Name: 레이저 유도 된 망막 변성 및 재생 Zebrafish 모델 뮐러 명과 셀 활성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: 배우세요 레이저로 유도한 망막 손상 후 제브라피시에서 뮐러 신경교세포 활성화와 재생 과정을 실시간 모니터링하는 방법을. OCT 영상과 면역조직화학을 통해 손상 부위의 형태학적 변화와 세포 반응을 정밀하게 관찰할 수 있습니다.

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우리가 그녀의 우수한 기술 지원에 대 한 모델 및 Federica Bisignani 설정에서 그녀의 과학적인 입력에 대 한 마틴 Zinkernagel, 메릴랜드, 박사 학위 및 Reisenhofer, 박사 미리 암 감사 합니다.

모든 실험 성명 안과 및 안과 (ARVO)에 비전 연구를 위한 협회의 비전 연구에서 동물 사용에 대 한 준수 하 고 존중 하는 정부 기관의 관련된 규정.
 1. 동물 <ol><li>유지 TgBAC (gfap:gfap-GFP) zebrafish 167 (AB) 스트레인 26.5 ° C의 온도와 물 표준 조건 하에서 6-9 개월 ~ 14/10 h 명암 주기 18 세.</li>
	<li>정부 당국에 의해 승인 후 동물 실험에 대 한 관련 기관의 동물 보호 지침을 따릅니다.</li>
</ol> 2. 가역 전신 마 취 <ol><li>준비 물 탱크 그리고 트리 스의 1 M의 2.1 mL 97.9 ml tricaine 분말의 400 밀리 그램을 용 해 하 여 에틸 3 aminobenzoate methanesulfonate 소금 (tricaine)의 재고 솔루션 버퍼링 식 염 수 (TBS). 어둠 한 달에에서 4 ° C에서 1 M Tris (pH 9)와 저장소 pH 7.0 조정. 
	참고: Tricaine는 동물의 자연 생활 상태 처럼 물에 준비 되어야 한다, 원래 탱크 물 사용 하는 선호.</li>
	<li>재고 솔루션 1시 25분 탱크 물에 희석 하 고 즉시 사용.</li>
	<li>10 cm 배양 접시 그들이 움직이지 되 고 외부 자극 (약 2-5 분, 무게와 연령에 따라)에 응답 하지 않는 때까지 마 취 솔루션 50 mL를 포함 하는 제 브라 넣습니다.</li>
	<li>전송할 각 물고기 손으로 레이저 치료 ( 그림 1A)에 대 한 맞춤 실리콘 핀 홀더. 
	주의! 물고기 탱크를 10 분만에 외부 마 취 남아 있을 수 있습니다.</li>
	<li>치료 및 이미징 후 마 취를, 물 탱크를 포함 하는 컨테이너에서는 zebrafish 장소.</li>
	<li>Zebrafish 물에 앞뒤로 이동 하 여 만들 신선한 탱크 물의 흐름 아가미 이상으로 복구를 지원 하기 위해.</li>
</ol> 3. 망막에 초점 부상 레이저 참고: A 532 nm 다이오드 레이저는 zebrafish의 망막에 초점 빛 피해를 만드는 데 사용 됩니다. 레이저의 실험 설정 수 성인 제 브라에서 재현할 수 초점 망막 상해의 설립.
<ol><li>레이저의 출력 설정: 70 mW; 공중 직경: 50 µ m; 펄스 기간: 100 양 주의! 레이저 빛 사용 하려면 적절 한 개인 보호와 지역의 라벨.</li>
	<li>치료 전에 눈에 붙이기 2 %hydroxypropylmethylcellulose 1-2 방울을 적용 하 고 2.0 m m 저 레이저 렌즈를 사용 하 여 초점을 망막에 레이저를 목표로 빔. 
	주의! hydroxypropylmethylcellulose 방울 점성 있고 아가미에가 경우 호흡에 문제를 일으킬 수 있습니다.</li>
	<li>왼쪽에 시 신경 주위 장소 4 레이저 명소 눈과 눈을 오른쪽, 치료를 사용 하 여 내부 통제로.</li>
</ol> 4. Vivo에서 망막 형태학의 이미징 <ol><li>마 취에서 그들 되살리는 없이 시각화 zebrafish 망막 레이저 유도 후에 직접적으로 0 일에. 전신 마 취를 사용 하는 전혀 다른 시간 포인트 (섹션 2 참조: 가역 전신 마 취). 맞춤 실리콘 핀 홀더 ( 그림 1 B, B.1)에 고정된 zebrafish 장소.</li>
	<li>최적의 이미지를 잘라 zebrafish 눈에 맞게 상용 하이드로 겔 콘택트 렌즈 (Ø 5.2 m m, r = 2.70 m m, 중심 두께 = = 0.4 m m) 구멍 펀치를 사용 하 여. 스 렌즈의 오목한 표면 작성 및 각 막 위에 놓습니다.</li>
