Name: 인간의 중추 신 경계에서 Endopeptidomic 분석을 위한 시료 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 학습하세요 인간 뇌척수액의 엔도펩티드 질량분석을 위한 시료 준비 방법을. 분획 크로마토그래피와 질량분석을 활용하여 저농도 펩티드를 검출하고 신경퇴행성 질환 바이오마커 발굴에 활용할 수 있습니다.

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많은 Tanveer Batth와 동료 조언 사전 분류 방법 설정에 대 한 감사 합니다.
이 작품에서 스웨덴 연구 위원회는 Wallström 및 Sjöblom 재단, 총 및 베 Stohne 기초 Stiftelse, 매 그 너 스 Bergwall 재단, Åhlén 재단, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen 염 자금에 의해 지원 되었다 Gamla Tjänarinnor는 크누트와 앨리스 발 렌 버그 재단, Frimurarestiftelsen을 FoU 서쪽 Götalandsregionen.
이 프로젝트에 대 한 자금 지원의 주요 받는 Kaj Blennow, 헨릭 Zetterberg와 요한 Gobom 했다.

아래에 설명 된 프로토콜은 많은 양의 내 인 성 펩 티 드 인간 CSF15에 발견 했다 이전 연구에서 사용 되는 것의 세련 된 버전입니다. 원래 프로토콜에 대 한 업데이트 CSF의 화학 사전 처리에 사소한 변경 뿐만 아니라 오프 라인 높은 pH RP HPLC 사전 분류에 사용 되는 그라데이션의의 최적화를 포함 한다.
윤리적인 고려 사항
스웨덴 환자 및 제어 자료의 모든 연구 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다: 세인트 예란 (참고 2005-554-31/3). 암스테르담 치 매 코 호트에서 CSF 샘플 및 신경과 신경외과, 런던 국립 병원에서 수집 된 샘플 모든 참여 환자 로부터 서 면된 동의와 승인 지역 윤리 위원회에서 연구를 위해 사용 되었다. 여기 주로 활용 자료 진단 목적 샘플에서 왼쪽 위에 CSF 이루어져 있고 우리의 연구에 포함 되 고 전에 취소 확인 했다. 다시 개별 기증자 또는 기증자의 그룹 샘플 추적의 아무 가능성도 있다.
1. 인간의 뇌 척추 액체 (CSF)의 추출:
<ol><li>허리 빵 꾸 (훈련 된 의사에 의해 수행 되어야 합니다)를 통해 CSF를 추출22표준화 된 프로토콜 사용 하 여.</li>
	<li>20 분 동안 2500 x g에서 원심 분리 하 여 세포 파편 및 다른 비 녹는 물자를 제거 합니다.</li>
	<li>시각적으로 혈액 오염 펑크 출혈에서 결과 나타낼 수 있는 변색에 대 한 CSF 샘플을 검사 합니다. 혈액과 프로 테아의 존재에서 상당히 높은 단백질 농도 분석 결과 크게 영향을 미칠 수 있습니다.</li>
</ol>2. 사전 처리의 CSF (1.5 mL 샘플 볼륨, 아니 부 량):
<ol><li>녹여 실 온 (RT)에서 CSF aliquots의 1.5 mL, 10 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 내용을 전송 및 버퍼링 요원으로 1 M Triethylammonium 중 탄산염 (TEAB)의 80 µ L를 추가.</li>
	<li>0.65 mL 8 M guanidinium 염 산 염 (GdnHCl)를 추가 (활성 농도 GdnHCl: 2.4 M) 및 10 분에 대 한 실시간에 부드럽게 소용돌이. 참고: chaotropic 에이전트, GdnHCl, 모두 용 매 점도 영향을 미치는 고 단백질 전개 되는 정력적으로 호의 베푸는23결과 polypeptide 사슬 상호 작용. 따라서, GdnHCl 단백질 집계를 녹이 고 여과 하는 동안 내 인 성 펩 티 드의 복구를 증가 한다.</li>
	<li>60 µ L의 수성 200 m m의 추가 tris(2-carboxyethyl) phosphine 염 (TCEP) (활성 농도 TCEP: 6 m m)과 시스테인 아를 줄이기 위해 1 h 55 ° C에서 품 어.</li>
