Name: Vivo에서 예방 접종 모델을 사용 하는 항 원 특정 T-셀 Cytolytic 함수의 검색에 대 한 분석 결과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: 배우세요 생쥐 모델에서 항원 특이적 세포독성 살상을 검출하는 면역학 프로토콜을. T세포 조작을 통한 면역 기능 강화와 빠른 세포독성 잠재력 평가 방법을 익히세요.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 NIH 연구에 의해 지원 (A1R03AI120027 (RN)와 1R21AI20012 (RN)), 제도적 연구 그랜트 (RN), 시작 (RN) 부여, 그리고 MD 앤더슨 CIC 시드 부여 (RN).

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 텍사스 대학 MD 앤더슨 암 센터의에 의해 승인 되었습니다.
1입니다. 백신에 대 한 펩 티 드의 준비
<ol><li>인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 적절 한 농도와 30에 대 한 소용돌이와 동결 건조 된 펩 티 드를 분해 s. 참고: hgp10025-33, 최종 농도 1 mg/mL 및 OVA257-264, 최종 농도 0.5 mg/mL입니다. 주입 전에 펩타이드 reconstitute 재구성 후 저장 하지 마십시오.</li>
</ol>2입니다. 유전자 변형 마우스에서 Splenocytes의 격리
참고: 셀 별개로 비장의 살 균 방식으로 수행 되어야 합니다.
<ol><li>
승인 된 CO2 질 메서드를 사용 하 여 OT-1 유전자 변형 마우스를 안락사 하 고 비장을 제거 합니다. 참고: 적절 한 유전자 변형 마우스는 선택의 펩 티 드에 대 한 특정이 단계에서 이용 된다.<ol>
<li>그것의 오른쪽에 마우스를 놓는다. 스프레이 70% 에탄올 (EtOH) 마우스의 왼쪽. 집게를 사용 하 여 피부를 끌어와 수술가 위;를 사용 하 여 피부를 잘라 비장은 복 강 내 표시 되지 것입니다. 부드럽게 잘라 오픈 액세스 비장 하 복 막 구멍. 집게를 사용 하 여 비장을 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
(1% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 PBS) 2 mL 매체 A와 페 트리 접시에 70 µ m 필터에 그것을 배치 하는 플런저의 끝으로 비장을 스매싱 하 여 비장을 세분화.
	<ol>
<li>페 트리 접시를 50 mL 원뿔 튜브에 장소는 splenocytes를 수집 합니다. 매체 수집 하는 모든 셀을 두 번 A의 5 mL를 페 트리 접시를 씻어. 매체는 최대 25 mL를 추가 하 고 셀 475 x g에 실 온에서 5 분 동안 원심.</li>
	</ol>
</li>
	<li>셀을 발음 하 고 1 ml에서 / 비장 적혈구 (RBC) 세포의 용 해 버퍼를 resuspend. 품 어 5 분에 대 한 실 온에서 매체 A의 추가 10 mL와 475 x g.에 상 온에서 원심 분리기 Resuspend 매체 A의 10 mL에 펠 릿 및 셀 서 스 펜 션 깨끗 한 50 mL 원뿔형으로 70 µ m 필터를 통해 필터링 하 여 파편을 제거.</li>
	<li>
Trypan 블루와 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 10의 최종 농도에 PBS에 셀 resuspend6 -6 셀/100ml. OVA257-에 대 한 특정264 106 셀/mL에서 resuspend, 및 hgp100에 대 한25-33 특정 1006 셀/mL에서 resuspend.
	<ol>
<li>스핀 475 x g.에서 5 분 동안 실내 온도에 남아 있는 세포는 상쾌한 발음 하 고 세포를 씻어 15 mL 차가운 PBS에 resuspend. 한 번 더 세척 단계를 반복 합니다. 스핀 475 x g.에서 5 분 동안 실내 온도에 세포는 상쾌한 발음 하 고 최종 볼륨 단계 2.4에서에서 결정에 따라 차가운 PBS에 resuspend.</li>
		<li>단일 세포 현 탁 액 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 전송 하 고 받는 사람 C57/BL6 마우스에 주사까지 얼음에 계속.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 유전자 변형 쥐에서 Splenocytes의 주입
<ol><li>등 쪽으로 restrainer에서 받는 사람 C57/BL6 마우스를 놓습니다. 스프레이 분사 꼬리 기본 영역 70% 이소프로필 알콜. 경사 면 27 G 바늘을 사용 하 여 꼬리 정 맥에 정 맥의 단일 세포 현 탁 액 (제 2) 100 µ L를 관리할 수 있습니다.</li>
</ol>4. Covax 관리
참고: 셀 오후에 주입 하는 경우 covax 해야 관리할 수 세포 주입의 18 h 이내 다음 아침.
<ol><li>1-3 %isoflurane 분명 마 취 상자에 마우스를 놓습니다. 후 마우스는 완전히 마 취, 마 취 실에서 매니폴드에 연결 된 코 콘 쥐 전송. 마우스를 등 쪽 사이드와 절제 된 유지. 참고: Anesthetization 철수 반응 elicited 하지 확인 하려면 간단한 발가락 핀치에 의해 확인 된다. 연방 법률 허가 수 의사 순서 isoflurane 사용을 제한합니다.</li>
	<li>스프레이 분사 꼬리 기본 영역 70% 이소프로필 알콜. (단면도 1)에서 펩 티 드 솔루션의 100 µ L를 피하 주사 꼬리 기본 지역 위로 향하도록 바늘 경사 쪽으로 4-5 밀리미터를 관통 하는 주사기 27 G 바늘을 사용 하 여. 참고: 쥐 꼬리10의 기지에서 피하 주사와 함께 하나의 측면에서 예방 접종.</li>
	<li>백신 주사 사이트를 100 µ L 안티-CD40 항 체 (주식 0.5 mg/mL) 측면을 주입.</li>
	<li>예방 접종 사이트에 imiquimod 크림 50 mg/마우스를 신중 하 게 적용 됩니다. 크림은 더 이상 볼 수 하 고 완전히 흡수 될 때까지 imiquimod 크림 표면에 문질러.</li>
	<li>Intraperitoneally 100000 IU/mL rhIL-2 단백질의 100 µ L를 주사 (i.p.) 더 낮은 복 부 지역에. 그들은 완전히 마 취에서 회복 후 5 분 동안 쥐를 관찰 합니다. 참고: 실험은 일시 중지이 시점에서 3 일 동안.</li>
</ol>5. 격리의 대상 Splenocytes CFSE와 라벨에 대 한
