포유류 세포에 있는 바닥 상태 고갈 슈퍼 해상도 영상

이 형광 이미징 기술의 전반적인 목표는 ground state depletion microscopy 및 individual molecule return이라고 하는 초고해상도 현미경 형태의 방법을 사용하여 회절 이하의 해상도로 고정된 세포의 세포 단백질을 시각화하고 정량화하는 것입니다. 이 방법은 회절 제한 분해능을 우회하여 연구자가 세포 단백질의 분포를 보다 정확하게 정의, 시각화 및 정량화하는 데 도움이 되기 때문에 세포 생물학 및 막 생물 물리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 컨포칼 현미경 검사와 같은 기존 형광 현미경 이미징 접근 방식에 비해 해상도가 약 10배 향상된 이미지를 획득할 수 있다는 것입니다.

제 연구실의 박사후 연구원인 Oscar Vivas와 Rose Dixon 연구실의 박사후 연구원인 Karen Hannigan이 이 절차를 시연할 것입니다. 시작하려면 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 커버 슬립과 셀을 준비합니다. 그런 다음 샘플을 고정하고 면역세포화학을 수행하여 관심 있는 원형질막 및/또는 세포내 막 단백질을 라벨링합니다.

다음으로, 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브에 12.5 마이크로 리터의 카탈라제 원액, 3.5 밀리그램의 포도당 산화 효소 및 0.5 마이크로 리터의 1 몰 트리스를 49.5 마이크로 리터의 PBS에 첨가하여 산소 제거 Glock 용액을 준비합니다. 튜브를 닫고 잠시 와류를 일으켜 구성 요소를 용해시킵니다. 그런 다음 용액을 3분 동안 원심분리합니다.

이제 베타 메르 캅토 에틸 아민 용액을 PBS에 100 밀리 몰의 농도로 용해시키고 pH를 8.0으로 수정하여 광 스위칭 유도 티알 용액을 준비합니다. thial 용액을 Aliquot하고 최대 1 주일 동안 냉동실에 보관하십시오. 이미징 직전에 thial 및 oxygen suringing 성분을 식염수 완충액과 함께 혼합하고 용액을 얼음에 보관합니다.

준비된 사진 스위칭 버퍼 100마이크로리터를 사용하여 염색된 세포가 포함된 커버 슬립을 함몰 슬라이드에 장착합니다. 다음으로, 이미징 버퍼의 급격한 산화를 방지하기 위해 실리콘 접착제로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉합니다. 이미징하기 전에 실리콘 접착제가 완전히 경화될 때까지 몇 분 정도 기다리십시오.

그렇지 않으면 커버 슬립이 떠내려갑니다. 시작하려면 선택한 형광단을 기반으로 샘플을 비출 적절한 레이저를 선택합니다. Alexa 647 형광단의 경우 642 나노미터 레이저를 사용합니다.

다음으로, 적절한 dichroic imaging cube와 objective lens를 선택합니다. 이미징 소프트웨어를 엽니다. 2D 획득 모드를 선택한 다음 노출 시간을 11밀리초로 설정합니다.

또한 EM 게인을 300으로 설정하고 적절한 감지 임계값을 선택합니다. 그런 다음 Auto Event Control(자동 이벤트 제어)을 켜고 Events Per Images(이미지당 이벤트) 수를 8로 설정합니다. 픽셀 크기를 20나노미터로 입력합니다.

GSD Tools 탭에서 High Resolution Image Calculation 옵션으로 이동하여 Histogram Mode가 선택되어 있는지 확인합니다. 원형질막에서 단백질을 이미지화하려면 TIRF 모드를 선택하고 입사각을 수정하여 침투 깊이를 결정합니다. 그런 다음 레이저 강도를 100%로 설정하여 전자를 어두운 상태로 보냅니다.

다음으로, 펌핑하는 동안 단일 분자 검출을 선택하고 프레임 상관관계가 0.20일 때 자동으로 획득하도록 설정합니다. 획득의 경우 레이저 강도를 50%로 설정하고 획득 프레임 수를 60, 000으로 설정합니다. 그런 다음 이미지 촬영을 시작합니다.

단백질 클러스터 크기를 정량화하려면 ImageJ에서 10나노미터 히스토그램 단일 분자 국소화 맵의 이미지 파일을 엽니다. 이미지 메뉴에서 조정으로 이동하고 자동 옵션을 사용하여 이미지의 밝기와 대비를 최적화합니다. 그런 다음 유형 메뉴에서 8비트를 선택합니다.

그런 다음 Analyze(분석) 메뉴를 열고 Set Scale(배율 설정)을 클릭한 다음 여기에 표시된 값을 입력합니다. 그런 다음 Analyze(분석) 메뉴에서 Set Measurements(측정 설정)를 선택하고 Area(영역) 옵션 옆의 확인란을 선택합니다. 이미지 메뉴로 돌아가서 Adjust, Threshold를 선택한 다음 Over/Under를 선택합니다.

최대값을 255로, 최소값을 1로 이동한 후 적용을 클릭합니다. 마지막으로 Analyze(분석) 메뉴를 열고 Analyze Particles(파티클 분석)를 선택합니다. 확인 표시를 하여 Pixel units(픽셀 단위), Display results(결과 표시) 및 Summarize(요약)를 선택합니다.

그런 다음 크기를 4에서 무한대로 설정하고 Bare Outlines 옵션을 선택한 다음 OK를 클릭합니다. 여기에서 이미징된 세포는 소포체 단백질인 mCherry-Sec61 beta로 형질 주입되었으며 TIRF 모드에서 분열 제한 TIRF 현미경과 초고해상도 GSD 현미경을 모두 사용하여 이미지화되었습니다. 이 곡선은 ER 세뇨관의 직경을 나타냅니다. 오른쪽 이미지는 측면 해상도의 개선을 보여주며 ER 세뇨관의 구조를 보다 정확하게 표현합니다.

초고해상도 GSD 이미징이 제공하는 해상도의 개선은 항-CAV 1.2 항체가 있는 표지된 심장 근세포를 보여주는 이러한 이미지에서 추가로 입증됩니다. GSD 모드를 사용하면 측면 해상도의 개선이 두드러지고 별도의 채널 클러스터를 더 쉽게 식별할 수 있습니다. 이 프로토콜은 일단 마스터하면 3일 이내에 완료할 수 있습니다.

단일 세포의 초고해상도 이미징은 필요한 프레임 수에 따라 10분에서 30분이 걸립니다. 이 절차에 따라 관심 형광 단백질이 복잡한 세포 환경과 어떻게 상호 작용하는지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 전기 현미경 검사와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 기저 상태 고갈(ground state depletion) 후 개별 분자 회수(return again)를 사용하여 초고해상도 현미경 검사를 위해 하나 이상의 세포 단백질을 시각화하기 위해 샘플을 준비, 획득 및 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.