	<li>78 D 비 접촉 슬릿 램프 렌즈 OCT 시스템을 장비.</li>
	<li>집중은 IR 적외선 (IR) 이미지 + 10 월 모드 ( 그림 2A)는 적외선을 눈의 저 시각화를 클릭 하 여 그림에서 &#34; 취득 &#34; 버튼 ( 그림 2B) 지역화 하는 레이저 시스템을 사용 하 여 망막에 반점 &#39; s 소프트웨어.</li>
	<li>시각화 IR + 10 월 망막 층의 3 차원 섹션 모드를 클릭 하 여 사진의 찍을 하 고는 &#34; 취득 &#34; 버튼 ( 그림 2B). 외부 핵 층 (ONL)에서 상해의 심각도 관찰 (섹션 3 참조: 레이저 망막에 초점 부상) 이러한 이미지.</li>
	<li>치료 및 이미징 zebrafish는 물 탱크를 포함 하는 컨테이너에 배치 후 마 취를.</li>
	<li>Zebrafish 물에 앞뒤로 이동 하 여 만들 신선한 탱크 물의 흐름 아가미 이상으로 복구를 지원 하기 위해.</li>
	<li>망막 형태론의 비슷한 vivo에서 이미징을 수행 하는 하루에 1, 3, 7, 14 및 주 6.</li>
</ol> 5. 되며 &#38; 오신 (H &#38; E) 얼룩 <ol><li>zebrafish 감기 (4 ° C)에 침수에 의해 안락사 마 취 솔루션 enucleate 및 적어도 10 분 동안 얼음에 눈 즉시으로 의미의 작은 곡선된 겸 자.</li>
	<li>20 h 4 ° C에서 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 4 %paraformaldehyde (PFA)에서 전체 눈을 해결 하 고 다음 등급된 알코올 시리즈에서 샘플을 탈수 (크 실 렌 에탄올 70%, 3 분 두 번에 대 한 에탄올 96%, 에탄올 100 %5 분 두 번, 5 분 두 번에 대 한 100 %3 미 n 한 번). 
	주의! PFA는 눈, 코, 그리고 상부 호흡기 트랙에 자극 수 있습니다. PFA는 알려진된 인간 발암 물질 의심된 생식 위험.</li>
	<li>파라핀에 샘플을 포함, 시 신경 머리의 수준에서 5 µ m 섹션을 잘라 고 유리 슬라이드에 탑재.</li>
	<li>5 분 0.1% 산 되며 솔루션 deparaffinized 섹션 얼룩 및 염 산 믹스에 슬라이드를 찍기 후 두 번 증류수에에서 슬라이드를 찍어 (2 mL 25% HCl 250 ml에서 증 류 물) 및 암모니아 (250 ml에서 2 mL 25% 암모니아를 혼합 소 주 물)입니다. 적어도 10 분에 대 한 수도 물에 의해 얼룩이 지는 hematoxylin의 개발 후 오신 G 용액 0.5 %3 분에 대 한 섹션을 얼룩</li>
	<li>아크릴 수 지 장착 매체에 탈수 슬라이드를 탑재 하 고 가벼운 현미경 슬라이드 관찰.</li>
</ol> 6. MC 활성화 Immunohistochemistry <ol><li>적절 한 기선 또는 10-15 분 동안 전자 레인지에 3 분에 대 한 항 원 검색 버퍼 (트리 스-EDTA + 0.05% 비 이온 세제, pH 9.0)에서 deparaffinized 섹션을 열 및 5 TBS와 세 번 씻어 각 분.</li>
	<li>원형 한 실리콘 섹션 펜 및 100 µ L를 추가 차단 솔루션 (TBS + 10% 염소 정상 혈 청 + 1% 소 혈 청 알 부 민, pH 7.6) 1 헤에 대 한 실 온에서</li>
	<li>안티 폐해 fibrillary 산 성 단백질으로 얼룩 (GFAP) 토끼 polyclonal 항 체 그리고 방지 글루타민 합성으로 (GS) 마우스 단일 클론 항 체, 1: 200 희석 (샘플 당 40 µ L)에서 모두. 하룻밤에 4 ° C에서 습도 챔버 슬라이드를 품 어. TBS + 0.1%로 세 번 세척 5 분 트윈 20.</li>
	<li>완료 시각화와 적절 한 2 차 항 체입니다. 이 프로토콜 사용 하는 염소-토끼 IgG H &#38; GFAP와 염소 반대로 마우스 IgG H L 녹색 이차 항 체 &#38; L GS, 1 헤에 대 한 실 온에서 1: 500 희석에 모두 밝은 빨간색</li>
	<li>DAPI를 포함 하는 설치 매체와 함께 슬라이드를 탑재 하 고 형광 현미경 슬라이드 관찰.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

