인간의 중추 신 경계에서 Endopeptidomic 분석을 위한 시료 준비
2017년 12월 4일
인간의 뇌 척추 액체 (CSF)에 내 인 성 펩 티 드의 질량 spectrometric 분석 하는 방법을 제시 합니다. 채용 함으로써 분자량 컷오프 필터링, 크로마 사전 분류, 대량 spectrometric 분석 및 펩 티 드 식별 전략의 후속 조합, 그것은 거의 10 배 비해 알려진된 CSF peptidome 확장 가능 이전 연구입니다.
이 프로토콜의 목표는 내인성 펩타이드의 LC-MS 분석을 위해 인간 뇌척수액 샘플을 준비하고 분석하는 것입니다. LC-MS 이전의 펩타이드 사전 분획 단계는 식별된 펩타이드의 수를 증가시키고 상대적으로 존재비가 낮은 CSF 펩타이드를 검출할 수 있도록 합니다. CSF의 내인성 펩타이드는 광범위하게 연구되지 않은 칼슘 분자이며 잠재적으로 신경퇴행성 질환의 중요한 새로운 바이오마커를 포함할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 질량 분석법을 통해 CSF 펩티돔의 광범위한 특성 분석을 수행할 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 저농도 CSF 펩타이드를 주입할 수 있고 다중 동중원소 라벨링 기술과 호환되어 임상 연구에 적용할 수 있다는 것입니다. 지금까지 우리는 주로 이 방법을 뇌척수액 분석에 적용했습니다. 그러나 약간의 수정으로 혈장 및 조직 샘플 분석에도 사용할 수 있음을 나타내는 예비 데이터가 있습니다. 먼저 롤러 믹서에서 실온에서 1.5ml의 CSF 분취량을 해동합니다. 해동되면 내용물을 10ml 폴리프로필렌 튜브에 옮깁니다. 그리고 완충제로 80마이크로리터의 1몰 TAB을 첨가합니다. 그런 다음 0.65ml의 8몰 구아니디늄 하이드로클로라이드를 첨가하여 단백질 응집체를 용해시키고 실온에서 10분 동안 부드럽게 와류를 일으킵니다. 다음으로, 60 마이크로 리터의 200 밀리 몰 수성 TCEP에서 55에서 배양합니다.
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개요
본 연구는 인간 뇌척수액(CSF) 내 내인성 펩타이드의 질량 분석법을 제시합니다. 분자량 컷오프 여과, 크로마토그래피 전분획 및 질량 분석법을 활용함으로써, 본 연구는 알려진 CSF 펩티돔 범위를 크게 확장하며, 신경퇴행성 질환의 바이오마커로 활용될 수 있는 저발현 펩타이드의 식별 능력을 향상시켰습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 질량 분석법
- 바이오마커 발굴
배경
- CSF 내의 내인성 펩타이드는 신경퇴행성 질환을 식별하는 데 잠재적으로 중요한 의미를 가집니다.
- 저농도로 존재하는 CSF 펩타이드는 그동안 광범위하게 연구되지 않았습니다.
- 기존 방법들은 CSF 펩티돔에 대해 제한적인 데이터만을 제공해 왔습니다.
연구 목적
- 인간 뇌척수액(CSF) 내 내인성 펩타이드의 식별 및 특성 분석을 강화하기 위함입니다.
- 뇌척수액 펩티돔에 대한 보다 포괄적인 관점을 제공하기 위함입니다.
- 신경퇴행성 질환의 새로운 바이오마커 가능성을 탐색하기 위함입니다.
사용된 방법
- CSF 샘플의 사전 분획을 이용한 질량 분석법.
- 특정 시약을 사용하여 1.5 milliliter의 CSF 분주액을 해동하고 처리하는 과정이 포함됨.
- 다중 등량질 표지법(multiplex isobaric labeling) 기술과 호환됨.
- 약간의 수정을 통해 혈장 및 조직 샘플 분석에 적용 가능함.
주요 결과
- 이 방법은 이전 연구들에 비해 훨씬 더 많은 수의 펩타이드를 검출할 수 있게 해줍니다.
- 주요 결과는 이전에 탐색되지 않았던 저발현 펩타이드의 존재를 나타냅니다.
- 새로운 바이오마커의 발견으로 이어질 수 있는 통찰력을 제공합니다.
결론
- 본 연구는 CSF 펩티돔을 특성화하는 효율적인 접근 방식을 제시합니다.
- 이 방법의 다각적인 활용 가능성은 신경퇴행성 질환에 대한 임상 연구의 길을 열어줍니다.