참고: 셀 별개로 비장의 살 균 방식으로 수행 되어야 합니다.
<ol><li>승인 된 CO2 질 방법 C57BL/6 마우스 안락사 2.1.1 단계에서 spleen(s)를 제거 합니다. 비장을 세분화 하 고 세척 단계 2.2.1-2.2.3에서와 같이 splenocytes. 붉은 혈액 세포 단계 2.3-2.3.2에서 lyse</li>
	<li>hemocytometer를 사용 하 여 계산에 대 한 셀을 제거 하 고6 셀/10ml CFSE 라벨 솔루션 (7 단계에서 설명)에서 세포의 최종 농도 대 한 계산. G. Aspirate 상쾌한 x 475에 5 분 동안 실내 온도에 남아 있는 세포를 스핀.</li>
</ol>6. 펩 티 드 대상 Splenocytes의 펄스
참고: 펩 티 드 펄스 살 균 방식으로 수행 합니다.
<ol><li>완전 한 미디어에 106 셀/mL에서 셀 resuspend (RPMI 1640 미디어 10 %FBS, 1 %L-글루타민 (L-Gln), 1% 페니실린/스 (펜/Strep)). 2 튜브 (15 mL conicals)로 셀을 나눕니다. 각 튜브 펄스 또는 unpulsed 레이블.</li>
	<li>
펩 티 드 라는 튜브에 펄스를 추가 합니다. OVA257-264 펄스에 대 한 1 µ g/mL을 추가 하 고 hgp10025-33 펄스, 2 µ g/mL를 추가 합니다. 참고: unpulsed 셀 펩 티 드의 추가 없이 그냥 펄스 셀 같은 외피를 받 다.<ol>
<li>셀 + 1 시간 동안 37 ° C에서 펩 티 드를 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>완전 한 미디어의 10 mL을 추가 (RPMI 1640 미디어 10 %FBS, 1 %L-글루타민 (L-Gln), 1% 페니실린/스 (펜/Strep)) 씻어 각 관 모두 펄스를 대상 셀 unpulsed. G. Aspirate 상쾌한 x 475에 5 분 동안 실내 온도에 남아 있는 세포를 스핀.</li>
</ol>7. 준비 CFSE의 대상 Splenocytes 라벨에 대 한
<ol><li>
세척 단계 6.3;에서 셀 동안 CFSE 라벨 솔루션을 준비 펄스 셀으로 CFSEloCFSE안녕 하 고는 unpulsed로 표시 됩니다. 106 셀 CFSE 라벨 솔루션의 1 mL를 준비 합니다. 참고: CFSE 빛에 민감한 이며 항상 빛 으로부터 보호 되어야 한다.<ol>
<li>CFSE안녕 준비-미디어 RPMI 1640 2%에서에서 5 µ M/mL의 최종 농도 대 한 1 uL/mL CFSE (5 m m 재고 솔루션)를 추가 하 여 라벨 미디어 FBS.</li>
		<li>CFSElo 준비-1 uL/mL CFSE (0.5 m m 재고 솔루션) 2%와 0.5 µ M/mL RPMI 미디어 1640의 최종 농도 대 한 추가 하 여 라벨 미디어 FBS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. 라벨링 CFSE와 대상 Splenocytes
참고: CFSE 라벨 살 균 방식으로 수행 해야 합니다.
<ol><li>106 셀/mL CFSE 라벨 미디어에서 (에서 단계 6.3) 펄스와 unpulsed 대상 셀 resuspend Resuspend 펄스 셀 준비 CFSE안녕-미디어와 함께 unpulsed 셀 라벨 준비 CFSElo-라벨 미디어.</li>
	<li>세포와 부드러운 반전 또는 소용돌이 CFSE 라벨 미디어 믹스. Vortexing에 의해 혼합 하지 마십시오. 셀을 품 어 하 고 15 분 동안 37 ° C에서 미디어 CFSE 라벨 리믹스 셀 마다 5 분.</li>
	<li>475 x g에 5 분 동안 실 온에서 각 셀 서 스 펜 션 및 스핀 세포를 완전 한 미디어의 10 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>상쾌한 발음 하 고 10 mL 차가운 PBS에 셀 resuspend. 475 x g에 5 분 동안 4 ° C에서 세포를 스핀.</li>
	<li>8.4 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>계산 셀과 믹스 펩 티 드-펄스, CFSE안녕-표시 unpulsed, CFSElo-셀 받는 쥐로 주입에 대 한 1:1 비율로 표시. 1 x 106 초기 흐름 cytometry 평가 (11 단원)를 사용 하 여 셀을 혼합 한 약 수를 유지 합니다. 참고: 주입에 대 한 최종 볼륨 마우스 당 100 µ L입니다. 마지막 셀 수 10e6 셀입니다. 주사기와 바늘에 볼륨의 손실 고려 되어야 하 고 500 µ L에서 추정 한다.</li>
</ol>9입니다. 대상 세포의 주입
참고: 계속 하기 전에 가능한 만큼 많이 주입 하는 동안 빛에서 보호 CFSE 표시 셀.
<ol><li>등 쪽으로 restrainer에서 받는 사람 C57BL/6 마우스를 놓습니다. 스프레이 분사 꼬리 기본 영역 70% 이소프로필 알콜. 관리 100 µ L 단일 세포 현 탁 액의 정 맥 꼬리 정 맥에 베벨 면이 위로 향하도록 합니다.</li>
</ol>10입니다. 다시 격리 대상 셀의
참고:이 단계의 타이밍은 중요 하 고 CTL 세포 독성과 자극에 대 한 항 원의 강도 의존. 죽이 OVA257-264 펄스 대상의 평가, 대 한 세포를 주입 후 수확된 4-6 h을 있이 필요가 있다. CFSE 표시 된 셀은 어둠 속에서 빛, 민감한 프로세스 spleens 이후.
<ol><li>승인 된 CO2 질 방법 받는 사람 C57BL/6 마우스 안락사</li>
	<li>2.1.1 단계에서 spleen(s)를 제거 합니다. 비장을 세분화 하 고 세척 단계 2.2.1-2.2.3에서와 같이 splenocytes. 붉은 혈액 세포 단계 2.3-2.3.2에서 lyse</li>
	<li>Cytometry에 의해 평가 대 한 정렬 (FACs) 버퍼 (1 %BSA + PBS) 1 mL 형광 활성화 된 세포에 세포를 resuspend.</li>
</ol>11. 제어 논리 Cytometry CTL 활동을 결정 하
<ol><li>
표준 교류 cytometry 프로토콜을 사용 하 여 CTL 활동의 평가 수행 합니다. 여기11488 nm 레이저와 교류 cytometer에 FITC 채널을 사용 하 여 셀을 획득 합니다.
	<ol>
<li>게이트 앞으로 분산형 (FSC) vs 측면 살포 (SSC) 매개 변수를 사용 하 여 라이브 세포에. CFSE 긍정적인 총인구에 대 한 라이브 림프 구 게이트 내에서 subgate. 참고: 삽입 된 CFSE 표시 셀 비장에 총 림프 톨의 작은 하위 집합을 만들 것입니다. CSFE-긍정적인 세포는 로그 눈금에 두 개의 뚜렷한 인구로 표시 되어야 합니다.</li>