제 브라에서 망막 재생/변성 cytotoxin 중재 세포 죽음22, 기계적 상해23, 열 상해24등 다른 방법으로 조사 되었습니다. 우리 고용 zebrafish 망막 손상 532 nm 다이오드 레이저. 따라서, 우리의 모델 몇 가지 장점을 제공합니다. 예를 들어, 우리는 급속 하 게 외부 망막, PRs 계층에서 특히에 상해의 잘 정의 된 영역을 만들었습니다. 또한,이 실험 설정 안 neovascularization를 유도 Bruch의 막 손상에 의해, 예를 들어 다른 생물 학적 과정을 공부 하는 손상의 더 큰 영역을 생산 하기 위해 수정할 수 있습니다. 최소한의 피해 이며 재생 응답의 타이밍은 정확 하 게 그리고 reproducibly 변조 될 수 있습니다.
Phenotypical 변화 시간이 지남에 따라, 우리는 하이델베르크 Spectralis 시스템...

비전 아마 인간의 가장 필수적인 의미 이며 그 장애는 높은 사회 경제 충격. 공업화 한 세계에서 망막 퇴행 성 질병 시력 손실과 실명 성인 인구1중의 대다수를 위한 계정. 망막 화 (RP)에 영향을 미치는 약 1.5 백만 사람들 전세계2,360와 20의 나가 사이 사람들에서 실명의 가장 일반적인 상속 된 원인입니다. 그것은 상속 된 망막 장애 망막 안료 상피 하 고, 그 후, gliosis의 변성 및 내부 신경4개조 (PRs) 대뇌의 진보적인 손실에 의해 특징의 다른 유형의 가족. 질병의 과정 봉, 희미 한 빛에 콘, 컬러 비전 및 시력5에 필수적인 색 비전에 대 한 책임은 일반적으로 시작 하는 두 홍보 세포 유형에의 증분 손실에 의해 설명 될 수 있다. 단일 유전자 결함은 RP를 일으킬 충분 합니다. 지금까지 45 유전자에서 130 개 이상의 돌연변이 질병6와 연결 되었습니다. 이 다양 한 질병 고기 리드 이며 유전자 치료는 비 일반화할 이유 중 하나 이렇게 복잡 한 치료 접근. 그러므로, 망막 유년에 눈부신 질병 치료에 새로운 일반적인 치료 접근을 개발 하는 긴급 한 필요가 있다.
종종 망막 변성 관련 홍보 손실; 따라서, 홍보 세포 죽음은 망막7에 퇴행 성 프로세스의 특징 이다. 그것은 이미 홍보 세포 죽음 뮐러 명과 셀 (MC) 활성화와 확산8자극 입증 되었습니다. MCs, 척 추가 있는 망막에 주요한 glial 세포 유형 망막 신경 세포 사이 아무것도 "접착제" 보다는 더 많은 것 한 번 고려 되었다. 최근 몇 년 동안, 많은 연구 MCs 단순한 구조 보다는 더 많은 지원9행동 나타났습니다. 다른 기능 중 MCs 성체에도 참여 하 고10을 복구 합니다. 실제로, 악화 망막에서 diffusible 요소에 대응, MCs 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP) 식 크게 증가. 그러므로, GFAP 라벨로 망막 상해 및 변성11응답 보조 MC 활성화에 대 한 표식으로 사용할 수 있습니다.
