Name: 미세 드라이 회전 및 재생성된 실크 Fibroin 섬유의 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 배우세요 미세유체 드라이 스피닝을 이용한 재생 실크 피브로인 섬유의 구조 및 인장 특성 분석 방법을 습득하세요. 상대습도가 섬유 특성에 미치는 영향을 연구하여 생체 모방 소재 개발에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 주최 국립 자연 과학 재단의 중국 (21674018), 국가 핵심 연구 및 중국의 개발 프로그램 (2016YFA0201702 /2016YFA0201700), 그리고 "Shuguang 프로그램" 상하이 교육 개발 지원 재단과 상하이 시 교육 위원회 (15SG30), 상해시 영 교수 프로그램 (A201302), 중앙 대학 및 111 프로젝트 (No.111-2-04)에 대 한 근본적인 연구 자금을 구별.

주의: 사용 하기 전에 모든 관련 물질 안전 데이터 시트를 참조 하십시오. 성형을 준비에 사용 되는 화학 물질의 일부는 심하게 독성이 있습니다. 개인 보호 장비 (안전 안경, 장갑, 실험실 코트, 전장 바지 및 폐쇄 발가락 신발)를 사용 하십시오.
 1. 미세 회전의 RSF 용액 <li>준비의 RSF 마약 회전 수성 4 , 15 , <ol> 16 <ol><li>Degumming 누의 <ol><li>Degum 누에나방 고치 나 2 CO 3 수성 솔루션 (물에 0.5 wt %)에 두 번 30 분 각, 100 ° C에서 누에고치 및 다음 제거 하는 이온된 수와 실크를 씻는 sericin.</li>
		</ol></li> <li>Dissolving 반죽 누 누에고치의 <ol><li>건조 한 공기에 반죽 누에고치 실크; 다음 9.0 M LiBr 수 용액 1:10 (w/v) 40 ° C에서 2 h의 비율에 반죽 누에고치 실크 분해. 예를 들어 1 그램 실크 ( 그림 1a) 당 10 mL LiBr 추가.</li>
		</ol></li> <li>Centrifuging와 필터링 <ol><li>RSF 솔루션 1.5 배 이온을 제거 된 물에 의해 희석. 원심 분리기 및 불순물을 제거 하는 필터 1,234.8 x g.에서 10 분 원심 분리기 4 ° C에서 250 mL 병에 RSF 솔루션 RSF 솔루션 20 µ m 필터와 진공 펌프를 사용 하 여 필터링 합니다. 더블 필터 종이 침대는 실험 효과 고려 하는 것이 좋습니다.</li>
		</ol></li> <li>Dialyzing <ol><li>룰 반 투과성 멤브레인을 사용 하 여 3 일 동안 5 ° C에서 이온된 수에 RSF 솔루션 Dialyze (MWCO: 14000 ± 2000). RSF 솔루션의 전체 볼륨은 약 1 L, 4 투 석 가방에 로드. 이 투 석 가방 양동이에 넣어는 10 L 역삼 투 (RO)으로 가득 저온. 
			참고: 이온된 수의 pH 값을 집중 과정에서 겔 화를 피하기 위해 6 보다 높아야 한다. 이 프로토콜에 대 한 이온된 수의 pH 조정을 요구 하지 않았다.</li>
		</ol></li> <li>집중 <ol><li>응축 RSF 20 wt % 용액 5 ° C. 추가 3 M CaCl 2 수성 해결책에서 강제적인된 공기에 의해 1.0 mmol/g 캘리포니아 2 + 최종 농도; RSF 솔루션 다음 강제적인된 공기에 의해 집중 38-47 wt % 흐름.</li>
			<li>유리 슬라이드에 한 방울 RSF 솔루션의 무게와 다음 오븐 105에서 2 h 동안 건조 ° c. 