	<li>400 m m iodoacetamide (IAA)의 35 µ L를 추가 (활성 농도 IAA: 4 m m)와 알 시스테인을 30 분 동안 어둠 속에서 RT에서 품 어. 알 킬 그룹의 추가 시스테인 잔류물 형성할 수 없습니다 자연스럽 게 새로운 이황화 다리 어떤 시점에서 후속 견본 준비 동안을 보장 합니다.</li>
	<li>-이온된 수와 짧게 MWCO 여과, 5.5 mL의 총 샘플 볼륨 결과 전에 샘플을 희석 하는 소용돌이의 3.25 mL를 추가 합니다. 이 단계 높은 농도 때로는 필터 장치에서 고분자 물질의 침 출을 관찰로 1m 아래에 GdnHCl을 희석 하는 역할.</li>
</ol>3. 사전 처리 CSF (10 x 150 µ L 샘플 볼륨, Isobaric 라벨 정량화)의:
<ol><li>RT에서 10 개인에서 CSF aliquots의 150 µ L를 녹여 이후 개별 1.5 mL 낮은 바인딩 마이크로 원심 관에 콘텐츠를 전송 하 고 버퍼링 요원으로 1 M TEAB의 8 µ L를 추가.</li>
	<li>8 M GdnHCl의 65 µ L를 추가 (활성 농도 GdnHCl: 2.4 M) 및 10 분에 대 한 실시간에 부드럽게 소용돌이.</li>
	<li>수성 TCEP의 200 m m의 6 µ L를 추가 (활성 농도 TCEP: 6 m m)과 시스테인 아를 줄이기 위해 1 h 55 ° C에 외피.</li>
	<li>3.5 µ L 400 m m 수성 IAA를 추가 (활성 농도 IAA: 6 m m)와 알 시스테인 RT 30 분 동안 어둠 속에서 품 어.</li>
	<li>Isobaric 라벨 키트를 준비 (예., 탠덤 질량 태그 10plex isobaric 라벨 시 약). RT 시 약 불필요 일 분을 방지, HPLC 급 이기 (AcN)의 41 µ L을 추가 하 고 5 분에 대 한 부드러운 교 반에 의해 해산을 그들을 열기 전에 도달 isobaric 라벨-시 약 병을 허용 합니다.</li>
	<li>Isobaric 라벨-시 약 해결책의 30 µ L 해당 샘플을 전송 하 고 부드러운 동요에서 RT에 1 시간에 품 어. Isobaric 라벨 시 뿐만 아니라 리 진 잔류물 펩 티 드의 N termini에 1 차 아민으로 반작용 하는 NHS 에스테 르 그룹을 포함 합니다.</li>
	<li>5 %hydroxylamine 8 µ L를 추가 (활성 농도 hydroxylamine: 0.16%) 라벨 반응을 풀기 위해 20 분에 대 한 실시간에 부드럽게 흔들어. 별도로 이라는 샘플 결합 될 수 있기 때문에, 확인 라벨 반응 침묵 이다. Hydroxylamine 형태의 아민 그룹의 풍요로 움의 추가에 의해 나머지 isobaric 라벨 시 약 반응을 허용 되 고 따라서 비활성 렌더링 됩니다.</li>
	<li>각 단일 15 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 10 이라는 개별적으로 샘플의 내용을 결합 합니다.</li>
	<li>결합 된 샘플을 짧게 AcN 농도 12%에서 3%를 줄이기 위해 소용돌이 드 이온된 수의 6.4 mL을 추가 하 고 GdnHCl 농도를 높은 농도로 1m 아래에 GdnHCl 때때로 고분자 물질의 침 출을 관찰 되었습니다. 필터 장치.</li>
</ol>4. 분자량 컷오프 여과
<ol><li>오염 물질, 상태는 MWCO 수성 1 M GdnHCl, 25 mM TEAB 및 g와 RT x 2500에서 15 분 동안 centrifuging 10 mL 로드 하 여 필터링 하는 잠재력을 제거 하려면, 삭제는 자형 (피트).</li>
	<li>필터의 전체 샘플 볼륨을 로드 (5 mL 비 셔 서 CSF (2.5 단계) 또는 10 mL isobarically 셔 서 CSF (단계 3.9)) x g와 RT, 2500에서 30 분 두고는 자형 (피트) 컬렉션 컨테이너에 대 한 원심과. 여과의 결과 펩 티 드 및 작은 단백질에서 더 큰 단백질 및 잔여 셀 구분 됩니다. 이 단계는 proteomic 실험에서 펩 티 드를 생성 하기 위해 단백질의 분해 소화의 사용에 해당 peptidomic로 볼 수 있습니다.</li>
	<li>펩 티 드의 복구를 향상 시키기 위해 필터와 g x 2500에서 15 분 동안 원심 분리기에 (수성) TEAB와 RT, 25 m m의 5 mL을 로드 합니다.</li>
	<li>소용돌이 앞의 두 단계 (비 분류의 총 10 mL 또는 15 mL isobarically 표시 샘플)에서 결합된 FTs 샘플 산성화를 진행.</li>