최근, 우리 개발 zebrafish (Danio rerio) 망막 변성을 유도 하는 레이저를 사용 하 여 초점 상해의 소설을 각 색을 했다. 초점 부상 부상된 사이트에 셀의 이동 및 망막 재생12중 사건의 정확한 타이밍 등 특정 생물 학적 과정을 공부에 대 한 유리 하다. 또한,는 zebrafish가 되고있다 시각적 연구에 중요 한 다른 척추 동물의 시각적 시스템 사이의 유사성 때문에. 인간과 teleost retinae의 심한 형태학 및 조직학 특징 몇 가지 차이점을 표시합니다. 따라서, 인간과 zebrafish retinae 망막 프로젝션 뉴런, 신경 절 세포 안쪽에 거주 하는 동안 빛 감지 대뇌 바깥쪽 레이어를 차지 같은 계층된 패턴에 같은 주요 셀 클래스 포함 신경 층, 렌즈에 인접입니다. 망막 수, amacrine, 바이 폴라, 및 가로 셀, 포토 리셉터와 신경 절 세포 층13사이 지역화합니다. 또한, zebrafish 망막은 콘 지배 하 고 따라서 보다, 예를 들어 집중적으로 공부 쥐 망막 인간의 망막에 더 가까이. 매혹적인 차이 teleost 및 포유류 물고기 망막과 망막 재생 손상 후에 지속적인 성체입니다. Zebrafish, MCs dedifferentiate를 중재 부상된 망막14,15에서 재생 됩니다. 닭, MCs는 또한 세포 주기를 다시 입력 하 고 dedifferentiate 일부 용량을가지고. 성인 물고기에 망막 상해 다음 MCs는 새로운 신경16생산을 손상 된 망막 조직을 마이그레이션할 조상 및 줄기 세포의 특정 특성을 채택. 진 식 포유류 MCs의 프로 파일링 망막 창시자, 예기치 않은 유사점 그리고 닭고기, 설치류, 심지어 인간의 망막에 MCs의 본질적인 neurogenic 잠재력에 대 한 증거는17성장 하 고 있다. 그럼에도 불구 하 고, 왜 재생 응답 조류와 포유류에 낮은 물고기에 강력한 응답 비교는 아직 이해 되지. 따라서, zebrafish에 내 생 수리 메커니즘을 이해 포유류와 인간 자극 망막 중생에 대 한 전략을 제안할 수 있습니다. 망막 변성 환자 치료를 위한 치료 도구로 MCs의 내 생 수리 메커니즘을 채용 우리 사회에 대 한 뛰어난 영향을 미칠 것 이다.
여기, 우리 안과 연구에서 변성/재생 모델을 고용 하는 데 필요한 단계를 제공 합니다. 우리는 먼저 부상 사이트, 그리고 인접 한 MCs의 마지막으로 머릿속 참여 개발 이벤트의 이미징에 다음 neurosensory 망막에서 초점 손상을 유도에 집중 했다. 일반적인 프로토콜 비교적 쉽게 수행 하 고 다양 한 망막을 나중에 평가 대 한 가능성을 엽니다.