			참고: 무게 백분율 남은 고체 단백질과 CaCl 2의 총 농도 건조 하기 전에 드롭의 무게에 비해. RSF 농도 CaCl 2의 질량의 공제 후 파생 됩니다. 적어도 4 개의 반복 측정 수행 했다. 우리의 이전 연구의 캘리포니아 2 + 농도 크게 유 변 학적 특성 및 RSF 수성 해결책의 spinnability 영향을 보여주었다. 한편, 캘리포니아 2 +의 추가 β 시트의 제한 형성과 RSF 17의 집계 라는 메시지가 나타납니다. 기본 회전 마약 CaCl 2 회전 하는 회전 하기 전에 겔 화를 피하기 위해 마약의 저장 하는 동안 중요 한 역할을 간주 됩니다. 18</li></ol></li></ol></li> <li>미세 칩의 준비 8 , 19 <ol><li>포토 마스크를 준비 <ol><li>에 마이크로 채널을 디자인 한 CAD 프로그램입니다. 고해상도 투명도 19를 생산 하기 위해 CAD 파일 인쇄.</li>
		</ol></li> <li>금형 준비 <ol><li>청소 유리 슬라이드 <ol><li>화학 후드에 끓인 뜨거운 접시에 집중된 한 황산의 혼합된 솔루션 및 30 vol % 과산화 수소 솔루션 (10:1) 20 분 동안 유리 슬라이드. 
				주의: 황산과 과산화 수소 증기는 매우 유독.</li>
			</ol></li> <li>세척 유리 슬라이드 <ol><li>이온된 수를 사용 하 여 유리 슬라이드를 세척 하 고 건조 고 순도 질소로 불어.</li>
			</ol></li> <li>코팅 필름 <ol><li>SU-8 포토 레지스트 코팅 바의 아래쪽 면과 유리의 위 표면 사이 100 µ m의 간격으로 맞춤식 코팅 장치에 의해 유리 슬라이드에 코트.</li>
			</ol></li> <li>스핀 코팅 <ol><li>30 40.3 x g에서 spin coater를 사용 하 여 균일 한 필름을 형성 하기 위하여 유리 슬라이드에 포토 레지스트를 확산 s. 균일 한 필름의 두께 약 85 µ m.</li>
			</ol></li> <li>응고 <ol><li>프로그램 제어 온도 오븐에 포토 레지스트를 공고히. 실 온에서 2 ° C/min에서 65 ° C에 온도 상승 고 잡고 2 분 계속 65 ° C에서 열에 65 ° C ~ 95 ° C에서에서 누른 95 ° C 오븐과 멋진 15 분 회전에서 자연스럽 게 방 오븐에 온도.</li>
			</ol></li> <li>자외선 빛 노출 <ol><li>노출 유리의 측 12 자외선에는 포토 레지스트와 슬라이드 사진 평판 19는 포토 마스크로 투명도 사용 하 여 s. 
				참고: 자외선의 wavenumber는 365 nm와 노출 에너지는 273.6 mJ/cm 2. 
				주의: UV 빛 및 오븐 작업 하는 동안 적절 한 안전 조치를 취할.</li>
			</ol></li> <li>1.2.2.5 단계에서 설명한 대로 포토 레지스트를 공고히.</li>
			<li>개발 <ol><li>30 미 세척 소 프로 파 놀과 유리 슬라이드에 없습니다 강 수 있을 때까지 둘 사이 번갈아 하는 개발자에 의해 유리 슬라이드에 대 한 개발자 솔루션에 초음파 레지스트 청소.</li>
			</ol></li> <li>프로그램 제어 온도 오븐에 포토 레지스트를 공고히. 실 온에서 2 ° C/min에서 170 ° C 온도 상승 하 고 170 ° C 오븐과 멋진 30 분 설정에서 자연스럽 게 실내 온도에 오븐을.</li>
		</ol></li> <li>소프트 리소 그래피 <ol><li>형과 65 ° C에서 30 분 동안 치료 8.8 g 액체입니다 (PDMS) 사전 폴리머 붓는 고 80 ° C. 액체 PDMS 사전 폴리머에서 15 분 PDMS와 경화제 (10:1 (w/w))에서 일반적으로 이루어져 있다.</li>
		</ol></li> <li>펀치 <ol><li>드릴 여 채널의 시작 부분에서 PDMS 복제를 통해 구멍을 펀치. 드릴의 직경은 1.2 m m.</li>
		</ol></li> <li>씰링 <ol><li>두 PDMS 층의 표면에는 산소 플라즈마 처리에 의해 패턴 없이 평면 PDMS 레이어 채널 PDMS 복제 인감. 
