레이저 유도 된 망막 변성 및 재생 Zebrafish 모델 뮐러 명과 셀 활성화

이 비디오의 전반적인 목표는 제브라피시에서 레이저로 인한 국소 망막 손상 후 생체 내에서 세포 변화를 모니터링하는 방법을 보여주는 것입니다. 이 모델은 형태학적 변화, 동역학 및 관련된 세포 유형과 같은 망막 재생의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 국소 손상을 유도함으로써 부상 부위에서 생물학적 과정을 직접 조사할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 제브라피시 망막의 재생에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 동물 모델의 복구 메커니즘을 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다. 97.9mm의 탱크 물과 2.1mm의 1몰 TBS에 트리카인 분말 400mg을 용해하여 마취제의 원액을 준비합니다. pH 9에서 1개의 어금니 트리스로 pH 7.0으로 조정합니다.

작업 용액을 만들려면 트리카인 원액을 탱크 물에 1-25로 희석하고 50ml를 페트리 접시에 옮깁니다. 그런 다음 제브라피시가 움직일 수 없게 되고 외부 자극에 반응하지 않을 때까지 2-5분 동안 제브라피시를 마취액에 넣습니다. 레이저 치료를 위해 각 물고기를 맞춤형 실리콘 핀 홀더에 손으로 옮깁니다.

적절한 마취는 동물의 복지와 시술의 성공에 매우 중요합니다. 따라서 갓 준비한 트리카인 용액이 매우 중요하며 물 밖으로 나가는 시간은 10분을 훨씬 초과해서는 안 됩니다. 532나노미터 다이얼 레이저의 출력 전력을 70밀리와트로, 펄스 지속 시간을 100밀리초로, 공중 직경을 50미크론으로 설정합니다.

그런 다음 2% 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 1-2방울을 눈에 바릅니다. 메틸셀을 눈에 바를 때는 점성이 있는 용액이 아가미로 들어가지 않도록 한다. 다음으로, 2mm 안저 레이저 렌즈를 사용하여 레이저 조준 빔을 망막에 초점을 맞춥니다.

왼쪽 눈의 시신경 주위에 4개의 레이저 스팟을 배치하고 치료되지 않은 오른쪽 눈을 내부 제어로 사용합니다. 레이저 인덕션 직후, 여전히 마취된 제브라피시를 이미징 영역의 맞춤형 실리콘 핀 홀더에 놓습니다. 최적의 이미지를 얻으려면 시중에서 판매되는 하이드로겔 콘택트 렌즈를 홀 펀치를 사용하여 제브라피쉬 눈에 맞게 자릅니다.

수정체의 오목한 표면을 메틸셀룰로오스로 채운 다음 각막 위에 놓습니다. 광간섭 단층촬영 시스템에 78D 비접촉 슬릿 램프 렌즈를 장착하십시오. IR 및 OCT 모드에서 적외선 이미지의 초점을 맞춰 눈의 안저를 시각화합니다.

그런 다음 획득 버튼을 클릭하여 IR 사진을 촬영하여 망막의 레이저 스폿을 배치합니다. 그런 다음 IR plus OCT 모드에서 망막 층의 3차원 섹션을 시각화하고 획득 버튼을 클릭하여 사진을 촬영합니다. 이 이미지에서 외부 핵층의 손상 정도를 관찰하십시오.

치료 및 이미징 후 마취를 역전시키려면 제브라피시를 탱크 물이 담긴 용기에 넣으십시오. 회복을 지원하려면 제브라피시를 물 속에서 앞뒤로 움직여 아가미 위로 신선한 탱크 물의 흐름을 만듭니다. 레이저 치료 직후, 확산성 과반사 신호가 망막 바깥쪽에 국한되었습니다.

그것은 망막 색소 상피에서 바깥쪽 망상층까지 확장되었습니다. 확산성 과반사 신호는 대조군의 병변이 없는 눈의 망막에는 없습니다. 부상 후 첫날에 감지된 유사한 확산 과반사 신호.

3일째 이후, 이 확산 신호는 더 조직적이고 조밀해졌습니다. 그것은 바깥쪽 핵층에서 일관되게 보였으며 광수용체층으로 확장되었습니다. 첫 주가 지나자 평균 병변 크기가 크게 감소했으며 작은 과반사 신호만 감지되었습니다.

14일째부터 조사된 최신 시점까지 레이저 스팟은 IR 및 OCT 이미지에서 더 이상 보이지 않았으며 망막의 형태는 여기에서 볼 수 있는 대조군과 비슷합니다. H&E 염색은 망막 변성 및 재생의 범위와 역학을 조사하기 위해 사용되었습니다. 이 그림에서는 컨트롤 섹션을 보여 줍니다.

이 이미지는 최대 광수용체 손실이 명백한 손상 후 3일 후에 H&E 염색을 보여줍니다. 신경교세포 마커인 글루타민 합성효소(glutamine synthetase)를 빨간색으로, 신경교섬유산성 단백질(glial fibrillary acidic protein)을 녹색으로 시각화하기 위한 면역조직화학(Immunohistochemistry)을 수행했습니다. 이 이미지는 녹색 형광이 거의 없는 대조 망막을 보여주며, 이는 GFAP를 나타냅니다.

GFAP 신호는 부상 후 3일째에 상향 조절된 반면, 적색 글루타민 합성효소 신호는 변하지 않았습니다. 이 절차에 따라 내인성 복구 메커니즘에서 분자 세포의 관여를 연구하기 위해 세포 및 분자 분석뿐만 아니라 두 광자 현미경 검사와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 제브라피시 망막에 국소 손상을 유도하는 방법과 다음과 같은 퇴행성 및 재생 과정을 생체 내에서 모니터링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.