tr> 1 <tr><td>차 항체 배양 용액</td><td></td><td></td><td>0.5 % Triton-X100, 20 % SEA 블록, PBS</td></tr><tr><td>2 차 항체 배양 용액</td><td></td><td></td><td>PBS의 1:1000</td></tr></tbody></table>

포유류 세포에 있는 바닥 상태 고갈 슈퍼 해상도 영상

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

형광 현미경 검사 법 및 세포 생물학에서 발전은 밀접 하 게 연관는 향상 된 셀룰러 이벤트 자주 하는 방법에 대 한 우리의 이해에 극적인 도약 선도 시각화 하는 기능 세포 기능. 개발 및 슈퍼 해상도 현미경의 상당 하 게 확장 했다 광학 해상도의 한계 ~ 250-20에서 nm. 생물학은 colocalization 회절 제한 된 지역 내에서 분자 상호 작용을 설명 하는 제한 된 더 이상, 오히려 그것은 이제 개별 분자의 동적 상호 작용을 시각화 수 있습니다. 여기, 우리 바닥 상태 고갈 고정된 셀 이미징에 대 한 현미경 검사 법에 의해 시각화 및 세포 단백질의 정량화에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 두 개의 서로 다른 막 단백질, 바인딩과 그물 translocon, sec61β, 그리고 원형질 막 지역화 전압 개폐 L 유형 캘리포니아2 + 채널 (CaV1.2)의 요소에서 예제를 제공합니다. 논의 특정 현미경 매개 변수, 고정 방법, 사진 스위칭 버퍼 정립, 그리고 함정 및 이미지 처리의 과제.

소개에 명시 된 여러 다른 슈퍼 해상도 현미경 이미징 형식 있습니다. 이 프로토콜은 GSD 슈퍼 해상도 영상에 집중 한다. 대표 이미지와 지역화 지도 그림 2 및 그림 3에 나와 있습니다.
그림 2 와 ER 단백질, mCherry-Sec61β, 위에서 설명한 메서드를 사용 하 여 처리 페 COS-7 셀을 보여 줍니다. 그림 2A -2B TIRF 모드 (A)에서 슈퍼 해상도 현미경을 사용 하 고 GSD 획득 모드 (B)를 사용 하 여 응급실의 이미지의 비교를 허용....

이 문서는 하나 이상의 플라즈마 포유류 세포에 있는 바닥 상태 고갈 (GSD) 슈퍼 해상도 현미경을 사용 하 여 세포 막 단백질의 검출에 대 한 프로토콜을 설명. 여기, 우리 토론 혜택과 시각화 및 세포 단백질의 정량화에 대 한 이러한 접근을 사용 하 여 고려 사항.