			참고: 칩의 전반적인 준비 과정은 약 72 h.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>RSF의 제조 섬유 <ol><li>마약 회전의 주입 <ol><li>아닌 2 µ L/분으로 마약 주사기 펌프에 의해 회전 하는 RSF 주사.</li>
		</ol></li> <li>환경 규제 <ol><li>조정 40 ± 5 상대 습도 RH % 또는 50 ± 5 가습기를 사용 하 여 RH %. 40 ± 5 RH에서 %로-돌 다 섬유 경화 50 ± 보다 더 빨리 5 RH %.</li>
		</ol></li> <li>생산의 RSF 섬유 <ol><li>미세 채널의 출구에 정확 하 게에 의해 RSF 드롭 터치, RSF 섬유 공기, 그리고 다음 ( 그림 1b 3 cm/s의 속도로 10 cm 공기 차이 통해 롤러에 릴 ).</li>
		</ol></li> <li>24 헤에 대 한 봉인된 desiccator에 RSF 섬유를 저장</li>
		<li>섬유 후 처리 <ol><li>80 vol %ethano 0.9 m m s -1에서 4 번으로 늘인 섬유를 그릴사용자 컴퓨터 및 다음 계속 그려진된 섬유에 의해 l 솔루션 고정 하 고 1 시간에 대 한 솔루션에 섬유를 담가. 이 치료 때문에 섬유의 길이 60 m m로 원래 15 m m에서 변경 되었습니다.</li>
		</ol></li> <li>특성화에 대 한 샘플 준비 <ol><li>10 mm 게이지 길이와 사후 처리 섬유 종이 프레임에 수정. 적어도 20 섬유 측정, 인장 시험, SEM, FTIR, WAXS에서 포함에 대 한 필요는. 이후 그려진된 섬유 범위 5에서 10 µ m. 그림 1의 직경의 섬유 생산 및 WAXD 특성화 회로도 보여준다. RSF 섬유의 기계적 성질 (25 ± 2) ° C 소재 테스트 시스템 및 (45 ± 5) % 상대 습도 의해 시험 되었다. 확장 속도 및 게이지 길이 2 mm/min와 1 ㎝를 각각 했다.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 2. 싱크 로트 론 방사선 특성의 결정 구조의 RSF 섬유 <ol><li>싱크 로트 론 방사선 특성 4 , 13 , 17 <ol><li>beamline <ol><li>의 조정 조정 엑스레이 및 0.07746 nm을 2, 3 x 2 µ m 크기의 파장 각각. 
			참고: 프로토콜 BL15U1 beamline 상해 싱크 로트 론 방사선 시설에서 사용 하 여 수행 됩니다.</li>
		</ol></li> <li>X 선 스팟의 위치 <ol><li>x 선 스팟의 위치 찾기. 
			참고: x 선 스팟의 위치는 싱크 로트 론 방사선 시설에서 실험실 기술자에 의해 조정 됩니다.</li>
		</ol></li> <li>표준 샘플의 테스트: 세 륨 산화물 (CeO 2) <ol><li>표준 샘플 CeO 2 분말을 테스트. 원 센터와 검출기에는 샘플에서 거리를 계산 하기 위해 CeO 2 분말 특징 이었다.</li>
		</ol></li> <li>샘플 준비 <ol><li>10mm 게이지 길이 종이 프레임에 서로 병행에서 RSF 필 라 멘 트를 수정. 테스트 단계에 종이 프레임 접착제. 