		<li>히스토그램 형식을 사용 하 여 unpulsed (왼쪽된 피크, CFSElo) 및 펄스 (오른쪽 피크, CFSE안녕)의 비율을 결정 인구. CFSE안녕하세요 셀의 손실 항 원 특정 CTL 활동을 나타냅니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+quantification+of+T+cell-mediated+cytotoxicity+using+cell-permeable+fluorogenic+caspase+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates.</a> Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).</li>
<li>Wherry, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+relationship+and+protective+immunity+of+memory+CD8+T+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets.</a> Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+flow+cytometry-based+cytotoxic+T-lymphocyte+assay+through+detection+of+cleaved+caspase+3+in+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells.</a> J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).</li>
<li>Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+killing+by+memory+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells.</a> J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).</li>
<li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescent+target+arrays+for+assessment+of+T+cell+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo.</a> J Vis Exp. (88), e51627(2014).</li>
<li>Johansson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell+education+in+mice+with+single+or+multiple+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules.</a> J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).</li>
<li>Hailemichael, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+antigen+at+vaccination+sites+induces+tumor-specific+CD8%28%2B%29+T+cell+sequestration%2C+dysfunction+and+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion.</a> Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).</li>
<li>Overwijk, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+regression+and+autoimmunity+after+reversal+of+a+functionally+tolerant+state+of+self-reactive+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells.</a> J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).</li>
<li>Cho, H. I., Celis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+peptide+vaccines+eliciting+extensive+CD8+T-cell+responses+with+therapeutic+antitumor+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects.</a> Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).</li>
<li>Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+for+pre-clinical+study+of+human+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy.</a> Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Durward, M., Harms, J., Splitter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+specific+killing+assay+using+CFSE+labeled+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜은 간단 하 고, 신중 하 게 수행 해야 하는 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 다음 테스트 되 고 항 원 특정 T 세포의 주입 covax 못쓰게 펄스 목표의 모든 살인을 볼 필요가 있다. 물 기반 covax 예방 접종 급성 염증 상태, 만성 염증 성 단계에 대 한 만듭니다 수 있지만 더 나은 생산할 수 있습니다 느린 원 출시 석유 기반의 접근 방식으로 단기 물에 기초를 둔 배합을 대체 결과7,12.
또한, antigen pulsing 해야 이상적인 흐름 cytometry 판독에 대 한 균일 한 다음 대상 셀의 CFSE 라벨. CFSE안녕 5 µ M와와는 CFSElo 0.5 µ M와 라벨이 제공 하는이 시스템 로그 차이 쉽게 구별 될 수 있는 인구에에서 적합 하 발견 되었다.
<p class="jove_content"...

