Vivo에서 인간 지방 유래 중간 엽 줄기 세포 형광 질 성 막 염료와 쥐 무릎 관절염 모델에서의 추적

이 프로토콜에는 빨강 형광 라벨 내부 관절 (IA) 주입을 통해 쥐 무릎 관절염 (KOA) 모델에 의해 셀 속성과 biodistribution 인간 지방 유래 중간 엽 줄기 세포 (haMSCs)의 모니터링 하는 효율적인 방법을 설명 합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 생체 내 형광 이미징을 사용하여 쥐 무릎 골골염 또는 KOA 모델에서 인간 지방 유래 중간엽 줄기 세포의 세포 지속성 및 생체 내 분포의 효능을 평가하는 것입니다. In vivo 줄기세포 추적은 KOA 동물 모델에서 중간엽 줄기세포에서 유래한 인간 지방의 자극 및 분포에 대한 재생 수학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. DiD 사용의 주요 이점은 쥐 이동 방출 스펙트럼을 통해 염료 표지된 세포에 대한 세포 효과나 기능적 손상 없이 살아있는 동물에서 심층 조직 이미징을 수행할 수 있다는 것입니다.

마취된 250-300g, 8-12주 된 수컷 Sprague Dawley 쥐를 가열된 패드의 왼쪽 측면 위치에 놓는 것으로 시작합니다. 면도기를 사용하여 오른쪽 무릎을 철저히 면도하고 10% 포비돈 요오드 용액과 70% 에탄올로 수술 부위를 소독합니다. 수술하지 않은 부위를 수술용 패드로 덮습니다.

그리고 메스를 사용하여 슬개건을 따라 옆으로 2cm 절개하여 관절낭을 노출시킵니다. 다음으로, 외과용 메스를 사용하여 내측 측부 인대를 절제하고 반월판을 대퇴골 쪽으로 반사시키고 겸자로 내측 반월판을 잡습니다. 메스를 사용하여 경골 부착부에서 가장 좁은 지점의 반월판을 자릅니다.

신뢰할 수 있고 실현 가능한 KOA 발병을 얻기 위해서는 각 실험 동물에서 반월판의 대퇴골 쪽을 완전히 절단해야 합니다. 그런 다음 관찰 가능한 4-O 봉합사로 관절 캡슐을 닫고 완전히 회복될 때까지 쥐를 모니터링합니다. 수술 8주 후, 섭씨 37도에서 3분 동안 2ml의 트립신과 EDTA를 사용하여 80% confluent 배양에서 인간 지방 유래 중간엽 세포를 분리합니다.

몇 분 후, 4ml의 완전 배양 배지로 트립신을 중화하고 원심분리로 세포를 수집합니다. 펠릿을 5 밀리리터의 무혈청 배양 배지에서 1 배 10에서 밀리리터 당 6 세포 농도로 재현탁시킵니다. 그리고 섭씨 37도에서 50분 동안 50마이크로리터의 DiD 세포 라벨링 솔루션으로 셀을 라벨링합니다.

배양이 끝나면 원심분리로 세포를 수집하고 세척당 5ml의 PBS로 2회 세척합니다. 마지막 원심분리 후, 세포를 PBS 농도 100마이크로리터당 6번째 생존 세포의 2.5배로 10으로 희석하고 26게이지 바늘이 장착된 1밀리리터 주사기에 세포를 로드합니다. 다음으로, 첫 번째 실험 동물의 관절염 무릎을 면도하여 관절 부위를 노출시키고 노출 된 피부를 70 % 에탄올로 소독합니다.

라벨링된 세포를 슬개골 인대의 내측, 내측 대퇴 과두, 내측 경골 과두에 의해 형성된 삼각형의 중심에 주입하고 이미징 소프트웨어를 엽니다. 생체 내 생물 발광 이미징 시스템을 초기화하고 이미징 시스템의 중앙 스테이지 내에서 앙와위 위치에 동물을 배치합니다. 챔버 도어를 닫은 상태에서 형광등 상자를 확인하고 적절한 여기 및 방출 형광 필터 세트를 선택합니다.

시야를 D로, 픽셀 벤딩을 8로, F 스톱을 2로, 노출 시간을 자동으로 설정합니다. 이미지를 얻은 후 동물이 완전히 회복될 때까지 모니터링과 함께 열 패드에서 회복하도록 합니다. 그런 다음 적절한 이미지 분석 소프트웨어에서 형광 측정을 위한 복사 효율 단위와 분석을 위한 관심 영역을 선택하고 각 이미지의 형광 신호를 정량화합니다.

이 대표적인 실험에서, 무릎 골관절염에 유발된 쥐의 무릎 관절의 연속적인 절편을 H&E와 사프라닌 O/패스트 그린 염색으로 수술 8주 후에 평가하였다. 관절 연골의 두께는 H&E 염색 부분에서 관찰된 바와 같이 수술을 받지 않은 반대쪽 관절보다 관절염이 있는 무릎에서 더 얇습니다. 또한, 사프라닌 O/패스트 그린 염색에 의해 시각화된 바와 같이 관절염 관절에서 프로테오글리칸이 감소하고 섬유질 콜라겐이 증가하며, 이는 수술에 의해 유도된 퇴행성 무릎 골관절염 표현형의 진행을 나타냅니다.

염색 1시간 후, DiD 표지된 인간 지방 유래 중간엽 세포는 in vitro에서 둥근 모양을 나타냅니다. 24시간 후, 배양된 DiD 표지 중간엽 세포는 DiD가 세포의 부착 능력을 변화시키지 않는다는 것을 확인하는 긴 방추체 모양을 보여줍니다. 수술 후 8주 후에 골관절염이 있는 동물의 무릎을 촬영하면 주사 후 0일차부터 70일차까지 DiD 표지 세포의 존재를 알 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 줄기세포 치료 분야의 연구자들이 동물의 무릎 골관절염 치료를 위한 중간엽 줄기세포의 안전하고 실현 가능한 주입을 위한 최적의 루틴과 용량을 결정할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 수술로 유도된 쥐 KOA 모델에서 주입 및 생체 내 추적을 위해 인간 중간엽 줄기세포를 DiD로 라벨링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.