			참고: 섬유를 수평 유지.</li>
		</ol></li> <li>SR WAXD 테스트 <ol><li>셔터를 열고 <ol><li>방에 아무 사람은 확인 후 beamline 역의 문을 닫습니다. X 선 빔 소스의 셔터를 열고.</li>
			</ol></li> <li>초점 <ol><li>초점에 때까지 약간 섬유를 이동. X, y, z 방향 ( 그림 1c) 소프트웨어를 통해 원격으로 섬유의 위치 조정.</li>
			</ol></li> <li>노출 샘플 <ol><li>이동 섬유 아래로 원격으로 소프트웨어를 통해 때까지 x 선 자리에. 20 x 선 beamline에 섬유를 노출 하는 소프트웨어에 시작 버튼을 누르면 s ( 그림 1c).</li>
			</ol></li> <li>회절 배경 <ol><li>테스트는 소프트웨어를 통해 원격으로 20 s. 이동 x 선 자리에서 섬유의 노출 시간 공기 배경의 회절. 보도 &#34; 시작 &#34;에 x 선 beamline 노출 소프트웨어에 단추 &#34; 공기 매체 &#34; 20 s.</li>
			</ol></li></ol></li></ol></li> <li>SR WAXD 데이터 처리 13 <ol><li>소프트웨어 보정 <ol><li>FIT2D (V12.077)를 사용 하 여 WAXD 데이터 처리. 원 센터와 샘플-검출기-CeO 2 분말의 회절 데이터를 사용 하 여 거리를 보정.</li>
		</ol></li> <li>2 차원 회절 패턴 <ol><li>FIT2D (V12.077)를 사용 하 여 섬유 회절 패턴에서 공기 배경 빼기.</li>
		</ol></li> <li>화도 및 crystallite 크기 <ol><li>산란 각도 2θ의 기능으로 회절 강도 통합. 자동된 피크 분리 소프트웨어 (버전 4.12) 12 deconvolution 강도 통합을 수행 합니다. 화도, c, x의 정도 관계에서 추정 되었다: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56271/56271eq1.jpg" /> , 어디 내가 c 결정 봉우리와의 통합된 강렬의 합계는 비정 질 헤일로 4 , 11의 통합된 강도 이다. WAXD 패턴의 통합 [200]의 피크 폭을 보여주었다, [020], [002] 반사. 이 봉우리의 FWHM 따라 crystallite 크기를 결정 하는 데 사용 했다는 a, b 및 c 축 Scherrer를 사용 하 여 &#39; s 수식 4.</li>
		</ol></li> <li>Crystallite 방향 결정 <ol><li>는 crystallite의 방향을 계산 하 고 비정 질 (020)의 방위 통합 및 (210) 봉우리 11. 결정 방향 허먼 따라 양적으로 계산할 수 있다 &#39; s 방향. 여기, 모두 (020) 및 (210) 봉우리 두 가우스 기능을 장착 했다. 좁은 한 결정 방향 이며 다른 광범위 한 지향된 비정 질 소재 13입니다. 여기, RSF 섬유의 crystallite 방향 방위 통합 (002) 피크의 절반 최대 (FWHM)에 전체 너비를 사용 하 여 비교 했다.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Asakura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+observations+on+the+structure+and+function+of+the+spinning+apparatus+in+the+silkworm+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Some observations on the structure and function of the spinning apparatus in the silkworm Bombyx mori.</a> Biomacromolecules. 8 (1), 175-181 (2007).</li>
<li>Vollrath, F., Knight, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+crystalline+spinning+of+spider+silk%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Liquid crystalline spinning of spider silk.</a> Nature. 410 (6828), 541-548 (2001).</li>
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<li>Martel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk+Fiber+Assembly+Studied+by+Synchrotron+Radiation+SAXS%2FWAXS+and+Raman+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Silk Fiber Assembly Studied by Synchrotron Radiation SAXS/WAXS and Raman Spectroscopy.</a> J Am Chem Soc. 130 (50), 17070-17074 (2008).</li>
<li>Rammensee, S., Slotta, U., Scheibel, T., Bausch, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+mechanism+of+recombinant+spider+silk+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Assembly mechanism of recombinant spider silk proteins.</a> P Natl Acad Sci USA. 105 (18), 6590-6595 (2008).</li>
<li>Kinahan, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+silk%3A+using+microfluidics+to+fabricate+silk+fibers+with+controllable+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Tunable silk: using microfluidics to fabricate silk fibers with controllable properties.</a> Biomacromolecules. 12 (5), 1504-1511 (2011).</li>
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<li>Peng, Q. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+spider+silk+from+aqueous+solutions+via+a+bio-inspired+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Recombinant spider silk from aqueous solutions via a bio-inspired microfluidic chip.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

RSF 솔루션의 투 석 동안 pH 값이 다음 농도 과정에 대 한 중요 합니다. 이온된 수의 pH 값이 6 보다 작은, RSF 솔루션 집중 과정에서 젤 쉬울 것 이다. 겔 화를 피하기 위해, CaCl2 RSF 솔루션에 추가 됩니다. CaCl2 의 농도 1 mmol RSF의 무게 당.