- 신경 메커니즘을 이해하고 질병 마커를 식별하는 데 잠재적인 시사점을 제공합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
이 방법은 신경퇴행성 질환의 바이오마커 발굴을 위한 핵심 생체 유체인 인간 뇌척수액 내 저농도 내인성 펩타이드의 검출 능력을 향상시킵니다. MWCO 분획을 통해 단백질 복잡성을 줄이고, 고-pH RP-HPLC 사전 분획을 통해 펩타이드 커버리지를 개선함으로써 타겟 검증을 위한 분석 민감도를 높입니다. 이러한 접근 방식은 더 심층적인 펩티돔 프로파일링을 가능하게 하여 메커니즘적 리스크 감소를 지원하며, 이는 중추신경계(CNS) 신약 개발 프로그램에서 초기 단계의 타겟 신뢰도 확보 및 예측 바이오마커 선정에 유용한 정보를 제공할 수 있습니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 과학적 가치: CNS 병태생리학적 과정을 반영하는 내인성 펩타이드 집단의 분석을 가능하게 하여, 표적 가설 검증을 지원합니다.
- 운영적 가치: 고농도로 존재하는 CSF 단백질로 인한 동적 범위 간섭을 줄여, 경로 조절과 관련된 저농도 신호 펩타이드의 검출 능력을 향상시킵니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 분석 표준화를 위해 일관된 LC-MS/MS 판독을 가능하게 하는 재현 가능한 펩타이드 분획 패턴을 생성합니다.
- 운용적 가치: 다중 등량 표지(multiplex isobaric labeling)와 호환되어 바이오마커 스크리닝 워크플로우에서 질환군과 대조군 간의 비교 펩티돔 분석이 가능합니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: 신경퇴행성 질환 기전과 상관관계가 있을 수 있는 CSF 유래 펩타이드를 식별함으로써 바이오마커 발굴을 용이하게 합니다.
- 운용적 가치: 약간의 수정으로 혈장 및 조직 샘플에 적용 가능하여, 중개 연구 파이프라인 내에서 샘플 간 교차 검증을 지원합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 초기 발견 연속체(early discovery continuum) 내에 적합하며, 리드 물질 발굴 및 전임상 검증 단계 이전의 가설 기반 펩티돔 탐색을 지원합니다.
- 발견 생물학: 내인성 펩타이드의 편향되지 않은 프로파일링을 지원하여 질환 관련 경로를 규명하고 표적 선택의 리스크를 줄입니다.
- 스크리닝: 시료의 복잡성을 낮추고 크로마토그래피 분리능을 향상시켜 높은 신뢰도의 펩타이드 검출을 가능하게 합니다.
- 분석: 비교 연구를 위한 라벨 기반 멀티플렉싱과 호환되는 정량적이고 분획 해상도가 높은 펩타이드 데이터를 생성합니다.
- 중개 연구: CSF 펩티돔 변화를 신경퇴행성 과정과 연결함으로써 바이오마커 정렬을 위한 기반을 제공합니다.
- 기업적 재사용: MWCO 여과, 고-pH 분획 및 LC-MS로 구성된 핵심 워크플로우를 여러 실험실에 표준화하여 재현 가능한 펩티돔 분석을 수행할 수 있습니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 펩타이드 식별 수율을 높이고, 메커니즘 또는 질병 상태의 지표가 될 수 있는 저농도 종의 검출을 가능하게 함.
- 운영적 가치: 표준화된 사전 분획을 통해 재현성을 향상시키고 복잡한 생체 유체 분석의 기술적 변동성을 줄임.
- 전략적 가치: CSF 내에서 관찰 가능한 생물학적 공간을 확장함으로써 표적 검증의 결정 신뢰도를 높임.
- 포트폴리오 영향: 더 넓은 펩티돔 커버리지와 개선된 신호 검출을 통해 위험 조정된 바이오마커 우선순위 지정을 지원함.
실행 시 고려 사항
- CSF 취급, 프로테아제 억제 및 질량 분석법 기반 펩티돔스 분야의 전문 지식이 필요합니다.
- 장비로는 high-pH 분획화 호환성 및 민감한 펩타이드 검출 능력을 갖춘 LC-MS/MS 시스템이 포함되어야 합니다.
- 사이트 간 표준화를 위해 일관된 MWCO 필터 선택, 분획 결합 및 소프트웨어 기반 식별 매개변수가 필요합니다.
- 혈장 또는 조직에 적용할 경우, 서로 다른 매트릭스 복잡성을 고려하여 용해, 제거 및 분획 조건을 최적화해야 합니다.
- 실질적인 제한 사항으로는 여과 과정 중 발생할 수 있는 펩타이드 손실과 저농도 표적 분석으로 인한 세심한 오염 제어의 필요성이 있습니다.
바이오 제약 FAQ
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Pre-treatment of Bulk Volume CSF without Quantification
2:24
Pre-treatment of Small Volume CSF Samples with Isobaric Labeling
4:00
MWCO Filtration, Desalting, and Sample Clean-up by Solid Phase Extraction
6:00
Offline High-pH Reverse Phase HPLC Sample Fractionation
7:09
LC-MS Analysis
7:47
Results: Peptide Identification After LC-MS Analysis
9:13
Conclusion