</ol>5. 드 사용 및 샘플 정리 고체 상 추출 하 여
<ol><li>4.4 이전 고체 상 추출 (SPE) 단계에서 필터링 된 샘플 시 어 지 다. 산성화 SPE 카트리지의 고정 단계와 용액 (펩타이드) 상호 작용을 개선 하기 위해 수행 됩니다.</li>
	<li>비 셔 서 샘플 (볼륨 10 mL): 추가 1 %Trifluoroacetic 산 (TFA)-샘플의 총 볼륨의 550 µ L: 0.05 %10.55 mL TFA.</li>
	<li>Isobaric 표시 샘플 (볼륨 15 mL): 추가 20 mL 0.1 %TFA 하 시 어 지 다 고 낮은 AcN 농도 3%에서 1%-샘플의 총 볼륨: 0.066 %30 mL TFA. 참고: TFA는 또한 그것의 기능에 대 한으로 추가 이온 쌍 시 약, 스스로 SPE 카트리지 유지를 포장 재료와 함께 충분히 강한 소수 성 상호 작용의 펩 티 드의 보존을 향상.</li>
	<li>만약 pH > 3, 적정 인산 20%와 샘플 샘플 pH는 때까지 < 3.</li>
	<li>84 %AcN, 0.1% 개미의 산 (FA), 그리고 삭제는 피트를 한 번 반복의 1 mL의 추가 의해 SPE 카트리지를 조건. 카트리지 필터의 컨디셔닝 후속 단계;에서 펩 티 드 함께 elute 그렇지 않으면 것입니다 원치 않는 물질을 제거 하는 데 필요한 또한, 필터의 증가 침투성 컨디셔닝.</li>
	<li>0.1의 1 mL의 추가 의해 SPE 카트리지 equilibrate %TFA, 피트 반복을 한 번 삭제. 필터는 마지막 평형 단계-후 건조 실행 되지 않습니다 확인 필터 위에 작은 볼륨을 유지. 카트리지 필터의 평형 조절 단계에서 왼쪽 (이기) 소수 성 물질을 제거 하 여 펩 티 드를 유지 하기 위해 필터를 준비 하기 위해 수행 됩니다.</li>
	<li>필요한 경우, 여러 부분에서 전체 샘플 볼륨 (10.55 mL 비 표시 샘플 또는 isobarically 표시 샘플 30 mL), 로드 하 고 피트 낭비로 실행 하자. 카트리지 로드 라운드 샘플 사이 건조 실행 하거나 후 마지막 샘플 볼륨-필터 위에 작은 볼륨을 유지 하지 않는 확인 하십시오.</li>
	<li>0.1%의 1 mL를 통과 소금 및 시 약을 제거 하 고 한 번 피트 반복을 삭제 하는 필터를 통해 TFA. 카트리지-각 세척 단계 후 건조 실행 하지 않습니다 카트리지 위에 액체의 작은 볼륨을 유지.</li>
	<li>장소 1.5 mL 낮은 바인딩 마이크로의 카트리지 아래 튜브 원심 및 84%의 1 mL를 전달 하 여 샘플을 elute AcN, 0.1%는 카트리지를 통해 FA.</li>
	<li>증발, 건조까지 활성 난방-80 ° C에서 저장 하거나 높은 pH 분별에 즉시 진행 하지 않고 실행 진공 원심 분리기에 의해 드 소금된 샘플에서 용 제를 제거 합니다.</li>
</ol>6. 오프 라인 높은 pH 역 상 HPLC 샘플 분류
<ol><li>
수성 고-pH (HpH) 모바일 단계 준비: HpH 버퍼 a: 순수한 물 HpH 버퍼 b: 84% AcN HpH 버퍼 c: 25 mM NH4오 HpH 로드 버퍼: 2.5 m m NH4오, 2 %AcN 참고: 드레싱 로딩 버퍼 전송 솔루션 및 샘플 버퍼로 사용 됩니다.</li>
	<li>다시 20 분에 대 한 부드러운 교 반으로 16 µ L 드레싱 로드 버퍼에 샘플을 분해</li>
	<li>96 깊은 잘 격판덮개 Batth 그 외 여러분 에 따르면 구성에 대 한 내부 분수 수집기 15 µ L HPLC 시스템에 샘플을 로드 사소한 변경으로 20 . PH-안정 분리 열 (C18 3.5 µ m, 2.1 m m x 250 m m) 100 µ L/min의 흐름에서 fractionate 고 선형 60 분 그라데이션 이상의 당 분 한 분수를 수집 합니다.</li>
	<li>다음 그라데이션 시간-포인트를 사용 하 여: t = 0 분, B = 1%, C = 10%; t = 4 분, B = 1%, C = 10%, 시작 분수 컬렉션; t = 76 분, B = 70%, C = 10%; 끝 분수 컬렉션; t = 76.5 분, B = 85%, C = 10%; t = 80 분, B = 85%, C = 10%; t = 80.5 분, B = 1%, C = 10%, t = 90 분, B = 1%, C = 10%.</li>