우리의 이전 작품의 미세 드라이-8RSF 수성 해결책 가능성을 보여주었다. 미세 채널의 형상을 단순화 된 단일 단계 지 수 함수를 했다. 거미 및 누, 회전 진한 액체 섬유 형성1,20전에 2 단계 지 수 회귀 회전 덕트를 통해 아래로 추첨을 했다. 여기, 미세 채널 형상 누 회전 덕트1의 두 번째 순서 지 수 감퇴 기능을 흉내 낸에 의해 설계 되었습니다. Microﬂuidi...

거미 및 누 주위 온도 압력에서 수성 단백질 해결책에서 뛰어난 실크 섬유를 생산할 수 있다. 전단 및 extensional 흐름 실크 동맥1액정 텍스처의 형성을 유도할 수 있다. 최근 몇 년 동안, 고 강도 인공 섬유를 생산 하기 위해서는 거미의 회전 과정을 흉내 낸에 큰 관심이 되었습니다. 그러나, 거미 실크 단백질의 대량 수 없습니다 효율적이 고 경제적으로 의해 생산 농업 식인 풍습으로 인해 거미. 상당한 양의 누 실크는 농업에 의해 쉽게 얻어질 수 있다. 그렇지 않으면, 누와 거미 유사한 회전 과정과 아미노산 성분이 있다. 따라서 누 실크 fibroin 선택 대신 인공 동물 실크 스핀 많은 연구자에 의해.
거미 및 누에에서 섬유에 그들의 회전 덕트를 통해 단백질 해결책을 압출 성형. 가장 가능성이 회전 덕트를 따라 생성 높은 스트레스 힘 더 확장 구조2실크 fibroin 분자 스트레칭. 인공 실크 섬유 기존의 젖은 회전 및 회전 건조 프로세스3,4, 고려 하지 않는 사용 하 여 회전 된 유체 힘 회전 덕트에서 생성 된 계정.
첫째, 미세 접근 실크 단백질5,6의 어셈블리를 조사 하기 위해 사용 되었다. 다음, RSF의 미세 제조 전단 및 extensional 세력7,8모델링을 통해 연구 했다. 영의 계수 및 RSF 섬유의 직경이 미세 젖은 회전에 의해 조정 될 수 있다 하지만 그려진된 섬유의 인장 강도 100 MPa7. 마지막으로, 고 강도 RSF 섬유 미세 드라이 회전 메서드를 사용 하 여 성공적으로 준비 하지만 섬유의 직경은 2 µ m8만. 최근, 미세 젖은 회전 강도 재조합 거미 실크 섬유의 생산에서 성공적으로 사용 되었다. 공기에서 후 회전 그리기9인공 섬유 표면 및 내부 결함 개선.
이 연구에서는 향상 된 미세 회전 RSF 섬유에 대 한 과정 소개 된다. 그것은 회전 마약, 전단 세력, 그리고 드라이 회전 과정을 포함 하 여 누 실크 회전 과정을 모방 하는 것을 목표로. 이 회전 방법은 고 강도 인공 실크 섬유를 생산할 수 있다 뿐만 아니라 또한 섬유의 직경을 조정할 수 있습니다. 첫째, RSF 마약 회전 전단 이었고 두 번째 순서 지 수 감퇴와 biomimic 채널에 길쭉한. 둘째, 섬유 형태와 속성에 상대 습도 (RH)의 영향 미세 드라이 회전 과정10에서 공부 했다. 기존의 회전 spinneret에 비해, 우리의 미세 시스템 높은 생체 모방 이며 건조 하 여 주위 온도에 솔루션에서 고 강도 섬유를 생산 또는 회전 방법 젖은 사용할 수 있습니다.
때문에 고해상도, 고휘도, 고 에너지 싱크 로트 론 방사선 미소 초점 x 선의를 사용할 수 있습니다 몇 마이크로미터4,11 의 직경을 가진 단 하나 섬유의 미세 하 , 12 , 13 , 14. 여기, SR WAXD 기술은 화도, crystallite 크기 및 RSF 섬유의 결정 방향 계산에 사용 되었다.