<table><tbody><tr><td>산성 헤마톡실린 용액</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td><td>2852</td><td></td></tr><tr><td>알부민</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td><td>A07030</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>Dako Pen</td><td>Dako, Glostrup, Danmark</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 마운팅 매체</td><td>Vector Labs, Burlingame, CA, USA</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Eosin G 수용액 0.5%</td><td>Carl Roth, Arlesheim, Switzerland</td><td>X883.2</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 디아민 테트라아세트산(EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, 스위스</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 IgG H & L 알렉사 플루오&reg; 488</td><td>Life Technologies, Zug, 스위스</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG H& L 알렉사 플루오&reg; 594</td><td>Life Technologies, Zug, Switzerland</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>염소 노멀 세럼</td><td>Dako, Glostrup, Danmark</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>하이드로겔 콘택트렌즈</td><td>Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland</td><td>n.a.1-Day</td> <td>Acuvue Moist</td></tr><tr><td>Hydroxypropylmethylcellulose 2%</td><td>OmniVision, Neuhausen, Switzerland</td><td>n.a.Methocel</td> <td>2%</td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td><td>A5040</td><td>Tricaine, MS-222</td></tr><tr><td>Visulas 532s</td><td>Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany</td><td>n.a.532nm</td> <td>레이저</td></tr><tr><td>마우스 anti-GS monoclonal antibody</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>MAB302</td><td></td></tr><tr><td>HRA + OCT 이미징 시스템</td><td>Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany</td><td>n.a.Spectralis</td><td></td></tr> <tr><td>Heidelberg Eye Explorer</td><td>Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany</td><td>n.a.Version</td> <td>1.9.10.0</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-GFAP polyclonal anti anti GFAP polyclonal antibody</td><td>Invitrogen, Waltham, MA, USA</td><td>180063</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 핀 홀더</td><td>Huco Vision AG Switzerland</td><td>n.a.</td><td>살균 트레이의 실리콘 핀 매트에서 손으로 자릅니다.</td></tr><tr><td>슬릿 램프 BM900</td><td>Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>슬릿 램프 어댑터</td><td>Iridex Corp., Mountain View, CA, USA</td><td>n.a.Superfrost</td><td></td></tr> <tr><td>Plus 유리 슬라이드</td><td>Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain</td><td>KIT, Karlsruhe, Germany</td><td>15204</td><td>http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3</td></tr><tr><td>Tris buffered saline (TBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td><td>P5912</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>78D 비접촉 슬릿 램프 렌즈</td><td>Volk Optical, Mentor, OH, USA</td><td>V78C</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Ocular Fundus laser</td><td>lens Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA</td><td>OFA2-0</td><td></td></tr><tr><td>2100 Retriever</td><td>Aptum Biologics Ltd., 사우샘프턴, 영국</td><td>R2100-EU</td><td>스티머</td></tr></tbody></table>

레이저 유도 된 망막 변성 및 재생 zebrafish 모델 뮐러 명과 셀 활성화

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

매혹적인 차이 teleost 및 포유류 망막 신생 및 심각한 손상 후 재생 teleost 망막의 평생 가능성은. Zebrafish에 재생 경로 조사 포유류에서 망막 퇴행 성 질환의 치료를 위한 혁신적인 전략을 개발 하는 새로운 통찰력을가지고 있습니다. 여기, 우리는 532 nm 다이오드 레이저에 의하여 성인 zebrafish에 외부 망막에 초점 병 변의 유도에 집중 했다. 지역화 된 부상 망막 변성 및 손상의 지역에서 직접 재생 하는 동안 자리를 차지할 생물 학적 프로세스를 조사 하 고 있습니다. 비-침략 적 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)를 사용 하 여, 우리는 손상 된 지역 및 모니터 후속 중생의 위치를 정의 하 수 있었다 vivo에서. 실제로, 10 월 영상만 사용할 수 있었던 이전 조직학 분석 정보를 제공 하는 제 브라 망막의 고해상도, 단면 이미지를 생성 합니다. 조직학 단면도 수행한 실시간 10 월에서 데이터를 확인, 그리고 망막 상해의 유도 후 재생 응답 immunohistochemistry에 의해 조사 되었다.

실시간 10 월: 망막 수리에 MCs의 역할 분석, 우리 zebrafish 망막에 손상의 잘 delineated 영역 유도 레이저 부상 모델 사용. 손상의 사이트 했다 vivo에서 10 월 처음으로 (0 일) 부상 (그림 3)에 따라 60 분 이내에 의하여 몇 군데. 물고기 눈의 광학에 대 한 보상, 맞춤 콘택트 렌즈는 각 막에 배치 했다. 레이저 치료 후 즉시 확산 하이퍼 반사 신호 외부 망막 (화살표)에 지역화 되었습니다. 그것은 외부 plexiform 레이어 (OPL) 망막 안료 상피 (RPE)에서 연장. 유사한 신호는 또한 1 일에 감지. 3 일 후이 확산 신호는 더 조직 되 고 밀도 되었다. 그것은 지속적으로 외부 핵 층 (ONL) 포토 리셉터 레이어로 확장에 보였다. 첫 주 (7 일)에 따라 평균 병 변 크기에 상당한 감소와만 작은 하이퍼 반사 신호 감지 되었습...

Zebrafish는 척추 동물의 망막 변성/중생의 메커니즘 연구 인기 동물 모델입니다. 이 프로토콜에서는 내부 망막에 최소한의 손상으로 외부 망막을 방해 하는 지역화 된 상해를 유도 하는 방법을 설명 합니다. 망막 형태학 및 망막 재생 내내 뮐러 명과 응답 이후, vivo에서 모니터링합니다.