	<li>따라서 분수 12 분, 12 분수, 그 결과 각각 6 연결 된 하위 분수를 포함 하 여 간격을 연결 하는 순환 패턴에서 12 우물에서 반복 분수를 수집 합니다.</li>
	<li>건조까지 RT와 3000 rpm에서 진공 원심 분리에 의해 샘플에서 용 매를 제거 하 고 이전에 LC MS 분석-80 ° C에서 샘플을 저장할.</li>
</ol>7입니다. LC-MS
<ol><li>
수성 모바일 단계 준비: 버퍼 a: 0.1% FA 버퍼 b: 0.1 %FA, 84% AcN 로딩 버퍼: 0.05 %TFA, 2 %AcN 참고: 버퍼 로드 전송 솔루션, 샘플 버퍼 및 모바일 단계 로드 펌프에 대 한 사용 됩니다.</li>
	<li>다시 버퍼를 로드 하 고 20 분에 대 한 실시간에 떨고 6 µ L의 추가 의해 각각 12 분수의 분해</li>
	<li>나노 흐름 HPLC, 함정 열 구성에 부하 5 µ L 샘플 (함정 열: 75 µ m x 2 cm, C18, 100 Å의 기 공 크기, 3 µ m 입자 크기; 분리 칼럼: C18, 75 µ m x 500 m m, 100 Å의 기 공 크기, 2 µ m 입자 크기 다음 그라디언트를 사용 하 여 150 nL/min 흐름 속도로 펩타이드 분리 수행: t = 0 분, B = 2%; t = 10 분, B = 2%; t = 11 분, B = 7%; t = 100 분, B = 26%; t = 170 분, B = 45%; t = 175 분, B = 80%; t = 181 분, B = 2%, 및 t = 210 분, B = 2%.</li>
	<li>
나노-ESI 인터페이스를 통해 HPLC에 연결 된 고해상도 하이브리드 질량 분석기에 MS를 수행 합니다. 350-1400 m/z 범위 120000 (2.0e5 AGC 대상)의 해상도 설정에서 MS 모드에서 스캔 전체 스펙트럼을 기록 합니다.
	<ol>
<li>데이터 종속 획득 모드에서 질량 분 서 계, m/z > 150와는 강도 범위 1.0e4-1.0e5 조각 이온 분석에 대 한 내는 상위 10 개의 가장 강렬한 봉우리에서 MS/MS 스펙트럼을 선택. 선구자 이온 60%에 1 m/z의 사중 극 자 격리 창, 100 ms와 RF 렌즈의 최대 주입 시간을 사용 하 여 격리 합니다.</li>
		<li>15 제외 시간 동적 제외 적용 s 및 ± 10 ppm의 m/z 허용. 더 높은 충돌 에너지 분리 (HCD) 셀에 조각화 수행 하 고 50000 (5.0e4 AGC 대상 값)의 해상도 설정에서 orbitrap에 MS/MS 인수를 기록.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. 펩 티 드 식별
<ol><li>
펩 티 드 식별에 대 한 결과.raw-파일 대량 spectrometric 분석에서 다음과 같은 설정을 적용 하는 proteomics 검색 엔진에 제출: 참고: 이전에 연구15, 3 개의 검색 엔진; 마스코트 v2.4, Sequest HT와 봉우리 v7.5 병렬로 사용 하 고 여기에 지정 된 설정을 별도로 지정 하지 않는 한 모든 3 개의 검색 엔진에 대 한 고용 했다. 조정 가능한 설정의 대부분 펩타이드/단백질 식별에 대 한 보편적 이며 어떤 특정된 검색 엔진에서 해당 설정을 해야. 스펙트럼 선택: 분 선구자 질량: 350 Da 최대입니다. 선구자 질량: 5000 다 스캔 유형: 전체 신호/노이즈 임계값: 1.5 시퀀스 데이터베이스 검색 데이터베이스: UniProt_SwissProt [version2015_11] 분류: 호모 사피엔스 효소: 없음 최대입니다. 분열을 놓친: 0 악기 (마스코트만): ESI-트랩 분 펩 티 드 길이 (SequestHT만): 6 최대입니다. 펩 티 드 길이 (SequestHT만): 144 선구자 대량 허용 오차: 15 ppm 대중의 관용을 조각: 0.05 다 정적 수정: Carbamidomethyl (C); [분류] 하는 경우 TMT10plex (N-용어) 동적 수정: 산화 (M); [분류] 하는 경우 TMT10plex (K) 펩 티 드-스펙트럼 일치 (PSM) 유효성 검사기 여과기 (마스코트 및 Sequest HT만) 또는 미끼 퓨전 (봉우리만) 루즈벨트 대상: 0.01 유효성 검사에 따라: q 값</li>
</ol>