<table><tbody><tr><td>B. mori</td> 중국 <td></td><td></td><td>저장성 퉁샹의 고치 농부</td></tr><tr><td>탄산나트륨, 무수, 99.8%</td><td>Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd., 중국</td><td></td><td>분석적으로 순수한</td></tr><tr><td>리튬 브로마이드, 99.1%</td><td>Shanghai China Lithium Industrial Co., Ltd., 중국</td><td></td><td>분석적으로 순수한</td></tr><tr><td>염화칼슘, 무수, 96.0%</td><td>Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd., 중국</td><td></td><td>분석적으로 순수한</td></tr><tr><td>에탄올, 무수, 99.7%</td> <td>Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., 중국</td><td>10009218</td><td>분석적으로 순수한</td></tr><tr><td>SU-8 감광액</td><td>MicroChem Corp., 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>개발 용액</td><td>MicroChem Corp., 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>Shanghai Lingfeng 화학 시약 Co., Ltd., 중국</td><td></td><td>분석적으로 순수한</td></tr><tr><td>농축 황산</td><td>Pinghu 화학 시약 공장, 중국</td><td></td><td>분석적으로 순수한</td></tr><tr><td>30 vol% 과산화수소</td><td>Shanghai Jinlu 화학 시약 Co., Ltd., 중국</td><td></td><td>분석적으로 순수한</td></tr><tr><td>아세톤</td><td>Shanghai Zhengxing 화학 시약 공장, 중국</td><td></td><td>분석적으로 순수함</td></tr><tr><td>산소 플라즈마 처리</td><td>DT-01, Suzhou Omega Machinery Electronic Technology Co., Ltd., 중국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>&nbsp; KD Scientific, 미국</td><td></td><td>KDS 200P</td></tr><tr><td>가습기</td><td>SEN 전기</td><td></td><td></td></tr><tr><td>드릴러</td><td>Hangzhou Bo Yang Machinery Co., Ltd., 중국</td><td></td><td>벤치 드릴링 머신 Z406c</td></tr><tr><td>재료 테스트 시스템</td><td>Instron, 미국</td><td></td><td>모델: 5565</td></tr><tr><td>PeakFit</td><td>Systat Software, Inc., 미국</td><td></td><td>버전 4.12</td></tr></tbody></table>

미세 드라이 회전 및 재생성된 실크 fibroin 섬유의 특성

Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

프로토콜 누의 회전 과정을 흉내 낸에 대 한 메서드를 보여 줍니다. 기본 회전 과정에서 계약 회전 덕트 실크 단백질을 콤팩트 하 고 전단 및 신장 힘에 의해 정렬 될 수 있습니다. 여기, biomimetic 미세 채널 누의 회전 덕트의 특정 기하학을 모방 하도록 설계 되었습니다. 재생성 된 실크 fibroin (RSF) 회전 높은 농도, 첨가 온도 압력에서 드라이 스핀 섬유 아닌 통해 돌출 했다. 사후 처리 과정에서로 냈 지 섬유 했다 그려지고 에탄올 용액에 저장 됩니다. 싱크 로트 론 방사선 광각 x 선 회절 (SR-WAXD) 기술은 RSF 섬유 축 x-레이의 microbeam에 샘플 홀더를 고정 하는 단일 RSF 섬유의 미세를 조사 하기 위해 사용 되었다. 화도, crystallite 크기 및 결정 방향 섬유의 WAXD 데이터에서 계산 했다. 2 차원 WAXD 패턴의 적도 근처 회절 호 사후 처리 RSF 섬유 높은 방향 정도 나타냅니다.