레이저 유도 된 망막 변성 및 재생 Zebrafish 모델 뮐러 명과 셀 활성화

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

이 영상의 전반적인 목표는 제브라피시에서 국소적 레이저 유도 망막 손상 후 생체 내(in vivo) 세포 변화를 모니터링하는 방법을 보여주는 것입니다. 이 모델은 형태학적 변화, 역학 및 관여하는 세포 유형과 같은 망막 재생의 핵심 질문에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 국소적 손상을 유도함으로써 손상 부위에서 생물학적 과정을 직접 조사할 수 있다는 점입니다.이 방법은 제브라피쉬 망막의 재생에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 다른 동물 모델의 복구 메커니즘 연구에도 적용될 수 있습니다. 400 mg의 tricaine 분말을 97.9 mL의 수조 물과 2.1 mL의 1 M TBS에 녹여 마취제 스톡 용액을 준비하십시오. pH 9의 1 M tris를 사용하여 pH 7.0으로 조정하십시오.작업 용액을 만들려면 tricaine 스톡 용액을 수조 물에 1:25 비율로 희석한 후 50 mL를 페트리 접시에 옮깁니다. 그런 다음, 제브라피시가 움직이지 않고 외부 자극에 반응하지 않을 때까지 마취 용액에 2~5분 동안 둡니다. 각 물고기를 손으로 집어 레이저 처리를 위해 맞춤 제작된 실리콘 핀 홀더로 옮깁니다.적절한 마취는 동물의 안녕과 실험 절차의 성공을 위해 매우 중요합니다. 따라서 갓 조제한 tricaine 용액을 사용하는 것이 핵심이며, 물 밖으로 꺼내 놓는 시간은 10분을 크게 초과해서는 안 됩니다. 532 nanometer 다이얼 레이저의 출력 전력을 70 milliwatts로, 펄스 지속 시간을 100 milliseconds로, 빔 직경을 50 microns로 설정하십시오.그 다음, 2% hydroxypropyl methylcellulose를 눈에 한두 방울 점안합니다. methylcell을 점안할 때, 점성이 있는 용액이 아가미로 들어가지 않도록 주의하십시오. 이어서, 2 millimeter 안저 레이저 렌즈를 사용하여 레이저 조준 빔을 망막에 초점을 맞춥니다.왼쪽 눈의 시신경 주변에 네 개의 레이저 점을 생성하고, 치료하지 않은 오른쪽 눈을 내부 대조군으로 사용합니다. 레이저 유도 직후, 마취 상태인 제브라피시를 이미징 영역 내의 맞춤 제작된 실리콘 핀 홀더에 놓습니다. 최적의 영상을 얻기 위해, 펀치를 사용하여 시중에서 판매되는 하이드로겔 콘택트렌즈를 제브라피시 눈 크기에 맞게 자릅니다.렌즈의 오목한 표면을 메틸셀룰로스로 채운 후, 이를 각막 위에 배치하십시오. 광간섭 단층촬영(OCT) 시스템에 78D 비접촉식 슬릿 램프 렌즈를 장착하십시오. IR 및 OCT 모드에서 적외선 영상을 초점으로 맞추어 안저를 시각화하십시오.그 다음, 획득(acquire) 버튼을 클릭하여 IR 사진을 촬영함으로써 망막의 레이저 스팟 위치를 확인합니다. 이어서 IR 및 OCT 모드에서 망막 층의 3차원 단면을 시각화하고, 획득(acquire) 버튼을 클릭하여 사진을 촬영합니다. 이 이미지들에서 외핵층(outer nuclear layer)의 손상 정도를 관찰하십시오.처치 및 영상 촬영 후 마취를 해제하려면 제브라피시를 수조 물이 담긴 용기에 넣으십시오. 회복을 돕기 위해 제브라피시를 물속에서 앞뒤로 움직여 아가미 위로 신선한 수조 물이 흐르게 하십시오. 레이저 처치 직후, 확산된 고반사 신호가 외망막에서 국소적으로 관찰되었습니다.이는 망막 색소 상피에서 외망상층까지 연장되었습니다. 대조군인 비손상 안구의 망막에서는 확산성 고반사 신호가 나타나지 않습니다. 손상 후 1일 차에 유사한 확산성 고반사 신호가 검출되었습니다.3일 후, 이 확산된 신호는 더 조직화되고 밀도가 높아졌습니다. 이 신호는 외핵층에서 광수용체층으로 확장되며 지속적으로 관찰되었습니다. 1주일이 지난 후, 평균 병변 크기가 상당히 감소했으며, 작은 고반사 신호만이 검출되었습니다.14일째부터 조사된 마지막 시점까지 IR 및 OCT 이미지에서 레이저 반점이 더 이상 관찰되지 않았으며, 망막의 형태는 여기에서 보이는 대조군 측과 유사합니다. 망막 퇴행 및 재생의 정도와 역학을 조사하기 위해 H&E 염색을 실시하였습니다. 이 이미지는 대조군 절편을 보여줍니다.이 이미지는 광수용체 손실이 최대치로 나타나는 손상 3일 후의 H&E 염색 결과를 보여줍니다. 글리아 세포 마커인 glutamine synthetase(빨간색)와 glial fibrillary acidic protein(초록색)을 시각화하기 위해 면역조직화학 염색을 수행하였습니다. 이 이미지는 GFAP를 나타내는 초록색 형광이 거의 관찰되지 않는 대조군 망막을 보여줍니다.손상 후 3일째에 GFAP 신호는 상향 조절된 반면, 붉은색의 glutamine synthetase 신호는 변하지 않은 채 유지되었습니다. 이 절차 이후, 내인성 복구 기전에서 분자 세포의 관여를 연구하기 위해 이광자 현미경 관찰과 같은 다른 방법뿐만 아니라 세포 및 분자 분석을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 제브라피쉬 망막에 국소적 손상을 유도하고 이후의 퇴행 및 재생 과정을 생체 내에서 모니터링하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

