Methylene 청색 색소를 주입 하 여 요로 분기점 방해 결함 평가

이 절차의 전반적인 목표는 메틸렌 염료를 신장에 주입하여 요로 접합부의 폐쇄를 확인하는 것입니다. 이 방법은 요관 방광 연결과 같은 신장 및 하부 요로 발달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 최악의 경우 종괴 발생 시 요로 구조를 시각화할 수 있는 간단한 방법을 제공하여 요로 발달 분석을 가능하게 한다는 것입니다.

실험을 시작하려면 메틸렌 블루 파우더 0.1g을 측정하십시오. 메틸렌 블루를 10ml의 1x 인산염 완충 식염수 또는 PBS에 용해시키고 혼합물을 와류로 만듭니다. 다음으로, 주사기 필터로 밀리리터당 10밀리그램의 메틸렌 블루 용액을 여과하여 주입 중 막힘을 제거합니다.

그런 다음 3밀리리터 일회용 주사기로 멸균 두피 정맥 세트를 조립하고 주사기에 3밀리리터의 여과된 메틸렌 블루 용액을 채웁니다. 70% 에탄올로 해부 가위와 집게를 청소합니다. E18.5 또는 E19.5에서 주산기 배아를 채취하려면 먼저 이산화탄소 흡입을 사용하여 임신한 마우스를 안락사시킵니다.

그런 다음 NIH 지침에 따라 경추 탈구를 수행합니다. 다음으로 동물의 복부 표면에 70 % 에탄올을 분사합니다. 그런 다음 멸균 해부 가위와 집게를 사용하여 복강을 복부로 엽니다.

자궁 전체를 들어 올려 자궁 뿔 끝에서 몸과 분리합니다. 그런 다음 페트리 접시에 1x PBS로 자궁 전체를 헹굽니다. 해부 가위로 자궁을 분절하고 해부 겸자로 태반 데시두아를 제거하여 배아와 난황낭을 노출시킵니다.

먼저 난황낭을 제거한 다음 해부 겸자로 양막을 제거하여 주산기 배아를 해방시킵니다. 해부 가위로 배아의 목을 베십시오. 배아의 복부 표면이 위로 향하게 하여 이미징용 디지털 카메라가 장착된 해부 현미경에 배아를 고정합니다.

유전형 분석을 위해 꼬리를 수집합니다. 겸자를 사용하여 피부를 조심스럽게 찢어 배아의 복강을 엽니다. 그런 다음 간, 위, 장 등 여분의 장기와 조직을 겸자로 잘라내거나 당겨 등쪽에 위치한 신장, 요관, 방광을 노출시켜 조심스럽게 제거합니다.

멸균 거즈 패드로 절개된 배아에서 과도한 혈액을 흡수한 다음 염료 주입을 계속합니다. 정수압에 의해 바늘 끝에서 메틸렌 블루 용액을 배출하여 바늘과 튜브의 기포를 제거합니다. 염료 용액이 들어 있는 주사기를 바늘 끝 높이 위로 들어 올려 흐름을 시작합니다.

그런 다음 주사기를 내려 흐름을 멈춥니다. 다음으로, 바늘을 근위 요관 근처의 신장 골반에 삽입하되, 일단 삽입되면 바늘을 방해하지 않도록 주의합니다. 신장에 염료를 주입하여 요로 폐색을 확인합니다.

신장 골반에 바늘 하나를 삽입한 후, 이 검사의 성공은 신장을 통과하거나 혈관 쪽으로 가지 않고 요관 쪽으로 신장 골반에 바늘을 삽입해야 합니다. 주사기를 약 20cm 위로 들어 올려 정수압을 제공하고 15-16 마이크로 리터의 염료 용액이 흐르도록합니다. 그런 다음 염료의 파란색을 모니터링하여 먼저 신장 골반에서 시작하여 요관의 길이, 마지막으로 방광 내강에서 모니터링합니다.

주사기를 내려 염료의 흐름을 멈추고 신장에서 바늘을 제거합니다. 신장의 수소화증, 수뇨관 및 염료 용액의 최종 위치를 실험실 노트에 기록합니다. 마지막으로 반대쪽 신장을 주사하고 총 20초 동안 염료가 흐르도록 합니다.

신장, 요관 및 방광의 이미지를 실체 현미경에 연결된 카메라와 이미징 프로그램을 사용하여 염료 용액으로 추적하여 촬영합니다. 한쪽 신장에 주입된 후 메틸렌 블루 염료는 신장 골반에서 요관을 통해 방광으로 흘러 들어가 요관과 방광 내강에 눈에 띄는 파란색을 띱니다. 양쪽 신장에 염료를 주입한 후 약 20초 후에 더 긴 흐름으로 인해 방광 내강에 더 강한 파란색이 나타나는데, 이는 두 번째 비뇨기계에 요로 접합 폐쇄가 없음을 나타냅니다.

비정상적으로 팽창된 수뇨관을 주입할 때 염료 용액의 최종 위치가 불분명합니다. 그리고 요관 연접 폐쇄 또는 UVJO는 비정상적인 수뇨관이 중간에 손상되어 방광 내강에 염료가 없어도 확인할 수 없습니다. 이 절차를 시도하는 동안 온전한 비뇨기계를 얻기 위해 염료 주머니 주산기 배아를 계산하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

그리고 염료 흐름을 막지 않도록 기포를 제거하십시오.