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

이 형광 이미지 기술의 전반적인 목표는 바닥 상태 고갈 현미경법(ground state depletion microscopy) 및 개별 분자 회복(individual molecule return)이라 불리는 초고해상도 현미경 기법을 사용하여, 고정된 세포 내 세포 단백질을 회절 한계 이하의 해상도로 시각화하고 정량화하는 것입니다. 이 방법은 회절 한계 해상도를 극복함으로써 연구자가 세포 단백질의 분포를 더 정밀하게 정의, 시각화 및 정량화할 수 있도록 도와주며, 이를 통해 세포 생물학 및 막 생물물리학 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줍니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 공초점 현미경과 같은 기존의 형광 현미경 이미지 기법보다 해상도를 약 10배 향상시켜 이미지를 획득할 수 있다는 점입니다.시연은 저희 실험실의 박사후 연구원인 Oscar Vivas와 Rose Dixon 실험실의 박사후 연구원인 Karen Hannigan이 진행하겠습니다. 우선, 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 커버슬립과 세포를 준비하십시오. 그다음 샘플을 고정하고 면역세포화학법을 수행하여 관심 있는 세포막 및/또는 세포 내 막 단백질을 표지합니다.다음으로, 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 PBS 49.5 µL를 넣고, 여기에 catalase 스탁 용액 12.5 µL, glucose oxidase 3.5 mg, 1 M Tris 0.5 µL를 순서대로 추가하여 산소 제거용 Glock 용액을 준비합니다. 튜브를 닫고 짧게 볼텍싱하여 성분들을 용해시킵니다. 그런 다음 용액을 3분 동안 원심분리합니다.이제 beta-mercaptoethylamine 용액을 PBS에 녹여 100 millimolar 농도로 만들고 pH를 8.0으로 조절하여 광스위칭 유도 thial 용액을 준비합니다. thial 용액을 소분하여 냉동고에 최대 1주일 동안 보관하십시오. 이미징 직전에 thial과 산소 제거 성분을 식염 완충액과 함께 혼합하여 얼음 위에 보관합니다.준비된 광전환 버퍼 100 µL를 사용하여, 염색된 세포가 포함된 커버슬립을 오목 슬라이드 위에 장착합니다. 그다음, 이미지 처리 버퍼의 급격한 산화를 방지하기 위해 실리콘 접착제로 커버슬립의 가장자리를 밀봉합니다. 이미징을 시작하기 전, 실리콘 접착제가 완전히 경화될 때까지 몇 분 동안 기다립니다.그렇지 않으면 커버 슬립이 밀려날 수 있습니다. 우선, 선택한 형광체에 따라 시료를 조사하는 데 적합한 레이저를 선택하십시오. Alexa 647 형광체의 경우 642 nanometer 레이저를 사용하십시오.다음으로, 적절한 다이크로익 이미징 큐브와 대물렌즈를 선택합니다. 이미징 소프트웨어를 실행합니다. 2D 획득 모드를 선택한 후 노출 시간을 11 milliseconds로 설정합니다.또한, EM Gain을 300으로 설정하고 적절한 검출 임계값을 선택하십시오. 다음으로, Auto Event Control을 켜고 이미지당 이벤트 수를 8개로 설정하십시오. 픽셀 크기를 20 nanometers로 입력하십시오.GSD Tools 탭에서 High Resolution Image Calculation 옵션으로 이동하여 Histogram Mode가 선택되었는지 확인하십시오. 세포막의 단백질을 이미징하려면 TIRF 모드를 선택하고 입사각을 조정하여 침투 깊이를 결정하십시오. 그런 다음, 전자를 암상태(dark state)로 보내기 위해 레이저 강도를 100%로 설정하십시오.다음으로, 펌핑 중에 Single Molecule Detection을 선택하고 프레임 상관관계(frame correlation)가 0.20일 때 자동으로 획득하도록 설정하십시오. 획득을 위해 레이저 강도는 50%로, 획득 프레임 수는 60,000으로 설정합니다. 그런 다음 이미지 촬영을 시작하십시오.단백질 클러스터의 크기를 정량화하려면, ImageJ에서 10 nanometer 히스토그램 단분자 국소화 맵의 이미지 파일을 엽니다. Image 메뉴에서 Adjust로 이동하여 Auto 옵션을 사용하여 이미지의 밝기와 대비를 최적화합니다. 그다음 Type 메뉴에서 8-bit를 선택합니다.다음으로, Analyze 메뉴를 열고 Set Scale을 클릭한 후 여기에 표시된 값을 입력하십시오. 그런 다음, Analyze 메뉴에서 Set Measurements를 선택하고 Area 옵션 옆의 확인란을 체크하십시오. 다시 Image 메뉴로 돌아가 Adjust, Threshold를 순서대로 선택한 다음 Over/Under를 선택하십시오.최댓값은 255로, 최솟값은 1로 설정한 후 Apply를 클릭합니다. 마지막으로 Analyze 메뉴를 열고 Analyze Particles를 선택합니다. Pixel units, Display results 및 Summarize 항목에 체크 표시를 하여 선택합니다.그런 다음 크기를 4에서 무한대(infinity)로 설정하고, Bare Outlines 옵션을 선택한 후 OK를 클릭합니다. 여기에 표시된 세포는 소포체 단백질인 mCherry-Sec61 beta를 통해 형질전환되었으며, 회절 한계 TIRF 현미경과 TIRF 모드의 초고해상도 GSD 현미경을 모두 사용하여 촬영되었습니다. 이 곡선들은 ER 세관의 직경을 나타냅니다. 오른쪽 이미지는 측면 해상도가 향상되었음을 보여주며, ER 세관 구조를 더 정확하게 표현하고 있습니다.초고해상도 GSD 이미징이 제공하는 해상도 향상은 anti-CAV 1.2 항체로 표지된 심근세포를 보여주는 이 이미지들에서 더욱 명확히 입증됩니다. GSD 모드를 사용하면 횡방향 해상도의 향상이 두드러지며, 채널의 개별 클러스터를 더 쉽게 식별할 수 있습니다. 이 프로토콜에 숙달되면 3일 이내에 완료할 수 있습니다.단일 세포의 초고해상도 이미징은 필요한 프레임 수에 따라 10분에서 30분 정도 소요됩니다. 이 절차 이후에는 관심 있는 형광 단백질이 복잡한 세포 환경과 어떻게 상호작용하는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 전자현미경과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 바닥 상태 고갈(ground state depletion) 후 개별 분자 복귀(individual molecule return)를 이용한 초고해상도 현미경법으로 하나 이상의 세포 단백질을 시각화하기 위한 시료 준비, 획득 및 분석 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Biology