CD8의 cytolytic (CTL) 잠재력을 평가 하기 위해 존재 하는 여러 프로토콜+ 또는 CD4+ T-셀. 이 평가 생체 외에서 제어 조건1,,23에서 쉽게 할 수 있습니다. 또한, 전염병 모델, LCMV, 고전적인 차동 CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl 에스테 르) 대상 셀을 표시를 사용 하 여 CTL 기능 검사 어디는 CFSE안녕-레이블이 지정 된 셀 펩 티 드 및 CFSElo펄스-레이블이 대상 셀 남아 있다 unpulsed. 셀에 1:1 비율로 주입은 그리고는 CFSE안녕의 손실에 대 한 평가-흐름 cytometry4펄스 대상 이라고 표시 된. 백신 및 제거 모델도 비슷한 전략에 vivo에서 두 CD8 살해의 평가 대 한 사용+ 와 CD4+ T 세포 뿐만 아니라 NK 세포5,6. 이 강력한 분석 결과 이지만 대상 주입 전에 면역 시스템 프라임 전염 성 요원의 사용을 요구 한다.
이 프로토콜을 다른 한편으로, 아무 사전 감염 호스트의를 요구 하 고 대신 예방 접종 전략 대상 주입 전에 면역 체계를 이용 한다. 이 예방 접종 이라고 covax7, 수용 체 통행세 같이 7 (TLR7)의 구성 된 immunostimulatory 칵테일의 제공을 요구 하는 펩타이드 백신의 물 배합의 구성 주 작동 근 (imiquimod 크림), agonistic 안티-CD40 항 체, 그리고 interleukin-2 (일리노이-2) 펩 티 드 관련 못쓰게 하 고 강력한 면역 반응의 도출에 대 한 immunostimulatory 에이전트의 시너지 조합에 지도. 따라서,이 분석 결과 제공 CTL 함수의 빠른 판독 백신 3 일전 주입 대상 셀의 함수의 평가 대 한 셀에 함께 관리 된다. 또한, covax 못쓰게가 강하다 충분히 주입 후 4와 24 h 사이 끝났다 항 원 특정 T 세포의 살해 능력을 볼 수 있습니다.
이 프로토콜의 주요 한계는 타임 라인에서 vivo에서 항 원 및 가설 테스트에 적합 한 대상 살인의 탐지를 위한 식별 됩니다. 주의 깊은 평가 수행 해야 합니다, 유전 변경 뿐 아니라 항 원 강도에 유사로 T-세포에서 테스트 되 고 될 수 있습니다 대상 살인의 다른 타이밍 검출 필요로 하는 차동 CTL 함수. 또한, 예방 접종에 맞게 최적화 된 인간 흑색 종 항 원 glycopeptide 100 (hgp10025-33)에 대 한 펩 티 드의 적절 한 농도 동안 ovalbumin (OVA257-264)257-264 8,9 주어진된 연구에 더 적절 한 수 있습니다 다른 항 원 모델의 사용 추가 유효성 검사가 필요한 것 이다. 예상된 한 보조로는 covax와 함께에서 CTL effector 기능을 자극 하는 대상 항 용량 차이, 때문에 일리노이-2 복용량 농도 및 복용량 주파수의 최적화는 원하는 목표를 달성 하기 위해 필수적인 수 있습니다. 전반적으로,이 프로토콜 기능에서 vivo에서 살인의 빠른 평가 허용 하 고 어떤 주어진된 항 원에 적응 시킬 수 있다.