mller-glia-cell-activation-laser-induced-retinal-degeneration

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 레이저 손상을 사용하여 성인 제브라피시의 망막 변성을 유도하는 절차를 보여줍니다. 레이저는 망막의 광수용체 세포를 표적으로 삼아 세포 사멸과 퇴행성 과정을 유발합니다. 이 손상은 뮐러 신경교세포(MG) 세포를 활성화하여 망막 재생을 돕는 줄기세포 전구세포로 역분화시킵니다.

Targeting Retinal Degeneration and Regeneration in Zebrafish Using a Focal Laser Injury(초점 레이저 손상을 사용한 제브라피시의 망막 퇴행 및 재생 모델링)

출처: Lahne, M., et.al. 다광자 현미경에 의한 라이브 셀 이미징을 위한 성체 형질전환 제브라피시 망막 외식의 배양. J. Vis. Exp. (2017)이 비디오는 빛에 의한 광수용체 손상 후 아가로스가 박힌 제브라피시 망막 이식에서 Muller 신경교세포 핵 이동의 라이브 셀 이미징을 보여줍니다. 손상된 광수용체에 의해 방출된 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)는 뮐러 신경교세포(Muller glial cell)를 활성화하여 유사분열 및 신경 전구 생성(neuronal progenitor) 생성을 위해 내핵층과 외핵층을 통한 핵 이동을 유발합니다. 캡처된 이미지는 망막 재생 중 핵 이동과 전구 세포 분화의 역학을 보여줍니다.

제브라피시 망막 재생 중 Muller Glial 핵 이동의 라이브 셀 이미징

말초 신경계 (PNS)가 부상 후 중요한 수리 할 수​​ 있지만, 거의가이 현상을 제어하는​​ 세포 및 분자 메커니즘에 대해 잘 알려져 있습니다. 라이브 형질 전환 제브라 피쉬와 재현 신경 절개 분석하여, 우리는 신경 변성과 재생 중에 동적 아교 세포의 행동을 공부할 수 있습니다.

모터 신경 절개와 라이브 제브라 피쉬의 아교 세포 행동의 시간 경과 영상

복수의 가벼운 손상 프로토콜은 손상 광수를 설명하고 결과적으로 성인 zebrafish에있는 망막 재생 반응을 유도하고 있습니다. 이 프로토콜은 안료 동물에서 사용할 수있는 개선 된 방법을 설명하고 그로드하고 전체 망막에 걸쳐 콘 광수의 대부분을 손상.

