TIP60의 과도 한 소모 후 유 방 상피 세포 이동의 라이브 영상

이 절차의 전반적인 목표는 세포 이동에 대한 특정 관심 유전자의 고갈의 영향을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 암세포 이동과 같은 암 전이의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 동적 세포 이동을 실시간으로 모니터링할 수 있다는 것입니다.

이 방법에 대한 아이디어는 종양 억제제인 TIP60 환자의 세포 형태 변화를 관찰할 때 처음 떠올랐습니다. 10cm 접시당 3ml의 배양 배지에 100만 개의 유방 상피 세포를 파종하는 것으로 시작합니다. 실험용 세포 배양액에 실온 배양 SRINA 혼합물 20분을 한 방울씩 첨가합니다.

두 접시를 수동으로 흔들어 세포가 고르게 분포되었는지 확인한 후 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣습니다. 6시간 후, 상등액을 접시당 8ml의 신선한 배양 배지로 교체하고 배양액을 인큐베이터로 되돌립니다. 다음 날 아침, 상등액을 접시당 3ml의 신선한 배양 배지로 교체하고 방금 시연한 대로 실험용 세포 배양액에 SIRNA 혼합물의 두 번째 패치를 추가하여 세포를 인큐베이터로 되돌리기 전에 접시를 흔들어 시약이 완전히 혼합되었는지 확인합니다.

그런 다음 6시간 후에 상등액을 8ml의 신선한 배양 배지로 교체하고 밤새 배양물을 배양합니다. 3일째에는 플레이트당 2ml의 BPS로 세포를 한 번 세척하고 접시당 1ml의 tripson EDTA로 두 플레이트의 세포를 섭씨 37도에서 20분 동안 분리합니다. 배양이 끝나면 플레이트당 4ml의 완전 배양 배지로 반응을 중지합니다.

피펫팅으로 세포를 재현탁하고 세포 현탁액을 개별 15ml 튜브로 옮깁니다. 원심분리를 통해 세포를 수집하고 튜브당 5ml의 무혈청 배지에 펠릿을 재현탁합니다. 계산 후에, 600, 밀리리터 농도 당 000의 세포에 두 세포 배양물을 다 묽게 하고 100%confluency를 지키기 위하여 24의 웰 판의 1개의 우물에 각 배양물에서 세포의 500 마이크로리터를 추가하십시오.

모든 세포가 파종되면 플레이트를 앞뒤로, 좌우로 부드럽게 흔들어 균일하게 분포되도록 하고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 24시간 동안 놓습니다. 관심 유전자의 knock-down 효율을 확인하려면 다른 원심분리로 수집 튜브에 남아 있는 세포를 수집하고 실시간 정량 PCR 평가를 위한 제조업체 지침에 따라 상용 시약을 사용하여 펠릿에서 RNA를 분리합니다. 다음 날 아침, 라이브 셀 이미징을 시작하기 최소 1시간 전에 현미경과 온도 조절기를 켭니다.

온도를 섭씨 37도로 설정하고 이산화탄소 가스 공급을 5%로 설정합니다.챔버가 섭씨 37도에 도달하면 위상차 현미경을 사용하여 셀이 합류하고 웰 바닥에 완전히 부착되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 각 웰 중앙의 전체 길이를 직선으로 부드럽게 긁고 모든 웰을 무혈청 배지로 5회 부드럽게 세척하여 분리된 세포를 제거합니다. 마지막 세척 후, 각 웰에 1ml의 무혈청 배지를 첨가하십시오.

현미경 스테이지에 플레이트를 놓습니다.tage 10 파워 대물렌즈 아래 방출된 빛을 카메라 대신 접안렌즈로 향하게 합니다. 수동으로 초점을 조정하여 각 상처와 그 주변의 세포를 찾습니다. 그런 다음 방출된 빛을 카메라로 다시 되돌리고 라이브 셀 관찰 시스템을 사용하여 상처의 위치를 표시하고 시간 조건을 설정합니다.

적절한 실험 기간 동안 세포를 이미지화한 다음 적절한 이미징 소프트웨어에서 첫 번째 avi 비디오를 열고 m track j 플러그인을 엽니다. 추가 탭을 클릭하여 단일 세포에 대한 트랙을 추가하고 침입 전선의 끝에 있는 세포 하나와 자체적으로 이동할 수 있는 세포 하나를 선택합니다. mtrackJ를 사용하여 비디오에서 선택한 셀의 움직임을 추적하여 트래피킹을 추적합니다.

그런 다음 측정 탭을 클릭하여 셀 이동의 거리를 측정하고 트랙과 함께 비디오를 avi 형식으로 저장합니다. TIP60이 고갈된 후 유방 상피 세포는 대조 배양 세포에 비해 중간엽이 더 많습니다. 실제로, TIP60 발현과 상피 세포 접착 분자 발현은 siTIP60 치료 후 현저히 감소합니다.

반면에, TIP60 고갈 시 특정 상피에서 중간엽 전이 드라이버 유전자로의 발현이 증가합니다. 상처 투여 후 세포 배양의 실시간 이미징은 siControl 배양에 비해 siTIP60 처리 세포의 세포 이동이 더 빠르며, TIP60 고갈에 대한 반응으로 관찰된 이동 세포의 비율이 크게 증가함을 보여줍니다. 또한, siControl 세포는 시트로 이동하는 반면, siTIP60 배양 내에서는 더 많은 단일 세포 이동이 관찰됩니다.

이 동영상을 시청한 후에는 라이브 셀 이미징 기술을 사용하여 세포 이동의 동적 변화를 모니터링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.