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</ol>

아니 경쟁 관심사, 금융 또는 기타, 작가 사이 보고 되었습니다.

높은 pH RP HPLC 사전 분류 하는 단계 내 인 성 펩 티 드의 복구에 대 한 이전 개발된 프로토콜 분자량 외11 의 상대 샘플 복잡성을 감소 및 그로 인하여 5-fold 더 큰 허용 공부를 해야 샘플 볼륨. 이, 차례로, 각 분수에 펩 티 드의 부분 집합의 농도 증가 하 고 그로 인하여 낮은 풍부한 펩 티 드는 검출의 기회를 향상.
동시에 3 개의 proteomic 소프트웨어 고용 내 인 성 펩 티 드에 대 한 식별 전략을 수행 하 여 알려진된 CSF endopeptidome 이상 10 확장 가능 했다. 16,395 내 인 성 펩 티 드의 총 시료 풀링된 CSF에 예비 시험에서 확인 되었다. 식별 중 많은 수의 내 인 성 펩 티 드 단백질 신경 장애의 맥락에서 언급 이전에서 파생 했다. 위의 연구에서 확인 된 몇 가지 펩 티 드 현재 우리의 실험실에서 생체로 평가 되 고 있다. 이 프로세스가 합성 analogues 무거운 동위 원...