<table><tbody><tr><td>6주에서 12주 된 암컷 C57BL/6 마우스&nbsp;</td><td>찰스 리버</td><td>027</td><td>C57 블랙 6 마우스</td></tr><tr><td>OT-1 6-12 주 된 여성 마우스&nbsp;</td><td>잭슨 랩스</td><td>003831</td><td></td></tr><tr><td>hgp10025&ndash; 33</서브>&nbsp;</td><td>CPCScientific</td><td>834139</td><td>KVPRNQDWL</td></tr><tr><td>OVA 257&ndash; 264</서브>&nbsp;</td><td>CPCScientific</td><td>MISC-012</td><td>SIINFEKL</td></tr><tr><td>이미퀴모드 크림 5%&nbsp;</td><td>Fougera</td><td>51672-4145-6</td><td>Aldara Cream</td></tr><tr><td>CD40 특정 mAb&nbsp;</td><td>BioXcell</td><td>BE0016-2</td><td>클론 FGK4.5</td></tr><tr><td>rhIL-2 단백질&nbsp;</td><td>Hoffman LaRoche Inc</td><td>136</td><td>재조합 인간 IL-2 단백질</td></tr><tr><td>70% 이소프로필 알코올 준비&nbsp;</td><td>Kendall</td><td>S-17474</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>인산염 완충 식염수</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td><td>태아 소 혈청</td></tr><tr><td>RBC 용해 완충액&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td>적혈구 용해 완충액</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Life Technologies</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>페니실린/스트렙토마이신</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Life Technologies</td><td>C34554</td><td>5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate 숙시니미딜 에스테르</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL MCT 졸업 자연&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td>마이크로 원심분리기 튜브</td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td>Fisher</td><td>BP8201500</td><td>EtOH</td></tr><tr><td>Trypan 블루 용액, 0.4%&nbsp; &nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Fisher</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>27 게이지 바늘</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 주사기</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr></tbody></table>