성인 Zebrafish의 망막 재생 연구에있는 사용을위한 비발 한 가벼운 손상 패러다임

여기에서 우리는 망막 있도록 지연 및 재생과 성인 제브라 피쉬에서 N 메틸 N의 -nitrosourea을 사용하여 시각 기능에 미치는 영향의 정량화를 보여줍니다. 시력의 손실 및 감소 감광체 번호는 내부 핵 층에 확산하여 관찰 하였다. 완전한 형태 학적 및 기능적 재생은 30 일 초기 치료 후 발생했습니다.

조직 학적 및 기능적 특성 : Methylnitrosourea (MNU)는 망막 변성과 재생 제브라 피쉬에서 유도 된

개별 세포에 지시된 스트레스나 사멸을 일으키는 표적 조작은 상대적으로 수행하기가 어려웠습니다. 여기에서는 세포 배양 및 살아있는 동물에서 개별 세포에 선택적으로 스트레스를 가하고 죽이는 단일 세포 해상도 절제 접근법을 표준 컨포칼 UV 레이저를 기반으로 설명합니다.

기존의 UV 레이저 공 초점 현미경을 사용하여 트리거 세포 스트레스와 죽음

제브라 망막 재생이 거의 고정 된 망막을 이용하여 연구되었다. 그러나, interkinetic 핵 마이그레이션 동적 프로세스는 재생 반응 중에 발생 및 기본 메커니즘을 조사하기 위해 라이브 세포 이미징을 필요로한다. 여기, 우리는 광자 현미경을 사용하여 Interkinetic 핵 마이그레이션 (INM) 실시간을 모니터링하는 문화 및 이미징 조건을 설명합니다.

다중 광자 현미경으로 라이브 셀 이미징을위한 성인 형질 전환 Zebrafish의 망막의 Explants의 문화

레이저 절제는 생물학적 시스템의 재생을 연구하는 데 널리 적용되는 기술입니다. 제시된 프로토콜은 제브라피시 측면에서 신경마비 세포를 재생시키는 레이저 절제 및 후속 시간 경과 화상 진찰을 위한 표준 레이저 스캐닝 공초점 현미경의 사용을 설명합니다.

제브라피시 간 신경종 세포의 공초점 현미경 기반 레이저 절제 및 재생 분석

본 프로토콜은 유충 취급을 위한 자동화된 미세유체 플랫폼과 결합된 레이저 병변 시스템을 사용하여 제브라피쉬 유충에서 조직 특이적이고 재현성이 높은 부상을 유도하는 방법을 기술한다.

제브라피쉬 유충의 척수 재생 연구를위한 제어 된 반자동 레이저 유도 부상

이 기사는 망막 입력이 광학 텍텀의 성장과 발달에 어떻게 영향을 미치는지 조사하기위한 첫 번째 단계로 살아있는 제브라 피쉬 유충에서 눈을 외과 적으로 제거하는 방법을 설명합니다. 또한이 기사는 애벌레 마취, 고정 및 뇌 해부에 대한 정보를 제공하고 면역 조직 화학 및 공초점 이미징을 제공합니다.

살아있는 제브라 피쉬 유충의 눈 제거는 시각 시스템의 신경 의존적 인 성장과 발달을 조사합니다.

이 프로토콜은 형질전환 제브라피쉬 모델을 사용하여 망막 색소 상피(RPE)를 유전적으로 제거하는 방법론을 기술한다. 약리학적 화합물을 이용한 신호전달 경로 조절을 통합하도록 프로토콜을 적응시키는 것은 광범위하게 상세하다. 색소침착을 기반으로 RPE 재생을 정량화하기 위한 MATLAB 플랫폼이 개발되어 발표되고 논의됩니다.

니트로환원효소/메트로니다졸 매개 절제 및 제브라피쉬 망막 색소 상피의 재생 연구를 위한 MATLAB 플랫폼(RpEGEN)

배우세요 레이저로 유도한 망막 손상 후 제브라피시에서 뮐러 신경교세포 활성화와 재생 과정을 실시간 모니터링하는 방법을. OCT 영상과 면역조직화학을 통해 손상 부위의 형태학적 변화와 세포 반응을 정밀하게 관찰할 수 있습니다.

레이저 유도 된 망막 변성 및 재생 Zebrafish 모델 뮐러 명과 셀 활성화

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