생물학

우리는 박테리아 FtsZ-링의 구조 조직, 세포 분열에 필수적인 장치에 꼽는 영상 방법 수퍼 해상도를 설명합니다. 이 방법은 photoactivated 현지화 현미경 (PALM) 이미지의 정량 분석​​에 기반을두고 있으며 다른 세균 cytoskeletal 단백질에 적용 할 수 있습니다.

세균 본부 기계의 슈퍼 해상도 이미징

살아있는 세포 내부의 동적 단백질에 대한 시공간 정보는 생물학을 이해하는 데 매우 중요합니다. f3D-SIM(fast 3D-structured illumination microscopy)이라고 하는 초고해상도 현미경 검사의 한 유형은 박테리아의 사이토키네틱 Z 고리에 대한 고유한 정보, 즉 구슬 모양의 모양과 고리 내 FtsZ의 빠른 역학을 모두 보여줍니다.

고속 3D 구조 조명 현미경을 사용하여 라이브 박테리아의 Cytokinetic Z 반지의 슈퍼 해상도 이미징 (F3D-SIM)

여기에서는 면역학적 시냅스를 형성하는 유리 지지 지질 이중층 기술과 STED(Stimulated Emission Depletion) 현미경의 초고해상도 이미징 기술의 조합을 설명합니다. 이 프로토콜의 목표는 이러한 두 가지 기술을 성공적으로 수행하는 데 필요한 지침을 사용자에게 제공하는 것입니다.

유리 - 지원 평면 지질 이중층에 자연 살해 세포 면역 시냅스의 슈퍼 해상도 이미징

PI (4,5) P (2)는 다양한 세포 기능을 조절하지만, 세포 세포막에서의 나노 조직 잘못 이해된다. 라벨 PI 플렉스 트린 상동 도메인에 융합 된 이중 색상 형광 프로브 (4,5) P (2)에 의해, 우리는 나노 미터 스케일에서 (4,5) P 원형질막 2 공간 분포를 PI를 연구하는 새로운 방법을 기술 .