vivo에서 예방 접종 모델을 사용 하는 항 원 특정 t-셀 cytolytic 함수의 검색에 대 한 분석 결과

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

항 원 특정 살인에 대 한 현재 방법은 생체 외에서 사용을 제한 또는 전염병 모델에 활용. 그러나, 감염 없이 항 원 특정 살인을 측정 하기 위한 프로토콜이 아니라 있다. 이 프로토콜은 설계 및 항 원 특정의 검출 함으로써 이러한 한계를 극복 하는 방법을 설명 합니다+ T vivo에서세포 CD8 하 여 목표 셀의 살인. 이 분석 결과 죽이고 전통적인 CFSE 표시 대상 접종 모델을 병합 하 여 수행 됩니다. 이 조합은 분석 결과 감염 또는 종양의 성장에 따라 의존 하지 않습니다 직접 그리고 신속 하 게 항 원 특정 CTL 잠재력을 평가 하는 연구원을 수 있습니다. 또한, 판독 cytometry에 기반 하 고 그래서 대부분 연구자에 게 쉽게 접근할 수 있어야. 연구의 주요 한계는 타임 라인에서 vivo에서 테스트 중인 가설에 적합 한 식별 됩니다. 항 원 강도 변화와 차동 cytolytic 함수에서 발생할 수 있는 T 세포에 돌연변이 세포 수확 및 평가 대 한 최적의 시간을 결정을 신중 하 게 평가 해야 합니다. 예방 접종에 대 한 펩 티 드의 적절 한 농도 맞게 최적화 된 hgp10025-33 , OVA257-264, 하지만 추가 유효성 검사는 주어진된 연구에 더 적절 한 수 있습니다 다른 펩 티 드에 대 한 필요할. 전반적으로,이 프로토콜 기능에서 vivo에서 살인의 빠른 평가 허용 하 고 어떤 주어진된 항 원에 적응 시킬 수 있다.