뇌 척추 액체 (CSF)에서 생체 신경 퇴행 성 질환으로 현재 연구를 변형 시키고 있다. 전세계1,2, 펩 티 드 아 밀 로이드 베타 단백질 타우 microtubule 안정화의 구성 된 바이오 마커 triplet 사람들은 Alzheimer의 질병, 60 백만 이상에 영향을 미치는 가장 일반적인 신경 장애, 그리고 phosphorylated 타우 형태, 높은 감도와 특이성, 질병을 검색할 수 있습니다 및 진단 연구 조건3에 포함 되었습니다. 다른 신경 퇴행 성 질환, 파 킨 슨 병, 다 발성 경화 증 등에서 proteomic 연구의 일부는 현재 임상 연구4,5 에서에서 평가 받고 있다 수많은 바이오 마커 후보 식별 6.
CSF에는 단백질, 함께 내 인 성 펩 티 드7,8,9,10,,1112의 풍부한을 또한 포함 되어 있습니다. 많은 두뇌 파생 된 단백질의 분열 제품 구성, 이러한 펩 티이 드 또한 질병 biomarkers의 잠재적으로 중요 한 소스를 나타냅니다. 인간 CSF에서 확인 된 내 인 성 펩 티 드의 재고 증가 및 CSF endopeptidomic 분석 임상 연구에 사용, 방법 개발 샘플 준비 및 LC MS 분석 (간단한 프로토콜 스키마에에서 포함 된 그림 1 ). 최근 연구에서이 방법의 응용 확대 알려진된 CSF endopeptidome ten-fold13일반적인 진단의 몇몇 개인에서 풀링된 CSF 샘플에 거의 16,400 생 CSF 펩 티 드의 식별에 결과. 메서드를 선택적으로 정량화를 위한 isobaric 라벨 방식으로 함께에서 사용할 수 있습니다.
샘플 준비
CSF 단백질 질량의 주요 소스는 플라즈마 성분 (알 부 민 및 면역 글로불린) 혈액 두뇌 방 벽14,15위에 통과. 그들의 높은 풍부 낮은 풍부 하 고, 두뇌 파생 샘플 구성 요소 검색에 지장을 초래할 수 있습니다. 내 인 성 펩 티 드를 쉽게 따라서 낮은 풍부한 펩 티 드의 탐지 하도록 LC MS 분석에 사용할 CSF 펩타이드 추출의 훨씬 더 큰 볼륨을 수 있도록 높은 풍부한 단백질에서 분리 수 있습니다.
여기에 제시 된 프로토콜에서 분자량 (MWCO) 잘라 여과 단백질 분수;에서 CSF 펩 티 드를 분리 사용 되었다 몇몇 이전에 사용 된 방법8,,910,11,,1216공부 한다. 여과 단계는 높은 pH 모바일 위상 그라데이션을 통해 오프 라인 RP HPLC 사전 분류 단계에 선행 되었다. 주요 구별 되 고 ph에 두 RP HPLC 단계를 수행 하 여 두 단계 사이의 선택의 차이 다른 펩 티 드 충전 상태 결과로 변경 된 펩 티 드 보존에서 주로 발생 합니다. 산 성 조건 하에서 LC-MS 전에 높은 pH 펩 티 드 사전 분류의 응용 프로그램 펩 티 드 식별17,18, 증가에 되도록 우수한이 목적을 위해 복잡 한 생물 학적 효과 입증 샘플 더 직각 분리 모드19, 강한 고양이-이온 교환 (SCX)와 RP20에 비해. 분석 시간 단축, 연결 체계를 사용 되었다, 모든 12번째 분수 (예를 들어, 분수 1, 13, 25, 37, 및 49), RP HPLC의 높은 분해능으로 인해 여전히 크게 다른 펩 티 드의 공동 차입을 피할 수 있는 풀링 LC-MS에서 분수20,21단계.
펩 티 드 식별
Peptidomic 연구에서 펩 티 드 식별이 다릅니다 proteomic 연구의 아무 효소 분열 데이터베이스 검색에 지정할 수 있으며 식별 요금은 일반적으로 낮은11는 결과적으로. 최근 연구13 했다 내 인 성 펩 티 드로 얻은 Sequest 및 마스코트에 대 한 식별 요금 각각 소프트웨어 프로그램의 알고리즘을 득점 하는 기본 적응 점수를 사용 하 여 수정 된 때에 상당히 개선 했다 여과기, 내 인 성 펩 티 드에 대 한 최적의 점수 알고리즘 tryptic 펩 티 드13의 다 나타내는 알고리즘입니다. 연구, 식별 소프트웨어 봉우리 (BSI)를 사용 하 여 자동 펩타이드 de novo 연속에 따라 두 조각 이온 지문 기반 검색 엔진에 무료 발견 했다, 그의 훨씬 더 큰 집합에서 결과 확인 펩 티 드입니다.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; 1 M 트리에틸암모늄 바이카보네이</td>트 <td>플루카, 시그마-알드리치</td><td>17902-100ML</td><td>티브</td></tr><tr><td>&nbsp; 8 M 구아니디늄 염산염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7294-100ML</td><td>GdnHCl</td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td><td>Pierce</td><td>20490</td><td>TCEP</td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>SIGMA</td><td>I1149-5G</td><td>IAA</td></tr><tr><td>Hydroxylamine 50% (w/w)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>457804-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004-2L</td><td>재질 보기</td></tr><tr><td>포름산</td><td>Fluka, Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>56302-1mL-F</td><td>FA</td></tr><tr><td>트리플루오르로아세트산</td><td>시그마-알드리치</td><td>T6508-10AMP</td><td>TFA</td></tr><tr><td>수산화암모늄 용액</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>30501-1L-1M</td><td>NH4OH</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 원심 필터 유닛과 Ultracel-30 멤브레인</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC903024</td><td>MWCO 필터</td></tr><tr><td>Sep-Pak C18, 100 mg</td><td>Waters</td><td>WAT023590</td><td>SPE-column</td></tr><tr><td>Resprep 12-port SPE Manifold&nbsp;</td><td>Restek</td><td>26077</td><td>진공 매니폴드</td></tr><tr><td>TMT10plex 등압 라벨 시약 세트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>90110</td><td>TMT10plex</td></tr><tr><td>UltiMate 3000 RSLCnano LC 시스템</td><td>Dionex</td><td>5200.0356</td><td>온라인 시료 분리</td></tr><tr><td>Ultimate 3000 RPLC 신속 분리 바이너리 시스템</td><td>Dionex</td><td>IQLAAAGABHFAPBMBEZ</td><td>오프라인 high-pH 분별</td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Tribrid 질량분석기</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td><td>시료 분석용 질량분석기</td></tr><tr><td>Proteome Discoverer 2.0&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>IQLAAEGABSFAKJMAUH</td><td>단백질체학 검색 플랫폼</td></tr><tr><td>Mascot v2.4</td><td>Matrix Science</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>단백질체학 검색 엔진</td></tr><tr><td>Sequest HT</td><td>Thermo</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>단백질체학 검색 엔진</td></tr><tr><td>피크스 v7.5&nbsp;</td><td>생물정보학 솔루션(Bioinformatic Solutions Inc.)</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>단백질체학 검색 엔진</td></tr><tr><td>찬사 PepMap 100, 75 &micro; m x 2cm, C18, 100 & Aring; 기공 크기, 3 & 마이크로; m 입자 크기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>164535</td><td>트랩 컬럼 (나노 HPLC)</td></tr> <tr><td>Acclaim PepMap C18, 75 &micro; m x 500mm, 100&Aring; 모공 크기,&nbsp; 2 &마이크로; m 입자 크기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>164942</td><td>분리 컬럼 (나노 HPLC)</td></tr> <tr><td>Savant SpeedVac 고용량 농축기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SC210A-230</td><td>SpeedVac / Vacuum 농축기</td></tr><tr><td>XBridge 펩타이드 BEH C18 컬럼, 130 &Aring;, 3.5 &마이크로; m, 2.1mm X 250mm</td><td>Waters</td><td>186003566</td><td>분리 컬럼(마이크로 HPLC)</td></tr></tbody></table>