소설 형광 프로브와 플라즈마 막에서 포스파티딜 이노시톨 -4,5- 비스 포스페이트의 단일 분자 슈퍼 해상도 이미징

기존의 BODIPY 접합체는 일시성형, 적색 이동 접지 상태 이량체의 착취를 통해 살아있는 세포 단분자 국소화 현미경 검사법(SMLM)에 사용될 수 있습니다. 우리는 나노스코프 길이 척도에서 살아있는 포유류 및 효모 세포에서 세포내 중성 지질과 지방산을 추적하고 해결하기 위해 최적화된 SMLM 프로토콜을 제시합니다.

라이브 셀 슈퍼 분해능 현미경 및 단일 분자 추적을 위한 기존의 BODIPY 접합체

여기에 제출된 것은 손상되지 않은 조직에서 초해상도 라이브 세포 이미징을 위한 프로토콜입니다. 우리는 그것의 네이티브 조직 환경에 있는 높게 민감한 성인 줄기 세포 인구를 화상 진찰을 위한 조건을 표준화했습니다. 이 기술은 살아있는 조직에서 생물학적 현상의 직접적인 관찰을 허용하는 시간적 및 공간 해상도의 균형을 포함한다.

세포 전 형 구조의 슈퍼 해상도 라이브 세포 이미징

기저막은 발달 동안 조직 및 장기 형태 형성에 필수적입니다. 이 구조의 적절한 배치로 이어지는 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 제시된 프로토콜은 공초점 및 초분해능 현미경을 사용하여 상피 세포에서 기저막 단백질의 세포 내 밀매 및 분비를 시각화하고 특성화하는 방법을 설명합니다.

초 파리 Oogenesis 동안 양극화 된 세포 내 밀매 및 기저막 단백질의 분비의 공초점 및 수퍼 해상도 이미징

초고해상도 현미경은 감수 분열의 시냅톤 복합체 내 구성 요소 구성에 대한 자세한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기에서는 Caenorhabditis elegans synaptonemal 복합체의 개별 단백질을 해결하기위한 프로토콜을 보여줍니다.

Caenorhabditis elegans 생식계열 내 시냅톤 복합체의 초고해상도 현미경

이 기사는 유전자 코드 확장(GCE) 부위 특이적 표지를 사용하여 살모넬라균 분비 이펙터에 라벨을 붙이고 직접 확률적 광학 재구성 현미경(dSTORM)을 사용하여 HeLa 세포에서 분비된 단백질의 세포 내 국소화를 이미지화하는 간단하고 명확한 프로토콜을 제공합니다...

유전자 코드 확장을 이용한 박테리아 분비 단백질의 초고해상도 이미징

이 프로토콜은 광학 광자 재할당이 가능한 회전 디스크 공초점 현미경을 사용하여 심층 전세포 단일 분자 위치 현미경(SMLM)을 수행하는 절차를 설명하여, 맞춤형 광학 장치나 복잡한 조명 없이 DNA-PAINT 이미징을 가능하게 합니다.

광학 광자 재배치가 포함된 회전 디스크 공초점 디스크에 대한 DNA-PAINT를 통한 전세포 초해상도 영상

이 프로토콜은 고해상도 셀룰러 및 아셀룰러 이미징을 위한 다중화 배열 검출기와 통합된 레이저 스캐닝 공초점 현미경 시스템의 첨단 영상 응용과 공유 자원 관리를 상세히 설명합니다. 이 워크플로우는 단일 플랫폼 내에서 공초점에서 초해상도(~120 nm)까지 다중 모달 이미징을 가능하게 하여 나노스케일 시각화를 더욱 쉽게 접근할 수 있게 합니다.

초해상도 영상 및 공유 관리: 다중화 검출이 포함된 공초점 현미경 프로토콜

배우세요 포유류 세포에서 바닥 상태 고갈 초고해상도 현미경을 이용하여 세포막 단백질을 시각화하고 정량화하는 방법입니다. 이 기술은 기존 형광 현미경보다 약 10배 높은 해상도로 세포 생물학 및 막 생물물리학 연구에 필수적인 도구입니다.

포유류 세포에 있는 바닥 상태 고갈 슈퍼 해상도 영상

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