CFSE 표시 대상 셀의 주입, 전에 1:1 셀 혼합 CFSE안녕 와 CFSE소호 대상 셀의 기준 주파수를 결정 하는 흐름 cytometer에서 실행 됩니다. 그림 1 A CFSE 인구에 있는 변화를 검출 하는 제어 전략, 초기 게이트 FSC 그리고 SSC 매개 변수를 사용 하 여 이루어집니다. 이 인구는 레이블 없는 생 splenocytes에 비해 상대적으로 작은 총 CFSE 긍정적인 세포는 주파수에 있는 변화를 평가 하기 전에 subgated 다음. CFSE안녕하세요 고 CFSElo 인구의 상대 주파수 100% 총 CFSE 양성 인구를 설정 하 여 계산 이다. 이 분석을 할 수 있는 히스토그램 또는 점 작의 형식을 사용 하 여. 주입 전에 CFSE 인구의 상대 주파수의 예를 들어 <strong class="...

이 프로토콜의 목표 vivo에서 의 검출에 대 한 항 원 특정 murine 모델에서 목표 셀의 살인을 허용 하는 것입니다.

Vivo에서 예방 접종 모델을 사용 하는 항 원 특정 T-셀 Cytolytic 함수의 검색에 대 한 분석 결과

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

본 실험의 전체적인 목표는 마우스 모델에서 표적 세포에 대한 생체 내(in vivo) 항원 특이적 살해 능력을 검출하는 것입니다. 이 방법은 공격받은 면역 체계에서 표적 세포에 대한 항원 특이적 세포독성 살해의 충분성 및 검출, 그리고 T세포 조작을 통해 생체 내 기능을 강화함으로써 이를 어떻게 수정할 수 있는지와 같은 면역학 분야의 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 분석 결과가 종양 성장이나 감염 여부에 의존하지 않으므로, 연구자가 항원 특이적 세포독성 잠재력을 직접적이고 빠르게 평가할 수 있다는 점입니다.멜라노마 내과 종양학부의 Cara Haymaker와 Yared Hailemichael이 이번 절차를 안내하겠습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 마우스를 마취시킨 후, 70% isopropyl alcohol을 사용하여 주사할 꼬리 기부 부위를 분무 소독합니다. 시린지에 연결된 27 gauge 바늘의 사면이 위를 향하게 하여 꼬리 기부 영역으로 4~5 mm 깊이로 자입하고, 미리 준비한 펩타이드 용액 100 µL를 주입합니다.그런 다음, 백신 접종 부위의 측면에 anti-CD4D 항체 100 µL를 주입합니다. 백신 접종 부위에 마우스당 imiquimod 크림 50 mg을 조심스럽게 도포합니다. 크림이 더 이상 보이지 않고 완전히 흡수될 때까지 표면에 문질러 줍니다.그 다음, 하복부 부위에 100,000 IU/mL 농도의 recombinant human rhIL-2 단백질 100 µL를 복강 내로 주입합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 마우스에서 비장세포를 분리하고 적혈구를 용해시킨 후, 먼저 세포를 완전 배지에서 10⁶ cells/mL 농도로 재부유시켜 펩타이드 펄싱(peptide-pulsing)을 수행합니다. 세포를 두 개의 15 mL 코니컬 튜브에 나누어 담고 각각 pulsed 또는 unpulsed로 라벨을 붙입니다.OVA 257-264 펄싱을 위해, 'pulsed'라고 표시된 튜브에 펩타이드를 ml당 1$\mu$g 첨가하십시오. 그 다음, 펄싱된 세포와 펄싱되지 않은 세포를 37°C에서 1시간 동안 배양하십시오. 표적 세포를 세척하기 위해 펄싱된 튜브와 펄싱되지 않은 튜브 모두에 완전 배지 10ml를 첨가하십시오.그런 다음 남은 세포를 475 x g, 상온에서 5분 동안 원심 분리한 후 상층액을 흡입하여 제거합니다. 2% FBS가 포함된 RPMI 1640에 CSFE를 mL당 1 µL씩 첨가하여 최종 농도가 5 µM/mL가 되도록 CSFE 고농도 라벨링 배지를 준비합니다. 이어서 2% FBS가 포함된 RPMI 1640에 CSFE를 mL당 0.1 µL씩 첨가하여 최종 농도가 0.5 µM/mL가 되도록 CSFE 저농도 라벨링 배지를 준비합니다.표적 비장세포를 라벨링하기 위해, 펄스 처리된 세포 10⁶ cells/mL를 준비된 CFSE 고농도 라벨링 배지에 재현탁하고, 펄스 처리되지 않은 세포 10⁶ cells/mL를 CFSE 저농도 라벨링 배지에 재현탁합니다. 세포 현탁액을 부드럽게 뒤집거나 회전시켜 혼합합니다. 그 다음, 5분마다 세포를 다시 혼합하며 37 °C에서 15분 동안 세포를 배양합니다.다음으로, 각 세포 현탁액에 완전 배지 10 milliliters를 첨가하고, 실온에서 475 x g로 5분간 원심분리합니다. 그 다음 상층액을 흡입하여 제거하고, 차가운 PBS 10 milliliters를 사용하여 세포를 재현탁합니다. 4 degrees Celsius에서 475 x g로 5분간 원심분리한 후, PBS 세척 과정을 반복합니다.세포 수를 측정하고, 수용 마우스에 주입하기 위해 펩타이드가 펄싱된 CFSE high-labeled 세포와 펄싱되지 않은 CFSE low-labeled 세포를 1:1 비율로 혼합합니다. 기준선 유세포 분석 평가에 사용할 혼합 세포 1×10⁶개를 별도로 보관합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 세포를 주입하고 표적 세포를 재분리한 후, 표준 유세포 분석 프로토콜을 사용하여 CTL 활성을 평가하며, 이때 488 nm 레이저를 excitation 광원으로 사용하여 FITC 채널에서 세포를 획득합니다.CFSE로 표지된 표적 세포를 주입하기 전, CFSE high 및 CFSE low 표적 세포의 기저 빈도를 결정하기 위해 1:1 세포 혼합물을 유세포 분석기로 분석하였습니다. 여기에는 CFSE 세포군(population)의 변화를 감지하기 위한 게이팅 전략이 표시되어 있습니다. 초기 게이트는 FSC 및 SSC 파라미터를 사용하여 설정되었습니다.표지되지 않은 내인성 splenocytes와 비교했을 때 해당 세포군이 상대적으로 소수이므로, 빈도 변화를 평가하기 전에 전체 CSFE 양성 세포를 다시 서브게이팅(subgate)하였습니다. 주입 전 CSFE 세포군의 상대적 빈도 예시가 여기에 제시되어 있으며, 이는 거의 1:1에 가까워야 합니다. covex 프라이밍의 필요성은 이 패널에서 확인할 수 있으며, 주입 24시간 후 항원 펄스 CSFE high-표적 세포의 사멸이 관찰되지 않았습니다.이 그림은 항원이 펄스된 CFSE high-표지 표적 세포가 효과적으로 사멸되었음을 보여줍니다. 주입 전 관찰되었던 피크가 거의 검출되지 않았으며, 검출 비율이 50%에서 1%로 급격히 감소했기 때문입니다. 마지막으로, 이 그림은 주입 후 6시간과 24시간 시점에서 해당 세포 집단의 소실을 평가함으로써 항원이 펄스된 CFSE high-표지 표적 세포 사멸의 역학을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 항원과 T 세포의 기능에 따라 2~3일 내에 수행할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때 주의할 점은 CFSE 표지가 균일해야 하며, 분석을 수행하기 전에 CTL 반응의 역학을 반드시 평가해야 한다는 것입니다. 본 절차 이후에는 ELISA, ELISPOT 및 세포 내 유세포 분석 염색과 같은 다른 방법을 통해 이펙터 기능의 변화를 평가하고 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면 감염이나 종양이 없는 상태에서 in vivo CTL 기능을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

in-vivo-assay-for-detection-antigen-specific-t-cell-cytolytic

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

대부분의 감염은 강력한 CTL 반응을 이끌어내는,하지만 가끔 응답 세포의 수량은 병원균 제어 상관 관계를하지...

항원 특정 VIVO에서</emCFSE 라벨 대상 세포를 사용하여> 죽이는 분석

이 비디오는 상업적으로 이용 가능한 백신의 면역원성을 측정하기 위한 단핵구 유래 수지상 세포, MoDC 기반 분석을 보여줍니다. MoDC 분석은 항원, 병원체 또는 치료제에 대한 수지상 세포 반응을 조사하고 면역 반응, 백신 개발 및 면역 요법 연구에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

림프구 증식을 유도하기 위한 백신 펄스 수지상 세포 기반 체외 분석

이 비디오는 in vivo adjuvant-induced cytotoxic T lymphocyte 또는 CTL 생산을 모니터링하는 면역학적 방법을 보여줍니다. 마우스에는 유전자 조작된 증식성 염료 염색 공여체 CD8+ T 림프구가 사전 주입됩니다. 보조제와 함께 오브알부민을 피하 주사하면 세포독성 CD8+ T 림프구가 생성되며, 이는 면역염색 및 유세포 분석을 통해 수확 후 확인됩니다.