인간의 중추 신 경계에서 endopeptidomic 분석을 위한 시료 준비

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

이 프로토콜 인간의 뇌 척추 액체 (CSF)에 내 인 성 펩 티 드를 식별 하기 위해 개발 하는 방법을 설명 합니다. 이 위해 이전 개발된 방법 분자량 컷오프 (MWCO) 여과에 기반 하 고 대량 spectrometric 분석 오프 라인 높은 pH 역 상 HPLC 사전 분류 단계와 결합 되었다.
CSF로 분 비 중추 세포에 의해 창 고 분자의 제거를 위한 주요 통로 이다. 따라서, 중앙 신경 시스템에 많은 프로세스 CSF, 그것에 게 귀중 한 진단 유체 렌더링에 반영 됩니다. CSF는 8-9 배나의 농도 범위에 걸쳐 있는 단백질을 포함 하는 복잡 한 구성, 있다. 단백질, 게다가 이전 연구 또한 내 인 성 펩 티 드의 많은 수의 존재를 증명 하고있다. 단백질 보다 덜 광범위 하 게 공부 하는 동안이 또한 생체로 잠재적인 관심을 고정할 수 있습니다.
내 인 성 펩 티 드 MWCO 여과 통해 CSF 단백질 함량에서 분리 되었다. 샘플에서 대부분의 단백질 콘텐츠를 제거 하 여 공부 샘플 볼륨 및 그로 인하여 또한 내 인 성 펩 티 드의 총 금액 증가 가능 하다. 침투 펩 티 드 혼합물의 복잡성 역 위상 LC MS 분석 전에 알칼리 pH에서 (RP) HPLC 사전 분류 단계를 포함 하 여 해결 했다. 분류는 결합 되었다 60 분수 12에 풀링된 했다 간단한 연결 계획, 분석 시간 소비 함으로써 감소 될 수 있었다 아직도 크게 공동 차입을 피하고 있는 동안.
자동화 된 펩 티 드 식별 3 가지 펩타이드/단백질 식별 소프트웨어 프로그램을 사용 하 고 이후 결과 결합 하 여 수행 되었다. 다른 프로그램 보완 보다는 세 사이 겹쳐 식별의 15%와 비교 했다.

여기 설명 하는 방법은 적용 되어 있으며 샘플 사전 분류 (표 1)을 도입 하기 전에 세 가지 연구에서 평가. 첫 번째 연구는 MALDI 표적 격판덮개에 CSF 분수를 안보에 대 한 오프 라인 LC를 사용 하 고 730 확인 된 내 인 성 펩 티 드11결과. 두 다음 연구에서 isobaric 라벨 고용 되었다. 케이스/제어에 주로 식별 및 CSF endopeptidome에 프로테옴 잠재적인 생체의 특성에 대 한 동시에 연구24, 두 번째 연구 isobaric labelling에 치료 효과 vivo에서 모니터링 사용 되었다 36 h16이상의 CSF에 펩 티 드 식에서 γ-secretase 억제제의. 케이스/제어 연구에 437 내 인 성 펩 티 드 확인 되었다, 64의 농도와 개인 사이 크게 변경 된와 건강 한 컨트롤. 셋째, 치료 연구, 식별 1798 내 인 성 펩 티 드, 11 모니터링...

인간의 뇌 척추 액체 (CSF)에 내 인 성 펩 티 드의 질량 spectrometric 분석 하는 방법을 제시 합니다. 채용 함으로써 분자량 컷오프 필터링, 크로마 사전 분류, 대량 spectrometric 분석 및 펩 티 드 식별 전략의 후속 조합, 그것은 거의 10 배 비해 알려진된 CSF peptidome 확장 가능 이전 연구입니다.