고 강도 RSF 섬유 미세 회전 메서드를 사용 하 여 성공적으로 생산 되었다. 응력-변형 곡선 및 뻗어 RSF 섬유 C44R40의 SEM 이미지는 그림 2에 표시 됩니다. 적어도 10 섬유는 인장 시험에서 측정 되었다. 응력-변형 곡선 섬유의 주요 스트레스와 긴장의 평균 값에 따라 선택 되었다. 섬유의 WAXD 데이터는 그림 3에 나와 있습니다. 화도 및 결정 방향 WAXD 데이터에 따라 계산 했다. 샘플 지정 사용 하 여 C와 R 회전 마약 및 상대 습도에 RSF의 농도 각각 제시. 예를 들어 섬유 40 ± 5% RH 4의 무승부로 비에 그린 후 C44R40으로 지정 되었다 44 wt %RSF 회전 마약에서 냈 지. 다른 섬유는 같은 설명에 따라 C44R50, C47R40, 및 C47R50로 변경 했다.
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미세 회전 및 재생성된 실크 fibroin monofilament의 미세 특성화에 대 한 프로토콜 제공 됩니다.

미세 드라이 회전 및 재생성된 실크 Fibroin 섬유의 특성

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

본 실험의 전체적인 목표는 미세유체 건식 방사법을 이용하여 상대 습도가 재생 실크 피브로인 섬유의 구조 및 인장 특성에 미치는 영향을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 전단력 및 건식 방사 공정과 같은 생체 모사 방사 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 미세유체 채널이 누에의 방사관을 모방하여 설계되었다는 점입니다.이 방법은 실크 피브로인의 건식 방사 공정에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 이는 재조합 거미 실크의 습식 방사 공정에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자는 초기 단계에서 어려움을 겪을 수 있습니다.방사 용액을 준비하고 적절한 방사 성능을 확보하는 데 2주일이 소요되기 때문입니다. 이 방법의 시각적 시연은 매우 중요합니다. 경험이 부족할 경우 방사 용액을 제조하기가 매우 어려우며, 제조 시 방사 시간을 조절하는 것이 매우 필수적이기 때문입니다.0.5% sodium carbonate가 포함된 수용액에서 Bombyx mori 고치를 정련(degumming)하는 것으로 시작합니다. 침지시킨 고치를 100 °C에서 30분 동안 배양합니다. 그 다음, sodium carbonate 용액을 교체하고 배양 과정을 두 번째로 반복합니다.완료되면, 탈이온수로 실크를 세척하여 세리신을 제거합니다. 정련된 고치 실크를 공기 중에서 건조시킨 후, 1:10의 중량 비율로 9.0 molar 리튬 브로마이드에 침지시킵니다. 실크가 완전히 용해될 때까지 40 °C에서 2시간 동안 배양합니다.다음으로, 재생 실크 피브로인 용액을 탈이온수를 사용하여 250 mL 병에 1.5배 희석합니다. 용액을 원심분리한 후, 진공 펌프를 사용하여 20 µm 메쉬 크기의 이중 여과지 베드로 여과하여 불순물을 제거합니다. 여과된 재생 실크 피브로인 용액 250 mL를 셀룰로스 반투과성 막 투석 백에 넣고, 각 백을 5 °C의 역삼투 탈이온수 10 L에서 3일 동안 투석합니다.투석 후, 강제 공기 흐름을 사용하여 5°C에서 용액을 초기 무게의 20%까지 농축합니다. 다음으로, 칼슘 이온의 최종 농도가 g당 1.0 mM이 되도록 농축된 용액에 3 M 염화칼슘 수용액을 첨가합니다. 다시 강제 공기 흐름을 통해 재생 실크 피브로인 용액을 초기 무게의 44%까지 농축합니다.먼저 농축 황산과 30% 과산화수소 용액을 10:1 비율로 혼합한 용액에 유리 슬라이드를 넣고 20분 동안 끓입니다. 과정이 끝나면 탈이온수로 유리 슬라이드를 세척한 다음, 고순도 질소로 건조시킵니다. 이어서, 코팅 바의 바닥면과 유리의 윗면 사이의 간격이 100 micrometers가 되도록 유리 슬라이드를 맞춤 제작된 코팅 장치에 배치합니다.SU-8 포토레지스트로 틈을 채운 다음, 40.3 times G에서 30초 동안 스핀 코팅하여 약 85 micrometers 두께의 균일한 막을 형성합니다. 