Vivo에서 예방 접종 모델을 사용 하는 항 원 특정 T-셀 Cytolytic 함수의 검색에 대 한 분석 결과

이 실험의 전반적인 목표는 쥐 모델에서 표적 세포의 생체 내 항원 특이적 사멸을 검출할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 면역학 분야의 질문, 예를 들어 공격받은 면역 체계에서 표적 세포의 항원 특이적 세포 용해 사멸의 충분성 및 검출, 생체 내 기능을 향상시키기 위해 T 세포를 조작하여 이를 수정할 수 있는 방법과 같은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 분석이 종양 성장이나 감염에 의존하지 않기 때문에 연구자가 항원 특이적 세포 용해 가능성을 직접 신속하게 평가할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 발표하는 것은 Cara Haymaker와 Yared Hailemichael이 흑색종 종양학과에서 우리에게 지시할 것입니다. 마우스 마취 후 텍스트 프로토콜에 따라 70% 이소프로필 알코올을 사용하여 주사를 위해 꼬리 베이스 영역에 스프레이합니다. 주사기에 부착된 27 게이지 바늘을 사용하여 베벨 면이 위를 향하게 하여 꼬리 베이스 영역에 4-5mm를 관통하고 미리 준비된 펩타이드 용액 100마이크로리터를 주입합니다.

그런 다음 백신 주사 부위 측면으로 100마이크로리터의 항-CD4D 항체를 주사합니다. 백신 접종 부위에 마우스 당 50mg의 이미퀴모드 크림을 조심스럽게 바르십시오. 크림이 더 이상 보이지 않고 완전히 흡수될 때까지 크림을 표면에 문지릅니다.

그런 다음 100 마이크로 리터의 100, 000 IUs를 복강 내 재조합 인간 rhIL-2 단백질의 밀리리터 당, 하복부 부위에 주입합니다. 마우스에서 비장 세포를 분리하고 적혈구를 용해 한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 완전한 배지에서 밀리리터당 6번째 세포에서 10에서 6번째 세포로 세포를 먼저 재현탁하여 펩타이드 펄스를 수행합니다. 세포를 두 개의 15ml 원추형 튜브로 나누고 pulsed 또는 unpulsed로 표시합니다.

OVA 257 - 264 펄스의 경우 pulsed라고 표시된 튜브에 펩타이드 밀리리터당 1마이크로그램을 추가합니다. 그런 다음 펄스가 있는 세포와 펄스가 없는 세포를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 펄스 튜브와 비펄스 튜브 모두에 10ml의 완전한 배지를 추가하여 표적 세포를 세척합니다.

그런 다음 나머지 세포를 475 x g과 실온에서 5분 동안 회전시킨 후 초자연극물을 흡인합니다. 2%FBS가 있는 RPMI 1640에 밀리리터당 1마이크로리터의 CSFE를 첨가하여 밀리미터당 5마이크로몰의 최종 농도를 얻어 CSFE 고표지 배지를 준비합니다. 그런 다음 2% FBS가 있는 RPMI 1640에 밀리리터당 1마이크로리터의 CSFE를 추가하여 최종 농도가 밀리리터당 0.5마이크로몰이 되도록 CSFE 저표지 배지를 준비합니다.

표적 비장질을 라벨링하려면 준비된 CSFE 고표지 배지로 펄스 세포의 밀리리터당 10에서 6번째 세포를 재현탁하고, CSFE 낮은 표지 배지로 펄스가 없는 세포의 밀리리터당 10에서 6번째 세포를 재현탁합니다. 부드러운 반전 또는 소용돌이로 세포 현탁액을 혼합합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 15분 동안 세포를 배양하고 5분마다 세포를 재혼합합니다.

다음으로, 각 세포 현탁액에 10ml의 완전 배지를 첨가하고 475 x g 및 실온에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 흡인하고 10ml의 차가운 PBS를 사용하여 세포를 재현탁합니다. PBS 세척을 반복하기 전에 475 x g 및 섭씨 4도에서 5분 동안 세포를 회전시킵니다.

세포를 계수하고 펩타이드 펄스 CSFE 고표지 세포와 비펄스 CSFE 저표지 세포를 1:1 비율로 혼합하여 수용 마우스에 주입합니다. baseline 유세포 분석 평가에 사용하기 위해 10에서 6번째 혼합 세포의 1 곱하기 부분 표본을 유지하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 표적 세포를 주입 및 재분리한 후 표준 유세포 분석 프로토콜을 사용하여 CTL 활성을 평가하고 excitation을 위해 488 나노미터 레이저와 함께 FITC 채널을 사용하여 세포를 획득합니다.

CSFE 표지된 표적 세포를 주입하기 전에 CSFE 높은 표적 세포와 CSFE 낮은 표적 세포 모두의 기준선 빈도를 결정하기 위해 유세포 분석기에서 1:1 세포 혼합물을 실행했습니다. 다음은 CSFE 모집단의 변화를 감지하기 위한 게이팅 전략입니다. 초기 게이트는 FSC 및 SSC 매개변수를 사용하여 만들어졌습니다.

그런 다음 빈도의 변화를 평가하기 전에 총 CSFE 양성 세포를 subgation했는데, 이는 이 집단이 표지되지 않은 내인성 spenlocytes와 비교할 때 상대적으로 작기 때문입니다. 주사 전 CSFE 집단의 상대적 빈도의 예가 여기에 나와 있으며 1:1에 가까워야 합니다. 코벡스 프라이밍(covex priming)의 필요성은 이 패널에서 볼 수 있으며, 주입 후 24시간 동안 항원 펄스 CSFE 고표적 세포의 사멸이 관찰되지 않았습니다.

이 수치는 주입 전에 관찰된 피크가 거의 검출되지 않았고 비율이 50%에서 1%로 급격히 이동했기 때문에 항원 펄스 CSFE 고표지 표적 세포의 효과적인 사멸을 보여줍니다. 마지막으로, 이 그림은 또한 주입 후 6시간 및 24시간 모두에서 이 집단의 손실을 평가하여 항원 펄스 CSFE 고표지 표적 세포 사멸의 동역학을 보여줍니다. 이 기술을 완전히 익히면 항원과 T 세포 기능에 따라 2-3일 안에 수행할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 CSFE 라벨링은 균일해야 하며 분석을 수행하기 전에 CTL 반응의 역학을 평가해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 ELISA, ELISPOT 및 세포 내 유세포 분석 염색과 같은 다른 방법을 수행하여 효과기 기능의 변화를 평가하고 다른 추가 질문에 답할 수도 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 감염이나 종양이 없는 경우 생체 내 CTL 기능을 평가하는 방법을 잘 이해할 수 있을 것입니다.