경고 설치류에 Transcranial 전기 두뇌 자극

이 수술 절차의 전반적인 목표는 각성 상태의 설치류에서 신뢰할 수 있고 반복적인 경두개 전기 뇌 자극을 가능하게 하는 것입니다. 이 방법은 뇌 네트워크의 표적 전기 자극을 통해 운동 기능이나 결손을 개선함으로써 신경 조절 및 신경 가소성 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 각성 상태의 설치류에게 불편함을 유발하지 않고 행동 측정에 대한 간섭을 최소화하면서, 반복적인 비침습적 전기 뇌 자극 세션을 수행할 수 있다는 점입니다.

이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 흉부에서 머리로 이어지는 터널링의 정확한 경로를 찾는 것과 전극 소켓 배치 전의 골 준비 과정에서 어려움을 겪을 수 있으며, 이는 초보 연구자들에게 종종 까다로운 작업입니다. 전극 소켓 배치를 위한 외과적 단계뿐만 아니라 자극을 위한 전극 준비 및 배치가 실험의 성공에 결정적이므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 본 연구실의 박사 후보생인 Stephanie Haschka가 각성 상태의 쥐를 대상으로 NEBS 절차를 수행하는 과정을 도울 것입니다.

발표자}먼저 설치류를 수술대 위에 흉부를 바닥으로 하여 눕힙니다. 소독제에 적신 면봉으로 제모된 두피를 소독합니다. 공기 중에서 건조시킵니다.

그 후 마취 깊이를 확인하고, 메스로 눈의 앞쪽 높이부터 귀의 중간 높이까지 일직선으로 피부를 절개합니다. 다음으로 쥐를 앙와위(supine position)로 돌려 흉부가 노출되게 한 뒤 흉부를 소독합니다. 양손 손가락 두 개로 오른쪽 흉부의 측면 피부를 당기고, 두개골 방향으로 직선상 시상 절개를 실시합니다.

작은 가위를 반복적으로 벌려 피부를 왼쪽 대흉근에서 외상 없이 분리하여 피하 포켓을 형성합니다. 다음으로, 동물을 오른쪽으로 눕히고 지혈 겸자를 사용하여 표층 근막을 관통하며, 열려 있는 머리 피부의 왼쪽 후두부 모서리부터 목을 따라 흉근 포켓으로 나오는 케이블 경로를 터널링합니다.

지혈 집게를 조심스럽게 벌려 백금 전극에 연결된 전극 케이블의 끝부분을 잡되, 날카로운 와이어가 튀어나오지 않도록 주의합니다. 전극의 소작 지점이 설치류의 왼쪽 뒷다리를 향하도록 하여 전극이 파우치에 들어갈 때까지 케이블을 터널을 통해 잡아당깁니다. 그다음 설치류를 다시 엎드린 자세로 돌려놓습니다.

다음으로, 멸균된 합성 꼰 비흡수성 봉합사를 사용하여 백금 플레이트의 마주 보는 두 모서리 구멍을 통해 흉근 근막에 고정합니다. 마찬가지로, 조직 터널 진입 전 부분에 약간의 루프를 형성하도록 느슨한 매듭을 지어 케이블을 근막에 부착합니다. 마지막으로, 절개 부위의 크기에 따라 3~4개의 피부 봉합사로 피부를 봉합합니다.

먼저 메스로 두개골 측면의 결합 조직인 골막을 긁어내고 면봉으로 깨끗이 닦아냅니다. 절개 부위의 네 모서리에 있는 결합 조직을 불독 클램프로 고정한 다음, 수술 부위를 개방 상태로 유지하기 위해 측면으로 당겨 고정합니다. 다음으로 0.9% saline을 도포하여 면봉으로 뼈 표면과 조직을 세척합니다.

그런 다음 3% Hydrogen Peroxide로 뼈 표면을 세척합니다. 면봉을 사용하여 가시적으로 보이는 골막의 잔여물을 모두 제거하십시오. 고정 나사는 접착제의 부착력을 향상시키므로, 나사 크기에 맞는 드릴 비트를 선택하십시오.

핸드 드릴로 사전 천공한 후 본 드릴로 가벼운 입자 압력을 가하여 두 개의 서로 다른 골판에 두 개의 천공 구멍을 만듭니다. 이 비디오에서 보여주는 것처럼 전극을 삽입하는 경우에는 터널링된 케이블을 나중에 고정하기 위해 우측 후두정골에 세 번째 구멍을 뚫습니다. 천공 구멍에 플라스틱 나사를 배치하고 첫 번째 마찰이 느껴질 때까지 나사를 조입니다.

그 후 나사를 180도씩 세 번 더 돌립니다. 포셉을 사용하여 나사의 안정성을 확인하고, 충분히 조여지지 않았다면 한 번 더 돌려줍니다. 소작기를 켜고 약 5분 동안 예열합니다.