인간의 중추 신 경계에서 Endopeptidomic 분석을 위한 시료 준비

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

본 프로토콜의 목적은 내인성 펩타이드의 LC-MS 분석을 위해 인간 뇌척수액 샘플을 준비하고 분석하는 것입니다. LC-MS 전 단계에서 펩타이드 사전 분획 단계를 거치면 식별되는 펩타이드의 수가 증가하며, 상대적으로 저농도로 존재하는 CSF 펩타이드의 검출이 가능해집니다. CSF 내의 내인성 펩타이드는 아직 광범위하게 연구되지 않은 분자들로, 신경퇴행성 질환의 중요한 새로운 바이오마커를 포함하고 있을 가능성이 있습니다. 이 방법은 질량 분석법을 통해 CSF 펩티돔의 광범위한 특성 분석을 가능하게 합니다. 이 방법의 주요 장점은 저농도의 CSF 펩타이드 주입이 가능하다는 점과 다중 아이소바릭 라벨링 기술과 호환되어 임상 연구에 적용할 수 있다는 점입니다. 지금까지 우리는 이 방법을 주로 뇌척수액 분석에 적용해 왔습니다. 하지만 약간의 수정을 통해 혈장 및 조직 샘플 분석에도 사용할 수 있음을 나타내는 예비 데이터를 보유하고 있습니다. 먼저 롤러 믹서 위에서 실온으로 1.5 mL의 CSF 분주액을 해동하십시오. 해동이 완료되면 내용물을 10 mL 폴리프로필렌 튜브로 옮기십시오. 그리고 완충제로 1 M TAB 80 µL를 첨가하십시오. 그런 다음 단백질 응집체를 용해하기 위해 8 M guanidinium hydrochloride 0.65 mL를 첨가하고 실온에서 10분 동안 부드럽게 볼텍싱하십시오. 다음으로 200 mM 수용성 TCEP 60 µL를 첨가하고 55

sample-preparation-for-endopeptidomic-analysis-human-cerebrospinal

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

기록 포르말린 고정 및 (FFPE) 포함 된 파라핀은 임상 시료는 질병의 조사를 위해 가치있는 소재입니다. 여기에서 우리는 microdissected FFPE 조직의 깊이있는 단백체 분석을 허용하는 샘플 준비 워크 플로를 보여줍니다.

포르말린에서 프로테오믹스 샘플 준비 파라핀 조직에게 고정 및

우리는 뇌척수액 (CSF)에서 마이크로 RNA 프로필 실시간 PCR의 프로토콜을 설명합니다. RNA 추출 프로토콜을 제외하고, 절차는 다른 체액, 배양 된 세포 또는 조직 표본에서 추출한 RNA로 확장 될 수있다.

정량 실시간 PCR을 사용하여 뇌척수액의 마이크로 RNA 프로파일

인간과 쥐의 뇌 조직을위한 요소 / 티오 / SDS 버퍼를 사용하는 일반적인 단백질 추출 프로토콜은 허용 2D-DIGE 미니 2DE의 면역 블롯에 의해 그들의 연속 특성에 의한 단백질의 indentification. 이 방법은 인간의 조직 검사 및 실험 모델에서 더 많은 재현성 및 신뢰성있는 결과를 얻기 위해 하나를 할 수 있습니다.

합의 뇌 유래 단백질, 2D-DIGE 미니 2DE 면역 블롯을 모두 사용하여 인간과 쥐과 뇌 프로테옴 연구를 위해 추출 프로토콜

우리는 임상 번역 잠재력 개발 된 높은 처리량, 멀티 플렉스 및 대상 단백체 뇌척수액 (CSF) 분석에 대해 설명합니다. 시험은 예컨대 아포지 단백질 E 변형 (E2, E3 및 E4)과 같은 신경 퇴행에 대한 잠재적 마커 및 위험 인자를 정량하고, 그 대립 유전자 발현을 측정 할 수있다.

높은 처리량, 멀티 플렉스 및 대상 단백체 CSF 분석은 퇴행성 신경 바이오 마커 및 아포 지단백 E 이소 상태를 정량화하기

눈 microvascular 침대의 프로테옴 특성은 인 간에 있는 많은 눈 병 리의 깊이 있는 이해를 위해. 이 연구에서는 단백질 추출 및 질량 분석 기반 proteomics 분석 모델 선박으로 돼지 짧은 후부 속눈썹 동맥을 사용 하는 작은 혈관에서 샘플 준비, 급속 한, 효과적이 고 강력한 방법 보여 줍니다.

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여기에서는 신경 장애에 대한 microRNA(miRNA) 바이오마커의 공급원으로 작은 세포외 소포체를 얻기 위해 최소량의 신선 냉동 뇌 조직 절편과 크기 배제 크로마토그래피와 결합된 접근 가능한 고속 원심분리 방법을 사용하여 프로토콜을 구축합니다.

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심실 뇌척수 (CSF)는 배아의 초기 뇌 발달 동안 neuroepithelial과 대뇌 피질 전구 세포를 bathes. 여기에는 생물학적 기능을 조사하기 위해 다양한 연령대의 쥐 배아에서 심실 CSF를 분리하기 위해 개발 된 방법을 설명합니다. 또한, 우리는 우리의 대뇌 피질 explant의 해부와 문화 매체 또는 CSF의 최소한의 볼륨으로 explant 성장을 허용 문화 기술을 보여줍니다.

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인간의 중추 신 경계에서 Endopeptidomic 분석을 위한 시료 준비

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