그다음, 포토레지스트가 도포된 슬라이드를 온도 제어 프로그램이 설정된 오븐에 넣습니다. 온도를 상온에서 분당 2 degrees Celsius의 속도로 65 degrees Celsius까지 올린 후, 65 degrees Celsius에서 2분 동안 유지합니다.그런 다음, 슬라이드를 65°C에서 95°C까지 분당 2°C의 속도로 계속 가열하고, 95°C에서 15분 동안 온도를 유지합니다. 이 시점에서 오븐의 전원을 끄고 슬라이드가 오븐 내에서 실온으로 자연스럽게 식도록 둡니다. 다음으로, 포토레지스트가 도포된 슬라이드를 UV 램프 아래에 배치하고, 적절한 마이크로채널이 포함된 포토마스크를 슬라이드 위에 정렬합니다.슬라이드 측면을 12초 동안 UV 광선에 노출시킵니다. 노출 후, 슬라이드를 다시 오븐에 넣고 이전과 같이 가열합니다. 베이킹 후, 현상액에서 30초 동안 초음파 세척하여 포토레지스트를 제거합니다.그 후, 유리 슬라이드 위에 침전물이 남지 않을 때까지 이소프로판올과 현상액을 교대로 사용하여 세척합니다. 온도 제어 프로그램이 설정된 오븐에서 포토레지스트를 경화시킵니다. 온도를 상온에서 분당 2 °C의 속도로 170 °C까지 올린 후, 170 °C에서 30분 동안 유지하고, 오븐 전원을 끈 다음 오븐 내부에서 상온으로 자연 냉각시킵니다.다음으로, 경화된 SU-8 몰드를 알루미늄 상자에 넣고, 8.8 g의 PDMS 프리폴리머를 몰드 위에 약 5 mm 높이가 되도록 붓습니다. PDMS를 65 °C에서 30분 동안, 이어서 80 °C에서 15분 동안 경화시킵니다. 경화가 완료되면, 1.2 mm 직경의 드릴 비트를 사용하여 채널 입구의 PDMS 복제물에 구멍을 뚫습니다.그런 다음, PDMS 채널 면이 위로 향하게 하여 두 번째 평평한 PDMS 층과 함께 플라즈마 코터에 넣고 산소 플라즈마 처리를 합니다. 플라즈마 챔버에서 꺼낸 즉시 채널이 있는 PDMS 층을 평평한 PDMS 층에 밀봉합니다. 이제 마이크로채널을 사용할 준비가 되었습니다.시린지 펌프를 사용하여 재생된 실크 피브로인 방사 도프를 분당 2 µL의 속도로 마이크로채널에 주입합니다. 가습기를 사용하여 전기방사 영역의 상대 습도를 40% 또는 50% 상대 습도로 조절합니다. 그런 다음, 표면이 초당 3 cm의 속도로 이동하도록 롤러를 작동시킵니다.습도가 안정되면, 재생된 실크 피브로인 방울을 터치하여 공중으로 실크 섬유를 끌어냅니다. 그런 다음, 10 centimeter의 공극을 통해 이를 롤러 위에 배치하십시오. 롤러가 남은 실크 섬유를 끌어당길 것입니다.완료 후, 섬유를 밀폐된 데시케이터에 넣고 24시간 동안 보관하십시오. 다음 날, 맞춤 제작된 기계를 사용하여 80% ethanol 내에서 0.9 millimeters per second의 속도로 섬유를 4회 연신하여 후처리합니다. 연신된 섬유를 고정한 상태로 80% ethanol 용액에 1시간 동안 담가 두십시오.마지막으로, 후처리된 섬유를 10 millimeter 게이지 길이의 종이 프레임에 고정합니다. 여기에는 최종적으로 신장된 재생 실크 피브로인 섬유의 SEM 이미지가 나와 있습니다. 이 섬유들의 평균 직경은 9 microns였습니다.인장 강도를 측정한 결과, 상대 습도 40% 조건에서 형성된 섬유는 상대 습도 50%에서 형성된 섬유에 비해 극한 인장 강도와 최대 변형률이 약간 더 높았으나, 영률(Young's modulus)은 비슷하게 나타났습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 생체 모방 미세유체 칩을 사용하여 수성 실크 용액으로부터 실크 섬유를 건식 방사하는 방법을 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

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미세 드라이 회전 및 재생성된 실크 Fibroin 섬유의 특성

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