조직 터널에서 나오는 케이블을 오른쪽 두정엽 나사 주변으로 후두부 방향으로 감은 다음, 감은 부분 뒤로 약 1cm의 케이블이 남도록 절단합니다. 메스를 사용하여 케이블 끝의 절연체를 조심스럽게 벗겨냅니다. 그 후 사이아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 감은 케이블을 나사와 뼈에 고정합니다.

다음으로, 커넥터와 대전극 케이블의 피복이 벗겨진 전선 부분에 무연 주석 납을 소량 도포합니다. 주석 납이 녹을 때까지 납땜 팁을 대고 미리 납이 도포된 두 부분을 짧게 눌러 서로 연결합니다. 케이블의 과도한 금속 가열로 인한 이후의 조직 손상을 방지하기 위해 납땜 팁을 즉시 제거하십시오. 운동 피질 자극에는 직경 4mm 소켓을 사용하십시오.

얇은 톱니 모양 팁 포셉으로 맞춤 제작된 tES 전극 소켓을 집어 들고, 소켓의 하단 테두리에 시아노아크릴레이트 접착제를 얇게 도포합니다. 소켓의 내측 경계는 정중 봉합선에서 정확히 끝나야 하며, 내측 경계의 끝부분은 브레그마(bregma)에 위치해야 합니다. 그런 다음 접착제가 굳을 때까지 소켓을 뼈 위에 잠시 눌러 고정합니다.

그리고 조명을 사용하여 소켓 영역 내의 뼈에 반사성 접착제가 묻어 있지 않은지 확인하십시오. 소켓이 제대로 배치되고 향후 자극 부위에 접착제가 없는 것이 확인되면, 해당 위치에서 전류 션트(shunting)를 유발할 수 있는 유체 브릿지 형성을 방지하기 위해 소켓의 외측 경계를 인접 조직에 시아노아크릴레이트 접착제 한 방울로 밀봉하십시오. 그런 다음 모든 나사를 시아노아크릴레이트 접착제로 덮으십시오.

다음으로, 작은 실리콘 튜브나 유리 용기에서 아크릴 시멘트의 두 성분을 혼합합니다. 점성이 생기면 즉시 치과용 스패출러를 사용하여 소켓의 남은 경계 부위를 뼈에 밀착시켜 밀봉합니다. 마지막으로 두개골 전체와 나사, 대전극 케이블, 그리고 소켓의 약 1/3 지점까지를 치과용 아크릴 시멘트로 덮습니다.

모든 뼈가 덮이고 시멘트가 경화되면 불독 클램프를 제거하고 피부를 원래 위치로 되돌립니다. tES 전극 소켓의 절반을 0.9% saline으로 채우고 기포를 제거하는 것으로 시작하십시오. 음극 tES 세션 전에는 염화 상태를 확인하고, 필요한 경우 은-염화은 전극을 다시 염화시키십시오.

양극 tES 세션 시작 전, 자극 중 양호한 전도성을 확보하기 위해 사포를 사용하여 이전 자극으로 인해 발생했을 수 있는 과도한 염화은 침전물을 제거하십시오. 그런 다음 tES 전극 캡을 돌려 끼웁니다. 케이블을 머리에 있는 두 개의 커넥터에 연결하십시오.

그런 다음 설치류를 실험용 케이지에 넣으며, 케이지 상단의 스위블에 케이블을 연결하여 자유로운 움직임이 가능하도록 합니다. 자극기를 켜고 자극 파라미터를 조정합니다. 마지막으로 자극이 종료된 후, 케이블을 분리하고 머리의 전극 캡 나사를 푼 다음, 면봉으로 소켓을 닦고 건조시킵니다.

결과에 따르면, 형태학적 변화로 평가한 미세아교세포 활성화는 31.8 amps per square meter에서 먼저 발생한 반면, 신경 퇴행의 첫 징후는 47.8 amps per square meter에서 검출되었습니다. 샘플 1번부터 4번까지는 양성으로 판정되었습니다. 각성 상태의 쥐에서 47.8 amps per square meter일 때 fluoro-JC 양성 퇴행 뉴런을 가진 뇌 절편의 비율이 더 높게 나타나, 마취가 DCS에 대한 반응 정도에 영향을 미친 것으로 나타났습니다.

또한, 고강도에서의 행동적 또는 분자적 효과는 저강도 효과와 기전적으로 다를 것으로 예상됩니다. 흉부 전극 배치를 포함한 이 기술을 숙달하여 적절하게 수행한다면 40분에서 45분 내에 완료할 수 있습니다. 대전극을 외과적으로 배치하지 않은 경우에는 보통 10분에서 15분의 더 짧은 시간이 소요됩니다.

이 영상을 시청하고 나면 다양한 NEBS 시뮬레이션 기법을 위한 영구 전극 설치 방법과 각성 상태의 설치류에 eTS를 적용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 전극이 자극 전에 충분히 준비되지 않은 상태에서 전류를 사용하는 것은 설치류에게 해로울 수 있음을 잊지 마십시오. 따라서 본 절차를 수행하기 전에는 음극 자극 전 전극의 재염화나 양극 자극 전 잔해물 제거와 같은 예방 조치를 항상 취해야 합니다.