보조 매개 세포독성 T 림프구 생성을 모니터링하기 위한 면역학적 기술

우리는 HIV 특정 CD4 T 세포에 의한 사이토 카인 분비의 조절에 면역 경로의 역할을 조사하기 위해 시험 관내 분석을 개발 하였다.

시험 관내 분석에서 HIV 특정 CD4 T 세포의 이펙터 기능에 면역 경로의 영향을 평가하기

생체 내에서 상세히 T 세포 반응을 모니터링 할 수있는 능력은 면역 반응에 대한 이해의 발전을 위해 중요하다. 여기에서 우리는 유동 세포 계측법에 의해 동시에&gt; 250 매개 변수를 평가하는 생체 내 T 세포의 분석에서 형광 타겟 어레이 (FTA 체결)의 사용을 설명한다.

T 세포 반응의 평가를위한 형광 대상 배열의 사용<em&gt; 생체 내</em

쥐 백신 접종 모델에서 나노 입자를 사용한 면역에 대한 반응으로 항원 특이적 CD8+ T 세포의 확장을 모니터링하기 위한 전체 동물 이미징 및 유세포 분석 기반 기술에 대해 설명합니다.

나노 입자 백신 접종 후 분석 항원 특이 CD8 + T 세포 반응에 대한 전체 동물 이미징 및 유세포 기술

선물이 여기 표준 면역학 기술에 대 한 응용 프로그램 (CFSE 스테인드 OT-내가 확산) 빠르게 보조 중재 된 세포 독성 T 림프 구 (CTL) 세대를 모니터링 하기 위한 vivo에서. 이 빠른 CTL 용량 추정 세포내 병원 체에 대 한 예방 백신으로 치료 암 백신의 개발에 대 한 유용합니다.

급속 한 비보에 평가 보조의 세포 독성 T 림프 톨 생성 기능의 백신 개발에 대 한

여기, 전 대 한 프로토콜 선물이 vivo 항 원 특정 CD8의 질적 검색+ T 세포. 분석은 단일 셀 정지 적은 양의 혈액 또는 기관에서 가능 합니다. 광범위 한 연구는 세포 독성 T 세포 응답 (예방 접종과 암 immunotherapy 연구)의 분석을 필요로 합니다.

반대로 벡터 및 안티 transgene 특정 CD8의 동시 정량화+ T 세포가 MHC를 통해 내가 Tetramer 바이러스 성 벡터와 예방 접종 후 얼룩

여기에서는 종양 항 원에 대 한 세포 독성 T 림프 구 (CTL) 반응에서 면역 우세의 검사를 가능 하 게 하는 유 세포 분석 기반의 생체 사 멸 분석 법을 설명 한다. 이 우아한 분석을 기계 론 적 연구와 약물 효능 테스트에 사용 하는 방법의 예를 제공 합니다.

종양 특이 CD8+ T 세포 반응에서 면역 우세를 연구 하기 위한 생체 내 세포 독성 분석 법

이 프로토콜은 정형 외과 췌장 종양의 외과 생성 및 갓 단송된 뮤린 췌장 종양의 급속한 소화를 기술합니다. 소화 후, 실행 가능한 면역 세포 집단은 유세포 세포 분석에 의한 세포내 사이토카인 검출을 위한 T 세포의 생체내 자극을 포함하는 추가하류 분석을 위해 사용될 수 있다.

종양 침투 T 세포 독성의 정형 외 췌장 종양 및 Ex 생체 특성의 생성

이 원고는 유세포 분석기를 사용하여 종양 세포 유래 세포밖 소포 (EVs)의 생체 내 면역원성을 평가하는 방법을 설명합니다. 치료를 받는 종양으로부터 유래된 EVs-유도된 면역원성 세포 사멸은 종양 면역감시에 특히 관련있는 것으로 보인다. 이 프로토콜은 옥살리플라틴-유도된 면역자극성 종양 EVs의 평가를 예시하지만, 다양한 설정에 적응될 수 있다.

생체 내 비장 T 세포의 유세포 분석기에 의한 종양 유래 세포밖 소포의 면역원성 스크리닝

배우세요 생쥐 모델에서 항원 특이적 세포독성 살상을 검출하는 면역학 프로토콜을. T세포 조작을 통한 면역 기능 강화와 빠른 세포독성 잠재력 평가 방법을 익히세요.

Vivo에서 예방 접종 모델을 사용 하는 항 원 특정 T-셀 Cytolytic 함수의 검색에 대 한 분석 결과

더 많은 동영상 탐색